2.2.2. Les enzymes spécifiques des liaisons α (1→ 6)
L’Iso amylase (E.C. 3.2.1.68) est une enzyme déramifiante ; elle hydrolyse les liaisons α (1→ 6) présentes dans les polysaccharides tels que de l’amylopectine.
La pullulanase (E.C. 3.2.1.41) est également une enzyme déramifiante spécifique à l'hydrolyse des liaisons α (1→ 6) de pullulan. Elle est incapable d'hydrolyser totalement l'amylopectine qui est beaucoup plus ramifiée que le glycogène (Scriban, 1993).2.2.3. Les enzymes spécifiques des liaisons α (1→ 6) et α(1→ 4)
L'amyloglucosidase (E.C.3.2.1.31), encore appelée glucoamylase, scinde rapidement non seulement les liaisons α (1→ 4) des extrémités non réductrices mais aussi les liaisons α (1→ 6) de l'amylopectine en libérant du β- D- glucose (Mercier, 1982).
2.3. Définition et nomenclature de l’α-amylase
Son action, de type endomoléculaire, conduit à la formation du D- glucose, de maltose et d'une petite quantité de maltodextrines. L'enzyme hydrolyse les molécules d'amidon exactement au niveau de la liaison α (1-4) glucanes (Mercier, 1982).
Non systématique : α-(1-4) D-glucane glucanohydrolase.
Non codifié : E.C .3.2.1.1
Non recommandé : Alpha-amylase.
Synonymes: glycogenase, endoamylase, maxilase, taka-amylase A, takatherm, thermolase, amylotherm, clarase, amylopsin, spitase CP1, G995, kleistase L1, THC 250, maxamy, ptyalin (Graber, 1989).
L’α-amylase
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2.4. Structure et mécanisme d’action
Les α-amylases sont des métallo-enzymes à calcium (un ion calcium par molécule
d'enzyme). Ces ions sont nécessaires à l'activité enzymatique et au maintien de la stabilité de la structure en acides aminés d enzyme qui varient d'une souche à une autre (Fogarty et al., 1980). On prend comme exemple la teneur en acides aminés de l'α-amylase de B. amyloliquefaciens et A. oryzae.
Structurellement, les α-amylases sont également considérées comme des glycoprotéines renfermant 478 acides aminés répartis en 2 domaines globulaires appelés A (1-380 résidus) et B (381-478 résidus) .Ces domaines sont associés par une chaîne polypeptidique constituée principalement de résidus hydrophobes. La partie glucidique est formée essentiellement de mannose, les résidus constituant le site de fixation du substrat ainsi que ceux constituant le site catalytique sont localisés dans le domaine A qui montre que l' α-amylase est formée de 8 feuillets β plissés et de 8 hélices α (Chiba, 1988 et Burhan, 2003).
Le mécanisme d'action de l' α-amylase nécessite la participation de 3 fonctions du site
actif impliquant un attaquant nucléophile, un stabilisateur de la charge positif de l'atome attaqué et un donneur de proton au groupe déplacé ; ceci signifie que le rupture de la liaison osidique fait intervenir une série d'échanges d'électrons et de protons entre certains résidus de l'enzyme et du substrat. Les groupes impliqués dans la réaction du site actif sont deux acides carboxyliques et un noyau imidazole (Parkc et al., 1997).
Ce mécanisme est une caractéristique de l'enzyme dans les conditions expérimentales telles que la T°, pH, taille et d'action des α-amylases :
Attaque aléatoire: l’α-amylase hydrolyse aléatoirement les liaisons glucosidiques,
libérant deux fragments qui seront séparément attaqués.
Attaque préfèrée : l' α-amylase montre une préférence pour certaines liaisons dans le
substrat.
Attaque répétitive ou multiple : elle implique le déplacement de l'enzyme tout au
long de la chaine du substrat, pour hydrolyser les liaisons glucosidiques sans se dissocier du substrat (Berry et Paterson, 1990).
Figu re 3 : Héli 21 ce d'amylos se (Chiba, 1988) L’α-amylase
L’α-amylase
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Les modalités d'action des enzymes dépendent de leur origine ; elles hydrolysent les
liaisons α (1→ 4) de l'amylose et l'amylopectine de l'amidon (l’amylose 25-30% et
l'amylopectine 70-75%) (Fig.3), à l'exclusion des liaisons terminales de ces chaînes (Parkc et al., 1997).
L'attaque aléatoire de l' α-amylase sur l'amylose conduit à une dégradation rapide du
substrat en maltose et en maltotriose, avec une absence de coloration iodique de l'amylase. Alors que pour le cas de l'amylopectine, en plus du glucose, du maltose et du maltotriose il persiste des dextrines limites contenant des ramifications en α (1→ 6) (Parkc et al., 1997).
2.5. Les différentes sources de l’α-amylase
Les α-amylases peuvent avoir plusieurs sources : animale, végétale ou microbienne:
L'origine animale
Les amylases d'origine animale sont généralement extraites à partir de la salive et du pancréas des mammifères (French, 1975). Les α-amylase animales sont incapables d'hydrolyser la liaison α (1→ 6) de l'amylopectine ou du glycosyl oligosaccharides, l'hydrolyse complète de l'amylose et de l'amylopectine par les α-amylases animales donne respectivement du maltose et du D-glucose pour l'amylose et du glucose, maltose et des dextrines limites pour l'amylopectine (Coolbear et al., 1992).
L'origine végétale
Les α-amylases végétales possèdent une importance primordiale dans le métabolisme
glucidique où elles participent à la conversion de l'amidon en le réduisant en sucres réducteurs qui sont la source énergétique nécessaire à la germination et elles sont généralement incapable d'hydrolyser le maltose (Octávio et al., 2000).
Ces enzymes végétales sont synthétisées par un mécanisme cellulaire compliqué (Fig.4), au cours de la germination des graines qui requiert une activité enzymatique très importante pour la mobilisation des réserves et le développement de l'embryon (Brawn et al., 1993).
F Figure 4: B Biosynthèse 23 de l’α-amy ylase (Braw wn et al., 19 L’α 993). -amylase
L’α-amylase
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L'origine microbienne
L' α-amylase fongique
La production industrielle d'enzymes à partir des microorganismes fongiques, parmi les genres Aspergillus et Penicillium, existe depuis longtemps du fait que la première production d' α-amylase a été réussie par Takamine en 1894. L'α-amylase fongique est d'une thermostabilité assez faible, son optimum d'action se situe entre 50°C et 55°C (Fogarty et al., 1994).
L' α-amylase bactérienne
Ce type d'enzyme est obtenu principalement par fermentation de Bacillacées (Milner et
al., 1997). Historiquement la première enzyme a été produite à partir de souches de Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis (Bousseboua, 2002) ou B. subtilis fermentant en surface (Mctigue et al., 1995).
De nombreuses amylases aux propriétés industrielles ont été découvertes chez des bactéries acidophiles, alcalinophiles et thermophiles. Ces enzymes interviennent dans la transformation de l'amidon par fragmentation rapide en clivant les liaisons α (1→4) (Nadirman et al.2006).
2.6. Caractéristiques de l’α-amylase
Pour qu’une enzyme réponde aux exigences potentielles en vue d’une production industrielle, il est nécessaire de déterminer les propriétés de cette enzyme. Selon Sicard (1982), le poids moléculaire de la majorité des α –amylases apparaît être de l'ordre de 50.000 Dalton (Berry et Paterson, 1990). Chaque molécule contient un ion calcium , grâce au gel de filtration sephadex deux fractions peuvent être obtenues, le composant le plus rapide à un PM de 50.000 Dalton et le plus lent à un PM 100.000 Dalton (Mercier, 1982). Une autre étude, réalisée sur l' α-amylase d'origine bactérienne par la même méthode, montre que l'enzyme est
un tétramère contenant du Zn++ et possèdant une masse moléculaire d’environ 96.000 Dalton
(Kim et al,1995).
Selon Bakri (2003), la température optimale des amylases fongiques varie selon leur origine et se situe entre 30 et 40°C avec une faible thermostabilité. Les amylases microbiennes, quant à elles, ont une forte thermostabilité (30°C–60°C) et leur température optimale peut être plus élevée, se situant entre 40°C et 70°C et (Park et al., 1997).
L’α-amylase
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Tableau 5: Exemples de production de l'α-amylase par des microorganismes et leurs propriétés physico-chimiques Microorganisme T° OPT. OPT.pH P.M. (DALTON) PI Références Bactéries
Bacillus sp 60 11-12 96.000 - Kim etal. ,(1995) Bacillus Subtilis - - 59.000 - Brumm et al.,(1991)
Moisissures
Aspergillus awamori 50 4.8-5.0 54.000 4.2 Bhella et altosar (1985) Aspergillus flavus 55 6.0 52.500 - Khoo et al., (1994) Aspergillus fumigatus 40 5.5 65.000 - Plancho colona, (1995) Aspergillus oryzae 50 4.5-5.0 59.000 - Kundu and Das (1970) Penicillium expansum 60 4.5 64.000 - Doyle et al.,(1989) Rhizopus sp 60-65 4.0-5.6 64.000 - Vayssier et al., (1990)
Levures Saccharomycopsis
cerevisiae
L’α-amylase
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Le pH optimal de l' α –amylase est pratiquement acide entre 4,8 – 6,5 (Larpent et al., 1992) . Cet intervalle varie selon l'origine de l’enzyme, les α –amylases fongiques ont des pH optimums faibles (4,0 – 5,0) (Tableau 5).
2.6.1. L'amidon, substrat naturel de l' α-amylase
L'amidon est une macromolécule glucidique présente chez de nombreux végétaux, notamment dans les organes de réserve comme le tubercule de pomme de terre et dans les graines (blé, maïs, riz, etc.) où il constitue une forme de stockage du glucose. Il s'agit d'un polyoside de structure moléculaire proche de celle du glycogène, forme de stockage du glucose rencontrée chez les animaux et certaines microorganismes (Nadirman et al., 2006).
Dans la molécule d'amidon comme dans celle de glycogène, des unités de glucose reliées par des liaisons osidiques alpha 1-4 formant des chaînes hélicoïdales d’amylose, sur lesquelles de courtes chaînes de même constitution se branchent par des liaisons osidiques alpha 1-6 (Mercier, 1982).
Dans l'amidon, les ramifications sont présentes environ tous les trente résidus glucose tandis que dans le glycogène, elles sont présentes environ tous les dix résidus. En présence d'iode, l'amidon se colore en bleu violet alors que le glycogène se colore en brun acajou (Berry et Paterson, 1990).
2.6.2. Effet des ions métalliques
Les amylases sont des métalloprotéines absolument dépendantes du Ca2+ qui est
vraisemblablement un activateur allostérique (Egas et al., 1998). Le calcium ne participe pas directement à la formation de complexe enzyme-substrat mais il maintient l'enzyme dans une conformation optimale pour un maximum d'activité et de stabilité vis à vis de la dénaturation thermique (Savcheko et al., 2002 ;Peixoto-Nogueira et al., 2008) et de la dénaturation acide vis à vis de la protéolyse (Nigam et al.,1995, Mctigue et al., 1995).
L'activité enzymatique de l' α-amylase n'est pas modifiée par les ions K+, Na+, NH4+ mais elle est fortement inhibée par l’EDTA et les métaux lourds (Igarashi et al., 1998 ; Talamond et al., 2002 ).
L’α-amylase
27 2.7. Production de l’α-amylase
Traditionnellement, les enzymes microbiennes sont produites par culture en couche mince en surface sur un milieu liquide solide ou semi solide. Cette technique est encore utilisée pour quelques productions, en particulier celles d’enzymes d’origine fongique telles que les amylases et les protéases d’Aspergillus et de Mucor ou les pectinases de Penicillium. Mais les contrôles de température, d’aération, de pH et d’humidité présentent des difficultés (Bel´en et al., 2006).
La production d'enzymes à partir de micro-organismes se fait généralement en fermentation liquide ou submergée dans des fermenteurs agités, de tailles diverses, jusqu’à plus de 300 mètres cubes (Niehaus et al., 1999). Ce procédé de fabrication est aujourd'hui majoritairement utilisé par les principaux producteurs d'enzymes car il est particulièrement bien adapté à la fermentation des bactéries aérobies. Ces microorganismes permettent la production d'amylases, de protéases, de cellulases et d’autres enzymes bactériennes constituant une grande partie du marché des enzymes (Pascal et Thomas, 1990).
Appliquée aux micro-organismes fongiques, cette technique de fermentation liquide ou submergée présente certains inconvénients : le développement naturel sous forme mycélaire des micro-organismes fongiques provoque une augmentation de la viscosité, préjudiciable à la solubilisation de l'oxygène dans le milieu. Pour faire face à ce problème, une agitation mécanique est généralement mise en place mais à l'insu de la qualité du mycélium (Bel´en et al., 2006)
La fermentation du milieu liquide est beaucoup mieux adaptée aux microorganismes
fongiques du genre Penicillium : (P. urticae, P. roseo-citreum, P. spiculosporum, P.
chlorophaeum, P. citreo-rodeum, P. purpurogenum, P. aurantio-griaeum,P. brunneo-rubrum) pour la production de l’α-amylase avec un rendement d’activité de 6 à 10 U/ml (Espine et al., 2009).
Le substrat de fermentation utilisé est principalement formé de déchets organiques comme la pulpe de betterave (Baldwin et al., 1986), de déchets d’oranges (Diomi et al., 2008, Mahmoud et al., 1998 et Hart et al.,1991) ou des produits céréaliers (Pascal et Thomas, 1990 ).
L’α-amylase
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2.8. Immobilisation de l’α-amylase
L’une des voies importantes et prometteuses de la bio-ingénierie dans l’industrie
agroalimentaire est l’emploi d’enzymes immobilisées (Shimizu et al., 1979).
L’immobilisation des enzymes est l'une des technologies la plus importante utilisée dans l'alimentation, la production pharmaceutiques et la biotechnologie. L’immobilisation d’une enzyme consiste en sa rétention dans une phase insoluble, par liaison chimique ou rétention physique (Siva et al., 2006).
Actuellement, de très nombreuses méthodes d’immobilisation intéressant plus de 100 enzymes ont été développées dans le but d'étendre le champ d’ applications industrielles de ces catalyseurs, pour leur utilisation en continu ou pour en assurant leur réutilisation et l'augmentation de leur stabilité, en facilitant le contrôle de l’action des enzymes (Tee et Kaletunç, 2009 ; Hernaiz et al., 2000).
L’intérêt d’utiliser des enzymes immobilisées dans des bioréacteurs tient essentiellement à leur récupération plus facile que celle des enzymes solubles, dans le cas d’un fonctionnement par cycles ou la possibilité de leur utilisation en continu. Toutefois, dans la plupart des procédés industriels et d’après Teotia et al., (2001) les enzymes sont mélangées dans une solution avec des substrats et ne peut être économiquement récupéré qu’après l'épuisement des substrats (Hamilton et al., 1999).
Cet usage unique est évidemment tout à fait inutile lorsque le coût des enzymes est considéré. Ainsi, il ya une incitation à utiliser des enzymes sous forme immobilisée ou insoluble, de sorte qu'’elles peuvent être conservées dans un réacteur biochimique pour catalyser d'autres flux ultérieurs. L'exploitation d'une enzyme immobilisée dans un procédé enzymatique en mode continu rend son utilisation plus favorable (Wu et al., 1998).
De nombreuses méthodes existent pour l'immobilisation des enzymes, parfois appelée insolubilisation d’enzyme (Wu et al., 1998). La majorité des méthodes peuvent être classées en quatre catégories principales: l’inclusion dans une matrice, la micro- encapsulation, l'adsorption et la liaison covalente. Parmi ces méthodes, l’inclusion dan un gel d’alginate de sodium est au cœur de cette expérience.
L’α-amylase
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Tableau 6: Principales méthodes d’immobilisation d’enzymes (Tumturk et al., 2007)
Immobilisation par rétention
physique
Inclusion
-Dans une matrice constituée par le réseau tridimensionnel d’un gel ou d’un polymère.
Confinement
-Dans une microcapsule délimitée par une membrane semi-perméable (micro-encapsulation).
-Dans une fibre creuse.
Immobilisation par liaison
chimique
Fixation sur un support
-Par adsorption par des liaisons faibles (Inter actions ioniques)
-Par liaisons covalentes.
Réticulation
-Etablissement d’un réseau par liaisons cov intermoléculaires.
L’α-amylase
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Outre la fuite des enzymes, l’inconvénient lié à la méthode de l'immobilisation est la
résistance de transfert de masse des substrats, des produits et des inhibiteurs car le diamètre
moyen d'un cordon de type de gel imprégné d’enzymes est beaucoup plus grand par rapport à la longueur de diffusion moyenne, le substrat ne peut pas diffuser en profondeur dans la matrice de gel comme dans tout autre catalyseur conventionnel non biologique immobilisé (Zaborsky et al., 1973). En même temps, la résistance diffusionnelle rencontrée par les molécules de produits peut parfois pousser le produit à s'accumuler près du centre du gel à un niveau élevé et indésirable, conduisant à une inhibition de certaines enzymes.
Ainsi, idéalement le réseau de réticulation doit être assez gros pour que le passage du substrat et des molécules de produits et la sortie du faisceau de gel soient aussi libres que possible (Raviyan et al., 2003). Pour cette raison, la rétention n'est pas appropriée pour les cas particuliers où le substrat a un poids moléculaire élevé, tel qu'il ne peut facilement se déplacer librement dans la matrice de gel (Yagar et al., 2008).
Contrairement aux méthodes d'adsorption et de liaison covalente, la plupart des réactions de polymérisation à l'origine de réticulation et de formation de gel dans les méthodes de rétention ne concerne pas directement la formation de liaisons entre les supports d'appui et les molécules d'enzymes (Yakup et al., 2006).Ces obligations changent la conformation de la
protéine enzymatique et modifient les propriétés des enzymes (Martino et al., 1999) étant
donné que les molécules d'enzymes ne participent pas à la réaction de polymérisation dans les méthodes de piégeage. Les techniques d’immobilisation peuvent être appliquées avec succès à un large éventail d'enzymes avec seulement des modifications mineures entre les différentes enzymes (Zaborsky et al., 1973 ; Ramkrisshna et al., 1993).
Méthodes d’immobilisation
Les méthodes d’immobilisation sont nombreuses. Les principales sont résumées dans le (Tableau 6).
Inclusion dans une matrice
L’enzyme est emprisonnée dans le réseau tridimensionnel d’un polymère insoluble, très souvent le polyacrylamide ou l’alginate.
Inclusion dans l’alginate.
L’alginate est un polyoside formant une solution visqueuse en présence de cations
monovalents comme le sodium .En présence de cations divalents comme le calcium, il forme un gel.
L’α-amylase
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Ainsi l’immobilisation de l’ α-amylase a été aussi l’objet de recherche de plusieurs
auteurs soit : Immobilisation par technique de réticulation ou « Cross linked polyacrylamide gel », « Covalent binding to the surface of sepharose gel », « beads activated by cyanogen bromide (CNBr) » et « Entrapment within calcium alginate beads ». (Sadhukhan et al.,1993); (Bickerstaff, 1997) ;(Gargi ,2002); (Siva et al.,2006).
La préparation des billes d'alginate comporte le mélange des solutions d'alginate de sodium et l’α-amylase dans la suspension, suivie de l'égoutté dans la solution de chlorure de calcium pour former un gel (Sadhukhan et al., 1993). L’inclusion physique d'alginate de calcium à pH 5-6 et à une température de 20 à 60 °C a permis les conditions optimales d’α-amylase immobilisée (Dey et al., 2000 ; Saiyavit et al., 2002).
Les billes d’un diamètre de 2 mm ont produit la vitesse de réaction la plus rapide comparée à celles de 3, 4, et 5 mm (Dey et al., 2000).
Le processus physique d'inclusion exige que l'enzyme immobilisée doit être une molécule assez grande et maintenue à l'intérieur de la matrice de gel mais le substrat et le produit doivent être assez petits pour passer par les pores du gel (Galazzo et Bailey, 1990). 2.9. Les applications industrielles et biotechnologiques de l'α- amylase
Les α- amylases microbiennes sont parmi les enzymes les plus utilisées dans les
procédés industriels:
Utilisation des α- amylases dans les industries Agro-alimentaires
Glucoserie
La principale industrie utilisatrice de l'α- amylase est la glucoserie qui, à partir d'un substrat complexe, l'amidon, développe un nombre important de transformations faisant appel aux enzymes, parmi lesquelles les α- amylases bactériennes ou fongiques qui sont utilisées pour la dégradation de l’amidon (Martin et al., 2003).
L’α-amylase
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La sucrerie
L' α- amylase est utilisée pour faciliter les opérations d'extraction et de raffinage du saccharose à partir de la betterave ou de la canne à sucre pour éliminer des traces d'amidon gênant la purification .De plus, des α- amylases fongiques sont très utilisées pour la préparation des sirops sucrés à base d'amidon de maïs et de sirops de chocolats (Martin et al., 2003).
Panification et biscuiterie
L’usage de l’alpha amylase « améliorant de panification » est devenue une pratique de fabrication machinal dans l’industrie panaire, non seulement pour améliorer la qualité du pain mais aussi pour contrôler le processus, de fabrication ce qui conduit à un gain en temps et en énergie. Cette industrie emploie les α- amylases fongiques d’A. oryzae pour la régulation des activités diastasiques des farines en dégradant l'amidon en maltose. Cette opération favorise la formation de la mie souple en boulangerie et améliore la texture des gâteaux pâtissiers et des biscuites (Malhotra et al., 2002).
Industrie des boissons
Dans ce secteur l' α- amylase fongique intervient essentiellement dans la
fabrication d'alcool éthylique, de boissons sucrées non alcoolisées, de jus de fruits (Mamo et al., 1999). En brasserie, elle permet d'obtenir des bières sans dextrines, dites bières à basses colories .
Utilisation des α- amylases dans le domaine industriel
Les α-amylases sont aussi utilisées dans l'industrie textile pour le désencollage des tissus ainsi que dans les domaines de la tannerie, de la papeterie (Teodoro et al., 2000) et des détergents pour les lessives où elles facilitent la disparition des tâches en dégradant les souillures, permettant ainsi l'augmentation du pouvoir blanchissant. Elles sont utilisées aussi dans le traitement des eaux résiduaires pour l’élimination de l'amidon (Malhotra et al., 2002).
L’α-amylase
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Autres applications des α- amylases
Dans le domaine médical
L'augmentation du taux des α- amylases dans le sang peut témoigner d'une pancréatite
aiguë et se rencontre également dans certains cancers digestifs et dans les oreillons (Lo et al., 2001) , elles sont donc employées en diagnostic médical pour détecter certaines maladies.
Dans le domaine pharmaceutique
Les α- amylases fongiques sont utilisées comme :
Aide digestif pour éviter les dyspepsies et les fermentations
intestinales par exemple : Danilase (Yihan et al., 2010).
Agent anti-inflammatoire en soutenant le traitement antibiotique (Lo et al.,
2001).
2.10. Substrat de fermentation : (La pulpe) de déchets d’oranges
L’agriculture et les industries agroalimentaires rejettent quotidiennement des masses importantes de sous-produits généralement considérés comme sources de pollution (déchets organiques, paille, son, boue de clarification du papier, eaux résiduaires de certaines industries alimentaires...) (Diomi et al., 2008). Aussi, la récupération et la valorisation de ces sous-produits à des fins alimentaires peut constituer une alternative intéressante. Il s’agit de la production des enzymes (Tableau 7), des métabolites intermédiaires et la création de biomasse sous forme de protéines d’organismes unicellulaires ‘P.O.U’.
Dans notre pays, les possibilités de la valorisation énergétique de la biomasse sont offertes par les produits agricoles de faible valeur commerciale, les liquides résiduels des industries agro-alimentaires, les résidus de récoltes, les déjections animales et les boues résiduaires. Une part importante des recherches expérimentales dans le domaine de la valorisation des sous-produits a touchée à la production de biomasse à haute valeur biologique. Parmi les avantages des techniques de la biotransformation, on peut citer la réduction des quantités de sous-produits , ce qui permet d’atténuer les problèmes de pollution et d’améliorer les rendements.
L’α-amylase
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Tableau 7: L'utilisation de déchets d'oranges pour la production de quelques enzymes par des microorganismes
Enzyme RéferencesMicroorganisme
xylanases Penicillium janthinellum CRC Oliveira et al. (2006)
pectinases Fusarium oxysporum F3 Fonseca et al. (1994)
Polygalacturonase Neurospora crassa DSM 1129 Mamma, et al. (2008)