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Dx EBV ASSAY
96 37021
Détection quantitative directe du virus d'Epstein-Barr par PCR en temps réel
EBV_rB0414
1. USAGE PRÉVU
Le test Dx EBV Assay se destine à la quantification in vitro de l'ADN génomique du virus d'Epstein-Barr dans les échantillons de plasma et de sang total humain avec un contrôle simultané de la réaction d'extraction/d'amplification par le biais d'un contrôle interne (IC).
Le test Dx EBV Assay est standardisé par rapport au standard international de l’organisation mondiale de la santé (OMS) du virus Epstein Barr (code NIBSC 09/260) pour exprimer les charges virales en unités internationales (UI/ml).
Le test Dx EBV Assay est validé pour une utilisation avec l’instrument Dx Real-Time System et le logiciel associé Dx Real-Time software.
Grâce à la procédure d'extraction et d'amplification commune de l'acide nucléique, la quantification virale Epstein-Barr à l'aide du test Dx EBV Assay peut être effectuée simultanément avec d'autres analyses quantitatives de la gamme des tests Dx transplant Panel.
2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST
Le virus d'Epstein-Barr est un herpèsvirus commun qui infecte plus 90 % de la population mondiale, laissant la majorité des personnes avec une infection silencieuse qui dure toute la vie. Bien que la majorité des infections EBV soient asymptomatiques, chez des individus au système immunitaire compromis comme des patients VIH ou des personnes ayant bénéficié d'une greffe, le virus est le facteur majeur de prédisposition au développement d'un vaste éventail de syndromes lymphoprolifératifs à lymphocytes B (lymphome de Burkitt, carcinome du rhinopharynx et lymphomes hodgkiniens et non hodgkiniens).
Le génome du virus d'Epstein Barr est une molécule linéaire à ADN double-brin d'environ 175 kb. Il encode une série de produits interagissant ou présentant une homologie avec une grande variété de molécules anti-apoptotiques, des cytokines et des transducteurs de signal, favorisant ainsi l'infection EBV, l'immortalisation et la transformation.
Il est crucial de détecter le virus EBV tôt pour assurer un traitement efficace et un complément thérapeutique par immunosuppresseurs, pouvant conduire à la régression de la pathologie proliférative.
Les stratégies de traitement des syndromes lymphoprolifératifs post-greffe associés à un EBV comprennent la réduction de l'immunosuppression souvent efficace en cas de greffe d'organe solide, l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-lymphocytes B, la chimiothérapie conventionnelle et la radiothérapie. Les thérapies courantes des lymphomes non hodgkiniens associés au EBV incluent la chimiothérapie et la radiothérapie.
Il a été démontré que les analyses moléculaires telles que les analyses par PCR en temps réel constituent un outil utile pour le diagnostic d'une primo-infection EBV du fait de la sensibilité élevée, la spécificité, l'aisance d'utilisation et la rapidité de cette méthode.
La mesure quantitative d'ADN du virus Epstein-Barr est essentielle pour différencier l'infection de faible niveau de porteurs sains de l'infection de haut niveau d'une maladie associée au EBV.
3. PRINCIPE DU TEST
Le test Dx EBV Assay se compose de deux étapes principales : la préparation des échantillons et l'amplification/détection de l'ADN cible par PCR en temps réel. Les produits d'amplification sont détectés par colorants fluorescents pendant la réaction PCR en temps réel. La phase de PCR en temps réel permet d'amplifier et de détecter l'ADN du virus Epstein-Barr, collecté pendant la phase d'extraction de l'échantillon biologique examiné. Pendant la PCR en temps réel, les produits d'amplification sont détectés et quantifiés par rapport à une courbe caractéristique à l'aide de colorants fluorescents.
Un contrôle interne (IC) est systématiquement extrait, amplifié et détecté avec chaque échantillon, ce qui permet de vérifier la procédure d'extraction et la présence d'éventuels inhibiteurs de la PCR dans l'échantillon.
Grace au contrôle interne (IC) commun utilisé durant l’étape d’extraction, les échantillons extrait issus d’une même matrice (plasma ou sang total) peuvent être utilisés d'autres analyses quantitatives de la gamme des tests Dx transplant Panel.
Préparation des échantillons
L’extraction automatisée et l'extraction manuelle de l’ADN sont réalisées sur tous les types d'échantillons indiqués dans le chapitre « Recueil et manipulation des échantillons » par l’instrument NucliSens® easyMAG® System ou la trousse Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit conformément aux notices d'instructions des fabricants (respectivement bioMérieux et QIAGEN).
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Un contrôle négatif (NC) est soumis à l'ensemble de la procédure de préparation de l'échantillon avec les autres échantillons.
Le contrôle interne (IC) est ajouté à chaque échantillon et au contrôle négatif au début de la procédure de préparation des échantillons.
Amplification et détection par PCR en temps réel
Le test Dx EBV Assay est validé pour une utilisation avec l'instrument Dx Real-Time System (Bio-Rad).
Après extraction, le mélange d’amplification et les extraits d’ADN sont distribués manuellement dans les Dx 24-Well PCR Strips.
Au cours de la PCR en temps réel, des sondes oligonucléotidiques fluorescentes spécifiques sont utilisées pour détecter l’ADN en s’hybridant avec les amplicons générés durant la phase d’amplification. Le test Dx EBV Assay utilise deux types de sondes oligonucléotidiques différentes : [1] la sonde EBV ciblant le fragment de gêne du génome viral et [2] la sonde du contrôle interne permettant un contrôle de la procédure d’extraction et la mise en évidence d’inhibiteurs de PCR.
En l’absence d’ADN cible pour une sonde oligonucléotidique donnée, la fluorescence correspondante n’est pas émise et ne donne donc lieu à aucune détection de signal. Lorsque l’ADN cible est présent, l’intensité de la fluorescence augmente en même temps que la quantité d’amplicons à chaque cycle d’amplification. Pendant l'étape d’élongation, le module optique de l'instrument Dx Real-Time System mesure la fluorescence obtenue à partir de chaque fluorophore et le logiciel associé Dx Real- Time Software trace l’intensité de la fluorescence en fonction du nombre de cycles. En fin d’expérience, le logiciel Dx Real-Time Software analyse automatiquement les résultats pour l’ensemble des échantillons, les standards de quantification et les contrôles.
4. RÉACTIFS
4.1. Description
Les réactifs sont fournis en quantité suffisante pour réaliser 96 tests. Tous les réactifs sont destinés à un usage exclusif de diagnostic in vitro.
Étiquette Description Présentation
AM Amplification Mix Mélange d'amplification concentré (bleu)
ADN polymérase en tampon PCR contenant : amorces, sondes spécifiques fluorescentes, dNTPs, MgCl2
Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
2 x 150 µl À diluer avec DIL
DIL Amplification Mix Diluent Diluant du mélange d'amplification (blanc) Tampon PCR contenant du MgCl2
Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
2 x 645 µl Prêt à l'emploi
IC Internal Control Contrôle interne (jaune)
ADN non infectieux en tampon Tris-HCl-EDTA.
Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
1 x 1 600 µl Prêt à l'emploi
NC Negative Control Contrôle négatif (vert) Tampon Tris-HCl-EDTA.
Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
2 x 1 100 µl Prêt à l'emploi
PC Positive Control Contrôle positif (rouge)
ADN non infectieux contenant une séquence d'EBV en tampon Tris-HCl-EDTA.
Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
1 x 600 µl Prêt à l'emploi
QS1 Quantification Standard
Standard de quantification (marron)
ADN non infectieux contenant une séquence d'EBV en tampon Tris-HCl-EDTA. Concentration : 100 000 copies/µl Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
1 x 600 µl Prêt à l'emploi
QS2 Quantification Standard Standard de quantification (marron)
ADN non infectieux contenant une séquence d'EBV en tampon Tris-HCl-EDTA. Concentration : 1000 copies/µl Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
1 x 600 µl Prêt à l'emploi
QS3 Quantification Standard
Standard de quantification et référence pour l’ajustement de la courbe (orange)
ADN non infectieux contenant une séquence d'EBV en tampon Tris-HCl-EDTA. Concentration : 100 copies/µl Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
2 x 600 µl Prêt à l'emploi
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QS4 Quantification Standard Standard de quantification (marron)
ADN non infectieux contenant une séquence d'EBV en tampon Tris-HCl-EDTA. Concentration : 10 copies/µl Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300
1 x 600 µl Prêt à l'emploi
4.2. Conditions de stockage et de manipulation
La trousse Dx EBV Assay doit être conservée congelée à -18 °C/-22 °C. Conservé à cette température, chaque réactif peut être utilisé jusqu’à la date de péremption figurant sur son emballage.
Identification Conservation après ouverture
Contrôle négatif (NC) 2 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 2 fois.
Jeter tout réactif contaminé.
Contrôle positif (PC) 4 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 4 fois.
Jeter tout réactif contaminé.
Contrôle interne (IC) 4 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 4 fois.
Jeter tout réactif contaminé.
Standards de quantification (QS1, QS2, QS3, QS4)
2 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 2 fois.
Jeter tout réactif contaminé.
Mélange reconstitué (AM+DIL)
2 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 2 fois.
Le mélange reconstitué ne peut subir qu'un cycle de congélation/décongélation.
5. MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS Pour le diagnostic in vitro uniquement.
5.1. Précautions liées à la santé et la sécurité
• Porter des gants jetables, des blouses de laboratoire et des lunettes de protection lors de la manipulation des réactifs et échantillons.
• Se laver soigneusement les mains après manipulation des réactifs et échantillons. Ne pas manger, boire ou fumer dans les espaces de travail dédiés.
• Manipuler tous les échantillons comme s’ils étaient potentiellement infectieux conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire.
• Tout produit chimique doit être manipulé et éliminé conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire.
• La fiche de données de sécurité est disponible sur demande auprès de votre agent Bio-Rad.
5.2. Précautions liées à la procédure
• Cette trousse est validée pour une utilisation avec le Dx Real-Time System (réf. Bio-Rad # 94000) et son logiciel Dx Real- Time Software uniquement.
• L’extraction d'ADN doit être réalisée avec la trousse bioMérieux NucliSens® easyMAG® System ou la trousse Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit conformément à la notice d'instructions (bioMérieux, QIAGEN).
• Ne pas utiliser de réactifs périmés.
• A l’exception du contrôle interne (IC), ne pas échanger, mélanger ou associer des réactifs provenant de trousses portant des numéros de lots différents.
• Ne pas modifier la procédure d'analyse.
• Éviter toute contamination croisée au cours des étapes de manipulation des échantillons : s'assurer que les contenants des échantillons ne sont pas au contact l'un de l'autre ; en cas de contact des gants avec l'échantillon, les changer immédiatement.
• Utiliser un nouvel embout de filtre pour chaque échantillon.
• Utiliser des microtubes et embouts de filtre exempts de DNase et RNase.
• Reconstituer soigneusement le mélange d’amplification en évitant toute contamination.
• Vérifier les pipettes et les autres équipements pour garantir leur précision et leur bon fonctionnement.
• Éviter de renverser les échantillons ou les solutions contenant les échantillons. Les éclaboussures doivent être rincées à l’eau de Javel diluée à 10 %. Le matériel utilisé pour le nettoyage devra être jeté dans un container spécial pour déchets contaminés.
• Les surfaces de travail, les pipettes et les autres équipements doivent être régulièrement décontaminés à l’eau de Javel diluée à 1 %.
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• Zones de travail : dans le laboratoire, deux zones dédiées doivent être utilisées de manière unidirectionnelle pour les étapes de préparation des échantillons et d'amplification / détection :
1. La zone de pré-amplification est dédiée à : (a) la préparation des contrôles et échantillons et (b) la configuration de la PCR (pipetage du mélange d'amplification, des contrôles et des échantillons sur les Dx 24-Well PCR Strips). Ces deux étapes doivent être réalisées dans deux zones distinctes de la zone de pré-amplification.
2. La zone d'amplification est dédiée à la réaction de PCR en temps réel. Tous les réactifs, équipements et blouses de laboratoire utilisés dans une zone doivent rester dans cette zone et ne jamais pénétrer dans une autre zone. Ne jamais transférer des produits d'amplification ou un équipement de la zone d'amplification dans la zone de pré- amplification.
6. RECUEIL ET MANIPULATION DES ÉCHANTILLONS
Les échantillons doivent être recueillis et transportés conformément aux instructions de laboratoire et la législation locale applicable au transport de matériel dangereux et infectieux.
Les échantillons doivent être prélevés et transportés le plus rapidement possible et en fonction de leur usage spécifique final.
Les échantillons doivent être clairement identifiés avec des codes et des noms pour éviter toute interprétation erronée des résultats.
Échantillons de plasma :
Le sang total doit être collecté dans des tubes EDTA conformément aux directives du laboratoire.
Conserver le sang total prélevé à température ambiante et séparer le plasma des cellules par centrifugation (environ 1 200 g pendant au moins 10 minutes à température ambiante) dans les 2 heures suivant le prélèvement. Le plasma qui n'est pas traité directement après son arrivée doit être conservé à +2 °C/+8 °C pendant une semaine au maximum. Si la période de conservation doit être plus longue, conserver le plasma à -18 °C/-22 °C.
Le plasma doit être envoyé au laboratoire à température ambiante de préférence (+18 °C/+25 °C) ou à +2 °C/+8 °C.
Lorsque des échantillons congelés sont utilisés, décongeler les échantillons juste avant la phase d'extraction pour éviter la dégradation de l'acide nucléique.
Échantillons de sang total:
Le sang total doit être collecté dans des tubes EDTA conformément aux directives du laboratoire.
Ne pas conserver au-delà de 6 heures le sang total prélevé à température ambiante (+18°C/+25°C) ou +2°C/+8°C. Pour une conservation plus longue, conserver le sang total à -18 °C/-22 °C.
Le sang total doit être envoyé au laboratoire à température ambiante de préférence (+18 °C/+25 °C) ou à +2 °C/+8 °C.
Lorsque des échantillons congelés sont utilisés, décongeler les échantillons juste avant la phase d'extraction pour éviter la dégradation de l'acide nucléique.
7. PROCÉDURE
7.1. MATÉRIEL NÉCESSAIRE 7.1.1 Matériel fourni
• Dx EBV Assay (réf. 37021)
7.1.2. Matériel nécessaire vendu séparément
• Dx Real-Time System et accessoires (Bio-Rad, réf. 94000)
• Dx Strip Cap Tool (fourni dans le pack Dx Real-Time System Bio-Rad, réf. 94000)
• Dx 24-Well PCR Strips (réf. 94020) 7.1.3. Équipement nécessaire non fourni
Pour l'extraction à l'aide de NucliSens® easyMAG® system
• Instrument NucliSens® easyMAG®, réactifs et consommables de bioMérieux: easyMAG® Extraction Buffers 1, 2 et 3 (réf. # 280130, 280131, 280132), easyMAG® Magnetic Silica (réf. 280133), easyMAG® Lysis Buffer (réf. 280134), easyMAG® Disposables (réf. 280135), embouts Biohit (réf. 280146) et (en option) strip 8 wells (réf. 278303).
• Centrifugeuse de paillase pour microtubes de 1,5 ml et 2 ml
• Agitateur type « Vortex ».
• Microtubes à bouchon vissé hermétiques de 1,5 ml ou 2 ml à fond arrondi
• Pipettes réglables calibrées p 10 or p 20, p 100 ou p 200 et p1000 µl
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• Embouts de pipette stériles avec filtre
• Eau distillée pour usage Biologie Moléculaire
• En option : tampon phosphaté (PBS)
• Gants jetables non poudrés
Pour l'extraction avec la trousse QIAamp® DNA Mini Kit
• QiAamp® DNA Mini Kit, 250 (réf.# 51306), réactifs et consommables supplémentaires de Qiagen : Protéinase K (2 x 2 ml, réf. 19131 ou 1 x 10 ml, réf. 19133), tampon AL (1 x 216 ml, réf. 19075) et tubes de 2 ml de collecte (réf. 19201)
• Centrifugeuse de plateau pour microtubes de 1,5 ml et 2 ml
• Agitateur type « Vortex ».
• Éthanol 96-100 %
• En option : tampon phosphaté (PBS)
• Bloc de chauffage pouvant atteindre 56 °C
• Pipettes réglables calibrées p10 ou p20, p100 ou p200 et p1000 µl.
• Embouts de pipette stériles avec filtre
• Microtubes à bouchon vissé hermétiques de 1,5 ml ou 2 ml à fond arrondi
• Gants non poudrés
7.2. PRÉPARATION ET STOCKAGE DES RÉACTIFS
7.2.1 Pour l'extraction avec l'instrument NucliSens® easyMAG® system
La plateforme NucliSens® easyMAG® est conçue pour l'isolation automatisée de l'acide nucléique total (ADN/ARN) des échantillons biologiques.
La conservation du tampon de lyse entre 2 et 8 °C peut entraîner l'apparition de cristaux en raison de la concentration élevée en sel. Les cristaux doivent être dissouts avant l'emploi.
S'assurer que NucliSens® easyMag® Buffer 2 et 3 sont à température ambiante avant de commencer la procédure.
Après leur chargement dans la zone des réactifs de l'instrument, tous les tampons sont stables jusqu'à 1 mois à température ambiante.
Une fois ouverte, la silice magnétique doit être conservée entre 2 et 8 °C pendant 14 jours au maximum.
Pour l'extraction des échantillons de plasma, la silice magnétique doit être diluée avec de l'eau distillée tel qu'indiqué au point 9 de la section 7.3.2 et doit être utilisée immédiatement.
Pour plus d'informations, se référer au manuel d'utilisation NucliSens® easyMAG®.
7.2.2 Pour l'extraction avec la trousse Qiagen®
La trousse QIAamp® DNA Mini Kit est conçue pour la purification de l'ADN total des fluides corporels en utilisant le principe de la centrifugation.
Tampon AW1 : Avant la première utilisation, ajouter de l'éthanol (96-100 %) comme indiqué sur le flacon. Le tampon AW1 préparé est stable pendant 1 an s'il est conservé fermé à température ambiante.
Tampon AW2 : Avant la première utilisation, ajouter de l'éthanol (96-100 %) comme indiqué sur le flacon. Le tampon AW2 préparé est stable pendant 1 an s'il est conservé fermé à température ambiante.
Pour plus d'informations, se référer au manuel d'utilisation de la trousse Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit.
7.2.3 Reconstitution du mélange d'amplification
Avant la reconstitution, les tubes de mélange d’amplification (AM) et de diluant du mélange d’amplification (DIL) doivent être décongelés et vortexés 5 secondes, puis centrifugés pendant 15 secondes.
Ajouter 645 μl de diluant du mélange d’amplification (DIL) dans un tube de mélange d’amplification concentré (AM). Vortexer pendant 10 secondes puis centrifuger brièvement.
Un tube de mélange d’amplification reconstitué (AM+DIL) suffit à réaliser 48 réactions par PCR en temps réel. Préparer autant de tubes de mélange d'amplification reconstitué que nécessaire (par exemple 2 tubes pour 96 tests).
Le mélange d’amplification reconstitué (AM+DIL) peut être utilisé immédiatement ou conservé à –20 °C durant 2 mois. Chaque tube peut être utilisé deux fois. Le mélange reconstitué ne peut subir qu'un cycle de congélation/décongélation.
Le mélange d’amplification (AM) et le mélange d’amplification reconstitué (AM+DIL) sont sensibles à la lumière. Ne pas exposer à une forte exposition de lumière.
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7.3. Mode opératoire
Suivre strictement ces instructions et appliquer les Bonnes Pratiques de Laboratoire.
7.3.1. Extraction automatisée d'ADN avec NucliSENS® easyMAG® (bioMérieux)
1. Avant toute utilisation, suivre les instructions fournies dans le manuel du fabricant pour la préparation des réactifs et des équipements.
2. Déterminer le nombre d'échantillons à analyser et utiliser un microtube à bouchon vissé par échantillon plus un microtube pour le contrôle négatif (NC). Étiqueter chaque microtube.
3. Laisser les échantillons se stabiliser à température ambiante.
Mode opératoire pour les échantillons de plasma 4. Régler l'instrument sur General Protocol
REMARQUE : Utiliser le Protocole spécifique B si les matrices Plasma et sang total sont extraites en même temps 5. Volume de plasma de l'échantillon = 500 µl
6. Volume d'élution = 55 µl
7. Type d’échantillon = Primaire, avec incubation de la lyse
8. Ajouter 500 µl d'échantillon dans un rack jetable adapté (8 échantillons par rack).
9. Placer le rack jetable à l'emplacement prévu à cet effet sur l'instrument.
10. Démarrer la phase de distribution automatique avec une incubation sur l’instrument (10 minutes).
REMARQUE : lorsque les matrices Plasma et sang total sont extraites en même temps (Protocole spécifique B) les 10 minutes d’incubation des échantillons de plasma sont à réaliser hors de l’instrument « off-board ».
11. Durant la phase de lyse, préparer le pré-mélange comme suit :
Réactifs pour extraction de plasma 1 test 12 tests 24 tests
Silice magnétique 50 µl 600 µl 1 200 µl
Eau distillée 50 µl 600 µl 1 200 µl
Contrôle interne (IC) 6 µl 72 µl 144 µl
Le pré-mélange doit être utilisé immédiatement. Le pré-mélange restant doit être jeté.
12. Ajouter 100 µl de pré-mélange dans chaque échantillon. Mélanger l'échantillon avec la pipette électronique Biohit réglée sur le programme 3.
13. Redémarrer l'instrument en phase automatique (40 minutes).
Transférer dans les 30 minutes et avec précaution l'échantillon purifié dans un microtube à bouchon vissé de 1,5 ml propre en évitant tout contact avec la silice.
L'ADN extrait transféré peut être conservé à température amiante pendant 2 heures ou entre 2 et 8 °C jusqu'à 4 jours. Si la conservation doit être plus longue, l'ADN extrait peut être conservé à -20 °C pendant 6 mois.
Procedure for Whole Blood Samples
1. Régler l’instrument sur « Specific B Protocol » 2. Volume de sang total = 200µl
3. Volume d’élution = 40µl
4. Type d’échantillon = Primaire, sans incubation de l’étape de lyse 5. Placer le rack jetable à l'emplacement prévu à cet effet sur l'instrument.
6. Démarrer la phase de distribution du Tampon de Lyse
7. Durant l’étape de distribution du Tampon de Lyse, préparer le pré-mélange comme suit :
Réactif pour extraction de sang total 1 test 12 tests 24 tests
Silice magnétique 100µl 1200 µl 2400 µl
Tampon de Lyse 600µl 7200 µl 14400 µl
Contrôle interne (IC) 6µl 72 µl 144
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8. Ajouter 200 µl d’échantillon au Tampon de lyse dans un rack jetable adapté (8 échantillons par rack) et mélanger par des allers retours pipette.
9. Ajouter 700 µl de PreMix à chaque échantillon. Mélanger l'échantillon avec la pipette électronique Biohit réglée sur le programme 3.
10. Redémarrer l'instrument en phase automatique (60 minutes).
Transférer, dans les 30 minutes et avec précaution l'échantillon purifié dans un microtube à bouchon vissé de 1,5 ml propre en évitant tout contact avec la silice.
L'ADN extrait peut être conservé à température amiante pendant 2 heures ou entre 2 et 8 °C jusqu'à 4 jours. Si la conservation doit être plus longue, l'ADN extrait peut être conservé à -20 °C pendant 6 mois.
Mode opératoire pour extraction simultanée du plasma et sang total :
PARAMETRAGE DE L’INSTRUMENT Specific B protocol
Type échantilon = Primaire
Le volume échantillon dépend de la matrice de l’échantillon (se référer à la section spécifique ci-dessus) Le volume d’élution dépend de la matrice de l’échantillon (se référer à la section spécifique ci-dessus)
Lancer la série SANS l’étape d’incubation (Pour la matrice Plasma, l’incubation de l’étape de lyse se fait hors de l’instrument) Hors instrument « off-board »
Sang total Plasma
Etape 1 - Ajouter 500µl de plasma aux emplacements dédiés du rack
Dans l’instrument « off-board ».
Etape 2 Placer le rack jetable à l'emplacement prévu à cet effet sur l'instrument
Etape 3 Démarrer la phase de distribution du Tampon de Lyse
Hors instrument « off-board »
Etape 4 Durant l’étape 3 de distribution du Tampon de Lyse par l’instrument, préparer le pré-mélange comme indiqué dans la section ci-dessus
Etape 5 A la fin de l’étape 3 retirer le rack approprié
Etape 6 Ajouter 200µl de sang total au bon emplacement du rack et mélanger par des allers retours pipette
Incubation de la Lyse à température ambiante (10 min)
Etape 7 Ajouter le pre-Mix spécifique (700µl) au mélange
“échantillon+ Tampon de lyse”
Ajouter le pre-Mix spécifique (100µl) au mélange
“échantillon+ Tampon de lyse”
Dans l’instrument « on-board »
Etape 8 Placer le rack jetable à l'emplacement prévu à cet effet sur l'instrument Etape 9 Mélanger les échantillons avec la pipette électronique Biohit réglée sur le programme 3.
Etape 10 Démarrer l'instrument (60min)
Transférer, dans les 30 minutes et avec précaution l'échantillon purifié dans un microtube à bouchon vissé de 1,5 ml propre en évitant tout contact avec la silice.
L'ADN extrait peut être conservé à température amiante pendant 2 heures ou entre 2 et 8 °C jusqu'à 4 jours. Si la conservation doit être plus longue, l'ADN extrait peut être conservé à -20 °C pendant 6 mois.
7.3.2. Extraction manuelle d'ADN avec la trousseQIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen)
1. Avant toute utilisation, suivre les instructions fournies dans le manuel du fabricant pour la préparation des réactifs.
2. Déterminer le nombre d'échantillons à analyser et utiliser un microtube à bouchon vissé par échantillon plus un microtube pour le contrôle négatif. Étiqueter chaque microtube.
3. Laisser les échantillons se stabiliser à température ambiante.
4. Chauffer un bloc de chauffage à 56 °C.
5. Si un précipité s'est formé dans le tampon AL, le dissoudre par incubation à 56 °C.
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Mode opératoire pour les échantillons de plasma
6. Ajouter 40 µl de protéinase K (PK) dans le fond de chaque microtube à bouchon vissé de 1,5 ml.
REMARQUE : Ne pas ajouter de protéinase K directement dans le tampon AL.
7. Ajouter 400 µl d'échantillon dans le microtube à bouchon vissé de 1,5 ml.
8. Ajouter 400 µl de tampon AL dans l'échantillon. Vortexer brièvement pendant 15 secondes.
9. Ajouter 6 µl de contrôle interne (IC) fourni avec Dx EBV Assay.
10. Incuber à 56 °C pendant 10 minutes.
11. Centrifuger brièvement pour enlever les gouttes à l'intérieur du couvercle.
12. Ajouter 400 µl d'éthanol 96-100 % à l'échantillon, mélanger et vortexer pendant 15 secondes puis centrifuger brièvement pour éliminer les gouttes à l'intérieur du couvercle.
13. Transférer prudemment 620 µl du mélange dans la colonne QIAamp sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 6 000 g (8000 tr/min.) pendant 1 minute. Placer la colonne centrifuge QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat.
14. Répéter l'étape 13 en transférant le volume restant du mélange.
15. Ajouter prudemment 500 µl de tampon AW1 dans la colonne QIAamp sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 6 000 g (8 000 tr/min.) pendant 1 minute. Placer la colonne QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat.
16. Ajouter prudemment 500 µl de tampon AW2 dans la colonne sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 20 000 g (14 000 tr/min.) pendant 3 minutes.
17. Placer la colonne QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat. Centrifuger à plein régime pendant 1 minute.
18. Placer la colonne QIAamp dans un microtube à bouchon vissé de 1,5 ml propre et jeter le tube contenant le filtrat.
19. Ouvrir la colonne QIAamp et ajouter 50 µl de tampon AE. Incuber à température ambiante (18-25 °C) pendant 1 minute et centrifuger à 6 000 g (8 000 tr/min.) pendant 1 minute.
20. Jeter la colonne QIAamp.
L'ADN extrait peut être conservé à une température comprise entre 2 et 8 °C pendant 4 jours ou à -20 °C pendant 6 mois.
Mode opératoire pour les échantillons de sang total
1. Ajouter 20 µl de protéinase K (PK) dans le fond de chaque microtube à bouchon vissé de 1,5 ml.
REMARQUE : Ne pas ajouter de protéinase K directement dans le tampon AL.
2. Ajouter 200 µl d'échantillon dans le microtube à bouchon vissé de 1,5 ml.
3. Ajouter 200 µl de tampon AL dans l'échantillon. Vortexer brièvement pendant 15 secondes.
4. Ajouter 6 µl de contrôle interne (IC) fourni avec Dx EBV Assay.
5. Incuber à 56 °C pendant 10 minutes.
6. Centrifuger brièvement pour enlever les gouttes à l'intérieur du couvercle.
7. Ajouter 200 µl d'éthanol 96-100 % à l'échantillon, mélanger et vortexer pendant 15 secondes puis centrifuger brièvement pour éliminer les gouttes à l'intérieur du couvercle.
8. Transférer prudemment le mélange dans la colonne QIAamp sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 6 000 g (8000 tr/min.) pendant 1 minute. Placer la colonne centrifuge QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat.
9. Ajouter prudemment 500 µl de tampon AW1 dans la colonne QIAamp sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 6 000 g (8 000 tr/min.) pendant 1 minute. Placer la colonne QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat.
10. Ajouter prudemment 500 µl de tampon AW2 dans la colonne sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 20 000 g (14 000 tr/min.) pendant 3 minutes.
11. Placer la colonne QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat. Centrifuger à plein régime pendant 1 minute.
12. Placer la colonne QIAamp dans un microtube à bouchon vissé de 1,5 ml propre et jeter le tube contenant le filtrat.
13. Ouvrir la colonne QIAamp et ajouter 100 µl de tampon AE. Incuber à température ambiante (18-25 °C) pendant 1 minute et centrifuger à 6 000 g (8 000 tr/min.) pendant 1 minute.
14. Jeter la colonne QIAamp.
L'ADN extrait peut être conservé à une température comprise entre 2 et 8 °C pendant 4 jours ou à -20 °C pendant 6 mois.
9 [FR]
7.3.3 Courbe standard
Les standards de quantification (QS1 à QS4), fournis avec Dx EBV Assay, doivent être inclus dans chaque première analyse d'un nouveau lot de kit pour générer une courbe standard dans le logiciel Dx Real-Time Software.
La courbe standard enregistrée (pente, R2) est valide pendant 6 mois et le standard de quantification (QS3) issu du même lot de kit doit être utilisé comme calibrateur dans les analyses suivantes.
REMARQUE : S'assurer que les conditions de stockage du QS3 sont strictement appliquées telles que décrites dans la section 4.2.
Si la valeur Ct QS3 entre dans le critère d'acceptabilité, la courbe standard enregistrée sera repositionnée au niveau de à la valeur QS3.
7.3.4. Amplification et détection par PCR en temps réel
Se référer au manuel d’utilisation du logiciel Dx Real-Time Software pour plus de détails.
Chaque analyse doit inclure un contrôle négatif et un contrôle positif et les standards de quantification nécessaires.
Dans la zone de pré-amplification :
1. Reconstituer les tubes de mélange d'amplification tels que nécessaires en suivant la procédure dans la section 7.2.3 (numéro de test = n échantillons + 1 contrôle positif + 1 contrôle négatif et les standards de quantification nécessaires).
2. Prendre le nombre requis de Dx 24-Well PCR Strips, les placer sur un support puis à l'aide du pipette répétitive, distribuer prudemment 15 µl de mélange d'amplification reconstitué (AM+DIL) dans chaque puits.
3. Ajouter 10 µl d'ADN extrait ou de contrôle négatif extrait (NC) ou de contrôle positif non extrait (PC) et le standard de quantification nécessaire (QS1 à QS4, ou uniquement QS3) dans les puits correspondants, en suivant le schéma de plaque établi.
4. Placer Dx 8-Cap Strips sur Dx 24-Well PCR Strips et fermer correctement.
5. Centrifuger Dx 24-Well PCR Strips pendant 30 secondes à 400 g pour éviter les bulles dans les puits.
Dans la zone d'amplification :
6. Allumer l’ordinateur puis le Dx Real-Time System. Ouvrir le logiciel Dx Real-Time Software. Saisir votre nom d'utilisateur et cliquer sur « Setup ».
7. Cliquer sur « create a new plate » et sélectionner le nom du kit PCR dans « PCR kit ». Se référer au support local pour plus d'informations sur le nom du kit PCR.
8. Cliquer sur le bouton « Run », puis sur « Open Lid ».
9. Charger Dx 24-Well PCR Strips dans Dx Real-Time System et utiliser Dx Strip Cap Tool pour fixer Dx 8-Cap Strips.
10. Cliquer sur le bouton « Close lid », puis cliquer sur le bouton « Start run ».
11. Cliquer sur « Results » pour afficher les résultats.
À la fin de la réaction de PCR en temps réel, ôter Dx 24-Well PCR Strips de l'instrument, les placer dans un sac en plastique hermétique et les jeter conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire.
8. CALIBRATION
Pendant chaque cycle PCR, à l'étape d'hybridation, le module optique Dx Real-Time System mesure la fluorescence obtenue de chaque fluorophore et le logiciel associé Dx Real-Time Software calcule l'intensité de la fluorescence par rapport au nombre de cycles.
Une fois que l'essai a été effectué pour une plaque, le logiciel Dx Real-Time Software analyse automatiquement les données de fluorescence et interprète les résultats de la série en se fondant sur les règles d'interprétation du test. L'analyse des résultats du test Dx EBV Assay se fonde sur la valeur Ct.
Ct se définit comme la fraction du nombre de cycle de PCR à laquelle la fluorescence soustraite du bruit de fond coupe la ligne de seuil défini pour chaque séquence d'acide nucléique détectée dans l'analyse. Dans la plage de quantification du test, la valeur Ct est inversement proportionnelle à l'algorithme du nombre de copies de la séquence-cible dans l'échantillon avant l'amplification : plus la valeur Ct est élevée, plus le nombre initial de copies est faible.
Pour chaque échantillon, les valeurs du paramètre mathématique déterminant sont calculées pour les courbes PCR et s'affichent à côté de l'interprétation et du (des) message(s) d'alerte. Si une courbe PCR n'indique pas d'amplification significative, un « * » s'affiche à la place de valeur numérique.
10 [FR]
9. CONTRÔLE QUALITÉ Contrôles positifs et négatifs
Il est nécessaire d’inclure dans chaque série un contrôle positif et un contrôle négatif, afin de détecter toute anomalie potentielle au cours des étapes de traitement des échantillons, d'amplification ou de détection.
Si les valeurs Ct des contrôles ne se situent pas dans l’intervalle attendu, le logiciel Dx Real-Time Software invalide la série entière et affiche l’un des messages d’alerte suivants :
* Contrôle négatif :
Message Signification
Invalid_IC Contrôle interne non valide EBV_conta Contamination par l'ADN de l’ EBV
* Contrôle positif :
Message Signification
EBV_out Valeur de la cible EBV en dehors de l’intervalle attendu
Si l’un de ces messages apparaît, toute la série concernée doit être ré-analysée.
Courbe standard
Pour la quantification des échantillons, tous les standards de quantification (QS) fournis dans la trousse Dx EBV Assay doivent être inclus dans l'analyse pour créer une courbe de calibration standard (première série).
* Courbe standard (QS1 à QS4) :
Critères d'acceptabilité
Pente -3,9 < pente < -3,1
Corrélation (R2) R2 > 0,98
Si les valeurs sont en dehors des critères d'acceptation, toute l'analyse PCR doit être ré-analysée en commençant avec une nouvelle série de test PCR.
* Standard de quantification (QS3) :
Dans les séries suivantes, seul le standard de quantification (QS3) doit être inclus pour valider la courbe standard effectuée précédemment. Si la valeur Ct du standard de quantification (QS3) ne se situe pas dans l’intervalle attendu, le logiciel Dx Real- Time Software invalide la série entière et affiche l’un des messages d’alerte suivants :
Message Signification
QS_out Valeur du standard de quantification en dehors de l'intervalle attendu
Si la valeur est en dehors de l'intervalle attendu, toute l'analyse PCR doit être ré-analysée en commençant avec une nouvelle série de test PCR.
Détection de l'inhibition : Contrôle interne
Le contrôle interne est ajouté à chaque échantillon et au contrôle négatif au début de l'étape d'extraction d'ADN et est détecté à l’aide d’une sonde spécifique au cours de la réaction de PCR en temps réel.
Les échantillons dont la valeur Ct du contrôle interne est au-delà de la valeur attendue (échantillons potentiellement inhibés) sont interprétés par le logiciel Dx Real-Time Software comme suit :
• Tout échantillon négatif est rapporté comme « Failed » pour cette cible.
• Tout échantillon avec une cible détectable (< LLOQ ou dans l'intervalle de quantification de la cible) est détecté comme
« EBV_POS » pour la cible donnée mais pas quantifiable et accompagné du message d'alerte « Invalid_IC ».
• Tout échantillon présentant une charge virale au-dessus de la limite supérieure de quantification (ULOQ) de la cible est détecté comme « EBV_POS » et accompagné du message d'alerte « > ULOQ ».
Si la valeur Ct du contrôle interne est en dehors des critères d'acceptabilité et, par conséquent, déclaré non valide « Invalid », répéter l'analyse en extrayant et en testant l'échantillon concerné correctement dilué dans le PBS, dans le respect des pratiques courantes de laboratoire pour les diagnostics moléculaires par PCR en temps réel.
Le facteur de dilution de l'échantillon (par ex. : 1/2, 1/10, 1/100) doit être prudemment choisi sur la base de la valeur Ct affichée dans le logiciel Dx Software et doit être inversement proportionnel à la valeur Ct.
11 [FR]
10. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
10.1. Critères de validation du test La série d'analyses est valide si :
• la valeur Ct du contrôle positif est dans la plage attendue pour la cible.
• Le contrôle négatif n'a pas de valeur Ct pour la cible et la valeur Ct du contrôle interne est dans la plage attendue.
• Les valeurs de la courbe standard répondent aux critères d'acceptabilité ou
• La valeur QS3 est dans la plage attendue pour la cible.
Si la série d'analyses est valide, le logiciel Dx Real-Time Software affiche l'état « Passed » pour la série. Sinon, le logiciel Dx Real-Time Software affiche l'état « Failed » pour la série.
Si l'état de la série est « Failed », tous les résultats du test dans cette série possèdent l'état « Invalid » et tous les échantillons et contrôles concernés doivent être retraités tel qu'indiqué dans le chapitre 9.
10.2. Calculs / Interprétation des résultats
Le test Dx EBV Assay est standardisé par rapport au 1er standard international de l’organisation mondiale de la santé (OMS) du virus Epstein Barr (code NIBSC 09/260) pour exprimer les charges virales en unités internationales (UI/ml).
Les résultats sont calculés par le logiciel Dx Real-Time Software, qui détermine automatiquement les valeurs Ct pour l'EBV et pour le contrôle interne dans les échantillons et les contrôles.
Si le test est valide, tous les échantillons (inhibés ou non) contenant un ADN EBV détectable est interprété comme
« EBV_POS » pour la cible donnée par le logiciel Dx Real-Time Software. Toutefois, un échantillon positif accompagné du message « Invalid_IC » ne pourra être quantifié. L'échantillon correspondant devra donc être retraité en commençant par l'étape d'extraction de l'ADN de l'échantillon correctement, dilué dans le PBS tel que décrit dans le chapitre 9.
Le tableau suivant résume les différentes situations pour l'interprétation du test EBV, avec les messages associés et leur signification :
Critère Interprétation
« Résultat » Signification
Message
« Message d'alerte »
VALID Contrôle interne
Échantillon négatif
« EBV_neg » ADN EBV non détecté Aucun
Échantillon positif non titré
« EBV_POS »
ADN EBV en dessous de la limite inférieure de
quantification (LLOQ) < LLOQ Échantillon positif
Titrage en nombre de copies/ml ou UI/ml
« EBV_POS »
ADN EBV égal ou supérieur à la limite inférieure de quantification (LLOQ) et inférieur ou égal à la limite
supérieure de quantification (ULOQ) Aucun
Échantillon positif non titré
« EBV_POS »
ADN EBV supérieur à la limite supérieure de
quantification (ULOQ) > ULOQ
NON VALIDE Internal Control
« Failed » ADN EBV non détecté Invalid_IC
Échantillon positif non titré
« EBV_POS »
ADN EBV détectable mais non quantifiable Invalid_IC
ADN EBV supérieur à la limite supérieure de
quantification (ULOQ) > ULOQ
11. LIMITATIONS DU TEST
• Les performances optimales de ce test dépendent directement de la qualité des échantillons. Il est par conséquent important de se conformer aux indications dans le chapitre « Recueil et manipulation des échantillons ».
• L'analyse doit être réalisée uniquement sur les types d'échantillons indiqués. Les autres types d'échantillons n'ont pas été validés.
12 [FR]
• L'utilisation de ce test est réservée au personnel formé à l'utilisation de la trousse Dx EBV Assay, du Dx Real-Time System et du logiciel Dx Real-Time Software.
• Un résultat négatif n'exclut pas la possibilité d'une infection car les résultats dépendent de plusieurs variables. Un recueil ou une manipulation incorrect(e) des échantillons, la présence d'inhibiteurs ou une erreur technique peut entraîner des résultats erronés.
• Comme pour tous les tests diagnostiques, les résultats de Dx EBV Assay doivent être interprétés en association avec d'autres résultats biologiques ou cliniques.
• Les échantillons contenant des résidus de fibrine ou de grosses particules ou encore des filaments et corps microbiens doivent être jetés étant donné qu'ils sont susceptibles de produire des résultats erronés.
• Les échantillons de plasma hémolysés (rouge) et hyperlipémiques (d'aspect laiteux) doivent être jetés étant donné qu'ils sont également susceptibles de produire des résultats erronés.
• Les échantillons de plasma recueillis dans des tubes contenant de l'héparine comme anticoagulant ne doivent pas être utilisés car l'héparine (>10 UI/ml) influence la réaction par PCR.
• Les performances décrites dans cette trousse ne peuvent être garanties que pour les systèmes d'extraction et l'instrument PCR recommandé.
12. PERFORMANCES DU TEST 12.1. MESURE DE LA PRECISION
12.1.1 Mesure de reproductibilité et de la répétabilité
Un panel d'échantillons constitué d'échantillons négatifs et d'échantillons positifs EBV à différentes concentrations (basse, moyenne et élevée) a été créé et testé en 3 réplications d'extraction dans le cadre de l'étude de précision.
Cette étude a été réalisée avec 2 lots Dx EBV Assay différents (Lot1, Lot2) sur 2 instruments Dx Real-Time System sur une période de 10 jours en 3 séries.
cible EBV : Résultats de précision totaux - Valeur Ct des échantillons positifs
*Reproductibilité
Panel EBV Total Intra-essai
Échantillon
Lot EBV N Ct
moyen SD CV % N Ct
moyen SD CV % Bas (3xLOD) Lot 1 & Lot 2 66 36,75 1,040 2,83 22 36,31 0,478 1,32 Moyen Lot 1 & Lot 2 66 31,35 0,309 0,99 22 31,60 0,291 0,92 Élevé Lot 1 & Lot 2 66 20,98 0,349 1,66 22 21,27 0,111 0,52
*Répétabilité
Panel EBV Total Intra-essai
Échantillon Lot EBV N Ct
moyen SD CV% N Ct
moyen SD CV%
Bas (3xLOD) Lot 1 33 36,13 0,519 1,44 22 36,06 0,538 1,49 Lot 2 33 37,36 1,070 2,86 22 37,87 0,900 2,38
Moyen Lot 1 33 31,36 0,255 0,81 22 31,31 0,231 0,74
Lot 2 33 31,33 0,360 1,15 22 31,11 0,175 0,56
Élevé Lot 1 33 21,14 0,130 0,61 22 21,08 0,091 0,43
Lot 2 33 20,82 0,422 2,03 22 20,59 0,306 1,49
12.2. PERFORMANCE ANALYTIQUE 12.2.1 Limite de détection (LOD)
La limite de détection (LOD) a été déterminée, en tenant compte de la méthode d'extraction, en testant le standard international EBV de l’OMS (code NIBSC 09/260) en plusieurs séries de dilution jusqu’à la concentration limite et au moyen de l'analyse Probit pour retenir la dilution donnant 95 % de réponse positive.
L'analyse statistique (Probit) a été effectuée sur la base des résultats obtenus à partir de 24 répliquats de 6 points de dilution testés au cours de 3 séries différentes (8 répliquats x 3 séries).
13 [FR]
Extraction automatique avec NucliSens® easyMAG® Extraction manuelle QIAamp® DNA Mini Ki
LOD (95 %) = 47,92 IU/ml = 79,07 copies/ml LOD (95 %) = 77,71 IU/ml = 247,8 copies/ml
12.2.2 Spécificité analytique
La spécificité analytique de Dx EBV Assay a été évaluée sur un panel d'échantillons provenant de patients souffrant d'infections causées par des organismes potentiellement interférants fournis par un centre clinique référant.
Pathogènes à réactivité croisée
Pas de réaction croisée observée dans le panel testé.
12.3. PERFORMANCES CLINIQUES
12.3.1 Résultats exprimés en unités internationales
Un facteur de conversion (copies vers Unités Internationales) a été déterminé en testant des dilutions en série du standard international EBV de l’OMS (code NIBSC 09/260) dans un pool de plasma EDTA négatif. Les résultats obtenus en copies/ml peuvent être convertis en unités internationales de l'OMS UI/ml grâce au facteur de conversion (FC) spécialement déterminé pour chaque méthode d'extraction utilisée en association avec la trousse, comme décrit ci-dessous :
Extraction NucliSens® easyMag® Extraction Qiagen®
Facteur de conversion (FC) PLASMA 1,65 3,19
Facteur de conversion (FC) SANG TOTAL 2.05 1.47
La formule de conversion de copies/ml en unités internationales/ml UI/ml est :
Résultats (IU/ml) = nombre de copies/ml / Facteur de conversion
Famille Cible Concentration (copies/ml) Résultat
Virus de l'herpès
CMV 10000 Pas de réaction croisée
VZV 10000 Pas de réaction croisée
HHV6 10000 Pas de réaction croisée
HHV8 1000 Pas de réaction croisée
HSV1 100000 Pas de réaction croisée
HSV2 100000 Pas de réaction croisée
Polyomavirus JCV 10000 Pas de réaction croisée
BKV 100000 Pas de réaction croisée
Virus de l'hépatite HBV 1000000 Pas de réaction croisée
HCV 1000000 Pas de réaction croisée
14 [FR]
12.3.2 Plage dynamique
La plage dynamique du test Dx EBV Assay a été déterminée par la dilution en série du standard international EBV de l’OMS (code NIBSC 09/260) et d’un plasmide, porteur de la séquence-cible d'EBV, dans un pool de plasma EDTA négatif. Sur la base des résultats obtenus de cette étude à l'aide de différentes méthodes d'extraction, la plage dynamique pour Dx EBV Assay est la suivante :
Méthode
d'extraction Plage dynamique (échantillons Plasma) Plage dynamique (échantillons sang total)
NucliSENS®
easyMAG®
250 UI/ml < Plage dynamique < 6 666 667 UI/ml 244 IU/ml < Plage dynamique < 9 760 000 IU/ml 413 copies/ml < Plage dynamique < 11 000 000 copies/ml 500 copies/ml < Plage dynamique < 20 000 000 copies/ml QIAamp®
DNA Mini Kit 250 UI/ml < Plage dynamique < 3 918 495 UI/ml 206 IU/ml < Plage dynamique < 10 300 000 IU/ml 798 copies/ml < Plage dynamique < 12 500 000 copies/ml 303 copies/ml < Plage dynamique < 15 200 000 copies/ml
12.3.3 Sensibilité diagnostique
La sensibilité diagnostique de Dx EBV Assay a été évaluée sur un panel QCMD 2012 également utilisé pour confirmer la charge virale en UI/ml.
Tous les échantillons ont été extraits par extraction automatique NucliSens® easyMAG® (bioMérieux) et avec leQIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN).
QCMD 2012 Extraction Qiagen® Extraction NucliSens®
easyMag® Résultats de référence (copies/ml) N° d'échantillon Résultats
(copies/ml)
Résultats (Log)
Résultats (copies/ml)
Résultats
(Log) (copies/ml) Plage de mesure (Log)
EBV12-01 1570 3,196 POS (<LOQ) 571 2,297 3,217
EBV12-02 13000 4,114 6520 3,814 6310 3,392 4,208
EBV12-03 327000 5,515 179000 5,253 161000 4,84 5,576
EBV12-04 129000 5,111 79400 4,9 65800 4,417 5,219
EBV12-05 46700 4,669 23600 4,373 21400 3,953 4,709 EBV12-06 69000 4,839 37600 4,575 30700 4,105 4,869 EBV12-07 136000 5,134 67200 4,827 62100 4,409 5,177
EBV12-08 7070 3,849 3370 3,528 3180 3,092 3,914
EBV12-09 5210 3,717 2820 3,45 2110 2,908 3,74
EBV12-10 NEG NEG NEG
QCMD 2012 Extraction Qiagen® Extraction NucliSens®
easyMag® Résultats de référence (UI/ml) N° d'échantillon Résultats
(UI/ml) Résultats
(Log) Résultats
(UI/ml) Résultats
(Log) UI/ml Plage de mesure (Log)
EBV12-01 492 2,692 POS (<LOQ) 234 1,862 2,876
EBV12-02 4080 3,61 3950 3,597 4240 3,305 3,949
EBV12-03 103000 5,011 108000 5,035 86500 4,684 5,19
EBV12-04 40400 4,607 48100 4,682 41000 4,375 4,851
EBV12-05 14600 4,166 14300 4,155 14200 3,9 4,406
EBV12-06 21600 4,335 22800 4,358 18800 4,017 4,533
EBV12-07 42600 4,63 40700 4,61 30600 3,982 4,99
EBV12-08 2220 3,346 2040 3,31 2400 2,845 3,917
EBV12-09 1630 3,213 1710 3,233 1120 2,571 3,531
EBV12-10 NEG NEG NEG
12.3.4 Étude clinique
PLASMA
Une étude clinique rétrospective a été effectuée sur des échantillons de plasma provenant de patients transplantés et caractérisés par une trousse commerciale de PCR en temps réel homologuée CE. Les mêmes extraits d'échantillons de plasma (extraction automatique NucliSens® easyMAG®) ont été analysés avec Dx EBV Assay et avec une autre trousse commerciale homologuée CE disponible.
15 [FR]
Analyse qualitative :
Trousse commerciale homologuée CE de référence
NucliSens® easyMAG® Pos Neg
Dx EBV ASSAY
Pos 24 0 24
Neg 0 30 30
Total 24 30 54
Concordance = 100 %
Trousse commerciale homologuée CE
NucliSens® easyMAG® Pos Neg
Dx EBV ASSAY
Pos 24 0 24
Neg 1 29 30
Total 25 29 54
Concordance = 98 %
Tous les échantillons ayant des résultats discordants avaient une charge virale inférieure à la limite de détection (LOD).
Les mêmes échantillons de plasma ont également été extraits avec le système d'extraction manuelle et testés avec la trousse Dx EBV Assay ainsi qu'avec la trousse commerciale de PCR en temps réel homologuée CE, validée avec la même extraction.
Trousse commerciale homologuée CE
Qiagen® DNA mini kit Pos Neg
Dx EBV ASSAY
Pos 24 0 24
Neg 1 29 30
Total 25 29 54
Concordance = 98%
Tous les échantillons ayant des résultats discordants avaient des charges virales inférieures à la limite de détection (LOD).
Analyse quantitative :
Une analyse de corrélation a été effectuée comparant les charges virales (copies/ml) obtenue avec la trousse Dx EBV Assay et deux trousses CE, en tenant compte également de la méthode d'extraction utilisée.
57,(430-0
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*
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*
$ !%
16 [FR]
La corrélation était toujours > 0,95 %
SANG TOTAL
Une étude clinique rétrospective a été effectuée sur des échantillons de sang total provenant de patients transplantés et analysés avec Dx EBV Assay . Tous les echantillons ont été extraits avec NucliSens® easyMAG®) et caractérisés également par une trousse commerciale de PCR en temps réel homologuée CE.
Analyse qualitative:
Trousse commerciale homologuée CE (1)
NucliSens® easyMAG® Pos Neg
Dx EBV Assay Pos 25 1 26
Neg 1 23 24
Total 26 24 50
Concordance = 98%
Les même échantillons positifs en sang total ont été extrait avec la trousse Qiagen (extraction manuelle) puis testes, à l’aide du même extrait, avec les trousses Dx EBV assay et une trousse commerciale de PCR en temps réel homologuée CE.
Trousse commerciale homologuée CE (2)
Qiagen® DNA mini kit Pos Neg
Dx EBV Assay Pos 26 0 26
Neg 0 0 0
Total 26 0 26
Concordance = 100%
2)#(,),%(#+.**
02(#//-+
$
$
17 [FR]
Analyse quantitative
Une analyse de corrélation a été effectuée comparant les charges virales (copies/ml) obtenue avec la trousse Dx EBV Assay et deux trousses CE, en tenant compte également de la méthode d'extraction utilisée.
13. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Monitoring of Epstein-Barr virus DNA load in peripheral blood by quantitative competitive PCR. Stevens SJC, Vervoort MBHJ, van de Brule AJC, Meenhorst PL, Meijer CJLM, and Middeldorp JM. J Clin Microbiol Sept 1999: 2852-2857.
2. Multicenter comparison of different real-time PCR assays for quantitative detection of Epstein-Barr virus. Hayden RT, Hokanson KM, Pounds SB, Bankowski MJ, Belzer SW, Carr J, Diorio D, Forman MS, Joshi Y, Hillyard D, Hodinka RL, Nikiforova MN, Romain CA, Stevenson J, Valsamakis A, and Balfour HH. J Clin Microbiol. Jan 2008: 157-163.
3. Comparison of commercial real-time PCR assays for quantification of Epstein-Barr virus DNA. Ruiz G, Pena P, de Ory F, and Echevarria JE. J Clin Microbiol. May 2005: 2053-2057.
4. Simultaneous quantification of Epstein-Barr virus, Cytomegalovirus, and Human Herpesvirus 6 DNA in samples from transplant recipients by multiplex real-time PCR assay. Wada K, Kubota N, Ito Y, Yagasaki H, Kato K, Yoshikawa T, Ono Y, Ando H, Fujimoto Y, Kiuchi T, Kojima S, Nishiyama Y, and Kimura H. J Clin Microbiol. May 2007: 1426-1432.
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