La PCR en temps réel La PCR en temps réel
Exemple d'utilisation au laboratoire Exemple d'utilisation au laboratoire de Bactériologie de l'hôpital Pellegrin de Bactériologie de l'hôpital Pellegrin
Sabine Pereyre
Sabine Pereyre
PCR conventionnelle
Taq Taq
Dénaturation (95°C)
Hybridation des amorces
Elongation (72°C) 30 - 35 cycles
ADN, amorces, dNTP, Taq pol
PCR conventionnelle
1- Extraction (manuelle ou automatisée) 2- Amplification
3- Révélation : Electrophorèse sur gel d'agarose (1-2%)
Taq Taq
+ -
Cinétique de la PCR
Cinétique de la PCR
Phase exponentielle Phase plateau
- Haute précision pendant la phase exponentielle - Variabilité importante à la phase plateau
PCR en temps réel PCR "classique"
en point final
PCR conventionnelle versus en temps réel
PCR en temps réel
Basée sur la détection d'un "reporter" fluorescent
Signal proportionnel à la quantité d'amplicons
Signal détecté "en temps réel"
1- Extraction (manuelle ou automatisée) 2- Amplification et détection synchronisée
Système fermé, pas de manipulation post-amplification
● Rapidité
● Faible risque de contamination
PCR conventionnelle versus en temps réel
PCR conventionnelle Gel d'agarose
PCR en temps réel
Courbe de fluorescence
PCR en temps réel - Quantification
Valeurs de fluorescence corrélées à la quantité de produit amplifié
Concept de "cycle seuil" (Ct) : base de la quantification
Ct ( Cycle threshold)
= nombre de cycle d'amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent statistiquement significatif par rapport au bruit de fond (valeur seuil).
Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est concentré
Seuil fixé au dessus du bruit de fond
D ér iv ée d e la f lu o re sc en ce
Nbre de cycles
Ct
Quantification – courbes de calibration
Nombre de cycles
Fluorescence émise (UA)
101 106 105 104 103 102
Nombre de copies (log)
Cycle seuil - Ct
Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998
Ct
1Echantillon Inconnu : Ct =25
Génération de la fluorescence
1- Agent se liant à l'ADN double brin :
● STBR Green I
2- Utilisation de sondes
● Hydrolyse de sondes : sondes Taqman
● Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert)
● Molecular Beacons (balises moléculaires)
Principe du SYBR Green I
= Agent intercalant dont l'émission de fluorescence augmente lorsqu'il est lié à l'ADN double brin
hע
FAprès amplification F
ADN double brin
hע
Avant amplification
SYBR Green
Le SYBR Green en solution émet peu de fluorescence
Durant l'élongation, il se fixe sur l'ADN double brin naissant, entraînant une augmentation de la fluorescence
Principe du SYBR Green I
L'émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle d'élongation (l'émission de fluorescence décroît lorsque l'ADN est dénaturé à l'étape suivante)
SYBR Green Avantage - Inconvénients
Avantage
- Economique
- Facile d'utilisation
- Pas d'expertise particulière pour le design de sondes fluorescentes
- Non affecté par des mutations de l'ADN cible (qui affectent l'hybridation des sondes spécifiques)
Inconvénients
- La spécificité repose entièrement sur les amorces
- Faux positifs, surestimation de la quantification (le SYBRgreen se fixe à n'importe quelle molécule d'ADN double brin y compris des produits non spécifiques ex : dimères d'amorces, mauvais appariements)
Analyse de la courbe de fusion indispensable
Analyse de la courbe de fusion
- Chaque produit d'amplification est caractérisé par son Tm (température de fusion = melting temperature)
= température pour laquelle 50% de l'ADN double brin est dissocié
- Le Tm d'un produit d'amplification est mesuré en suivant
l'évolution de la fluorescence lorsque la température augmente
- Deux produits de PCR diffèrent par leur Tm
il est possible de détecter des produits non-spécifiques, des dimères d'amorce
Analyse de la courbe de fusion
Température °C Dérivée de la fuorescence
Tm =87°C
SYBR Green
Nombre de cycles Température °C
Fluorescence
Fluorescence
Courbe de fusion Courbe d'amplification
Ct : quantification Tm : spécificité du produit d'amplification
Génération de la fluorescence
1- Agent se liant à l'ADN double brin
● SYBR Green I
2- Utilisation de sondes
● Hydrolyse de sondes : sondes Taqman
● Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert)
● Molecular Beacons (balises moléculaires)
Sondes Taqman - Principe
Hybridation d'une sonde spécifique Composition de la sonde
● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5' Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein
● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl- rhodamine
pas d'émission de fluorescence
Cette méthode repose sur deux principes :
- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) - l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol
Spécificité des amorces pour la PCR
Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
5’
5’
3’
3’
FP
RP
Reporter Quencher
FAM, VIC TAMRA
Sondes Taqman - Principe
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R Q
Lumière
- FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),
pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte
Sondes Taqman - Principe
- au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’
nucléase coupe la sonde libération du reporter
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
- lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.
La fluorescence est proportionnelle aux taux d'hydrolyse de la sonde hybridée donc à la quantité de produit d'amplification
Sondes Taqman
Avantage :
- Spécificité accrue
Spécificité des primers pour la PCR
Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan - Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents
Inconvénient :
- Impossibilité de réaliser des courbes de fusion
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
● Utilisation de 2 sondes linéaires complémentaires d'une séquence cible - Une sonde marquée en 3' par un marqueur fluorescent, qui émet une fluorescence verte
- Une sonde marquée en 5' par un fluorochrome accepteur, qui émet une fluorescence rouge
● Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible proximité des fluorochromes Transfert d'énergie fluorescence rouge
En solution, bruit de fond de fluorescence verte
Pendant l'hybridation, fluorescence verte
FRET
Dénaturation Hybridation
Elongation
L'acquisition du signal se fait pendant l'hybridation. L'accroissement de fluorescence rouge est proportionnel à la quantité d'ADN synthétisé
Molecular beacons
= sonde d'hybridation en épingle à cheveux appelée balise moléculaire
- Une boucle : séquence complémentaire d'une séquence cible de l'ADN - Deux bras de séquences complémentaires
- Un fluorochrome émetteur (ex : FAM, ROX, TET)
- Un fluorochrome suppresseur, non fluorescent. Il dissipe l'énergie de l'émetteur en chaleur (FRET)
Fluorochrome émetteur Fluorochrome suppresseur = quencher
Molecular beacons
1- Dénaturation
2- Hybridation
3- Elongation
La sonde s'hybride préférentiellement à sa
séquence cible complémentaire sur la matrice
Emission de fluorescence balises libres : pas de fluorescence
Libération de la balise : pas de fluorescence
Molecular beacons
Avantages
- Très spécifique : détections des SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
Si la séquence cible ne correspond pas parfaitement à la balise moléculaire, pas d'hybridation donc pas d'émission de fluorescence (formation en épingle à cheveux thermodynamiquement plus stable)
Inconvénient
- Difficulté du design des sondes d'hybridation
Les appareils de PCR en temps réel
LightCycler (Roche Diagnostics)
Utilisation de fins capillaires en verre permettant une
optimisation des échanges thermiques
Rotor de 32 places
GeneAmp 5700 et Prism 7000 (Applied Biosystems)
GeneAmp 5700 ABI Prism 7000
Réactions en plaque de 96 puits
COBAS Taqman (Roche Diagnostics)
(48 tests)
COBAS Taqman 48
Icycler (BioRad)
Réactions en plaque de 96 puits
MX4000 (Stratagene) et Rotor Gene (Corbett Resesarch)
MX4000 Rotor Gene
SmartCycler (Cepheid)
Tubes réactionnels conçus pour optimiser les échanges thermiques et la sensibilité optique
Chaque tube peut fonctionner avec un programme indépendant
Principaux appareils de PCR en temps réel
Avantages PCR en temps réel /PCR conventionnelle
PCR conventionnelle PCR temps réel Préparation de l'échantillon
(lyse de l'organisme, purification des AN)
Manuel Automatisé
Manuel Automatisé Amplification et détection Plusieurs étapes
Système ouvert
Intégré Simultané Système fermé Système de détection Gels
Radio-isotopes Enzymes
Fluorochromes
Temps d'analyse 4h à 48h 20 min à 2h
Taux de contamination Moyen à fort Faible
Taux de quantification 2-3 log 5-6 log
Reproductibilité Bonne intra-labo Mauvaise inter-labo
Grande (théoriquement)
Traçabilité Détection, enregistrement et
analyses intégrés
Coût Gel : 4-5 euros SYBR Green : 4-5 euros
1- Diagnostic bactériologique
PCR qualitative ou quantitative
2- Etude de la résistance aux AB 3- Typage bactérien (génotypage)
Apport de la PCR en temps réel en Bactériologie
1- Diagnostic bactériologique
Exemple 1: Mycoplasma pneumoniae (TP jeudi)
- Bactérie responsable d'infections respiratoires chez l'enfant et l'adulte jeune
Culture difficile, peu sensible, en 3 semaines
Antibiotiques classiquement utilisés (β-lactamines) inactifs
A Pellegrin
Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic)
PCR en temps réel Taqman sur ABI Prism 7700, gène de l'adhésine P1
Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100ème, 1/1000ème
pur 10-1 10-2 10-3
En rouge : patient positif pour M. pneumoniae Patient
Diagnostic bactériologique
Exemple 2 : Chlamydia trachomatis (TP vendredi)
- Bactérie responsable d'infections génitales souvent inapparentes chez l'homme et la femme. Complications: stérilité féminine
Bactérie intracellulaire culture cellulaire difficile
A Pellegrin
- Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic) - PCR en temps réel Taqman sur COBAS Taqman
Diagnostic bactériologique
Exemple 3 : Neisseria meningitidis (méningocoque)
- Bactérie responsable de méningites graves. Diagnostic et traitement antibiotique sont une urgence vitale.
Nécessité d'une prophylaxie pour l'entourage (AB ou vaccin)
la culture bactérienne nécessite 24 heures
A Pellegrin
- Culture classique
- PCR en temps réel SYBR Green (gène ctrA, Pr de mb externe)
Amplification du gène ctrA de N. meningitidis
Témoin + patient
Témoin + patient
eau
Diagnostic bactériologique à Pellegrin
Germes Gènes Principaux
échantillons Extraction Amplification1 Intérêt M. pneumoniae Adhésine P1
(P de mb) Respiratoires MagNA Pure TaqMan Culture difficile
C. pneumoniae PMP4
(P de mb) Respiratoires MagNA Pure TaqMan Culture
exceptionnelle
C. psittacci IncA (P mb
d'inclusion) respiratoires MagNA Pure Taqman Culture facile mais secteur protégé P3
C. trachomatis Plasmide cryptique
Génitaux
Urine MagNA Pure
-COBAS Amplicor -Taqman (COBAS
Taqman)
Culture difficile (cellulaire)
M. genitalium Adhésine MgPa Génitaux Urine
MagNA Pure SYBR Green puis
Taqman Culture impossible M. tuberculosis (BK) ARNr 16S Respiratoires
LCR, divers Kit COBAS COBAS Amplicor
(PCR ELISA pt final) Culture très lente N. meningitidis ctrA (P de mb
externe) LCR Manuelle2 SYBR Green Diagnostic
d'urgence B. pertussis
B. parapertussis
IS 481
IS 1001 Respiratoires MagNA Pure SYBR Green Culture difficile S.aureus (+/- mecA) Fragment sa442
mecA Souche isolée Manuelle2 SYBR Green Si identification difficile PCR universelle 16S
(pt fragment bactérien) ARNr 16S Prélèvements
divers Manuelle2 ou
MagNAPure SYBR Green Contrôle
d'extraction PCR universelle 16S
(grand fragment) ARNr 16S Souche isolée Manuelle2 ou
MagNAPure SYBR Green Identification bactérienne
1Amplification par PCR en temps réel sauf COBAS Amplicor
2Extraction manuelle avec un tampon de lyse (Triton, Tween, Tris-EDTA) Ebullition 10 min centrifugation surnageant
2- Etude de la résistance aux antibiotiques
Exemple : Etude de la résistance à la clarithromycine chez H.pylori H.pylori : bactérie responsable de l'ulcère gastro-duodénal
Clarithromycine: AB utilisé en association en 1ère intention
Résistance par mutation ponctuelle d'une base de l'ARNr23S, cible de cet AB (20% des souches)
A Pellegrin
PCR en temps réel, FRET sur Lightcycler
FRET: Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible proximité des fluorochromes Transfert d'énergie fluorescence rouge
- S'il y a une mutation sur l'ADN cible, la sonde (rouge) est moins bien hybridée
- Si on augmente la température, elle se détachera plus facilement
Mutation
Réalisation de courbes de fusion
2- Etude de la résistance aux antibiotiques
Mismatch (mutation) Hybridation
parfaite
Température
basse moyenne élevée
Fluorescence Fluorescence si Pas de fluorescence hybridation parfaite
mais pas si mutation
Sauvage ACA AAA
AAG AGA
Mutations
Si mutation, le Tm est plus faible
Technique réalisable directement à partir des biopsies gastriques
3- Typage bactérien
- Typage bactérien : identifier les différents "types" ou les différentes souches d'une espèce bactérienne
- Intérêts nombreux
Ex : identifier une épidémie liée à une même souche
Ex : identifier un type plus virulent, résistant aux AB , etc…
Exemple : typage des souches de méningocoque à Pellegrin - Il existe plusieurs sérogroupes : A, B, C, Y, W135
Des vaccins existent contre les sérogroupes A, C, Y, W135 mais pas contre le sérogroupe B
- Objectif du typage : si diagnostic de N. meningitidis, peut-on vacciner les sujets contacts? Si oui, avec quel vaccin?
Détermination du sérogroupe de N.meningitidis
- Amplification du gène siaD (biosynthèse de la capsule des sérogroupe B, C, Y et W135) ou ou mynB (biosynthèse des polyosides de capsule du sérogroupe A).
- Amorces spécifiques, différentes selon les sérogroupes
- PCR temps réel SYBR Green sur ABI prism 7000 durée 2-3 heures
Recherche du sérogroupe B
Témoin +
patient
Recherche du sérogroupe C
Témoin +
patient
Confirmation : analyse de la courbe de fusion
Témoin +
patient
Recherche du sérogroupe W135
Témoin +
patient
Conclusion
Avantages de la PCR en temps réel
● Automatisation
● Rapidité
● Spécificité
● Sensibilité
● Faible risque de contamination
Place dans un laboratoire de Bactériologie
● Diagnostic de bactéries non ou difficilement cultivable
● Diagnostic d'urgence
● Etude de la résistance aux AB de bactéries difficilement cultivables
● Typage moléculaire
