Dx CMV Assay Détection quantitative directe de l'adn du cytomégalovirus par PCR en temps réel

(1)

Dx CMV Assay

96 37020

Détection quantitative directe de l'ADN du cytomégalovirus par PCR en temps réel

0318

CMV_rA0114

1. USAGE PRÉVU

Le test Dx CMV Assay se destine à la quantification in vitro de l'ADN génomique du cytomégalovirus dans les échantillons de plasma humain avec un contrôle simultané de la réaction d'extraction/d'amplification par le biais d'un contrôle interne (IC).

Le test Dx CMV Assay est standardisé sur la base de la première norme internationale de l'OMS sur les cytomégalovirus humains (code NIBSC 09/162) pour exprimer les charges virales en unités internationales (IU/ml).

Le test Dx CMV Assay est validé pour une utilisation avec l’instrument Dx Real-Time System et le logiciel associé Dx Real-Time software.

Grâce à la procédure d'extraction et d'amplification commune de l'acide nucléique, la quantification du CMV à l'aide du test Dx CMV Assay peut être effectuée simultanément avec d'autres analyses quantitatives de la gamme des tests Dx immunocompromis.

2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST

Le cytomégalovirus humain (HCMV) possède un génome à ADN double-brin linéaire supérieur à 230 kb et constitue le plus répandu des virus de la famille des herpèsvirus.

Au moins 60 % de la population a été exposé au CMV, avec une prévalence supérieure à 90 % dans les groupes à haut risque (par exemple, les fœtus dont les mères contractent une infection au CMV pendant la grossesse ou les personnes infectées par le VIH).

Les données cliniques indiquent que le CMV humain infecte divers tissus et types de cellules, et, par conséquent, est responsable de nombreuses complications cliniques.

En fonction du type de tissu et de la condition immunitaire de l'hôte, le CMV humain opère selon trois modes d'infection : les infections aiguës à croissance rapide, les infections persistantes associées à de faibles niveaux de réplication et les infections latentes qui ne produisent pas de progéniture virale. Le mécanisme de réactivation est inconnu dans son ensemble mais semble être fortement corrélé à un affaiblissement du contrôle immunitaire du virus. Pour cette raison, le CMV est l'un des pathogènes opportunistes les plus communs qui compliquent la prise en charge des patients greffés. Il constitue potentiellement une cause majeure de morbidité et de mortalité. Chez les receveurs d'une greffe d'un organe solide, il cause des effets « directs » et « indirects » incluant le rejet des allogreffes, une baisse de la survie du greffon et du patient, et une prédisposition aux infections opportunistes et aux cancers.

L'infection par CMV se développe généralement durant les premiers mois suivant la transplantation et s'accompagne d'une pathologie infectieuse clinique (par ex. de la fièvre, une pneumonie, des ulcères gastro-intestinaux, une hépatite) et de lésions ou de troubles aigus et/ou chroniques sur le greffon.

Le CMV se trouve dans les sécrétions oropharingées, l'urine, les sécrétions cervicales et vaginales, le sperme, le lait maternel et les dérivés du sang. Le CMV se transmet in utero pendant les 6 premiers mois de vie à compter de l'exposition aux sécrétions génitales de la mère et au lait maternel, et par les sécrétions orales et respiratoires à l'âge préscolaire. Après une infection congénitale, périnatale ou postnatale précoce, le virus peut sommeiller pendant des années dans les fluides corporels.

Le traitement des pathologies du CMV avec des médicaments antiviraux spécifiques, comme le ganciclovir ou le foscarnet réduit la sévérité de la maladie et la mortalité. Des stratégies prophylactiques et préventives ont été développées et visent à éviter les traitements agressifs d'une pathologie établie affectant l'organe final.

La quantification de la charge virale de l'ADN du CMV définit spécifiquement la progression de la pathologie. Les tests basés sur la PCR en temps réel permettent de quantifier l'ADN viral avec précision sans manipuler l'échantillon après la PCR. Ils permettent ainsi de fournir des résultats rapidement et assurent un très faible risque de contamination croisée de l'échantillon analysé.

3. PRINCIPE DU TEST

Le test Dx CMV Assay se compose de deux étapes principales : la préparation des échantillons et l'amplification/détection de l'ADN cible par PCR en temps réel. La phase de PCR en temps réel permet d'amplifier et de détecter l'ADN du cytomégalovirus, collecté pendant la phase d'extraction de l'échantillon biologique examiné. Pendant la PCR en temps réel, les produits d'amplification sont détectés et quantifiés par rapport à une courbe caractéristique à l'aide de colorants fluorescents.

Un contrôle interne (IC) est systématiquement extrait, amplifié et détecté avec chaque échantillon, ce qui permet de vérifier la procédure d'extraction et la présence d'éventuels inhibiteurs de la PCR dans l'échantillon.

(2)

Grace au contrôle interne (IC) commun utilisé durant l’étape d’extraction, les échantillons extrait issus d’une même matrice (plasma ou sang total) peuvent être utilisés d'autres analyses quantitatives de la gamme des tests Dx transplant Panel.

Préparation des échantillons

L’extraction automatisée et l'extraction manuelle de l’ADN sont réalisées sur tous les types d'échantillons indiqués dans le chapitre « Recueil et manipulation des échantillons » par l’instrument et la trousse Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit conformément aux notices d'instructions des fabricants respectifs (bioMérieux, QIAGEN).

Un contrôle négatif (NC) est soumis à l'ensemble de la procédure de préparation de l'échantillon avec les autres échantillons.

Le contrôle interne (IC) est ajouté à chaque échantillon et au contrôle négatif au début de la procédure de préparation des échantillons.

Amplification et détection par PCR en temps réel

Le test Dx CMV Assay est validé pour une utilisation avec l'instrument Dx Real-Time System (Bio-Rad).

Après extraction, le mélange d’amplification et les extraits d’ADN sont distribués manuellement sur les Dx 24-Well PCR Strips.

Au cours de la PCR en temps réel, des sondes oligonucléotidiques fluorescentes spécifiques sont utilisées pour détecter l’ADN en s’hybridant avec les amplicons générés durant la phase d’amplification. Le test Dx CMV Assay utilise deux types de sondes oligonucléotidiques différentes : [1] la sonde CMV ciblant le fragment de gêne du génome viral et [2] la sonde du contrôle interne permettant un contrôle de la procédure d’extraction et la mise en évidence d’inhibiteurs de PCR.

En l’absence d’ADN cible pour une sonde oligonucléotidique donnée, la fluorescence correspondante n’est pas émise et ne donne donc lieu à aucune détection de signal. Lorsque l’ADN cible est présent, l’intensité de la fluorescence augmente en même temps que la quantité d’amplicons à chaque cycle d’amplification. Pendant l'étape d’hybridation, le module optique de l'instrument Dx Real-Time System mesure la fluorescence obtenue à partir de chaque fluorophore et le logiciel associé Dx Real- Time Software trace l’intensité de la fluorescence en fonction du nombre de cycles. En fin d’expérience, le logiciel Dx Real-Time Software analyse automatiquement les résultats pour l’ensemble des échantillons, les standards de quantification (QS) et les contrôles.

4. RÉACTIFS 4.1. Description

Les réactifs sont fournis en quantité suffisante pour réaliser 96 tests.

Tous les réactifs sont destinés à un usage exclusif de diagnostic in vitro.

Étiquette Description PRÉSENTATION

AM Amplification Mix

Mélange d'amplification concentré (bleu)

ADN polymérase en tampon PCR contenant : amorces, sondes spécifiques fluorescentes, dNTPs, MgCl2 Conservateur: 0,03 % ProClin™ 300

2 x 150 µl À diluer avec DIL

DIL Amplification Mix Diluent

Diluant du mélange d'amplification (blanc)

Tampon PCR contenant du MgCl2 Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300

2 x 645 µl Prêt à l'emploi

IC Internal Control

Contrôle interne (jaune)

ADN non infectieux en tampon Tris-HCl-EDTA.

Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300

1 x 1 600 µl Prêt à l'emploi

NC Negative

Control Contrôle négatif (vert)

Tampon Tris-HCl-EDTA.Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300 2 x 1 100 µl Prêt à l'emploi

PC Positive Control

Contrôle positif (rouge)

ADN non infectieux contenant une séquence de CMV en tampon Tris-HCl- EDTA.Conservateur : 0,03 % ProClin™ 300

QS1 Quantification Standard

Standard de quantification (marron)

ADN non infectieux contenant une séquence de CMV en tampon Tris-HCl- EDTA. Concentration : 100 000 copies/µl

1 x 600 µl

Prêt à l'emploi

ADN non infectieux contenant une séquence de CMV en tampon Tris-HCl- EDTA. Concentration : 1 000 copies/µl

Standard de quantification et référence pour la courbe d'ajustement (orange)

ADN non infectieux contenant une séquence de CMV en tampon

Tris-HCl-EDTA. Concentration : 100 copies/µl

ADN non infectieux contenant une séquence de CMV en tampon Tris-HCl- EDTA. Concentration : 5 copies/µl

(3)

4.2. Conditions de stockage et de manipulation

Le test Dx CMV Assay doit être conservé congelé à -18 °C/-22 °C. Conservé à cette température, chaque réactif peut être utilisé jusqu’à la date de péremption figurant sur son emballage.

Identification Conservation après ouverture

Contrôle négatif (NC) 2 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 2 fois.

Jeter tout réactif contaminé.

Contrôle positif (PC) 4 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 4 fois.

Contrôle interne (IC) 4 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 4 fois.

Standards de quantification (QS1, QS2, QS3, QS4)

2 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 2 fois.

Mélange reconstitué (AM+DIL)

2 mois à -18 °C/-22 °C. Chaque tube peut être utilisé 2 fois.

Le mélange reconstitué ne peut subir qu'un cycle de congélation/décongélation.

5. MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS

Pour le diagnostic in vitro uniquement.

5.1. Précautions liées à la santé et mesures de sécurité

• Porter des gants jetables, des blouses de laboratoire et des lunettes de protection lors de la manipulation des réactifs et échantillons.

• Se laver soigneusement les mains après manipulation des réactifs et échantillons. Ne pas manger, boire ou fumer dans les espaces de travail dédiés.

• Manipuler tous les échantillons comme s’ils étaient potentiellement infectieux conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire.

• Tout produit chimique doit être manipulé et éliminé conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire.

• La fiche de données de sécurité est disponible sur demande auprès de votre agent Bio-Rad.

5.2. Précautions d’emploi

• Cette trousse est validée pour une utilisation avec l’instrument Dx Real-Time System (référence Bio-Rad 94000) et son logiciel Dx Real-Time Software uniquement.

• L’extraction d'ADN doit être réalisée avec la trousse bioMérieux NucliSens® easyMAG® ou la trousse Qiagen QIAamp®

DNA Mini Kit conformément aux notices d'instructions des fabricants respectifs.

• Ne pas utiliser de réactifs périmés.

• A l’exception du contrôle interne (IC), ne pas échanger, mélanger ou associer des réactifs provenant de trousses portant des numéros de lots différents.

• Ne pas modifier le mode opératoire.

• Éviter soigneusement toute contamination croisée au cours des étapes de manipulation des échantillons : s'assurer que les contenants des échantillons ne sont pas au contact l'un de l'autre ; en cas de contact des gants avec l'échantillon, les changer immédiatement.

• Utiliser un nouvel embout de filtre pour chaque échantillon.

• Utiliser des microtubes et embouts de filtre exempts de DNase et RNase.

• Reconstituer soigneusement le mélange d’amplification en évitant toute contamination.

• Vérifier les pipettes et les autres équipements pour garantir leur précision et leur bon fonctionnement.

• Éviter de renverser les échantillons ou les solutions contenant les échantillons. Les éclaboussures doivent être rincées à l’eau de Javel diluée à 10 %. Le matériel utilisé pour le nettoyage devra être jeté dans un container spécial pour déchets contaminés.

• Les surfaces de travail, les pipettes et les autres équipements doivent être régulièrement décontaminés à l’eau de Javel diluée à 1 %.

(4)

• Zones de travail : dans le laboratoire, deux zones dédiées doivent être utilisées de manière unidirectionnelle pour les étapes de préparation des échantillons et d'amplification / détection :

1. La zone de préamplification est dédiée à : (a) la préparation des échantillons et contrôles et (b) la configuration de la PCR (pipetage du mélange d'amplification, des contrôles et des échantillons sur les Dx 24-Well PCR Strips). Ces deux étapes doivent être réalisées dans deux zones distinctes dans la zone de préamplification.

2. La zone d'amplification est dédiée à la réaction de PCR en temps réel. Tous les réactifs, équipements et blouses de laboratoire utilisés dans une zone doivent rester dans cette zone et ne jamais pénétrer dans une autre zone. Ne jamais transférer des produits d'amplification ou un équipement de la zone d'amplification dans la zone de préamplification.

6. RECUEIL ET MANIPULATION DES ÉCHANTILLONS

Les échantillons doivent être recueillis et transportés conformément aux instructions de laboratoire et à la législation locale applicable au transport de matériel dangereux et infectieux.

Les échantillons doivent être collectés et transportés dans un laps de temps le plus court possible en fonction de leur usage spécifique final.

Les échantillons doivent être clairement identifiés avec des codes et des noms pour éviter toute interprétation erronée des résultats.

Échantillons de plasma :

Le sang total doit être collecté dans des tubes EDTA conformément aux directives du laboratoire.

Conserver le sang total prélevé à température ambiante et séparer le plasma des cellules par centrifugation (environ 1 200 g pendant au moins 10 minutes à température ambiante) dans les 2 heures suivant le prélèvement. Le plasma qui n'est traité directement après son arrivé doit être conservé à +2 °C/+8 °C pendant une semaine au maximum. Si la période de conservation doit être plus longue, conserver le plasma à -18 °C/-22 °C.

Le plasma doit être envoyé au laboratoire à température ambiante de préférence (+18 °C/+25 °C) ou à +2 °C/+8 °C.

Lorsque des échantillons congelés sont utilisés, décongeler les échantillons juste avant la phase d'extraction pour éviter la dégradation de l'acide nucléique.

7. PROCÉDURE

7.1. MATÉRIEL NÉCESSAIRE 7.1.1 Matériel fourni

• Dx CMV Assay (réf. 37020)

7.1.2. Matériel nécessaire vendu séparément

• Dx Real-Time System et accessoires (Bio-Rad, réf. 94000)

• Dx Strip Cap Tool (fourni dans le pack Dx Real-Time System Bio-Rad, réf. 94000)

• Dx 24-Well PCR Strips (réf. 94020) 7.1.3. Matériel nécessaire non fourni

Pour l'extraction avec le système NucliSens® easyMAG®

• Instrument NucliSens® easyMAG®, réactifs et consommables de bioMérieux : easyMAG® Extraction Buffers 1, 2 et 3 (réf.

# 280130, 280131 et 280132), easyMAG® Magnetic Silica (réf. 280133), easyMAG® Lysis Buffer (réf. 280134), easyMAG® Disposables (réf. 280135), embouts Biohit (réf. 280146) et (en option) strip 8 wells (réf. 278303).

• Centrifugeuse de plateau pour microtubes de 1,5 ml et 2 ml

• Agitateur type « Vortex ».

• Microtubes à bouchon vissé hermétiques de 1,5 ml ou 2 ml à fond arrondi

• Pipettes réglables calibrées p10 ou p20, p100 ou p200 et p1000

• Embouts de pipette stériles avec filtre

• Eau distillée

• En option : Tampon phosphate (PBS)

• Gants non poudrés

(5)

Pour l'extraction avec la trousse QIAamp^® DNA Mini Kit

• QiAamp^® DNA Mini Kit 250 (réf. 51306), réactifs et consommables supplémentaires de Qiagen : Protéinase K (2 x 2 ml, réf.

19131 ou 1 x 10 ml, réf. 19133), tampon AL (1 x 216 ml, réf. 19075) et tubes de prélèvement 2 ml (réf. 19201)

• Centrifugeuse de plateau pour microtubes de 1,5 ml et 2 ml

• Agitateur type « Vortex ».

• Éthanol 96-100 %

• En option : Eau salée à tampon phosphaté (PBS)

• Bloc de chauffage pouvant atteindre 56 °C

• Pipettes réglables calibrées p10 ou p20, p100 ou p200 et p1000 Embouts de pipette stériles avec filtre

• Microtubes à bouchon vissé hermétiques de 1,5 ml ou 2 ml à fond arrondi

• Gants non poudrés

7.2. PRÉPARATION ET STOCKAGE DES RÉACTIFS

7.2.1 Pour l'extraction avec l'instrument NucliSens^®easyMAG^® System

La plateforme NucliSens® easyMAG® est conçue pour l'isolation automatisée de l'acide nucléique total (ADN/ARN) à partir d'échantillons biologiques.

La conservation du tampon de lyse entre 2 et 8 °C peut entraîner l'apparition de cristaux en raison de la concentration élevée en sel. Les cristaux doivent être dissouts avant l'emploi.

S'assurer que NucliSens^® easyMag^® Buffer 2 et 3 sont à température ambiante avant de commencer la procédure.

Après leur chargement dans la zone des réactifs de l'instrument, tous les tampons sont stables jusqu'à 1 mois à conditions ambiantes.

Une fois ouverte, la silice magnétique doit être conservée entre 2 et 8 °C pendant 14 jours au maximum.

Pour l'extraction des échantillons de plasma, la silice magnétique doit être diluée avec de l'eau distillée tel qu'indiqué au point 9 de la section 7.3.2 et doit être utilisée immédiatement.

Pour plus d'informations, se référer au manuel d'utilisation NucliSens^® easyMAG^®.

7.2.2 Pour l'extraction avec la trousse Qiagen^®

La trousse QIAamp® DNA Mini Kit est conçue pour l'épuration de l'ADN total des fluides corporels en utilisant une micro- centrifugeuse.

Tampon AW1 : Avant la première utilisation, ajouter de l'éthanol (96-100 %) comme indiqué sur le flacon. Le tampon AW1 préparé est stable pendant 1 an s'il est conservé fermé à température ambiante.

Tampon AW2 : Avant la première utilisation, ajouter de l'éthanol (96-100 %) comme indiqué sur le flacon. Le tampon AW2 préparé est stable pendant 1 an s'il est conservé fermé à température ambiante.

Pour plus d'informations, se référer au manuel d'utilisation de la trousse Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit.

7.2.3 Reconstitution du mélange d'amplification

Avant la reconstitution, les tubes de mélange d’amplification (AM) et de diluant du mélange d’amplification (DIL) doivent être décongelés et vortexés 5 secondes, puis centrifugés pendant 15 secondes.

Ajouter 645 μl de diluant du mélange d’amplification (DIL) dans un tube de mélange d’amplification concentré (AM). Vortexer pendant 10 secondes puis centrifuger brièvement.

Un tube de mélange d’amplification reconstitué (AM+DIL) suffit à réaliser 48 réactions par PCR en temps réel. Préparer autant de tubes de mélange d'amplification reconstitué (AM+DIL) que nécessaire (par exemple 2 tubes pour 96 tests).

Le mélange d’amplification reconstitué (AM+DIL) peut être utilisé immédiatement ou conservé à –20 °C durant 2 mois. Chaque tube peut être utilisé deux fois. Le mélange reconstitué ne peut subir qu'un cycle de congélation/décongélation.

Le mélange d’amplification (AM) et le mélange d’amplification reconstitué (AM+DIL) sont sensibles à la lumière. Ne pas exposer à une forte exposition de lumière.

7.3. INSTRUCTIONS D'EMPLOI

Suivre strictement ces instructions et appliquer les Bonnes Pratiques de Laboratoire.

7.3.1. Extraction automatisée d'ADN avec NucliSENS^® easyMAG® (bioMérieux)

Avant toute utilisation, suivre les instructions fournis dans le manuel du fabricant pour la préparation des réactifs et des équipements.

Déterminer le nombre d'échantillons à analyser et utiliser un microtube à bouchon vissé par échantillon plus un microtube pour le contrôle négatif. Étiqueter chaque microtube.

(6)

Laisser les échantillons se stabiliser à température ambiante.

Mode opératoire pour les échantillons de plasma 1. Régler l'instrument sur General Protocol 2. Volume de plasma de l'échantillon = 500 µl 3. Volume d'élution = 55 µl

4. Type d’échantillon = Primaire, avec incubation de la lyse

5. Ajouter 500 µl d'échantillon dans un rack jetable adapté (8 échantillons par rack).

6. Placer le rack jetable à l'emplacement prévu à cet effet sur l'instrument.

7. Démarrer la phase de lyse automatique (10 minutes).

8. Durant la phase de lyse, préparer le prémélange comme suit :

Réactif 1 test 12 tests 24 tests

Silice magnétique 50 µl 600 µl 1 200 µl

Eau distillée 50 µl 600 µl 1 200 µl

Contrôle interne (IC) 6 µl 72 µl 144 µl

Le prémélange doit être utilisé immédiatement. Le prémélange restant doit être jeté.

9. Ajouter 100 µl de prémélange dans chaque échantillon. Mélanger l'échantillon avec la pipette électronique Biohit réglée sur le programme 3.

10. Redémarrer l'instrument en phase automatique (40 minutes).

Transférer dans les 30 minutes et avec précaution l'échantillon purifié dans un microtube à bouchon vissé de 1,5 ml propre en évitant tout contact avec la silice.

L'ADN extrait transféré peut être conservé à température ambiante pendant 2 heures ou entre 2 et 8 °C jusqu'à 4 jours. Si la conservation doit être plus longue, l'ADN extrait peut être conservé à -20 °C pendant 6 mois.

7.3.2. Extraction manuelle d'ADN avec la trousse QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen)

1. Avant toute utilisation, suivre les instructions fournies dans le manuel du fabricant pour la préparation des réactifs.

2. Déterminer le nombre d'échantillons à analyser et utiliser un microtube à bouchon vissé par échantillon plus un microtube pour le contrôle négatif (NC). Étiqueter chaque microtube.

3. Laisser les échantillons se stabiliser à température ambiante.

4. Chauffer le bloc de chauffage à 56 °C.

5. Si un précipité s'est formé dans le tampon AL, le dissoudre par incubation à 56 °C.

Mode opératoire pour les échantillons de plasma

6. Ajouter 40 µl de protéinase K (PK) dans le fond de chaque microtube à bouchon vissé de 1,5 ml.

Remarque : Ne pas ajouter de protéinase K directement dans le tampon AL.

7. Ajouter 400 µl d'échantillon dans le microtube à bouchon vissé de 1,5 ml.

8. Ajouter 400 µl de tampon AL dans l'échantillon. Vortexer brièvement pendant 15 secondes.

9. Ajouter 6 µl de contrôle interne (IC) fourni avec Dx CMV Assay.

10. Incuber à 56 °C pendant 10 minutes.

11. Retourner pour enlever les gouttes à l'intérieur du couvercle.

12. Ajouter 400 µl d'éthanol à 96-100 % dans l'échantillon, mélanger en vortexant brièvement pendant 15 secondes. Retourner pour enlever les gouttes à l'intérieur du couvercle.

13. Transférer prudemment 620 µl du mélange dans la colonne centrifuge QIAamp sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 6000 g (8000 tr/min.) pendant 1 minute. Placer la colonne centrifuge QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat.

14. Répéter l'étape 13 en transférant le volume restant du mélange.

15. Ajouter prudemment 500 µl de tampon AW1 dans la colonne centrifuge sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 6000 g (8000 tr/min.) pendant 1 minute. Placer la colonne centrifuge QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat.

16. Ajouter prudemment 500 µl de tampon AW2 dans la colonne centrifuge sans mouiller le bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 20000 g (14 000 tr/min.) pendant 3 minutes.

(7)

17. Placer la colonne centrifuge QIAamp dans un tube de prélèvement propre et jeter le tube contenant le filtrat. Centrifuger à plein régime pendant 1 minute.

18. Placer la colonne centrifuge QIAamp dans un microtube à bouchon vissé de 1,5 ml propre et jeter le tube contenant le filtrat.

19. Ouvrir la colonne centrifuge QIAamp et ajouter 50 µl de tampon AE. Incuber à température ambiante (18-25 °C) pendant 1 minute et centrifuger à 6000 g (8000 tr/min.) pendant 1 minute.

20. Jeter la colonne centrifuge QIAamp.

L'ADN extrait peut être conservé à une température comprise entre 2 et 8 °C pendant 4 jours ou à -20 °C pendant 6 mois.

7.3.3 Courbe standard

Les normes de quantification (QS1 à QS4), fournies avec Dx CMV Assay, doivent être incluses dans chaque première analyse d'un nouveau lot de kit pour générer une courbe standard dans le logiciel Dx Real-Time Software.

La courbe standard enregistrée (pente, R2) est valide pendant 6 mois et un standard de quantification (QS3) issu du même lot de kit doit être utilisé comme calibrateur dans les analyses suivantes.

REMARQUE : S'assurer que les conditions de stockage du QS3 sont strictement appliquées telles que décrites dans la section 4.2.

Si la Ct QS3 entre dans le critère d'acceptabilité, la courbe standard enregistrée sera traduite pour correspondre à la valeur QS3.

7.3.4. Amplification et détection par PCR en temps réel

Se référer au manuel d’utilisation du logiciel Dx Real-Time Software pour plus de détails.

Chaque analyse doit inclure un contrôle négatif et un contrôle positif et les standards de quantification nécessaires.

Dans la zone de préamplification :

1. Reconstituer les tubes de mélange d'amplification tels que nécessaires en suivant la procédure décrite dans la section 7.2.3 (numéro de test = n échantillons + 1 contrôle positif + 1 contrôle négatif et les standards de quantification nécessaires).

2. Prendre le nombre requis de Dx 24-Well PCR Strips, les placer sur un support et, à l'aide du pipeteur répétitif, distribuer prudemment 15 µl de mélange d'amplification reconstitué (AM+DIL) dans chaque puits.

3. Ajouter 10 µl d'ADN extrait ou de contrôle négatif extrait (NC) ou de contrôle positif non extrait (PC) et le standard de quantification nécessaire (QS1 à QS4, ou uniquement QS3) dans les puits correspondants, en suivant le schéma de plaque établi.

4. Placer Dx 8-Cap Strips sur Dx 24-Well PCR Strips et fermer correctement.

5. Centrifuger Dx 24-Well PCR Strips pendant 30 secondes à 400 g pour éviter les bulles dans les puits.

Dans la zone d'amplification :

6. Allumer l’ordinateur puis le Dx Real-Time System. Ouvrir le logiciel Dx Real-Time Software. Saisir votre nom d'utilisateur et cliquer sur « Setup ».

7. Cliquer sur « create a new plate » et sélectionner le nom du kit PCR dans « PCR kit ». Se référer au support local pour plus d'informations sur le nom du kit PCR.

8. Cliquer sur le bouton « Run », puis sur « Open Lid ».

9. Charger Dx 24-Well PCR Strips dans Dx Real-Time System et utiliser Dx Strip Cap Tool pour fixer Dx 8-Cap Strips.

10. Cliquer sur le bouton « Close lid », puis cliquer sur le bouton « Start run ».

11. Cliquer sur « Results » pour afficher les résultats.

À la fin de la réaction de PCR en temps réel, ôter Dx 24-Well PCR Strips de l'instrument Dx Real-Time System, les placer dans un sac en plastique hermétique et les jeter conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire.

8. CALIBRAGE

Pendant chaque cycle PCR, à l'étape d'hybridation, le module optique Dx Real-Time System mesure la fluorescence obtenue de chaque fluorophore et le logiciel associé Dx Real-Time Software calcule l'intensité de la fluorescence par rapport au nombre de cycles.

Une fois que l'essai a été effectué pour une plaque, le logiciel Dx Real-Time Software analyse automatiquement les données de fluorescence et interprète les résultats de lot en se fondant sur les règles d'interprétation du test. L'analyse des résultats du test Dx CMV Assay se fonde sur la valeur Ct.

(8)

La valeur Ct se définit comme la fraction du nombre de cycle de PCR à laquelle la fluorescence soustraite du bruit de fond dépasse le seuil défini de manière empirique pour chaque séquence d'acide nucléique détectée dans l'analyse. Dans la plage de quantification du test, la valeur Ct est inversement proportionnelle à l'algorithme du nombre de copies de la séquence-cible dans l'échantillon avant l'amplification : plus la valeur Ct est élevée, plus le nombre initial de copies est petit.

Pour chaque échantillon, les valeurs du paramètre mathématique déterminant sont calculées pour les courbes PCR et s'affichent à côté de l'interprétation et du (des) message(s) d'alerte. Si une courbe PCR n'indique pas d'amplification significative, un « * » s'affiche à la place de valeur numérique.

9. CONTRÔLE QUALITÉ Contrôles positifs et négatifs

Il est nécessaire d’inclure dans chaque série un contrôle positif et un contrôle négatif, afin de détecter toute anomalie potentielle au cours des étapes de traitement des échantillons, d'amplification ou de détection.

Si les valeurs Ct des contrôles ne se situent pas dans l’intervalle attendu, le logiciel Dx Real-Time Software invalide la série entière et affiche l’un des messages d’alerte suivants :

* Contrôle négatif :

Message Signification

Invalid_IC Contrôle interne non valide

CMV_conta Contamination par l'ADN du CMV

* Contrôle positif :

CMV_out Valeur de CMV hors limite

Si l’un de ces messages apparaît, toute la série concernée doit être ré-analysée.

Courbe standard

Pour la quantification des échantillons, tous les standards de quantification (QS) fournis dans la trousse Dx CMV Assay doivent être inclus dans l'analyse pour créer une courbe standard de calibrage (première série).

* Courbe standard (QS1 à QS4) :

Critères d'acceptabilité

Pente -3,9 < pente < -3,1

Corrélation (R2) R2 > 0,98

Si les valeurs sont en dehors des critères d'acceptation, toute l'analyse PCR doit être réanalysée en commençant avec une nouvelle série de test PCR.

* Standard de quantification (QS3) :

Dans les séries suivantes, seul le standard de quantification (QS3) doit être inclus pour valider la courbe standard effectuée précédemment. Si la valeur Ct du standard de quantification (QS3) ne se situe pas dans l’intervalle attendu, le logiciel Dx Real- Time Software invalide la série entière et affiche l’un des messages d’alerte suivants :

QS_out Valeur de CMV en dehors de l'intervalle

attendu

Si la valeur est en dehors de l'intervalle attendu, toute l'analyse PCR doit être réanalysée en commençant avec une nouvelle série de test PCR.

Détection de l'inhibition : Contrôle interne

Le contrôle interne est ajouté à chaque échantillon et au contrôle négatif au début de l'étape d'extraction d'ADN et est détecté à l’aide d’une sonde spécifique au cours de la réaction de PCR en temps réel.

Les échantillons dont la valeur Ct du contrôle interne est au-delà de la valeur attendue (échantillons potentiellement inhibés) sont interprétés par le logiciel Dx Real-Time Software comme suit :

• Tout échantillon négatif est rapporté comme « Failed » pour cette cible.

• Tout échantillon avec une cible détectable (< LLOQ ou dans l'intervalle de quantification de la cible) est détecté comme

« CMV_POS » pour la cible donnée mais pas quantifiable (Invalid_IC).

• Tout échantillon présentant une charge virale au-dessus de la limite supérieure de quantification (ULOQ) de la cible est détecté comme « CMV_POS » et accompagné du message « > ULOQ ».

(9)

Si la valeur Ct du contrôle interne est en dehors des critères d'acceptabilité et, par conséquent, déclaré non valide « Invalid », répéter l'analyse en extrayant et en testant l'échantillon concerné correctement dilué dans le PBS, dans le respect des pratiques courantes de laboratoire pour les diagnostics moléculaires par PCR en temps réel.

Le facteur de dilution de l'échantillon (par ex. : 1/2, 1/10, 1/100) doit être prudemment choisi sur la base de la valeur Ct affichée dans le logiciel Dx Software et doit être inversement proportionnel à la valeur Ct.

10. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS 10.1. Critères de validation du test La série d'analyses est valide si :

• la valeur Ct du contrôle positif est dans la plage attendue pour la cible.

• Le contrôle négatif n'a pas de valeur Ct pour la cible et la valeur Ct du contrôle interne est dans la plage attendue.

• Les valeurs de la courbe standard répondent aux critères d'acceptabilité ou

• le standard de quantification 3 (QS3) est dans la plage attendue pour la cible.

Si la série d'analyses est valide, le logiciel Dx Real-Time Software affiche l'état « Passed » pour la série. Sinon, le logiciel Dx Real-Time Software affiche l'état « Failed » pour la série.

Si l'état de la série est « Failed », tous les résultats du test dans cette série possèdent l'état « Invalid » et tous les échantillons et contrôles concernés doivent être retraités tel qu'indiqué dans la section 9.

10.2. Calculs / Interprétation des résultats

Le test Dx CMV Assay est standardisé sur la base de la première norme internationale de l'OMS sur les cytomégalovirus humains (code NIBSC 09/162) pour exprimer les concentrations des échantillons en unités internationales (IU/ml).

Les résultats sont calculés par le logiciel Dx Real-Time Software, qui détermine automatiquement les valeurs Ct pour le CMV et pour le contrôle interne dans les échantillons et les contrôles.

Si le test est valide, tous les échantillons (inhibés ou non) contenant un ADN CMV détectable est interprété comme

« CMV_POS » pour la cible donnée par le logiciel Dx Real-Time Software. Toutefois, un échantillon positif accompagné du message « Invalid_IC » ne pourra être quantifié. L'échantillon correspondant devra donc être retraité en commençant par l'étape d'extraction de l'ADN de l'échantillon correctement dilué dans le PBS tel que décrit dans la section 9.

Le tableau suivant résume les différentes situations pour l'interprétation du test CMV, avec les messages associés et leur signification :

Critère Interprétation

« Résultat » Signification

Message

« Message d'alerte »

VALIDE Contrôle interne

Échantillon négatif

« CMV_neg » ADN CMV non détecté Aucun

Échantillon positif non titré

« CMV_POS »

ADN CMV en dessous de la limite inférieure de

quantification (LLOQ) < LLOQ Échantillon positif

Titrage en nombre de copies/ml ou UI/ml

« CMV_POS »

ADN CMV égal ou supérieur à la limite inférieure de quantification (LLOQ) et inférieur ou égal à la limite

supérieure de quantification (ULOQ)

Aucun

« CMV_POS »

ADN CMV supérieur à la limite supérieure de

quantification (ULOQ) > ULOQ

NON VALIDE Contrôle interne

« Failed » ADN CMV non détecté Invalid_IC

« CMV_POS »

ADN CMV détectable mais non quantifiable Invalid_IC ADN CMV supérieur à la limite supérieure de

quantification (ULOQ) > ULOQ

(10)

11. LIMITATIONS DU TEST

• Les performances optimales de ce test dépendent directement de la qualité des échantillons. Il est par conséquent important de se conformer aux indications dans la section « Recueil et manipulation des échantillons ».

• L'analyse doit être réalisée uniquement sur les types d'échantillons indiqués. Les autres types d'échantillons n'ont pas été validés.

• L'utilisation de ce test est réservée au personnel formé à l'utilisation de la trousse Dx CMV Assay, de l'instrument Dx Real- Time System et du logiciel Dx Real-Time Software.

• Un résultat négatif n'exclut pas la possibilité d'une infection car les résultats dépendent de plusieurs variables. Un recueil ou une manipulation incorrect(e) des échantillons, la présence d'inhibiteurs ou une erreur technique peut entraîner des résultats erronés.

• Comme pour tous les tests diagnostiques, les résultats de Dx CMV Assay doivent être interprétés en association avec d'autres résultats biologiques ou cliniques.

• Les échantillons contenant des résidus de fibrine ou des particules lourdes ou encore des filaments et corps microbiens doivent être jetés étant donné qu'ils sont susceptibles de produire des résultats erronés.

• Les échantillons de plasma hémolysés (rouge) et hyperlipémiques (d'aspect laiteux) doivent être jetés étant donné qu'ils sont également susceptibles de produire des résultats erronés.

• Les échantillons de plasma recueillis dans des tubes contenant de l'héparine comme anticoagulant ne doivent pas être utilisés car l'héparine (>10 IU/ml) influence la réaction par PCR.

• Les performances décrites dans cette trousse ne peuvent être garanties que pour les systèmes d'extraction et l'instrument PCR recommandé.

12. PERFORMANCES DU TEST 12.1. MESURE DE LA PRECISION

12.1.1 Mesure de reproductibilité et de la répétabilité

Un panel d'échantillons constitué d'échantillons négatifs et d'échantillons positifs au CMV à différentes concentrations (basse, moyenne et élevée) a été créé et testé en 3 réplications d'extraction dans le cadre de l'étude de précision.

Cette étude a été réalisée avec 2 lots Dx CMV Assay différents (Lot1, Lot2) sur 2 instruments Dx Real-Time System sur une période de 10 jours en 3 séries.

CMV cible : Résultats de précision totaux - Valeur Ct des échantillons positifs

*Reproductibilité

Panel CMV Total Intra-essai

Échantillon

Lot CMV N Ct

moyen SD CV% N Ct

moyen SD CV%

Low (3xLOD) Lot 1 & Lot 2 64 37,35 0,87 2,34 20 37,83 0,66 1,73 Moyen Lot 1 & Lot 2 66 30,04 0,44 1,45 22 30,14 0,43 1,43 Élevé Lot 1 & Lot 2 66 19,99 0,48 2,38 22 20,09 0,38 1,90

*Répétabilité

Panel CMV Total Intra-essai

Échantillon Lot CMV N Ct

moyen SD CV% N Ct

moyen SD CV%

Low (3xLOD) Lot 1 32 37,93 0,70 1,84 22 37,77 0,71 1,87 Lot 2 32 36,78 0,62 1,69 22 36,50 0,49 1,35

Moyen Lot 1 33 30,42 0,17 0,55 22 30,37 0,16 0,52

Lot 2 33 29,65 0,24 0,82 22 29,59 0,21 0,70

Élevé Lot 1 33 20,40 0,22 1,08 22 20,39 0,26 1,25

Lot 2 33 19,57 0,22 1,14 22 19,47 0,162 0,83

(11)

12.2. PERFORMANCE ANALYTIQUE 12.2.1 Limite de détection (LOD)

La limite de détection (LOD) a été déterminée, en tenant compte de la méthode d'extraction, en testant le standard international EBV de l’OMS (code NIBSC 09/162) en plusieurs séries de dilution jusqu’à la concentration limite et au moyen de l'analyse Probit pour retenir la dilution donnant 95 % de réponse positive.

L'analyse statistique (Probit) a été effectuée sur la base des résultats obtenus à partir de 24 répliquats de 6 points de dilution testés au cours de 3 séries différentes (8 répliquats x 3 séries).

Extraction automatique avec NucliSens® easyMAG®

Extraction manuelle QIAamp® DNA Mini Kit

LOD (95 %) = 50 IU/ml = 27,50 copies/ml LOD (95 %) = 146 IU/ml = 110 copies/ml

12.2.2 Spécificité analytique

La spécificité analytique de Dx CMV Assay a été évaluée sur un panel d'échantillons provenant de patients souffrant d'infections causées par des organismes potentiellement interférants fournis par un centre clinique référant.

Pathogènes à réactivité croisée

Pas de réaction croisée observée dans le panel testé.

12.3. PERFORMANCES CLINIQUES

12.3.1 Résultats exprimés en unités internationales

Un facteur de conversion (copies / unités internationales) a été déterminé pour les dilutions en série du test Dx CMV Assay de la 1re norme internationale de l'OMS pour les cytomégalovirus humains (code NIBSC 09/162) dans un pool de plasma EDTA négatif. Les résultats obtenus en copies/ml peuvent être convertis en Unités internationales de l'OMS/ml grâce au facteur de conversion (FC) spécifique, déterminé pour chaque méthode d'extraction utilisée en association avec la trousse, comme décrit ci-après :

Famille Cible Concentration (copies/ml) Résultat

Virus de l'herpès

EBV 10000 Pas de réaction croisée

VZV 10000 Pas de réaction croisée

HHV6 10000 Pas de réaction croisée

HHV8 1000 Pas de réaction croisée

HSV1 100000 Pas de réaction croisée

HSV2 100000 Pas de réaction croisée

Polyomavirus

JCV 10000 Pas de réaction croisée

BKV 100000 Pas de réaction croisée

Virus de l'hépatite

HBV 1000000 Pas de réaction croisée

HCV 1000000 Pas de réaction croisée

(12)

Extraction NucliSens^®easyMag^® Extraction Qiagen^®

Facteur de conversion (FC) PLASMA 0,55 0,75

La formule de conversion de copies/ml en unités internationales/ml est :

Résultats (IU/ml) = nombre de copies/ml / Facteur de conversion

12.3.2 Plage dynamique

La plage dynamique a été déterminée pour le test Dx CMV Assay grace a des dilutions en série du 1^er standard international de l'OMS pour les cytomégalovirus humains (code NIBSC 09/162) et pour un plasmide, porteur de la séquence-cible d'ADN, dans un pool de plasma EDTA négatif. Sur la base des résultats obtenus de cette étude à l'aide de différentes méthodes d'extraction, la plage dynamique pour Dx CMV Assay est la suivante :

Méthode d'extraction Plage dynamique (échantillons de Plasma)

NucliSENS® easyMAG® 200 IU/ml < Plage dynamique < 20 000 000 IU/ml 110 copies/ml < Plage dynamique < 11 000 000 IU/ml

QIAamp® DNA Mini Kit

150 IU/ml < Plage dynamique < 16 666 667 IU/ml 113 copies/ml < Plage dynamique < 12 500 000 IU/ml

12.3.3 Sensibilité diagnostique

La sensibilité diagnostique de Dx CMV Assay a été évaluée sur un panel QCMD 2012 également utilisé pour confirmer la charge virale en IU/ml.

Tous les échantillons ont été extraits par extraction automatique NucliSens® easyMAG® (bioMérieux) et QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN).

QCMD 2012 Extraction Qiagen® Extraction NucliSens®

easyMag®

Résultats de référence (copies/ml) N° d'échantillon Résultats

(copies/ml)

Résultats Log

Résultats (copies/ml)

Résultats Log

Résultats

Log Plage de mesure Log

CMV12-01 12697 4,104 11173 4,048 4,303 3,977 4,629

CMV12-02 2046 3,311* 2525 3,402 3,741 3,381 4,101

CMV12-03 POS (<LLOQ) POS (<LLOQ) 2,242 1,755 2,729

CMV12-04 NEG POS (<LLOQ) 2,075 1,553 2,597

CMV12-05 1041 3,017 856 2,932 2,906 2,469 3,343

CMV12-06 1364 3,135 1200 3,079 3,302 2,956 3,648

CMV12-07 1459 3,164 980 2,991 3,329 2,981 3,677

CMV12-08 NEG NEG NEG

CMV12-09 3285 3,516 3093 3,490 3,674 3,312 4,036

CMV12-10 495 2,694 290 2,463 2,733 2,351 3,115

(13)

QCMD 2012 Extraction Qiagen® Extraction NucliSens®

easyMag® Résultats de référence (UI/ml) N° d'échantillon Résultats

(UI/ml) Résultats

Log Résultats (UI/ml) Résultats

Log Résultats

Log Plage de mesure Log) CMV12-01 16929 4,229 20315 4,308 4,389 4,034 4,744 CMV12-02 2728 3,436* 4591 3,662 3,879 3,578 4,180 CMV12-03 POS

(<LLOQ) POS (<LLOQ) 2,253 1,764 2,742

CMV12-04 NEG POS (<LLOQ) 2,031 1,507 2,555

CMV12-05 1388 3,142 1556 3,192 3,150 2,577 3,723 CMV12-06 1819 3,260 2182 3,339 3,441 3,072 3,810 CMV12-07 1946 3,289 1782 3,251 3,438 3,062 3,814

CMV12-08 NEG NEG NEG

CMV12-09 4379 3,641 5623 3,750 3,753 3,341 4,165

CMV12-10 660 2,819 528 2,722 2,783 2,333 3,233

L'échantillon CMV12-02 extrait avec Qiagen DNA Mini Kit a présenté un résultat inférieur à la limite inférieure d'acceptabilité mais le décalage n'est pas significatif en termes de quantification à la lumière de la gestion clinique.

12.3.4 Étude clinique PLASMA

Une étude clinique rétrospective a été effectuée sur des échantillons de plasma provenant de patients transplantés et caractérisés par une trousse commerciale de PCR en temps réel homologuée CE. Les mêmes extraits d'échantillons de plasma (extraction automatique NucliSens® easyMAG®) ont été analysés avec Dx CMV Assay et avec une autre trousse commerciale de PCR en temps réel homologuée CE disponible.

Analyse quantitative :

Trousse commerciale homologuée CE de référence

NucliSens® easyMAG® Pos Neg

Dx CMV Assay Pos 34 1 35

Neg 2 23 25

Total 36 24 60

Concordance = 95 %

Trousse commerciale homologuée CE

NucliSens® easyMAG® Pos Neg

Neg 4 21 25

Total 37 23 60

Concordance = 90 %

Tous les échantillons ayant des résultats discordants avaient une charge virale inférieure à la limite de détection (LOD).

Les mêmes échantillons de plasma ont également été extraits avec le système d'extraction manuelle et testés avec la trousse Dx CMV Assay ainsi qu'avec la trousse commerciale de PCR en temps réel homologuée CE, validée avec la même extraction.

(14)

Trousse commerciale homologuée CE

Qiagen® DNA Mini Kit Pos Neg

Neg 2 23 25

Total 36 24 60

Concordance = 95 %

Tous les échantillons ayant des résultats discordants avaient des charges virales inférieures à la limite de détection (LOD).

Analyse quantitative :

Une analyse de corrélation a été effectuée comparant les charges virales (copies/ml) obtenue avec la trousse Dx CMV Assay et deux trousses CE, en tenant compte également de la méthode d'extraction utilisée.

La corrélation était toujours > 0,95 %.

13. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1.Diagnosis Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Culture. Van Doornum G.J.J., Guldemeester J., Osterhaus A.D.M.E., Niesters H.G.M.. J. Clin. Microbiol., 2003; 41:576-580.

2.Validation of clinical application of Cytomegalovirus plasma DNA load measurement and definition of treatment criteria by analysis of correlation to antigen detection. Kalpoe J.S., Kroes A.C.M., de Jong M.D., Schinkel J., de Brouwer C.S., Beersma M.F.C., Claas E.C.J. J. Clin. Microbiol., 2004; 42: 1498-1504.

3.Functional profiling of a human cytomegalovirus genome. Dunn W.,Chou C., Li H., Hai R., Patterson D., Stolc V., Zhu H., Liu F. PNAS, 2003;100:14223-14228.

4.Detection of citomegalovirus (CMV) DNA in EDTA whole-blood samples: evaluation of the quantitative artus CMV LightCycler PCR kit in conjunction with automated sample preparation. Michelin B.D.A., Hadzisejdic I., Bozic M., Grahovac M., Hess M., Grahovac B., Marth E., Kessler H.H. J. Clin. Microbiol., 2008; 46:1241-1245.

5.DNA microarrays of the Complex Human Cytomegalovirus genome: profiling kinetic class with drug sensitivity of viral gene Δlog > 0,5

(15)

expression. Chambers J., Angulo A., Amaratunga D., Guo H., Jiang Y., Wan J.S., Bittner A., Frueh K., Jackson M.R., Peterson P., Erlander M.G., Ghazal P. J.Virol., 1999; 73:5757-5766.

6.Assessment of removal of human cytomegalovirus from blood components by leukocyte depletion filters using real-time quantitative PCR. Visconti M.R., Pennington J., Garner S.F., Allain JP., Williamson L.M. Blood, 2004; 103:1137-1139.

7.Comparative analysis of human cytomegalovirus a-sequence in multiple clinical isolates by using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism assays. Zaia J.A., Gallez-Hawkins G., Churchill M.A., Morton-Blackshere A., Pande H., Adler S.P., Schmidt G.M., Forman S.J. J. Clin. Microbiol., 1990; 28:2602-2607.

8.Real-Time PCR in clinical microbiology: applications for routine Laboratory testing. Espy M.J., Uhl J.R., Sloan L.M:, Buckwalter S.P., Jones M.F., Vetter E.A., Yao J.D.C., Wengenack N.L., Rosenblatt J.E., Cockerill F.R. III, Smith T.F. Clin.

Microbiol. Rev.2006; 19:165-256.

L’achat de ce produit permet à l’acquéreur de réaliser des services diagnostiques à des fins de diagnostic humain in vitro. Il n'est donc délivré à l'acquéreur aucun brevet général ni de licence d’aucune sorte autre que le droit ou l’usage permis par cet achat. ProClin™ est une marque déposée de Rohm and Haas Co.

Tout nom de marque pouvant apparaître dans la notice de ce test appartient à son propriétaire respectif.

DIA.PRO Diagnostic Bioprobes Srl Via G. Carducci n° 27

20099 Sesto San Giovanni (Milano) - Italy

Tel.: +39 02 27007161 Fax: +39 02 26007726

e-mail: info@diapro.it

Distributed by Bio-Rad

3 Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette, France Tel.: +33 (0)1 47 95 60 00

Fax: +33 (0)1 47 41 91 33 www. bio-rad.com

0318

CMV_rA0414