Diagnostic bactériologique Diagnostic bactériologique de de Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pneumoniae
par PCR en temps réel par PCR en temps réel
Au laboratoire de Pellegrin
Au laboratoire de Pellegrin
M. pneumoniae with respiratory epithelial cells
● Non commensal : pas de portage sain (sauf période d’épidémie)
● Infections respiratoires aigues, souvent bénignes
● Transmission aérienne
● Enfant > 5ans, adulte jeune
- Trachéobronchites +++
- Pharyngites
- Pneumopathies atypiques - Asymptomatique (20%)
● Mode endémique avec poussées épidémiques
Tous les 4-7 ans
Probable : exacerbation de l’asthme chez enfant et adulte
Infections respiratoires à M. pneumoniae
Manifestations extra-respiratoires
● Lésions cutanées +++
éruption, exanthème, érythème noueux, Stevens Johnson
● Atteintes neurologiques
encéphalites, neuropathies périphériques, Guillain Barré
● Arhrites, arthralgies
● Cardiaques (rares)
myocardites, péricardites
● Anémie hémolytiques (rares)
Non spécifiques
Diagnostic biologique
● Recherche directe de la bactérie - Culture
- PCR
● Recherche indirecte : recherche d'anticorps
Prélèvements pour détection directe
● Mêmes pour culture et PCR
● Respiratoires
pvt gorge (infection diffuse)
asp. naso-pharyngée (jeune enfant) LBA (formes sévères)
expectorations peu adaptées Autres (rares)
● Milieu de transport
- Milieu 2SP (saccharose-phosphate)
- conservation +4°C 24 h, puis -70°C
Culture de M. pneumoniae
• Fastidieuse, longue
• Exigence nutritionnelles milieux spéciaux enrichis Hayflick modifié, SP4
(20% sérum, extrait levure, -lactamines) Solide ou liquide
Glucose
37°C +/- CO
2pendant 2-3 semaines
• Prop. métaboliques en milieu liquide Fermentation glucose
Changement de couleur du rouge de phénol
• Dilutions indispensables (inhibiteurs)
Détection de la croissance en milieu solide
● Aspect des colonies sur agar (37°C, CO
2) Loupe binoculaire, 50-300µm
2-3 sem
● Identification : aspect colonies, hémadsorption, PCR
Détection de la croissance en milieu liquide
● Virage indicateur coloré
- Fermentation du glucose acidification : virage du rouge de phénol : rouge jaune
- 2-3 semaines en primo-isolement
M. pneumoniae
● Sensibilité vs PCR: 60%, spécificité : 100%
rare (labo spécialisés)
Détection par biologie moléculaire
● Hybridation par sonde : peu sensible
● 1
èrepublication de PCR en 1989 (Bernet, JCM, 89)
1989-2003 : 34 articles (Loens, JCM, 03)
● Cibles variées
ATPase, gène tuf ARNr 16S
adhésine P1 +++ (meilleure sensibilité)
● Techniques variées
- ADN : PCR, PCR multiplex, PCR en temps réel
- ARN : NASBA, RT-PCR
● Extraction d’ADN
- phénol-chloroforme et précipitation de l’ADN +/- SDS, protéinase K
- sonication - ébullition
- kits commercialisés
- Automate (ex: MagNAPure Roche diagnostic)
Sensibilité: 78-92%, spécificité: 92-100%
Détection par biologie moléculaire (2)
Avantages
Rapidité
Grande spécificité
Bonne sensibilité si infection
Quantification possible
Typage des souches, (groupe 1 et 2)
Autres pathogènes respiratoires (PCR multiplex)
Limites
Méthodes "maison"
Contrôles indispensables - Négatifs
- Internes - Extraction
Présence possible comme commensal?
Détection d’organismes non viables
Détection par biologie moléculaire (3)
Diagnostic biologique
● Recherche directe de la bactérie - Culture
- PCR
● Recherche indirecte : recherche d'anticorps
Diagnostic indirect sérologique
• Très utilisé mais résultat tardif
• Cinétique des AC
IgM : 1 sem après début infection, enfants +++
IgG : pic à 3 semaines, décroissance plusieurs mois IgA ?
• Différentes techniques
- agglutination de particules - immunofluorescence
- Fixation du complément
- ELISA (différents antigènes)
IgG
IgM
Infection
Temps (semaines)
Quantité d'Anticorps
Cinétique des anticorps
En résumé
Diagnostic par PCR + sérologie
• Enfants, PCR + IgM (sérum en phase aigue)
degré maximal de certitude
diagnostic en 1 ou 2 jours
• Une PCR positive isolée chez enfant avec pneumopathie atypique : très suggestif
• Adultes, PCR + FC ( 1/64) ou IgG X4 entre 2 sérums
Aujourd'hui, recherche de M.pneumoniae
Prélèvement de gorge
Extraction d'ADN automatisée
PCR en temps réel Taqman
Interprétation des résultats
MagNAPure
Prism 7000
Extraction d'ADN automatisée
MagNA Pure LC, Roche diagnostics
Principe
- Lyse cellulaire et dénaturation des protéines
- Digestion des protéines (Protéinase K) - Liaison de l'ADN à la surface de
particules de verre magnétiques
- Lavages (élimination des protéines, membranes, etc…)
- Elution de l'ADN purifié à haute
température
Amplification par PCR temps réel
ABI Prism 7000
PCR en temps réel - Protocole Taqman - Cible : Adhésine P1 2 amorces :
P1-204 P1-328
1 sonde de 125 bp
P1-284R (FAM-TAMRA)
Sondes Taqman - Principe
Hybridation d'une sonde spécifique Composition de la sonde
● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5' Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein
● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl- rhodamine
pas d'émission de fluorescence
Cette méthode repose sur deux principes :
- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) - l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol
Spécificité l’amorce pour la PCR
Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
5’
5’
3’
3’
FP
RP
Reporter Quencher
FAM, VIC TAMRA
Sondes Taqman - Principe
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R Q
Lumière
- FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),
pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte
Sondes Taqman - Principe
- au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’
nucléase coupe la sonde libération du reporter
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
- lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.
Sondes Taqman
Avantage :
- Spécificité accrue
Spécificité des primers pour la PCR
Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan - Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents
Inconvénient :
- Impossibilité de réaliser des courbes de fusion
Protocole opératoire
- Extraits dilués au 1/10ème - Préparation du Mix
Amorces Sondes
Mix (dNTP, Taq Polymérse, tampon)
+ Ajout de l'échantillon extrait au 1/10ème
- Contrôle interne : mélange précédent + culture extraite de Mpn
permet de vérifier l'absence d'inhibiteurs de PCR dans l'échantillon - Amplification d'une gamme de concentration
Culture extraite, pure et dilutions au 1/10ème, 1/100ème et 1/1000ème - Protocole du thermocycleur
10min 95°C 15 sec à 95°C
1 min à 60°C 40 cycles
Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100, 1/1000ème
pur 10-1 10-2 10-3
Interprétation
En rouge : patient positif pour M. pneumoniae Patient
