Etude moléculaire de l'évolution clonalede TP53 des Syndromes Myélodysplasiques avec del(5q) : conséquences sur la résistance au traitement et la progression du cancer

Texte intégral

(1)Etude moléculaire de l’évolution clonalede TP53 des Syndromes Myélodysplasiques avec del(5q) : conséquences sur la résistance au traitement et la progression du cancer Laurence Lode. To cite this version: Laurence Lode. Etude moléculaire de l’évolution clonalede TP53 des Syndromes Myélodysplasiques avec del(5q) : conséquences sur la résistance au traitement et la progression du cancer. Médecine humaine et pathologie. Université Montpellier, 2017. Français. �NNT : 2017MONTT071�. �tel-01698312�. HAL Id: tel-01698312 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01698312 Submitted on 1 Feb 2018. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés..

(2) THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER En Biologie et Biochimie Moléculaire École doctorale Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (CBS2) Unités de recherche UMR-CNRS 5235 et INSERM U1183. Étude moléculaire de l’évolution clonale de TP53 des Syndromes Myélodysplasiques avec del(5q).. Conséquences sur la résistance au traitement et la progression du cancer.. Présentée par Laurence LODÉ le 29 Novembre 2017. Sous la direction de Guillaume CARTRON et Thérèse COMMES-MAERTEN Devant le jury composé de Pr. Elizabeth A. MACINTYRE-DAVI, Université Paris-Sorbonne. Présidente du Jury. Pr. Estelle ESPINOS-PARROU, Université de Toulouse 3 Paul Sabatier. Rapporteur. Pr. Claude PREUDHOMME, Université de Lille 2. Rapporteur. Pr. Guillaume CARTRON, Université de Montpellier. Directeur de thèse. Pr. Thérèse COMMES-MAERTEN, Université de Montpellier. Co-directrice de thèse. Dr. Frédéric THOMAS, Université de Montpellier. Examinateur.

(3) 3/280. REMERCIEMENTS. Je voudrais remercier tous ceux qui m'ont aidée techniquement et moralement à mener à bien ce projet de thèse, en particulier la "tropical team" de Nantes (Audrey, Fabienne, Laëtitia, Marie-Christine, Amandine et Véro), et la "Guibert-Lodé family" de Prades-le-Lez.. Merci à Philippe Halimi, Édouard Couty, Thomas Le Ludec et Jérôme Solassol de m'avoir donné des conditions de travail compatibles avec la finalisation de ce projet.. Merci au Pr Commes-Maerten, au Pr Cartron, au Dr Pellat-Deceunynck et au Pr Moreau d'avoir accepté les rôles de directeurs successifs de cette thèse, et au Dr Delaunay de m’avoir accompagnée au début du projet nantais.. Merci aux membres du jury de m'avoir fait l'honneur d'accepter de dédier du temps à l'évaluation et à l'amélioration de ce travail, Pr Macintyre en tant que Présidente du Jury, Pr Preudhomme et Pr Espinos en tant que rapporteurs, et Dr Thomas en tant qu'examinateur..

(4) 5/280. AVANT-PROPOS L’école doctorale CBS2 exige que les doctorants prétendant au grade de Doctorat es Sciences aient acquis au cours de leur thèse les compétences requises pour conduire un projet en en définissant les objectifs scientifiques, en mettant en place une stratégie pour répondre à la question posée, en discutant les résultats obtenus, et en publiant des éléments nouveaux soumis à révision par des pairs. Le travail présenté ici n’est qu’une petite partie de cette démarche d’acquisition de ces compétences, démarche débutée il y a 15 ans (fin 2002) après un DEA de Génétique Humaine validée à l'Université Paris VI . Pendant le stage de 9 mois à l'Institut National de Transfusion Sanguine sous la direction du Dr Yves Colin, et grâce à des techniques de cultures cellulaires, de mutagenèse dirigée et de clonage d'expression, j'avais déjà commencé à acquérir ces compétences en contribuant à la caractérisation des sites d'interaction entre la protéine DARC de Plasmodium vivax et les antigènes du groupe sanguin Duffy. Puis un stage d'inter-CHU de 10 mois sous la direction du Pr Elizabeth Macintyre au laboratoire d'hématologie moléculaire de l'Hôpital Necker Enfants Malades m'a permis de poursuivre cet apprentissage en m’initiant à l'étude des facteurs génétiques pronostiques dans le myélome multiple (protocole MAG95).. PREMIERE INSCRIPTION EN THESE DE SCIENCES De retour à Nantes, j'ai alors entamé trois ans de thèse à temps plein (financée sur une Bourse de la Ligue contre le Cancer) dans l'ex-équipe du Pr Régis Bataille au sein de l'Unité INSERM dirigée par le Pr Marc Bonneville. Cette thèse portait sur l'étude des conséquences fonctionnelles de l'hyperexpression de la caseine kinase 2 (sous-unité alpha) dans le myélome multiple. L'équipe de mon directeur de thèse Stéphane Minvielle avait trouvé le transcrit CSNK2A1 surexprimé chez des patients atteints de myélome multiple et j'ai confirmé son hyperexpression protéique dans une série d'une vingtaine de lignées de collection ou établies dans le laboratoire (le plus souvent à partir de formes extra-médullaires de myélome). J'ai étudié les conséquences (en terme de prolifération, apoptose et d'activité kinase) de l’inhibition de la sous-unité alpha de la caséine kinase 2 par un inhibiteur ATP-compétitif et par si-RNA. J'ai également étudié les conséquences de son inhibition sur la voie Wnt/béta-caténine, une des voies régulées par la caséine Kinase 2. J'ai démontré que, dans le myélome,.

(5) 6/280. l'inhibition de la caséine kinase 2 entraînait une baisse d'expression de la bétacaténine suite à sa dégradation par le protéasome (confirmée après inhibition du protéasome par le MG132). A ma prise de fonctions comme assistante hospitalounversitaire, j'ai poursuivi ma thèse de sciences sur des sujets de recherche moins fondamentale et plus translationnelle, toujours sur le myélome multiple, mais en mettant cette fois en œuvre des techniques de biologie moléculaire à type de PCR, RTPCR et séquençage, appliquées à l'étude de l'impact pronostique du répertoire IGVH et du taux de mutations somatiques induites par l'enzyme AID (activation induced cytidine deaminase), puis à l'étude de la corrélation entre la présence de mutations de TP53 et la délétion 17p13 dans le myélome multiple. Du fait de l'impact pronostique péjoratif des délétions 17p13 (locus TP53) dans le myélome, nous avons étudié une corrélation entre la présence de mutations TP53 au diagnostic et la progression de la maladie mais notre résultat a été négatif. Pour des raisons personnelles, cette première thèse a conduit après 5 ans à un abandon de thèse en 2007. La faible disponibilité des échantillons de myélome, en particulier à la rechute, avait empêché de poursuivre le projet d'étude de l'évolution clonale de sous-clones mutés pour TP53 dans le myélome multiple, les résultats au diagnostic ont été publiés sous forme de lettre (Lodé et al., 2010).. DEUXIEME INSCRIPTION EN THESE DE SCIENCES. En 2012, j’ai participé à une étude nantaise sur l'évolution clonale dans le myélome qui montre par profils d'expression génique sur 24 patients des profils d'évolution linéaires et non-linéaires (Magrangeas et al., 2013). Envisageant une réinscription en thèse de sciences, j'ai entrepris des études préliminaires qui devaient conduire à plusieurs projets de cette seconde thèse de sciences dont le titre original était : Etude moléculaire des évolutions clonales des hémopathies malignes, notamment via les anomalies de TP53 car elle devait porter à la fois sur les syndromes myélodysplasiques et sur le myélome multiple, et elle devait porter sur des panels de gènes et pas seulement sur TP53. Un projet portait sur l'épissage alternatif du gène CRBN dans le Myélome Multiple. Le gène CRBN code pour la protéine Cereblon, cible des IMiDs parmi lesquels le lénalidomide occupe une place importante dans l'arsenal thérapeutique pour traiter le myélome multiple. Le cereblon fait partie du complexe E3 ubiquitin-ligase qui cible.

(6) 7/280. de nombreux substrats et induit leur dégradation par le protéasome sachant que le lenalidomide augmente l'affinité du cereblon pour ses substrats. Les travaux élucidant le mécanisme de la tératogénicité des ImiDs avaient permis de caractériser le domaine de fixation des ImiDs (Thamidomide Binding Domain ou TBD) sur la protéine Cereblon et plusieurs équipes ont cherché, en vain, des mutations de ce domaine du gène CRBN qui auraient pu expliquer que certains patients ne répondaient pas au lénalidomide ou devenaient résistants. Nous avons opté pour le séquençage des transcrits CRBN qui nous a révélé de fréquents transcrits d'épissage dépourvus de l'exon 10 codant pour le TBD. Nous avons mis au point une RT-PCR fluorescente à visée analyse de fragments par électrophorèse capillaire qui permettait de déterminer facilement le profil d'épissage du CRBN. Une étude rétrospective préliminaire sur des patients traités par lenalidomide montraient que chez deux patients résistants primaires au lenalidomide les transcrits CRBN étaient dépourvus de l'exon 10 codant pour le TBD, suggérant un possible impact prédictif de l’épissage du cereblon sur la réponse au lénalidomide. La littérature montrant une baisse des transcrits CRBN sur moelle des patients entre le diagnostic et la rechute, la poursuite de ce projet Cereblon comportait deux aspects : le premier consistait à tenter de comprendre le mécanisme en jeu dans l'épissage du transcrit CRBN en déterminant par une technique de RNAseq ciblé à la fois le statut d'épissage du CRBN entre autres et le statut mutationnel de gènes du spliceosome tels que SF3B1, SRSF2, U2AF1, ZRSR2, et SRSF3. Le second aspect visait à tenter de prédire la résistance au lénalidomide par quantification du transcrit Cereblon contenant le domaine TBD sur des prélèvements séquentiels de sang de patients atteints de Myélome Multiple avant et après initiation du traitement par lénalidomide. La mise au point de l'extraction d'ARN circulant (s'inspirant des techniques d'extraction des ARN viraux circulants) et de la RTqPCR ciblant le thalidomide binding domain (TBD) du CRBN était en cours. La RTqPCR Cereblon aurait ensuite été adaptée sur digital droplet PCR afin de s'affranchir de gammes de calibration. L'objectif était de déterminer dans une cohorte test prospective de patients la corrélation entre la diminution du taux de transcrits CRBN dépourvus de TBD, la sélection de sous-clones résistants au lénalidomide et la progression tumorale afin d'adapter le traitement avant la rechute du myélome. Les premiers résultats de ce projet ont fait l'objet d'une publication (Lodé L, et al. Br J Haematol. 2013) et d'une présentation affichée au congrès américain d'hématologie (Ménard et al., ASH 2013)..

(7) 8/280. Un autre projet a débuté fin 2011, quand une étude rétrospective portant sur une cohorte. de. 55. patients. suédois. et. britanniques. atteints. de. Syndromes. Myélodysplasiques de bas risque pronostique avec délétion 5q (SMD del(5q) montrait que les mutations de TP53 étaient prédictives de la survenue d'une forme agressive de la tumeur, la leucémie aiguë myéloïde secondaire (LAMs). Notre étude préliminaire portant sur 40 patients recrutés dans la région de Nantes montraient au contraire une absence de corrélation entre le statut muté TP53 au diagnostic et la survenue d'une LAMs. Sur une cohorte de 24 patients avec prélèvements séquentiels, nous avons montré que de nombreux patients négatifs pour TP53 au diagnostic devenaient positifs au cours du suivi. Nous avons reconstitué des scénarios d'évolution clonale grâce aux échantillons stockés à visée sanitaire mais cette étude rétrospective ne permettaient pas de maîtriser les délais entre deux prélèvements. Aussi, suite à la présentation orale de ces résultats préliminaires au congrès américain d'hématologie (ASH2013), nous les avons présentés devant le groupe français des myélodysplasies (en janvier 2014) avec le projet de constituer une cohorte prospective de patients du GFM qui auraient été prélevés très régulièrement sur le sang et ponctuellement sur la moëlle osseuse. Ces projets n’ayant pu aboutir, nous avons publié le travail en l’état (Lodé et al, 2017), complété le travail par une étude Pacbio sur les mutation multiples de TP53 (Lodé et al, 2018) et par une étude bibliographique de p53 dans la Leucémie Lymphoïde Chronique permettant de poser la question de l'addiction oncogénique à la voie p53. Les tumeurs agressives, si elles sont dépendantes de cette voie, pourraient ainsi être traitées par des molécules ciblant cette voie. Ce travail est présenté en annexe (Lodé et al., 2016)..

(8) 9/280. RÉSUMÉ Français La protéine p53 doit être altérée pour que le cancer puisse se développer. Elle est codée par le gène TP53 qui est retrouvé muté dans les formes les plus agressives de nombreux cancers. L'étude des mutations du gène TP53 par séquençage NGS dans les syndromes myélodysplasiques de bas risque avec délétion 5q ou SMD del(5q) a montré que le statut de TP53 au diagnostic ne prédisait pas la progression tumorale (p=0,777, test de Gray), contrairement à ce qui avait été publié précédemment (Jädersten, 2011). Sur une sous-cohorte de 24 patients traités par lénalidomide, nous avons observé une évolution clonale de TP53 chez 11 patients au cours de la maladie et montré que c’était l’évolution clonale du gène TP53 qui était l’élément clé de la progression des SMD del(5q) (p=0,009, test de Gray). Le lénalidomide est le traitement spécifique des anémies des SMD del(5q) qui a permis à 71 % des patients de notre étude d’être indépendants des transfusions pendant une durée médiane de 2 ans 1/2. Ensuite, dans près de la moitié des cas, est survenue une transformation en leucémie aiguë (LA) secondaire de pronostic très péjoratif. Les 11 patients avec transformation en LA (dont 10 évolutions clonales de TP53 et une évolution clonale de RUNX1) avaient reçu une dose cumulée de lénalidomide supérieure à celle reçue par les patients dont la tumeur était restée stable (p = 0.036, Test de Mann-Whitney). Conformément à la « théorie de la thérapie adaptative » (Gatenby, 2009), nous avons observé que, dans notre étude, la non-éradication de la tumeur voire la co-existence d’une seconde tumeur pouvait permettre une stabilité de la tumeur initiale sans progression et une survie prolongée avec une bonne qualité de vie. Une étude clinique prospective est requise pour valider ces résultats. Les protocoles conventionnels de thérapie anti-cancéreuse préconisent souvent d'administrer au patient la dose maximale tolérée. La « thérapie adaptative » privilégierait la dose minimale efficace pour ne pas éradiquer les cellules cancéreuses sensibles au traitement et qu'elles restent en compétition avec les cellules cancéreuses résistantes afin de limiter la progression du cancer ou sa rechute. Mots-Clés : TP53, NGS, SMD del(5q), évolution clonale, progression tumorale, lénalidomide.

(9) 10/280. Anglais p53 protein must be altered to let cancer grow. TP53 is the most mutated gene in agressive stages of cancers. We studied TP53 mutations in lower-risk myelodysplastic syndroms with del(5q)-MDS del(5q)- and showed that TP53 status at diagnosis could not predict tumor progression (p=0,777, Gray's test), by contrast with previously published data (Jädersten 2011). We showed that TP53 clonal evolution is the key feature of tumor progression in MDS del(5q)(p=0,009, Gray's test). Lenalidomide is a new specific therapy for anemia in patients with MDS del(5q). It allowed 71 % of patients from our cohort to become transfusion-independent with a median duration of efficacy of 36 months but then, half patients underwent secondary acute transformation of very poor prognosis. We found that the eleven patients with tumor progression (10 with TP53 clonal evolution and 1 with RUNX1 clonal evolution) were given a higher cumulative dose of lenalidomide compared to patients with stable disease (p = 0.036, MannWhitney's test). Similarly to « adaptive therapy theory »(Gatenby 2009), we observed that, in our study, eradication of the tumor wasn’t useful for improvement of quality of life. Absence of eradication might even allow to maintain a clonal equilibrium and a clonal competition between the distinct tumor sub-clones, resistant to lenalidomide or not, and therefore maintain stable disease. This theory of adaptive therapy questions the standard protocols of treatments against cancer, in which the maximal tolerated dose is preferred to the minimal effective dose. The latter might however slow down cancer progression or cancer relapse. To date, few clinical trials (if any) address impact of such models as adaptive therapy predicting that host survival can be maximized if “treatment-for-cure strategy” is replaced by “treatment-for-stability.” A prospective study is needed to validate this model. Key-words : TP53, NGS, MDS del(5q), clonal evolution, tumor progression, lenalidomide.

(10) 11/280. Table des matières Abréviations & Glossaire............................................................................................. 17 Publications et communications................................................................................ 19 Publications.....................................................................................................................19 Communications.............................................................................................................20 1. INTRODUCTION.................................................................................................... 21 1.1. La protéine p53, gardien du génome....................................................................22 1.1.1. Aspects physiologiques....................................................................................22 a) Découverte de p53..............................................................................................22 b) Localisation et Structure....................................................................................22 b.1) Chromosome 17p13.1...............................................................................................22 b.2) Gène TP53 et polymorphismes................................................................................24 b.3) Transcrits....................................................................................................................25 b.4) Protéine nucléaire, facteur de transcription...........................................................27 b.5) TP63 et TP73, autres membres de la famille TP53..................................................28 b.6) Isoformes ou Variants N-terminaux et C-terminaux de p53, p63 et p73..............28. c) Intégration de différents signaux de stress........................................................34 d) Médiateurs en amont de p53.............................................................................35 e) Mécanismes moléculaires ciblés par p53..........................................................36 e.1) Effets dépendant de la transactivation de la transcription....................................36 e.2) Effets nucléaires de p53 indépendants de la transactivation................................39 e.3) Effets cytoplasmiques de p53...................................................................................40. f) Régulation de p53................................................................................................41 f.1) Principaux régulateurs : MDM2, ATM/ATR.............................................................41 f.2) Autres régulateurs post-traductionnels....................................................................42 f.3) Micro-ARN, régulateurs de l'expression de p53 sauvage et mutée........................43. 1.1.2. Anomalies de TP53 dans les cancers..............................................................44 a) Délétions du locus 17p13....................................................................................44 b) Mutations............................................................................................................46 b.1) Prévalence par type de tumeur................................................................................46.

(11) 12/280. b.2) Distribution des mutations......................................................................................49. c) Conséquences fonctionnelles des mutations du gène TP53............................50 c.1) Effet perte de fonction...............................................................................................50 c.2) Activité dominante négative.....................................................................................52 c.3) Effet gain de fonction dominant positif...................................................................53 c.4) Accumulation de la protéine p53 mutée.................................................................54. d) Stratégie de réactivation de p53............................................................................55 1.2. ASPECTS METHODOLOGIQUES..........................................................................57 1.2.1. Séquençage Sanger..........................................................................................58 1.2.2. Séquençage de nouvelle génération (NGS) ou seconde génération............62 a) Définitions...........................................................................................................62 b) Technologie NGS 454® (Roche)..........................................................................64 b.1) Protocole expérimental de construction de la librairie.........................................65 b.2) Séquençage par pyroséquençage en Picotiter plate®.............................................67 b.3) Analyse bioinformatique..........................................................................................68. c) Technologie Illumina MiSeq..............................................................................71 c.1) Protocole de préparation de la librairie Haloplex...................................................71 c.2) Amplification clonale et Séquençage par synthèse avec terminateur réversible (Solexa/Illumina)......................................................................................................74 c.3) Analyse bioinformatique...........................................................................................77. 1.2.3. Séquençage de 3ème génération....................................................................80 Technologie PacBio sur RSII...................................................................................80 a.1) Protocole de préparation de la librairie SMRTbell TM.............................................81 a.2) Séquençage SMRT.....................................................................................................81 a.3) Analyse bioinformatique et erreurs de séquençage...............................................82. 1.2.4. Comparaison des caractéristiques des 4 techniques utilisées pendant ce projet............................................................................................................................ 84 1.3. EVOLUTION CLONALE DES CANCERS...............................................................92 1.3.1. Théorie de PC Nowell (1976)...........................................................................92 1.3.2. Modèle « multiple-hit » de Vogelstein (1988).................................................93 1.3.3. Sélection clonale darwinienne (2007).............................................................94 1.3.4. Hétérogénéité génétique tumorale.................................................................95.

(12) 13/280. 1.4. SYNDROMES MYELODYSPLASIQUES AVEC DÉLÉTION 5Q ISOLEE..............100 1.4.1. Caractéristiques des syndromes myélodysplasiques (SMD)......................101 a) Définition et classifications des SMD..............................................................101 b) Profil génétique des SMD.................................................................................104 b.1) Intérêt diagnostique................................................................................................104 b.2) Intérêt pronostique des marqueurs moléculaires................................................105. c) Mutations de TP53 dans les SMD....................................................................107 1.4.2. SMD de bas risque avec délétion 5q.............................................................109 a) Génotype et phénotype....................................................................................109 b) Mutations de TP53 dans les SMD del(5q).......................................................111 b.1) Transformation en LAM secondaire......................................................................111 b.2) Évolution des recommandations européennes (ELN).........................................111. 1.4.3. Prise en charge des SMD del(5q)...................................................................112 a) Traitement par support transfusionnel et soins de support..........................112 b) Mode d’action du lénalidomide......................................................................112 c) Efficacité du lénalidomide dans les SMD del(5q)...........................................114 d) Effets délétères, étude « PASS MDS del5q ».....................................................115 2. RÉSULTATS.......................................................................................................... 117 2.1. Évolution clonale de TP53....................................................................................118 2.1.1. Objectifs du travail et approche suivie.........................................................118 2.1.2. Analyse sur 40 patients..................................................................................119 a) Caractéristiques de la cohorte initiale.............................................................119 b) Incidence et impact clinique des mutations de TP53 au diagnostic.............120 c) Caractéristiques des 31 mutations de TP53....................................................121 2.1.3. Analyse longitudinale sur 24 patients...........................................................123 a) Caractéristiques de la cohorte "LEN"..............................................................123 b) TP53 au diagnostic et progression...................................................................126 c) Evolution clonale de TP53 : 4 scénarios...........................................................126 d) Impact de l'évolution clonale sur la progression de la maladie....................129 e) Paramètres impactant l'évolution clonale......................................................133 f) Impact du traitement par lénalidomide sur l'évolution clonale....................135 2.1.4. Article publié..................................................................................................139.

(13) 14/280. 2.2. Etude des mutations multiples par technique SMRT........................................154 a) Objectifs du travail et approches suivies............................................................154 a.1) Mutations multiples d’un oncogène au sein d’une même tumeur............154 a.2) PCR"long range"............................................................................................155 b) Analyse SMRT.......................................................................................................156 c) Article publié.........................................................................................................162 3. DISCUSSION........................................................................................................ 189 3.1. Hétérogénéité sous-clonale intra-tumorale des SMD del5q.............................190 3.1.1. Mutations multiples.......................................................................................190 a) « Intérêt » pour la tumeur d’héberger plusieurs mutations ?.........................191 b) Techniques d’étude..........................................................................................191 3.1.2. Une étude ciblée sur le gène TP53 suffit-elle ?.............................................193 a) Une tumeur sur 5 hébergeait JAK2 V617F.......................................................194 b) Coexistence d’hémopathies et mosaïque de mutations somatiques...........195 c) TP53 ne suffit pas à explorer l'hétérogénéité tumorale..................................197 3.2. Évolution clonale et progression tumorale.........................................................198 3.2.1. Impact du statut TP53 au diagnostic............................................................198 3.2.2. Impact de l’évolution clonale de TP53.........................................................201 3.2.3. Pré-existence des clones mutés TP53...........................................................205 a) Outils statistiques dédiés..................................................................................206 b) Backtracking par PCR digitale spécifique d’allèle..........................................207 c) Pré-existence des sous-clones dans les LAM liées au traitement..................209 3.2.4. Evolution clonale du gène RUNX1................................................................211 a) Détection de mutations de RUNX1 dans la progression des SMD del5q......211 b) RUNX1 et cancer...............................................................................................211 c) Synergie entre RUNX1 et la voie p53...............................................................212 3.3. Possible impact de la thérapie.............................................................................214 3.3.1. Lénalidomide vs. placebo ou soins de support............................................214 3.3.2. La dose cumulée de lénalidomide a impacté l'évolution clonale..............216 3.3.3. Importance du suivi génétique.....................................................................219 a) Suivi cytogénétique...........................................................................................219.

(14) 15/280. b) Suivi des mutations TP53.................................................................................221 c) Etude "PASS".....................................................................................................223 4. CONCLUSION - PERSPECTIVES.......................................................................... 225 Justification du protocole.........................................................................................229 Biomarqueurs et prélèvements de surveillance......................................................230 Résultats attendus.....................................................................................................232 5. ANNEXES ............................................................................................................. 235 5.1. Observations de patients sans évolution clonale...............................................236 5.2. LEUCEMIE LYMPHOIDE CHRONIQUE.............................................................241 5.2.1. Mécanismes pathogéniques de la LLC.........................................................241 5.2.2. Profil génétique des LLC................................................................................242 a) TP53 et LLC........................................................................................................242 a.1) A l’ère pré-NGS........................................................................................................242 a.2) Apports du NGS.......................................................................................................243 a.3) Conséquences cliniques..........................................................................................243. 5.2.3. Addiction oncogénique et thérapies ciblées................................................246 a) Addiction oncogénique des cancers................................................................246 b) Thérapies ciblant l'addiction oncogénique à p53..........................................247 5.2.4. Lodé et al., Cell Death Dis 2016 (publié)......................................................251 a) Objectif du travail et approche suivie..............................................................251 b) Discussion – perspectives................................................................................252 6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...................................................................259 7. INDEX................................................................................................................... 277.

(15) Abréviations & Glossaire. 17/280. Abréviations & Glossaire .

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(168) Publications et communications. 19/280. Publications et communications Publications. Emergence and evolution of TP53 mutations are a key feature of disease progression in myelodysplastic patients with lower-risk del(5q) treated with lenalidomide. Lodé L, Ménard A, Flet L, Richebourg S, Loirat M, Eveillard M, Le Bris Y, Godon C, Theisen O, Gagez AL, Cartron G, Commes-Maerten T, Villemagne B, Luycx O, Godmer P, Pellat-Deceunynck C, Soussi T, Béné MC, Delaunay J, Peterlin P. Haematologica. 2017 Dec 21. pii: haematol.2017.181404. doi: 10.3324/haematol.2017.181404. [Epub ahead of print] No abstract available. Single-molecule DNA sequencing of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes with multiple TP53 alterations.. Lodé L, Ameur A, Coste T, Ménard A, Richebourg S, Gaillard JB, Le Bris Y, Béné MC, Lavabre-Bertrand T, Soussi T. Haematologica. 2018 Jan;103(1):e13-e16. doi: 10.3324/haematol.2017.176719. Epub 2017 Oct 27. No abstract available..

(169) 20/280. Publications et communications. Communications ASH 2013, Présentation orale Backtracking Subclonal Mutations Of TP53 In Myelodysplasia (MDS) With Del(5q) With Next-Generation Sequencing (NGS) L Lodé, A Ménard, M Loirat, M Halliez, S Richebourg, P Talmant, C Godon, O Theisen, Y Le Bris, C Girard, N Blin, O Luycx, S Sadot-Lebouvier, N Morineau, P Godmer, F Subiger, B Villemagne, M Éveillard, S Wuillème, A Kohlmann, P Moreau, J Delaunay et Bene MC. Congrès de l'American Society of Hematology, ASH, décembre 2013, abstract 520) (Lodé et al., 2013). SFH 2013, Présentation affichée ÉVOLUTION. CLONALE. CHEZ. UN. PATIENT. ATTEINT. DE. SYNDROME. MYÉLODYSPLASIQUE AVEC DEL(5q) ISOLÉE L Lodé ; C Godon ; A Ménard ; S Richebourg ; M Halliez; M Loirat ; P Talmant; B Mahé ; H Jardel ; P Godmer ; J Delaunay ; MC Béné (Congrès de la Societé Française d'Hématologie, SFH, mars 2013, résumé 002704).

(170) INTRODUCTION. 1.. 21/280.

(171) 22/280. INTRODUCTION. 1.1. La protéine p53, gardien du génome 1.1.1. Aspects physiologiques. p53 a été découverte en 1979 par 4 équipes simultanément, non pas sous sa forme physiologique mais pathologique. De ce fait, elle a d’abord été classée par erreur comme « oncogène » car elle a été initialement identifiée comme un oncogène viral dans les lignées transformées par le virus SV40 (Simian Virus 40) puis clonée en 1984 sous forme mutante à partir de cellules cancéreuses. Ce n’est qu’après clonage du gène murin sauvage qu’elle a été réhabilitée en « suppresseur de tumeur » qui est sa véritable fonction physiologique. En 1989, les délétions 17p13 et mutations du gène TP53 sont décrites par Vogelstein dans les cancers colorectaux. L'invalidation chez la souris de 0, un ou deux allèle(s) génique(s) est décrite en 1992 comme associée à la survenue de tumeurs spontanées chez respectivement 1 % des souris à 18 mois, 2 % des souris à 9 mois ou 75 % des souris à 6 mois (D. Lane & Levine, 2010). Récemment, un renouveau d’intérêt sur les propriétés pathologiques oncogéniques de la protéine p53 mutante (déjà identifiées dès 1979) et la caractérisation de leurs conséquences fonctionnelles ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques ciblées (Walerych et al, 2015) .. ! ". ". #. Le gène TP53 est localisé sur le bras court du chromosome 17 en position 17p13.1. Il est codé par le brin antisens alors que le gène WRAP53 qui lui est chevauchant est codé par le brin sens (Figure 1). L’intérêt pour ce dernier gène a décliné mais il avait été considéré comme potentiellement régulateur positif de TP53 du fait de son caractère « antisens naturel » de l’exon 1 de TP53. D'autres gènes de la famille TP53.

(172) La protéine p53, gardien du génome. 23/280. (TP63 et TP73) présentant une structure similaire à celle de TP53 seront présentés ultérieurement. La position génomique précise de TP53 varie selon l'annotation utilisée : Ensembl : Chromosome 17: 7,661,779-7,687,550 UCSC Human assembly Dec 2013 (GRCH38/hg38) : chr17:7,668,402-7,687,538. Figure 1: Localisation chromosomique des gènes TP53 et WRAP53. Le gène TP53 est porté par le bras court du chromosome 17 et est codé par le brin -. Le gène WRAP53 est codé par le brin + et chevauche l'exon 1 de TP53. (source : http://ki.se/en/onkpat/marianne-farnebos-group).

(173) 24/280. INTRODUCTION. $ %&. '". ! " !NG_017013.2, ou. Ensembl:ENSG00000141510,. ". Figure 2: Organisation du gène TP53 Le gène a une taille d'environ 20kb et est transcrit en un ARNm d'environ 2,2kb ; les exons codants 2 à 11 sont colorés en vert, l'exon 1non codant est coloré en noir, les exons alternatifs 9 beta en rouge et 9 gamma en bleu sont traduits dans les isoformes béta et gamma ; le site ATG classique d'initiation de la traduction est situé dans l'exon 2 ; la taille des exons (E) et des introns (I) est indiquée en paires de bases (source : http://p53.fr). #. $ '(). %. %. *. + !. &. #. ,+-*./(0 '1). ". 2./(. * 7. %. 23, 2!. " 3 2. 7. 3 '.4 5. '6.

(174) La protéine p53, gardien du génome. 25/280. ". " % 9. #. *< 4 ?. '. = 0. 5. :. ". --3 $. ". ;6. 7. 0. ". ,+ < % > ;. # #. ;:. " ;6. ;. 9. '. ". 0 ;. 8. % >. $ ". Figure 3: Variants polymorphiques de TP53 induisant un changement d'acide aminé (Whibley et al, 2009). La séquence codante du gène TP53 est relativement simple à étudier en biologie moléculaire car elle a une taille d'environ 1200 paires de bases (NCBI Reference CCDS 11118.1). Le transcrit classique (variant 1) de TP53 (NCBI Reference Sequence: NM_000545.5 ou Ensembl: ENSG00000141510) a une longueur de 2591bp, sachant que l'exon 1 est non codant. Sept autres transcrits sont décrits dans EMBL/EBI..

(175) 26/280. INTRODUCTION. La région codante de l'ARN messager (ARNm) code pour la protéine qui sera décrite ci-après, les régions non codantes sont classiquement : (i) la région 5' non codante (5'Untranslated region ou 5'UTR) qui permet la traduction de l'ARNm en protéine et joue un rôle dans la stabilité de l'ARNm ; (ii) la région 3' non codante (3'UTR) qui contient des séquences régulatrices et des sites de liaison pour des micro-ARN (miRNA) régulateurs de l'expression de p53 ; (iii) une queue poly-A qui joue un rôle dans l'export nucléaire, la traduction et la stabilité de l'ARNm.. Figure 4: Huit transcrits TP53. Les transcrit t1 à t4 sont générés par le promoteur P1 et les trancrits t5 à t8 sont générés par le promoteur intra-génique P2 (Source : http://www.p53.fr/)..

(176) La protéine p53, gardien du génome. ( ). 27/280. *+. La séquence codante code pour une protéine p53 de 393 acides aminés dans. sa. forme. complète. (NP_000537.3). Son poids moléculaire avait été estimé à l’époque de sa découverte à 53kDa, ce qui avait conduit. ses. co-découvreurs. à. la. baptiser p53. Le poids moléculaire de la protéine native (sans modification post-traductionnelles) a depuis été corrigé à 43 kDa, mais "personne n'oserait songer à rebaptiser p53", dixit Arnold Levine (Levine and Oren, 2009).. Cette protéine ubiquitaire a le plus souvent une fonction de facteur de. Figure 5: Représentation de 4 monomères de p53 interagissant avec une molécule d'ADN . violet/bleu : Molécule d'ADN ; bleu turquoise, vert, orange et jaune :monomères de p53. Les points rouges représentent les codons les plus critiques du domaine de fixation à l'ADN pour l'interaction entre p53 et l'ADN (Source : UCSF). transcription et comprend un domaine de liaison à l’ADN (ou DNA binding domain) situé au centre (ou core) de la protéine p53 (Figure 7B). La protéine p53 contient dans sa partie N-terminale deux domaines de transactivation permettant d’activer la transcription de ses gènes cibles. Sa partie C-terminale contient un domaine de régulation négative et un domaine d’oligomérisation permettant la formation de tétramères de p53 qui seuls peuvent se lier à la double hélice d’ADN (Figure 5). Cette nécessité pour p53 d’adopter cette structure quaternaire en tétramères explique l'impact des mutations somatiques monoalléliques sur la fonction de p53 en terme d’activité dominante négative des formes hétérotétramériques mutant/sauvage(Walid Dridi et al, 2005). Les mutations germinales de TP53 induisent le syndrome de Li-Fraumeni, prédisposant à la survenue de cancers multiples à un âge précoce..

(177) 28/280. INTRODUCTION. *. " ". + ". Le gène TP63 et le gène TP73 ont été respectivement identifiés en 1998 et 1997 et localisés en 3q27 et 1p36. Comme TP53, ils codent pour des facteurs de transcription constitués de domaines transactivateurs en partie N-terminale, d'un domaine de fixation à l'ADN en leur centre et de domaines de tétramérisation et de régulation en région C-terminale. Ils codent de multiples isoformes protéiques dotées d'activités transactivatrices, inductrices de mort cellulaire et dominantes-négatives.. Figure 6: Zones d'homologie entre p53, p63 et p73 (d'après Courtois et al, 2004). Les formes longues de p63 et p73 interviennent au cours du développement et de la différenciation en induisant, comme p53, des gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose. Dans un modèle murin, l'inactivation biallélique de TP63 induit une souris sans peau et des malformations épithéliales, crânio-faciales et des membres tandis que l'inactivation biallélique de TP73 induit une hydrocéphalie, des infections chroniques et des anomalies des voies sensorielles (IARC.fr). Les mutations constitutionnelles de TP63 induisent des anomalies du développement mais pas de cancers. Malgré la quasi-absence de mutations somatiques des gènes TP63 et TP73 dans des cancers, p63 joue un rôle soit d'oncogène, soit de gène suppresseur de tumeurs selon l'isoforme mis en jeu.. ,. + " , #. -. .. ". /. .. ". /. *. Isoformes de p53 Le gène TP53 produit au moins onze protéines plus courtes que la forme canonique de p53 (ou isoforme complet. ). Les formes raccourcies dans la région N-terminale.

(178) La protéine p53, gardien du génome. 29/280. ("variants N-terminaux") sont issues d'épissage alternatif et d'utilisation de sites d'initiation variants de la traduction classique (ATG1) qui sont ATG40, ATG133 et ATG160 et les formes raccourcies dans la région C-terminale ("variants C-terminaux") sont issues de l'épissage alternatif de l'exon 9 et 9. situés dans l'intron 9 "ancestral",. contenant des codons stop prématurés et générant les isoformes variants tronqués et. . Les transcrits comprenant les domaines transactivateurs entiers sont. habituellement préfixés par "TA" tandis que les transcrits alternatifs "DELTA-N" ( N) codent pour des protéines dépourvues de tout ou partie des domaines transactivateurs (TAD)(Figure 7). Le domaine central de fixation à l'ADN est généralement conservé dans ces variants qui peuvent induire un programme transcriptionnel comme la forme canonique.. Figure 7: Description de douze isoformes de p53. (A) Ils dépendent de l'épissage alternatif de l'exon9b et/ou de l’utilisation du promoteur principal P1 ou du promoteur alternatif P2 et/ou du site principal d'initation de la traduction ATG1 ou d'un des 3 sites alternatifs ATG40, ATG133, ATG160 (B) Représentation des isoformes de p53. La forme canonique a deux domaines de transactivation (TAD1 et TAD2), un domaine riche en proline(PXXP), un domaine de liaison à l'ADN (DBD), un domaine de localisation nucléaire (NLS), un domaine d'oligomérisation (OD), et un domaine de régulation négative (Neg) (Surget et al., 2013)..

(179) 30/280. INTRODUCTION. Interaction de p53 avec ses variants d'épissage Les variants. et. N dépourvus de domaine transactivateur auraient une activité. dominante-négative sur les isoformes TA tandis que les variants C-terminaux induiraient leur activation constitutive du fait de l'absence de domaines régulateurs. Dans les cellules exposées au stress, la forme complète de p53 est l'isoforme dominant et il est peu probable que de faibles quantités de variants puissent avoir un effet physiologique. Cependant, dans les cellules non soumises au stress, les niveaux de variants de p53 pourraient égaler voire dépasser les niveaux des formes TA, exerçant ainsi un fort effet régulateur. En cancérologie, le rôle des isoformes de p53 sur l'activité transcriptionnelle de la forme longue de p53 est mal connu. Dans de nombreuses lignées cellulaires, les formes raccourcies de p53 sont présentes à des niveaux détectables, sans que l'on ait pu identifier de quelles isoformes il s'agit précisément. La surrexpression d'une isoforme. N pourrait potentiellement inhiber les fonctions de p53 sauvage dans les. cellules tumorales qui conservent des allèles sauvages, exerçant ainsi un effet dominant négatif (Courtois et al, 2004 ; Chen et al., 2017).. Figure 8: Impact de l'isoforme sur les mutations de TP53 dans le cancer du sein. Les patientes porteuses de cancers du sein avec mutations de TP53 et expression de l'isoforme ont une survie identique aux patientes non mutées pour TP53 (Bourdon et al, 2011). de p53.

(180) La protéine p53, gardien du génome. 31/280. En cas de mutations du gène TP53, les changements d'acides aminés présents sur la forme complète de p53 sont aussi présents sur les variants C- et N-terminaux, puisque produits du même gène. L'impact de ces mutations dans le domaine de fixation à l'ADN sur l'activité transcriptionnelle de ces variants est mal connu. Les cancers du sein porteurs de mutations de TP53 n'ont pas un impact pronostique plus péjoratif que les cancers on mutés. Une étude portant sur 127 patientes montrait une perte des formes variantes d'épissage exprimaient l'isoforme. et. dans 60% des cas. Les cancers mutés pour TP53 qui. (variant C-terminal également muté) avaient un pronostic. radicalement différent des cancers mutés pour TP53 sans isoforme. et avaient le. même pronostic que les tumeurs non mutées pour TP53 (Bourdon et al, 2011), suggérant un effet dominant négatif de l'isoforme gamma sur p53 canonique. En hématologie, l'expression des isoformes. et. de p53 ont été étudiées dans les. Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM) et décrites corrélées aux mutations NPM1 et FLT3 d'impact pronostique respectivement favorable et péjoratif dans les LAM à caryotype normal. Le profil /. identifié chez des sujets sains corrélait avec une survie longue. quand il était retrouvé chez les sujets atteints de LAM alors que l'expression de la forme complète. corrélait négativement avec la survie. Des données expérimentales. de sensibilité à la doxorubicine sur des lignées cellulaires suggéraient que les cellules leucémiques de LAM avec un niveau favorable. /. par rapport à. seraient les. cellules répondeuses aux traitements de chimiothérapie basés sur des anthracyclines (Ånensen et al., 2012).. Isoformes de p63 et p73 Les variants N-terminaux de TP63 et TP73 sont générés par épissage alternatif ou utilisation d'un promoteur interne alternatif présent dans l'intron 3 (P2). Ces isoformes sont désignés par " N" quand ils sont dépourvus de la plus grande partie du domaine transactivateur, par opposition au préfixe "TA" qui désigne les formes compétentes du point de vue de la fonction transactivatrice (Chen et al. 2017, Courtois et al. 2004)(Figure 9)..

(181) 32/280. INTRODUCTION. Figure 9 : Dix isoformes de p63. Contrairement à p53, p63 contient un domaine TID (Trans-inhibitory domain) est ipliqué dans des interactions protéine-protéine et la modulation de l'activité de p63 (Chen et al, 2017). Les isoformes complets ("TA") de p63 peuvent activer les mêmes gènes que p53 en reconnaissant les mêmes séquences consensus dans les promoteurs des même gènes cibles, conduisant comme p53 à l'arrêt du cycle cellulaire, la senescence cellulaire et l'apoptose cellulaire. Au contraire, les variants N-terminaux. np63 inhibent la. transcription de ces gènes, favorisant la prolifération et la survie cellulaire.. Interaction des isoformes de p63 et p73 avec p53 Les variants N-terminaux de p63 ( Np63) sont des represseurs trancriptionnels du fait de l'absence du domaine transctivateur TAD mais aussi du fait qu'ils peuvent antagoniser la transactivation des autres protéines de la famille p53 en formant des complexes inhibiteurs entre eux ou se liant de facon compétitive sur les éléments de réponse à p53 (Chen et al. 2017). En hématologie maligne, les réarrangements somatiques de TP63 mimant des variants N-terminaux de p63 ont été décrits dans 8 % des lymphomes anaplasiques alk-négatifs et associés à un pronostic très défavorable (17 % de survie à 5 ans) (Vasmatzis et al, 2012)..

(182) La protéine p53, gardien du génome. 33/280. Figure 10 : Interactions fonctionnelles entre les isoformes N- et C-terminales de la famille p53 Les formes longues de p53, p63 et p73 sont représentées au centre "full -length isoforms" (Courtois et al, 2004).. Par ailleurs, les formes mutées de p53 peuvent se lier à p73 bloquant sa capacité à transactiver des gènes cibles de l'apoptose. L'extinction de p53 mutée par de petits peptides interférant avec les mutants p53 rend les cellules sensibles avec une augmentation de l'expression des gènes cibles de p73 (Figure 11, Zawacka-Pankau et al., 2010).. Figure 11 : Interaction entre p53 mutée et p73. L'extinction de p53 mutée par des SIMP (Short interfering mutant p53 peptides) restaure le programme transcriptionnel pro-apoptotique de p73 (Zawacka-Pankau et al., 2010).

(183) 34/280. INTRODUCTION. 0. ++. 0. /. p53 a été qualifiée par ses découvreurs de « gardien du génome »(Lane et al, 1992) et de « contrôleur de la prolifération et de la division cellulaire » (Levine et al, 1997). Elle est chargée d’intégrer de nombreux signaux de stress comme les lésions de l’ADN et les signaux prolifératifs mais aussi le stress oxydatif ou réplicatif, l’hypoxie, le raccourcissement des télomères, tous susceptibles de favoriser le cancer. Elle va répondre en induisant des réponses protectrices pour l’organisme hôte à type de blocage du cycle cellulaire, réparation des lésions de l’ADN, apoptose, sénescence mais aussi reprogrammation métabolique, autophagie ...(Figure 12)(Bieging et al, 2014).. Figure 12 : Intégration de différents signaux de stress par p53. Ces signaux sont susceptibles d'induire une tumeur, et sont contre-carrés par les réponses de p53 en tant que suppresseur de tumeur (Bieging et al, 2014).

(184) La protéine p53, gardien du génome. 1. 35/280. ". Des médiateurs répondent aux différents signaux de stress cellulaires en induisant p53 le plus souvent par inhibition de ses régulateurs MDM2 et apparentés. Certains signaux de stress cellulaires induiront p53 via les protéines JNK, Erk p38, HIF-1a. Le modèle le plus élaboré d’induction de p53 est la réponse aux signaux de lésions de l’ADN via ATM/ATR et aux signaux de prolifération via ARF décrits dans la figure 35.. Figure 13 : Activation de p53 et induction de ses réponses. Des lésions de l'ADN ou des signaux de prolifération peuvent induire des kinases et des cascades de phosphorylation conduisant à la stabilisation de p53 et à ses réponses au stress (Bieging et al, 2014). Lorsqu’une cassure double-brin de l’ADN déclenche l'activation d'ATM (ataxiatelangiectasia mutated, une kinase qui phosphoryle la kinase CHK2), ou quand une fourche de réplication défaillante recrute ATR (ataxia telangiectasia and RAD3-related, une kinase qui phosphoryle la kinase CHK1), p53 devient un substrat pour les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 (figure20) qui coordonnent la phosphorylation des sérine S15 et S20 et favorisent sa stabilisation (Bieging et al, 2014). Les signaux oncogéniques activant la prolifération cellulaire perturbent l'interaction entre p53 et MDM2. Ces signaux peuvent stimuler la transcription de E2F, qui peut stimuler la transcription de ARF (alternative reading frame). A son tour, ARF inhibe.

(185) 36/280. INTRODUCTION. MDM2 en antagonisant son activité ubiquitin ligase ou en séquestrant MDM dans les nucléoles. Ainsi, l'activation de ARF favorise la stabilisation de p53, favorisant les réponses de p53 de type apoptose et senescence cellulaire.. 1. ". ". Les mécanismes d'action de p53 sont dépendants ou indépendants de l’activité de transactivateur de transcription, nucléaires ou cytoplasmiques.. Figure 14: Mécanismes d'action de p53 dépendant ou indépendant de l’activité de transactivateur de transcription. MOMP : mitochondrial outer membrane permeabilization (Green et Kroemer, 2009). 2++ En tant que facteur de transcription, p53 va répondre à ces signaux de stress en se fixant sous forme de tétramère au promoteur ou à une région intronique de ses gènes cibles afin de les transactiver..

(186) La protéine p53, gardien du génome. 37/280. p53 (comme p63 et p73) se lie à son gène cible au niveau d'une séquence d’ADN canonique composée d'au moins 2 décamères du type 5'-RRR-C-WWW-G-YYY -3' séparés de 0 à 13 paires de base (Figure 15), un seul motif étant insuffisant pour permettre la transactivation (Goldstein et al., 2011).. Figure 15 : Séquence canonique d'ADN à laquelle se fixe p53. Le facteur de transcription p53 ne peut induire la transcription génique que s'il se lie sur son gène cible à une région canonique constituée d'au moins deux décamères RRRCWWGYYY (Goldstein et al., 2011).. Sous forme plus ou moins dégénérée, cette séquence serait présente près de 24000 fois dans le génome (Bourdon et al, 1997). Une étude récente de méta-analyse sur 13 études à haut débit ont montré qu'environ 3500 gènes potentiels répondaient à p53, de façon variable selon les signaux de stress avec sans doute de nombreux faux positifs. Par analyse ciblée, 346 gènes cibles ont été validés, parmi lesquels des gènes impliqués dans l'apoptose, l'arrêt du cycle cellulaire, la senescence, la répration de l'ADN, le métabolisme, l'autophagie, le micro-environnement tumoral... (Figure 16). A noter que des microARN figurent à la fois parmi les cibles de p53 (dont mir-34a et mir-200c impliqués dans les propriétés invasives des cellules et mir-34a/b/c et mir145 impliqués dans les propriétés des cellules souches) et parmi les régulateurs de p53 (cf infra)..