Caractérisation d'un complexe chromatinien impliqué dans l'inactivation post-transcriptionnelle des ARNs

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Submitted on 27 Nov 2017

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Caractérisation d’un complexe chromatinien impliqué dans l’inactivation post-transcriptionnelle des ARNs

Nicolas Butel

To cite this version:

Nicolas Butel. Caractérisation d’un complexe chromatinien impliqué dans l’inactivation post- transcriptionnelle des ARNs. Biologie moléculaire. Université Paris Saclay (COmUE), 2017. Français.

�NNT : 2017SACLS302�. �tel-01649873�

NNT : 2017SACLS302

THESE DE DOCTORAT

DE L’UNIVERSITE PARIS-SACLAY, préparée à l’Université Paris-Sud

ÉCOLE DOCTORALE N° 567

Sciences du Végétal : du Gène à l’Ecosystème

Spécialité de doctorat : Biologie

Par

M. Nicolas Butel

Caractérisation d’un complexe chromatinien impliqué dans l’inactivation post- transcriptionnelle des ARNs

Thèse présentée et soutenue à Versailles, le 29/09/2017 :

Composition du Jury :

M. Lagrange Thierry Directeur de recherche, CNRS Président & Rapporteur M. Voinnet Olivier Professeur, ETH de Zurïch Rapporteur

M. Benhammed Moussa Maître Conférence, Université Paris-Sud Examinateur Mme. Duharcourt Sandra Directrice de recherche, CNRS Examinatrice Mme. Elmayan Taline Chargé de recherche, INRA Directrice de thèse M Le Masson Ivan Ingénieur de recherche, INRA Co-directeur de thèse

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Remerciements

Je ne pourrai pas remercier directement l’ensemble des personnes qui ont contribué à cette thèse. Je vous envoie donc un merci général ! Cependant, je tiens à remercier certaines personnes pour le rôle important qu’elles ont tenu dans son déroulement.

Le premier et probablement le plus important, est mon directeur de thèse, Ivan, avec qui j’ai véritablement appris ce qu’était le travail de recherche que ce soit dans l’organisation du travail, dans sa réalisation et dans la manière de communiquer les informations scientifiques.

Malgré trois années difficiles pour lui, il a toujours été présent et attentif à mon travail. Tout n’a certes pas été facile, mais si je suis arrivé jusque-là aujourd’hui, c’est en grande partie grâce à toi Ivan. Je te remercie donc sincèrement et j’espère que tu encadreras de nouveau des étudiants, ne serait-ce que pour quelques mois !

Ensuite, je tiens à dire merci à l’ensemble de mon équipe avec qui j’ai eu énormément d’interaction. Je suis notamment extrêmement reconnaissant envers Taline et Hervé pour le temps que vous m’avez accordé que ce soit pour les discussions scientifiques, pour relire mes rapports (et dieu sait qu’il y avait du travail !) ou pour assister à mes présentations. Je salue aussi particulièrement Nathalie et Agnès pour le soutien moral qu’elles m’ont apporté et qui m’a permis de supporter les tensions qui ont eu lieu durant ma thèse.

Merci à vous !

Je veux aussi remercier les personnes qui ont directement contribué à mon travail. Sébastien, Hervé, Bruno et les autres serristes pour l’aide que vous m’avez apporté pour la culture et l’entretien des plantes. Je remercie aussi l’ensemble du service informatique pour leur aide dans l’analyse des suppresseurs et, à qui, je dois d’avoir identifié les gènes avant la fin de ma thèse ! Enfin, je veux aussi remercier Luc et Elodie pour le travail de fond que vous avez effectué et qui a été primordial pour le déroulement de cette thèse.

J’adresse aussi ces remerciements à l’ensemble des doctorants de l’IJPB. Les soirées que nous avons passées ont toujours été des moments de joie et de détente forts agréables. Petite dédicace à Fadi, Olivier et Julien qui ont lancé la dynamique de rencontre, et je vous encourage fortement à continuer! Enfin, je tiens à remercier Isabelle pour les séances de tennis que nous avons faites et pendant lesquelles je me suis beaucoup amusé. Merci à tous, même à ceux que je n’ai pas cité!

3 Je tiens à souligner le soutien moral que m’ont apporté mes proches. Merci à mes parents qui ont toujours cru en moi et qui m’avez toujours encouragé à aller là où je voulais aller. Merci à ma famille et à mes amis (même les biologico-sceptiques) pour avoir toujours été derrière moi. Et enfin un grand merci à Max à qui je dois énormément et qui malheureusement n’assistera pas à la fin de ce cycle.

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Abstract

Post-transcriptional gene silencing (PTGS) is a defense mechanism that targets invading nucleic acids from endogenous (transposons) or exogenous (pathogens, transgenes) origins.

Mutations in JMJ14 and NAC52 have been retrieved from a genetic screen aiming to identify PTGS deficient mutants. JMJ14 encodes an histone demethylase targeting the bi- or tri- methylated lysine 4 of histone H3, while NAC52 encodes a transcription factor. Both act in a complex that regulates the transcription of hundreds endogenous genes. However, the function of this chromatin complex in transgenes expression and in PTGS is not known.

JMJ14 interacts with NAC52 but also with a guanine exchange factor of the RCC1 family.

Mutations in any member of the RCC1-JMJ14-NAC52 complex reduce transgene transcription.

JMJ14 binds to the transgene promoter independently of NAC52, whereas NAC52 requires JMJ14 to bind on the transcribed region. However, JMJ14 and NAC52 do not seem to be required for transcription itself. Indeed, a wild-type level of transcription is restored in the jmj14 drm2 double mutant, suggesting that the complex RCC1-JMJ14-NAC52 prevent de novo DNA methylation of the promoter by DRM2.

The effects of jmj14 and nac52 mutations on transgene transcription cannot explain their specific effect on some forms of PTGS. Indeed, jmj14 and nac52 do not affect constitutively- induced PTGS, but prevent the systemic spreading of locally-induced PTGS. Mutations in SCPL45, encoding a Serine-Carboxy Peptidase-Like that interacts with NAC52, but not JMJ14, have the same effect. In contrast, rcc1 does not affect the systemic PTGS, suggesting that a JMJ14-NAC52-SCPL45 complex is involved in the control of systemic PTGS. This complex could act directly on transgene chromatin to trigger PTGS in response to the PTGS signal, or indirectly by controlling the expression of an endogenous gene encoding a protein regulating systemic PTGS.

To better understand the function of JMJ14 in systemic PTGS, a genetic screen aiming to identify suppressors of jmj14 have been performed. Sixteen mutants corresponding to seven genes encoding proteins related to chromatin and having an antagonist function to JMJ14, have been characterized. Mutations in theses seven genes could suppress jmj14 by increasing transgene transcription and consequently the quantity of the PTGS systemic signal. A seventeenth mutant could have a qualitative effect on the PTGS systemic signal or could affect the perception of this signal in recipient cells. The corresponding gene remains to identify.

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Résumé

Le PTGS (post-transcriptional gene silencing) est un mécanisme de défense qui cible les acides nucléiques invasifs d’origines endogènes (transposons) ou exogènes (pathogènes, transgènes). Des mutations dans les gènes JMJ14 et NAC52 ont été isolés lors d’un crible génétique visant à identifier des mutants déficients en PTGS. JMJ14 code une histone déméthylase ciblant la lysine 4 bi- ou tri-méthylée de l’histone H3, tandis que NAC52 code un facteur de transcription. Ces deux protéines agissent en complexe et régulent la transcription de centaines de gènes endogènes. Toutefois, le rôle de ce complexe chromatinien dans l’expression des transgènes et surtout dans le PTGS reste incompris.

JMJ14 interagit avec NAC52 mais aussi avec une protéine de type guanine exchange factor de la famille RCC1. Des mutations dans l’un ou l’autre des membres du complexe RCC1-JMJ14- NAC52 réduisent la transcription des transgènes. JMJ14 se fixe au promoteur de façon indépendante de NAC52, tandis que NAC52 a besoin de JMJ14 pour se fixer à la région transcrite. Toutefois, JMJ14 et NAC52 ne semblent pas requis pour la transcription proprement dite. En effet, un niveau normal de transcription est restauré chez le double mutant jmj14 drm2, indiquant que le rôle du complexe RCC1-JMJ14-NAC52 semble être d’empêcher la méthylation de novo du promoteur par DRM2.

L’effet des mutations jmj14 et nac52 sur la transcription des transgènes ne peut expliquer leur effet sur certaines formes de PTGS. En effet, les mutations jmj14 et nac52 n’affectent pas le PTGS induit constitutivement. Par contre, elles empêchent la systémie du PTGS induit localement. Des mutations dans le gène SPCL45 codant une Serine Carboxy Peptidase-Like qui interagit avec NAC52, mais pas JMJ14, ont le même effet. En revanche, la mutation rcc1 n’affecte pas la systémie du PTGS, suggérant que c’est au sein d’un complexe JMJ14-NAC2- SPCL45 que JMJ14 et NAC52 contrôlent le PTGS systémique. Ce complexe pourrait agir directement sur la chromatine du transgène pour permettre d’enclencher le PTGS en réponse à la perception du signal systémique, ou indirectement en contrôlant l’expression d’un gène endogène codant une protéine régulant la systémie du PTGS.

Afin de mieux comprendre le rôle de JMJ14 dans la systémie du PTGS, un crible génétique visant à isoler des suppresseurs de la mutation jmj14 a été réalisé. Seize mutants correspondants à sept gènes codant des protéines ayant un lien avec la chromatine et une

6 action antagoniste à JMJ14 ont été caractérisés. Les mutations dans ces sept gènes pourraient supprimer l’effet de jmj14 en augmentant la transcription du transgène cible et donc la quantité du signal systémique de PTGS. Un 17^ème mutant pourrait quant à lui affecter qualitativement le signal systémique de PTGS ou la perception du signal dans les cellules qui le reçoivent. Le gène correspondant reste à identifier.

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Table des matières

Remerciements

Abstract

Résumé

Table des matières

Introduction

I. Le RNA silencing ... 12

I.1 Acteurs et effecteurs du RNA silencing ... 14

I.1.1 Origine des ARNs double brins ... 14

I.1.2 Enzymes DICER et types de siRNAs ... 16

I.1.3 Enzymes ARGONAUTEs et type d’activité guidée par les petits ARNs ... 18

I.2 Les différentes utilisations du RNA silencing par la cellule ... 21

I.2.3 La régulation des gènes endogènes par le RNA silencing ... 21

I.2.2 Le RNA silencing utilisé dans la défense contre les éléments transposables ... 23

I.2.3 Le RNA silencing permet de protéger les plantes contre les infections virales ... 28

I.2.4 Le silencing des transgènes ... 29

I.2.5 La suppression médiée par les ARNs est un mécanisme pouvant se propager à travers la plante ... 31

II. JMJ14 et NAC52, deux protéines liées à la transcription, affectent le PTGS ... 33

II.1 Mise en place d’un crible génétique afin d’identifier les gènes impliquées dans le S- PTGS ... 33

II.1.1 Obtention de lignées portant le transgène p35S:uidA ... 33

II.1.2 Identification des mutations jmj14 et sgs1 ... 35

II.2 Présentation des fonctions connues de NAC52 et de JMJ14... 37

II.2.1 NAC52 est un facteur de transcription à domaine NAC ... 37

II.2.2 JMJ14 code pour une histone déméthylase ... 38

II.2.3 JMJ14 et NAC52 interagissent physiquement et sont impliqués dans la transcription de nombreux gènes endogènes ... 40

8

II.3 Généralités sur la transcription initiée par la polymérase II ... 41

II.3.1 Les différentes étapes de la transcription par la polymérase II ... 41

II.3.2 Rôle de la chromatine sur la transcription ... 43

III. Problématique et plan de ce manuscrit ... 46

Résultats

I. Etude de la mutation jmj14 sur différents systèmes induisant le PTGS ... 49

I.1 Etat du PTGS dans les plantes portant la mutation jmj14 ... 51

I.1.1 Un PTGS résiduel de L1 est détecté en fond jmj14 ... 51

I.1.2 JMJ14 est nécessaire à l’induction du PTGS de 6b4 en réponse au signal systémique de silencing produit par L1 ... 52

I.2 La mutation jmj14 affecte le PTGS systémique mais pas le PTGS constitutif ... 55

I.2.1 jmj14 affecte partiellement le PTGS de 6b4 induit par des mutations du RQC ... 55

I.2.2 jmj14 affecte le PTGS de SUL induit localement par des siRNAs mais pas des miRNAs ... 58

1.2.3 JMJ14 n’est pas impliqué dans le PTGS des systèmes où la source et la cible du PTGS sont produit au sein des mêmes cellules ... 59

I.3 Conclusion ... 62

II. Caractérisation des protéines interagissant avec JMJ14 ou ses partenaires ... 63

II.1 Identification et caractérisation des protéines interagissant avec JMJ14 ... 63

II.1.1 Identification des partenaires protéiques de JMJ14 ... 63

II.1.2 Effets de mutations dans AT5G11580 sur le PTGS ... 64

II.1.3 Effet de mutations dans NAC50 sur le PTGS... 67

II.1.4 Effet de mutations dans NAC52 sur le PTGS ... 69

II.2 Identification et caractérisation des protéines interagissant avec NAC52... 72

II.2.1 Identification des partenaires protéiques de NAC52 ... 72

II.2.2 Effet de mutations dans SCPL45 sur le PTGS ... 72

II.3 Conclusion ... 74

9 III. Recherche du gène potentiellement impliqué dans la régulation du PTGS par

JMJ14 et NAC52 ... 75

III.1 Identification des gènes conjointement dérégulés chez jmj14, sgs1 et nac52 ... 75

III.2 Caractérisation du rôle de quatre gènes co-régulés par JMJ14 et NAC52 ... 79

II.2.1 Effet de mutations dans PRE-MRNA PROCESSING 8b (PRP8b) sur le PTGS ... 79

II.2.2 Effet de mutations dans CHROMATIN REMOLDELING 31 (CHR31) sur le PTGS ... 81

II.2.3 Effet de mutations dans MTO 1 RESPONSING DOWN (MRD1) et ENHANCER OF CELL INVASION NO.10 (HEI10) sur le PTGS ... 83

II.3 Conclusion ... 85

IV. Isolement de mutants suppresseurs de jmj14 ... 86

IV.1 Principe et déroulement du crible ... 86

IV.1.1 Choix du fond génétique de départ ... 86

IV.1.2 Déroulement du crible ... 86

IV.2 Caractérisation des suppresseurs de jmj14 ... 91

IV.2.1 Analyse des suppresseurs forts ... 91

IV.2.2 Analyse des suppresseurs intermédiaires ... 94

IV.2.3 Identification des gènes impliqués dans la suppression de jmj14 chez les suppresseurs intermédiaires ... 97

IV.3 Bilan sur le crible suppresseur des plantes JAP3/L1/jmj14 ... 105

V. Caractérisation d’un allèle nac52 néomorphe appelé sgs1 ... 108

IV.1 Caractérisation de l’effet de sgs1 sur la transcription et sur le PTGS de L1 et 6b4 108 V.2 Caractérisation complémentaire de sgs1 ... 142

V.2.1 Caractérisation de l’effet de sgs1 sur l’IR-PTGS ... 142

V.2.2 Accrochage de JMJ14 et NAC52 à la chromatine ... 143

V.3 Réalisation d’un crible génétique sur JAP3/sgs1 ... 145

V.3.1 Choix de la lignée et déroulement du crible ... 145

V.3.3 Caractérisation moléculaire des suppresseurs son ... 148

V.4 Bilan sur l’étude de sgs1 ... 151

10

Discussion ... 152

Caractérisation du rôle de JMJ14 sur le PTGS ... 153

Mise en évidence de l’existence de deux complexes impliqués dans la régulation des transgènes ... 156

Caractérisation du mode d’action de JMJ14 et de NAC52 sur la transcription des transgènes ... 158

AGO4, DCL3, HDA6, MOM1, FDM5 jouent un rôle antagoniste à JMJ14 sur le silencing de JAP3 ... 161

Modèle décrivant la production des siRNAs PDS dans les plantes JAP3 ... 164

Modèle sur la systémie du PTGS des transgènes et sur l’action de JMJ14 et NAC52 au sein de ce mécanisme ... 167

Matériel et Méthodes ... 171

Annexes ... 177

Table des figures ... 178

Table des tableaux ... 180

Abréviations utilisées ... 181

Références bibliographiques ... 183

11

Introduction

12

I. Le RNA silencing

Le dogme fondamental de la biologie moléculaire suppose que les ARNs messagers (ARNm), produits par la transcription de l’ADN, vont être traduits en protéines. Le maintien de la quantité correcte de protéines est un enjeu crucial pour la cellule afin d’assurer l’ensemble des fonctions nécessaires à sa survie. Différents niveaux de contrôles peuvent être observés.

Le premier consiste à moduler la synthèse des ARNs par régulation de la transcription (Liu et al. 2013). Le second est représenté par le RNA quality control (RQC) qui dégrade les ARNs de la cellule présentant des aberrations qui pourraient conduire à la formation de protéines incorrectes (Schmid & Jensen 2010). Un troisième niveau consiste à réguler la traduction des ARNm en protéines (Bologna & Voinnet 2014). Enfin, les ARNm peuvent être dégradés post- transcriptionnellement, avant ou après traduction.

Le RNA silencing ou RNA interférence (RNAi) participe au contrôle de la quantité des ARNs. Ce mécanisme est retrouvé chez l’ensemble des eucaryotes, à l’exception de quelques levures (Kim et al. 2009; Bologna & Voinnet 2014; Holoch & Moazed 2015). D’une manière générale, le RNAi est initié par un ARN double brin (ARNdb) qui est ensuite transformé en petits ARNs d’une taille de 20 à 30 nucléotides (-nt). Ces petits ARNs servent de guides à des protéines appelées ARGONAUTE (AGO) afin de reconnaître et réguler leurs cibles (ADN ou longs ARNs).

Les cibles sont définies par complémentarité de bases avec les petits ARNs. On distinguera le RNAi agissant exclusivement en trans (trans-RNAi) et le RNAi agissant en cis comme en trans (plus simplement appelé cis-RNAi par la suite). Dans le trans-RNAi, les séquences qui sont régulées par des petits ARNs sont distinctes des séquences qui produisent ces petits ARNs. Le trans-RNAi correspond principalement à la régulation des gènes endogènes par des microRNA (miRNAs). On le retrouve chez les animaux, les plantes et les champignons.

Exceptionnellement, certains types de siRNAs agissent presque exclusivement en trans (par exemple les ta-siRNAs chez les plantes). Dans le cis-RNAi, les séquences qui sont régulées par des petits ARNs et les séquences qui produisent ces petits ARNs se confondent. Le cis-RNAi correspond principalement à un mécanisme de type immunitaire qui vise à produire des siRNAs à partir de séquences invasives endogènes (transposons) ou exogènes (pathogènes ou

13 transgènes) afin de les éliminer. Comme mentionné plus haut, ce processus peut agir également en trans sur des séquences homologues endogènes ou exogènes. Il est important de noter que d’autres mécanismes apparentés au RNAi et mettant en jeu d’autres types de petits ARNs sont trouvés chez certains organismes. Par exemple, l’élimination de micro- séquences lors de l’amplification du macronoyau chez les ciliés (Garnier et al. 2004).

Le RNAi peut survenir au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. Chez les plantes, on parlera dans le premier cas de RNA-directed-DNA-METHYLATION (RdDM) ou de transcriptional gene silencing (TGS), et dans le second de post-transcriptional gene silencing (PTGS). Le TGS/RdDM implique essentiellement des siRNAs de 24-nt et catalyse la méthylation des cytosines de l’ADN (Wierzbicki et al. 2008; Yokthongwattana et al. 2009). L’équivalent chez les animaux est la voie des piwiRNA qui permet le contrôle des éléments mobiles de l’ADN dans les cellules germinales (Iwasaki et al. 2015). Le PTGS quant à lui implique des siRNAs de 21- ou 22-nt et catalyse la dégradation ou la répression traductionnelle des ARNs (Bologna &

Voinnet 2014). Ce mécanisme qui permet de neutraliser les virus a été découvert chez les plantes, mais il est également retrouvé chez les animaux (nématodes, drosophiles, mammifères) (Schütz & Sarnow 2005; Obbard et al. 2008; van Rij & Berezikov 2009; Maillard et al. 2013; Zhang et al. 2015a). Cependant, de nombreux virus se sont adaptés et produisent des protéines réprimant le PTGS (Pumplin & Voinnet 2013; Csorba et al. 2015).

Le RNAi est donc un processus très important chez les plantes servant à la fois à la régulation des gènes endogènes (par des miRNAs et ta-siRNAs), mais aussi à la protection des cellules contre les virus ou les transposons. La caractérisation du fonctionnement de ce mécanisme est donc un enjeu important. Lors de cette thèse, mon travail a consisté à étudier l’implication de la chromatine à la fois dans le TGS et le PTGS. Je vais donc, lors de cette introduction décrire en détail les mécanismes de TGS et de PTGS, ainsi que les protéines impliquées.

14

I.1 Acteurs et effecteurs du RNA silencing

Malgré des différences existant entre les différents mécanismes de RNAi, le principe général est conservé. Ainsi le clivage des ARNdb en petits ARNs est généralement assuré par une classe d’enzymes à domaine RNase III appelées DICER, tandis que le guidage des petits ARN vers leurs cibles est assuré par une classe d’enzymes à domaine RNaseH appelées ARGONAUTE. De manière à bien comprendre le RNAi, il est important de connaître la spécificité de ces enzymes.

I.1.1 Origine des ARNs double brins

Des structures doubles brins peuvent se former naturellement lorsqu’un ARN contient des séquences complémentaires dans sa séquence nucléotidique, ce qui lui permet de se replier partiellement en ARNdb. Pour décrire les évènements de PTGS induits par des transcrits en inverse repeat (IR), nous parlerons d’IR-PTGS (Figure 1). Les ARN en IR d’origine endogène sont généralement imparfaitement appareillés. Une première catégorie correspond aux précurseurs des miRNAs codés par les gènes MIR. La partie double brin est généralement assez courte (Park et al. 2002; Reinhart et al. 2002). Une seconde catégorie correspond à des ARNs en IR plus longs que les précurseurs de miRNAs (Henderson et al. 2006; Kasschau et al. 2007;

Montavon et al. 2016). Certains de ces loci correspondent à des loci MIR en devenir (Rajagopalan et al. 2006). La fonction des autres loci de ce type demeure mystérieuse.

La formation d’un ARNdb peut aussi provenir de l’appariement d’ARN sens et antisens distincts provenant de deux évènements transcriptionnels indépendants. On parlera de cis- natural antisens RNA lorsque les transcrits sens et antisens sont transcrits à partir des 2 brins d’ADN d’un locus unique et de trans-natural antisens RNA lorsqu’ils sont transcrits à partir de deux régions différentes du génome (Zhai et al. 2015). Pour décrire les évènements de PTGS induits par deux transcrits complémentaires, nous parlerons donc d’AS-PTGS (Figure 1).

Enfin, le PTGS peut être initié par des ARNs simple brin ne présentant ni structure en inverse repeat, ni complémentarité avec d’autres ARNs (Napoli et al. 1990; Elmayan et al. 1998). Dans ces conditions, l’ARNdb provient de l’action d’enzymes appelées RNA DEPENDANT RNA

15 POLYMERASE (RDRs) qui utilisent un ARN comme matrice afin de synthétiser un brin complémentaire (Baeg et al. 2017). Pour décrire les évènements de PTGS induits par un ARN sens transformé en ARNdb par une RDR, nous parlerons donc de S-PTGS (Figure 1). De manière à éviter un emballement du système conduisant à la dégradation aspécifique de tout ARNs, les RDRs ont des activités restreintes. Ainsi, RDR2 agit presque exclusivement sur les transcrits produits par la POLYMERASE IV (POL IV) (Li et al. 2014; Blevins et al. 2015). RDR1 et RDR6 semblent préférer les ARNs sans coiffe ou sans queue poly-adénylé (Martinez de Alba et al.

2015; Baeg et al. 2017) produits par certains locus (Parent et al. 2015b), certains virus (Garcia- Ruiz et al. 2010), ou issus du clivage par des endonucléases de type AGO (Yoshikawa et al.

2005).

Figure 1 : Schéma représentant les trois manières amenant à la formation d’un ARN double brin qui induira alors le PTGS.

Dans le sens PTGS (S-PTGS), le gène produit des ARNm aberrant qui vont entrainer la synthèse d’un brin complémentaire à l’ARNm. Dans l’AS-PTGS, le génome va produire un ARN sens et un ARN dit antisens qui lui est complémentaire, et qui en cas de rencontre vont pouvoir former un duplexe ARN. Dans l’inverse-repeat PTGS (IR-PTGS), l’ARN produit par un gène va se conformer naturellement en structure tige-boucle possédant une partie double brin parfaitement ou imparfaitement complémentaire. Dans tous les cas, la présence de l’ARN double brin conduira à l’initiation du PTGS.

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I.1.2 Enzymes DICER et types de siRNAs

Les ARNdb sont processés par des ribonucléases de type III appelées DICER (DICER-LIKE ou DCL chez les plantes). Ce clivage donne naissance à des duplexes d’une vingtaine de nucléotide présentant des extrémités 3’ sortantes de 2-nt (MacRae 2006). Ces extrémités sont une signature de l’action des DICERs (Chapman & Carrington 2007). Chez Arabidopsis thaliana, les types de petits ARNs ont été classés suivant leurs modes de production.

Une première catégorie correspond aux miRNAs. Les ARNs précurseurs codés par les gènes MIR, sont généralement assez courts et sont processés par DCL1 en un ou deux duplexes d’une vingtaine de nucléotides (Park et al. 2002; Vazquez et al. 2004). La majorité des miRNAs matures (simple brin) possèdent une taille de 21-nt (Henderson et al. 2006) mais du fait de la présence de renflements asymétriques sur un brin ou l’autre dans les zones appareillés, des miRNAs d’une taille de 20 ou 22-nt peuvent être produit. Comme nous le verrons au chapitre suivant, les miRNAs d’une taille de 22-nt permettent la production de siRNA secondaires comme les trans-acting siRNA (ta-siRNAs)(Chen et al. 2010). Certains miRNAs, dits jeunes, sont produits par des ARNs beaucoup plus longs que les précurseurs classiques de miRNAs. Ils sont processés par DCL4 en multiples petits ARNs de 21-nt dont le produit majoritaire est considéré comme un miRNA en devenir (Rajagopalan et al. 2006). Les autres longs IR endogènes sont processés en endoIR-siRNAs de 21, 22 ou 24-nt selon qu’ils sont processés par DCL4, DCL2 ou DCL3 (Henderson et al. 2006; Kasschau et al. 2007; Montavon et al. 2016). Leurs fonctions restent encore mystérieuses.

Les trans-acting siRNA (ta-siRNA) sont des siRNAs secondaires provenant du clivage d’un ARNdb par DCL4 qui libère des duplexes de siRNA de 21-nt (Henderson et al. 2006). Ces ARNdb ont la particularité de provenir de la transformation par une RDR d’un fragment d’un ARN TAS clivé originellement par une protéine AGO ayant chargé un miRNA de 22-nt (Adenot et al.

2006; Fahlgren et al. 2006; Montgomery et al. 2008).

Les nat-siRNA sont produits à partir d’ARNdb brins formés par deux ARNs complémentaires produits en cis- ou en trans-. Quelques exemples de nat-siRNA ont été décrits dans la littérature (Borsani et al. 2005; Katiyar-Agarwal et al. 2006; Ron et al. 2010). Comme les

17 endoIR-siRNA, différentes DCLs peuvent être impliquées dans leur production. Ainsi, certains nat-siRNAs dépendent de l’action de DCL1 (Katiyar-Agarwal et al. 2006; Ron et al. 2010) alors que d’autres dépendent de DCL2 (Borsani et al. 2005).

Les p4-siRNAs représentent le groupe de siRNAs le plus abondant chez Arabidopsis thaliana (Llave et al. 2002; Kasschau et al. 2007). Ils proviennent du clivage par DCL3 des ARNdb formés par l’action de RDR2 sur les transcrits produits par la polymérase IV (Blevins et al. 2015). Les p4-siRNAs ont une taille de 24-nt (Henderson et al. 2006). Les transcrits de la polymérase IV étant généralement court (30-45-nt), les p4-siRNAs proviennent généralement d’un unique clivage de l’ARN précurseur (Blevins et al. 2015; Zhai et al. 2015). DCL3 ayant une affinité pour les ARNdb courts, DCL4 ou la RNase III RTL2 raccourcissent certains précurseurs plus longs parfois produits par Pol IV et RDR2 afin de faciliter l’accès de DCL3 (Elvira-Matelot et al. 2016b;

Pumplin et al. 2016).

Certains petits ARNs ne sont pas présent constitutivement dans les plantes. On peut citer les diRNAs et uviRNAs de 21-nt produits par DCL4 lors de lésions de l’ADN (Wei et al. 2012; Schalk et al. 2017). Par ailleurs, des ARN aberrants endogènes peuvent donner naissance à des siRNA de 21-nt via l’action de RDR1 ou RDR6, et de DCL4 lorsque la machinerie de RQC qui vise à éliminer ces ARN aberrants est défaillante (Martinez de Alba et al. 2015; Zhang et al. 2015c).

Enfin, des siRNA ne correspondant pas à des séquences du génome peuvent être produits en réponse à l’introduction d’éléments exogènes. Par exemple, les ARNs viraux sont processés par DCL2, DCL3 et DCL4 en siRNA de 22, 24 et 21-nt respectivement (Bouché et al. 2006;

Deleris et al. 2006; Blevins et al. 2006).

Les siRNAs peuvent aussi provenir de l’insertion d’un transgène dans le génome de la plante.

Les ARNs de transgènes adoptants une structure similaire aux transcrits produits par les gènes MIR sont processés par DCL1 (Fenselau de Felippes et al. 2010), tandis que les transgènes produisant de longues IR sont processés par DCL2, DCL3 et DCL4 (Himber et al. 2003; Smith et al. 2007; Parent et al. 2015a). Dans le cas des transgènes sens produisant des ARN ne présentant ni structure en inverse repeat, ni complémentarité avec d’autres ARN, il peut

18 arriver que la production d’ARN aberrant excède la capacité de dégradation de la machinerie RQC. Dans ce cas, ces ARNs aberrants sont ciblés par des RDRs entrainant la production d’ARNdb qui vont être processés par DCL2, DCL3 et DCL4 en siRNA de 22, 24 et 21-nt respectivement.

I.1.3 Enzymes ARGONAUTEs et type d’activité guidée par les petits ARNs

Les miRNAs et siRNAs sont méthylés au niveau de leur extrémité 3’ par HEN1 ce qui les protège de l’uridylation et de la dégradation (Li et al. 2005; Yang et al. 2006; Ren et al. 2014). Une fois pris en charge par les protéines AGO, les petits ARNs guident les AGO vers les séquences complémentaires. Leur action dépend du type d’AGO et du siRNA impliqué. Chez Arabidopsis thaliana, il y a 10 protéines AGO (Vaucheret 2008). Deux familles peuvent être définies. La première comprend AGO1, AGO2, AGO5, AGO7 et AGO10 qui sont impliqués dans le PTGS en permettant de cliver ou de réprimer la traduction des ARNs cibles. Le second groupe comprend AGO4, AGO6 et AGO9 qui sont impliqués dans le TGS et conduisent à la répression transcriptionnelle des loci cibles.

AGO1 prend en charge la plupart des miRNAs produits par DCL1 et des ta-siRNA produits par DCL4. Une fois chargé d’un petit ARN, AGO1 va soit entraîner le clivage (Fagard et al. 2000;

Arribas-Hernández et al. 2016), soit inhiber la traduction des ARNs complémentaire au siRNA (Brodersen et al. 2008). Lorsque AGO1 est liée à un siRNA de 22-nt, elle va pouvoir initier la production de siRNA secondaire à partir d’un fragment de l’ARN clivé (Chen et al. 2010). Ce phénomène permet la transitivité du signal et est important pour générer les ta-siRNA (Chen et al. 2010). De par son association à la plupart des miRNAs, AGO1 joue un rôle important dans le développement de la plante, et les mutants nuls d’AGO1 présentent de grosses anomalies développementales et sont stériles (Bohmert et al. 1998).

AGO2 est impliquée dans la défense virale (Harvey et al. 2011; Brosseau & Moffett 2015) et dans la gestion de quelques miRNAs (Maunoury & Vaucheret 2011; Zhang et al. 2011).

Contrairement aux mutants ago1, les mutants ago2 se développent normalement. En effet, en temps normal, la protéine est très peu exprimée car l’ARNm d’AGO2 est régulé par miR403 via l’action d’AGO1 (Harvey et al. 2011). Cependant, lors d’infections virales, l’action d’AGO1

19 est souvent inhibée, ce qui lève l’inhibition exercée par le miRNA et induit donc l’accumulation de AGO2 (Harvey et al. 2011).

AGO5 n’est pas exprimée dans les parties végétatives, et chez Arabidopsis les mutants ago5 se développent normalement. Toutefois, son expression est induite en cas d’infection par certain virus, et son activité de clivage joue un rôle redondant avec AGO2 dans la résistance antivirale (Brosseau & Moffett 2015).

AGO7 possède un rôle très restreint. Elle est impliquée dans la voie des ta-siRNA où elle prend en charge miR390 pour cliver l’ARN TAS3 (Adenot et al. 2006; Montgomery et al. 2008). Les mutants présentent le phénotype foliaire caractéristique des mutants de la voie des ta-siRNA.

Enfin, AGO10, aussi appelé ZLL, possède un rôle partiellement redondant à celui d’AGO1 puisque le double mutant ago1 ago10 n’est pas viable (Mallory et al. 2009). AGO10 peut charger certains miRNAs et conduire à l’inhibition de la traduction des ARNm cibles (Brodersen et al. 2008; Mallory & Vaucheret 2009). Il a par ailleurs été montré qu’AGO10 pouvait entrer en compétition avec AGO1 pour le chargement des miR166/165 et que cette ‘’séquestration’’

empêchait le clivage des cibles de miR165/166 dans les tissus du méristème où AGO10 est exprimée (Zhu et al. 2011).

AGO4, AGO6 et AGO9 sont impliquées dans la RdDM. Cela signifie qu’elles chargent des siRNAs, généralement de 24-nt, et conduisent à la répression transcriptionnelle des loci homologue (Wierzbicki et al. 2008). Au niveau de la chromatine, AGO4 permet le recrutement de DRM2 qui méthyle les cytosines de l’ADN et initie ainsi la répression transcriptionnelle (Zhong et al. 2014). AGO6 joue un rôle redondant sur un certain nombre de loci même si son effet semble moins important (Zheng et al. 2007). Elle a aussi été impliquée dans la mise en place de la RdDM sur les transposons après que l’ARN du transposon ait été dégradé par du PTGS (McCue et al. 2015). Pour réaliser cette répression, AGO6 charge des siRNAs de 21 et 22- nt (McCue et al. 2015). AGO6 semble donc pouvoir se lier à différents siRNAs présent dans la cellule.

AGO9 est exprimée dans les fleurs et est impliquée dans la répression transcriptionnelle des transposons présents au sein de l’ovule (Durán-Figueroa & Vielle-Calzada 2010). Comme AGO4, elle lie majoritairement les siRNA de 24-nt (Durán-Figueroa & Vielle-Calzada 2010) et

20 est capable d’interagir avec DRM2 pour venir méthyler les loci qu’elle affecte (Zhong et al.

2014).

AGO3 et AGO8 restent peu caractérisés. Ces gènes sont juxtaposés à AGO2 et AGO9, et leurs séquences sont très proches car ils résultent de duplications récentes. Il semblerait qu’AGO8 ne soit pas actif (Mallory & Vaucheret 2010). AGO3 ne possède pas de rôle bien défini actuellement. Il a cependant été montré qu’elle pouvait lier les siRNAs de 24-nt (Zhang et al.

2016). De plus, sa surexpression complémente partiellement ago4 ce qui suggère qu’AGO3 pourrait être impliquée dans la RdDM mais avec un rôle très réduit (Zhang et al. 2016).

21

I.2 Les différentes utilisations du RNA silencing par la cellule

I.2.3 La régulation des gènes endogènes par le RNA silencing

Une petite fraction des gènes endogènes est régulée par du PTGS. Il s’agit des gènes produisant des ARNm ciblés par les miRNAs, les ta-siRNAs et les nat-siRNAs. Deux actions peuvent avoir lieu : le clivage ou la répression traductionnelle de l’ARNm ciblé selon que les miRNAs ou siRNAs s’associent à AGO1, AGO2 ou AGO10. Les cas de répression traductionnelle sont peu nombreux (Brodersen et al. 2008; Lanet et al. 2009; Mallory et al. 2009) tandis que le clivage est général (Baumberger & Baulcombe 2005; Montgomery et al. 2008; Zhang et al.

2011; Arribas-Hernández et al. 2016). Le clivage conduit à l’apparition de deux fragments d’ARNs qui sont généralement dégradés, excepté lorsque les miRNAs utilisés par AGO1 font une taille de 22-nt (Chen et al. 2010; Cuperus et al. 2010). Dans ce cas, il a été observé que les fragments sont stabilisés par SGS3 et utilisés par RDR6 de manière à donner un nouvel ARNdb qui est processé par DCL4 afin de produire des siRNAs secondaires (Chen et al. 2010) (Figure 2).

Les gènes endogènes produisent des ARN aberrants qui pourraient théoriquement entrer dans la voie du S-PTGS. Toutefois, les gènes endogènes échappent généralement au S-PTGS car les ARN aberrants qu’ils produisent sont dégradés par le RQC (voir plus loin). Les rares cas décrits concernent des allèles particuliers de gènes non essentiels. Généralement, ce sont des duplications qui permettent le déclenchement du mécanisme. Les allèles produisant des siRNAs correspondant à la région codante vont conduire à la mise en place de PTGS et donc au clivage de l’ARNm (Vedova et al. 2005; Tuteja et al. 2009). Au contraire, les allèles produisant des siRNAs correspondant à la région promotrice vont entraîner de l’inhibition transcriptionnelle du locus (Melquist & Bender 2004; Durand et al. 2012).

22 Figure 2 : Voies du PTGS endogène

Le schéma classique du PTGS part d’un ARN double brin. Cet ARN est processé par des DICERs en petits ARNs interférant (siRNAs) ou en miRNA. Ces petits ARNs vont alors être méthylés par HEN1, puis vont être pris en charge par une protéine ARGONAUTE qui va les utiliser de manière à reconnaître tout ARN complémentaires au petit ARN. La reconnaissance de la cible permettra sa répression traductionnelle ou son clivage. Dans le cas où les petits ARNs font une taille de 22-nt, les fragments résultants du clivage par AGO seront utilisés par RDR6 et SGS3 pour synthétiser un nouvel ARNdb qui sera processé par DCL4. Il existe plusieurs voies endogènes utilisant ce mécanisme qui sont décrites dans cette figure qui est adaptée de la figure 1 de cet article(Martinez de Alba et al. 2013).

23

I.2.2 Le RNA silencing utilisé dans la défense contre les éléments transposables

Les transposons sont des séquences de l’ADN capables de se déplacer au sein des génomes par des mécanismes de couper/coller ou de copier/coller. En s’insérant dans le génome, le transposon peut causer des effets délétères surtout si l’insertion a lieu dans un gène. Il est donc important de contrôler les évènements de transposition. Le RNA silencing joue un rôle important dans ce contrôle. D’ailleurs, les siRNAs les plus accumulés chez Arabidopsis thaliana ciblent les transposons (Llave et al. 2002; Kasschau et al. 2007).

La plupart des transposons présents dans le génome d’Arabidopsis thaliana sont soumis à de la répression transcriptionnelle. Cette répression transcriptionnelle est mise en place par la voie RdDM. Ce mécanisme suit le même principe que le PTGS mais dépend de la transcription de deux polymérases spécifiques aux plantes que sont la POLYMERASE IV (Pol IV) et la POLYMERASE V (Pol V) (Wierzbicki et al. 2008). Dans un premier temps, la polymérase IV transcrit un ARN relativement court d’environ 40 nucléotides (Blevins et al. 2015). La Pol IV interagit avec RDR2 qui va synthétiser le brin complémentaire de ce transcrit formant un ARN double brin (Law et al. 2011). L’ARNdb va alors être processé par DCL3 en siRNA d’une taille de 24-nt (Henderson et al. 2006; Blevins et al. 2015) qui vont être pris en charge par AGO4, AGO6 ou AGO9 (Wierzbicki et al. 2009). Le complexe AGO-siRNA va alors se lier à un transcrit de la Pol V généralement situé dans le promoteur du gène (Wierzbicki et al. 2008). Cette liaison va permettre le recrutement de DRM2 et la méthylation de toutes les cytosines présentes au niveau du locus initiant ainsi la mise en place de la répression transcriptionnelle (Cao & Jacobsen 2002; Naumann et al. 2011) (Figure 3).

24 Figure 3 : La voie RNA directed DNA methylation chez Arabidopsis thaliana

La polymérase IV associée à CLASSY et SHH1 transcrit un ARN court. Cet ARN est ciblé par RDR2 pour donner un ARNdb qui est processé par DCL3 en siRNA de 24-nt. Ces derniers sont stabilisés par HEN1 puis chargé dans AGO4. Le complexe AGO4-siRNA, assisté par diverses protéines telles KTF1 et IDN2, reconnaît un transcrit der la polymérase V. Une fois fixée, DRM2 est recruté et entraîne la méthylation des cytosines situées à proximité. Enfin, diverses protéines impliquées dans la chromatine, tel HDA6 ou JMJ14, participent à la mise en place de la répression transcriptionnelle du locus. Cette figure correspond à la figure 1 de l’article suivant (Matzke & Mosher 2014)

Une fois mis en place, ce TGS est activement maintenu de manière indépendante de la RdDM.

Pour la méthylation, la maintenance dépend du contexte nucléotidique entourant la cytosine concernée. Ainsi, les méthylations sont maintenues par MET1 pour les contextes CG (Lindroth et al. 2001; Kankel et al. 2003), par CMT3 pour les cytosines en contexte CHG (Lindroth et al.

2001) et par CMT2 pour les contextes CHH avec H qui peut être un A, un C ou un T (Stroud et al. 2013a). Pour cela, ces enzymes sont aidées de la protéine DDM1 qui leur permet d’accéder à l’hétérochromatine (Jeddeloh et al. 1999; Zemach et al. 2013). D’autres protéines ont été impliquées dans la mise en place ou la maintenance du TGS sans être directement lié à la méthylation de l’ADN. Ainsi, des protéines telles HISTONE DEACETYLASE 6 (HDA6) (Aufsatz et al. 2002) ou JUMONJI 14 (JMJ14) (Deleris et al. 2010) vont venir renforcer l’action de DRM2 en retirant les marques d’histones associées à de l’activation transcriptionnelle (Santos-Rosa et al. 2002; Shogren-Knaak et al. 2006). De plus, des mutations dans MORPHEUS MOLECULE

25 1 (MOM1) ou ses interactants PIAL1 et PIAL2 entraînent la levée partielle du TGS sans que la méthylation des locus ne soit affectée (Amedeo et al. 2000; Yokthongwattana et al. 2009; Han et al. 2016).

A cause de cette répression transcriptionnelle, il est difficile d’étudier le rôle du PTGS dans le silencing des transposons. Pour ce faire, il est nécessaire de lever cette inhibition transcriptionnelle. Des mutants des enzymes impliquées dans la maintenance de la méthylation de l’ADN tels ddm1 ou met1 conduisent à cette levée et conduisent à des phénomènes de transposition importants. Il a été observé que la mutation de ddm1 au niveau des grains de pollen entraîne l’apparition de siRNAs ciblant les transposons (Slotkin et al.

2009). Ces siRNAs ont été appelés epigeneticaly-activated siRNA (ea-siRNAs) et leur synthèse ressemble fortement à celle des ta-siRNAs. En effet, les ARNs issus des éléments transposables sont ciblés par des miRNAs générés par DCL1 et chargés sur AGO1. Le complexe AGO1/miRNA réalise un premier clivage au niveau de l’ARN issu d’un transposon (Creasey et al. 2014).

Ensuite, RDR6 et SGS3 prennent en charge les produits du clivage afin de permettre la production d’un ARNdb qui est processé par DCL4 donnant naissance à des ea-siRNAs de 21- nt (McCue et al. 2012). Grâce à ce mécanisme, une partie des ARN issu des transposons sont dégradés par la voie du PTGS, empêchant ainsi leur transposition et donc l’apparition d’effet délétère pour la cellule.

La saturation du RQC par des ARN aberrants issus des transposons réactivés permet également d’initier le PTGS contre les transposons. Le RQC est impliqué dans la dégradation des ARNm présentant des problèmes de maturations comme l’absence de coiffe ou de queue poly-adénylée (Schmid & Jensen 2010). Récemment, des liens ont émergé entre le RQC et le RNA silencing. En effet, de nombreux mutants du RQC induisent une augmentation du PTGS dans les cellules (Xu et al. 2006; Gy et al. 2007; Moreno et al. 2013; Martinez de Alba et al.

2015; Elvira-Matelot et al. 2016a). Cette augmentation suppose que le RQC joue un rôle inhibiteur sur le PTGS. Il est donc probable que les ARNs aberrants initient le PTGS grâce à l’action des RDR sur ces ARNs (Martinez de Alba et al. 2015). Cette idée est appuyée par le fait que RDR6 est inhibée in vitro par la présence d’une queue poly(A) sur l’ARNm (Baeg et al.

2017). Le RQC servirait alors à éviter que les ARNm aberrants produits par les gènes

26 endogènes ne déclenchent du PTGS. Par conséquent, il est supposé que les rares loci endogènes qui subissent le PTGS produisent une quantité trop importante d’ARN aberrant qui sature les systèmes du RQC. Les ARNs excédentaires sont alors adressés aux RDR afin d’initier la mise en place de PTGS. Ce mécanisme serait également actif contre les transposons réactivés.

L’étude du transposon Evadé (EVD) appuie cette idée. En effet, il a été montré que ce transposon produit un ARNdb via RDR6. L’ARNdb est processé par DCL2 et DCL4 induisant la production de siRNA de 21 et 22-nt. Ces derniers sont pris en charge par AGO1 et AGO2 afin de conduire au clivage des ARNm EVD (Marí-Ordóñez et al. 2013). DCL1 n’étant pas requis pour que des siRNAs soient observés, il est exclu que les ARNs EVD soient prise en charge par la voie des ea-siRNAs. De plus, comme aucun siRNA n’est détecté dans les mutants rdr6, il est probable que l’induction du PTGS dépend de l’action d’une RDR sur un ARN aberrant (Marí- Ordóñez et al. 2013).

Récemment, des liens entre le PTGS et la mise en place de TGS ont commencé à émerger (Marí-Ordóñez et al. 2013; McCue et al. 2015). Par exemple, le transposon EVD réactivé commence par être la cible de PTGS. Cependant, au fil des générations le nombre de copies présentes dans le génome des plantes augmente jusqu’à atteindre une quarantaine de copies (Marí-Ordóñez et al. 2013). Une fois ce seuil atteint, DCL2 et DCL4 sont saturés. Les ARNdb excédentaires sont alors utilisés par DCL3 pour donner des siRNAs de 24-nt qui permettent à AGO4 d’initier la RdDM et la mise en place de TGS au niveau des loci (Figure 4) (Marí-Ordóñez et al. 2013). Une autre voie conduisant à l’initiation de la RdDM au niveau du locus et impliquant RDR6, DCL2 et DCL4 et des siRNAs de 21 à 22-nt se liant à AGO6 a également été mise en évidence (Figure 4) (Nuthikattu et al. 2013; McCue et al. 2015).

Pour résumer, un transposon réactivé est d’abord ciblé par le PTGS avant d’être ciblé par la RdDM et d’être méthylé afin de le bloquer durablement par TGS.

27 Figure 4 : Voies reliant le PTGS et la voie RdDM

A : Schéma de la voie RDR6-RdDM. La voie commence lorsqu’un ARN se met à déclencher du PTGS. La voie se déroule classiquement excepté qu’une partie des siRNAs de 21 à 22-nt se lie à AGO6. Le complexe cible les transcrits de la polymérase V et induit la méthylation des locus ciblés.

B : Schéma de la voie RDR6-DCL3-RdDM. Cette voie ressemble à la voie RDR6-RdDM sauf que cette fois-ci ce sont les ARNs doubles brins produits par RDR6 qui sont pris en charge par DCL3.

Des siRNAs de 24-nt apparaissent puis rejoignent la RdDM canonique. AGO4 ou AGO6 les prendra en charge et ira reconnaître un transcrit de la polymérase V pour induire du TGS.

Ces deux figures proviennent des figures 3c (A) et 4a (B) de cet article (Cuerda & Slotkin 2016).

28

I.2.3 Le RNA silencing permet de protéger les plantes contre les infections virales

Chez Arabidopsis thaliana, une infection virale induit généralement la présence de siRNAs ciblant le virus (Hamilton 1999; Deleris et al. 2006; Garcia-Ruiz et al. 2010). Cela signifie que les ARNs produits par le virus sont capables d’initier le RNA silencing afin de limiter la propagation du virus. En accord avec cette hypothèse, de nombreux mutants du RNAi montrent une hyper-sensibilité aux virus (Mourrain et al. 2000; Morel et al. 2002; Boutet et al. 2003; Bouché et al. 2006; Deleris et al. 2006; Raja et al. 2008).

Dans le cas des virus, l’ARNdb peut provenir de plusieurs voies. Il est supposé que les ARNs des virus à brins positifs forment des structures secondaires doubles brins (Zhang et al.

2015a). Dans le cas des virus à ADN, l’ARNdb proviendrait d’une transcription convergente (Chellappan et al. 2004). Les RDRs d’origine virale impliquées dans la réplication du virus permettent aussi la production d’un ARNdb qui peut être reconnu par les DCLs donnants lieus à l’apparition de siRNAs issus du virus (Deleris et al. 2006; Garcia-Ruiz et al. 2010). Ces siRNAs vont alors être chargés dans AGO1, AGO2 ou AGO5 afin de cibler les ARNs viraux et d’induire leurs dégradations (Morel et al. 2002; Harvey et al. 2011; Brosseau & Moffett 2015). Dans le cas de certains virus comme le Cucumber mosaic virus, une amplification secondaire va avoir lieu. Cette dernière sera médiée par RDR6 ou RDR1 avec l’aide de SGS3 et de SDE5 pour permettre la production d’un ARNdb (Mourrain et al. 2000; Hernandez-Pinzon et al. 2007;

Wang et al. 2009; 2011). Dans le cas particulier des géminivirus, le RNA silencing secondaire initié par RDR6 va conduire à la méthylation de l’ADN viral et à la mise en place du TGS par un mécanisme ressemblant fortement à la voie liant le PTGS au TGS mise en évidence sur les transposons (Raja et al. 2008). Cette méthylation dépend des protéines DCL3, de la Pol IV, de RDR2 et des protéines impliquées dans la maintenance de l’ADN tel DDM1 (Raja et al. 2008).

Du fait de l’importance du RNA silencing dans la défense des plantes contre les virus, ces derniers ont développé de nombreuses stratégies de manière à contrecarrer ces mécanismes.

Par exemple, la protéine p19 exprimée par le Tombusvirus séquestre les duplexes de siRNAs de 21-nt empêchant ces derniers d’être chargés dans les AGO et donc limitant le PTGS (Qiu et al. 2002; Vargason et al. 2003). En contrepartie, les plantes ont aussi mis en place des

29 mécanismes de manière à renforcer le RNAi lors des infections virales. Ainsi, plusieurs ARNs codant pour des protéines liées au PTGS sont naturellement ciblés par des miRNAs. Lors de l’infection par un virus capable d’inhiber le RNAi, la voie des miRNAs va aussi être affectée conduisant à la levée de la répression exercée sur certains des membres du RNA silencing.

Ceci est le cas de AGO1, AGO2 ou AGO5 (Zhang et al. 2006; Harvey et al. 2011; Brosseau &

Moffett 2015). Ainsi, le résultat de l’infection par un virus dépendra de l’efficacité du RNAi initié contre le virus qui est supprimé par ce dernier et induit par la plante.

I.2.4 Le silencing des transgènes

L’insertion stable de séquences d’ADN au sein des génomes (transgènes) peut conduire au RNA silencing.

Le mécanisme peut être initié de manière volontaire. Pour cela, il suffit que le transgène ait été construit de manière à exprimer un ARN en IR (Waterhouse et al. 1998). Les ARNdb formés sont alors processés par DCL2, DCL3 et DCL4 en siRNAs de 22-, 24 et 21-nt respectivement. Si la séquence en IR correspond à une région promotrice, les siRNAs de 24-nt associés à AGO4, AGO6 ou AGO9 guideront la RdDM et le TGS sur les gènes exprimés sous le contrôle d’un promoteur complémentaire aux siRNAs (Mette et al. 2000). Si la séquence en IR correspond à une région codante, les siRNAs de 21 et 22-nt associés à AGO1 ou AGO2 guideront l’IR-PTGS des ARNm complémentaires aux siRNAs (Parent et al. 2015a).

Des transgènes fortement exprimés peuvent aussi déclencher le S-PTGS quand bien même aucun ARNdb n’est censé être produit (de Carvalho et al. 1992; Elmayan et al. 1998). Pour le transgène L1 exprimant un ARN codant pour la protéine GUS sous le promoteur 35S, il a été suggéré que l’ARNdb provenait de la transformation par RDR6 d’un ARN sans coiffe issu de la maturation d’un ARN readthrough provenant de la transcription du gène de résistance à la kanamycine situé à côté du gène uidA en orientation inverse (Parent et al. 2015b). Cela suppose que comme pour les transposons, le déclencheur du S-PTGS est un ARN aberrant et que le déclenchement du S-PTGS n’a lieu que lorsque le RQC est saturé par un excès d’ARN aberrant transgénique. En effet, le S-PTGS requiert RDR6, SGS3, DCL2, DCL4, ainsi que AGO1 (

30 Figure 5) (Mourrain et al. 2000; Morel et al. 2002; Parent et al. 2015a).

Figure 5 : Le Post transcriptional gene silencing chez Arabidopsis thaliana

Le mécanisme est initié par l’apparition d’un ARNdb dans la cellule. Cet ARN double brin peut être naturellement formé dans l’IR-PTGS et l’AS-PTGS. Dans le S PTGS, il nécessite l’action de SGS3 et de RDR6 pour être formé. Dans tous les cas, l’ARNdb est processé par DCL2 et DCL4 en duplexe de siRNAs qui vont être méthylés par HEN1. Ces duplexes sont pris en charge par des ARGONAUTES et formant le complexe RISC (RNA inducing silencing complex). Le complexe reconnaît alors tout ARN complémentaire au siRNA. Cette reconnaissance peut induire de la répression traductionnelle. Cependant, dans la majorité des cas, elle entraîne le clivage de l’ARN reconnu. Les produits du clivage sont alors soit dégradés soit pris en charge par SGS3 et RDR6 pour redonner un ARNdb et amplifier le signal. Cette figure est adaptée de la figure 3 de ce papier (Martinez de Alba et al. 2013).

31

I.2.5 La suppression médiée par les ARNs est un mécanisme pouvant se propager à travers la plante

Le RNAi se transmet à travers l’ensemble de la plante (Palauqui et al. 1996; 1997; Voinnet et al. 1998). Cette transmission joue un rôle important dans la défense de la plante contre les virus puisqu’il va permettre à la plante de dégrader l’ARN viral avant que celui-ci ne puisse se répliquer et donc se propager. Cette transmission suppose que les cellules initiant le mécanisme produisent un signal capable d’être transporté à travers la plante et pouvant induire un RNAi similaire à celui réalisé par la cellule initiale.

Le signal ne peut être qu’un ARN (Mlotshwa et al. 2002). Mais s’agit-il d’un siRNA ou d’un ARN précurseur plus long ? Chez Arabidopsis thaliana les siRNAs de 24-nt sont capables de passer à travers des greffes et d’induire du TGS (Molnar et al. 2010). Dans le cas du PTGS systémique, la preuve que les siRNAs de 21 ou 22-nt correspondent au signal reste à démontrer. En effet, des expériences de greffes réalisées entre un porte-greffe exprimant un ARN en IR dans un fond dcl2 dcl3 dcl4 et un greffon exprimant un ARNm cible ont montré qu’un signal était transféré du porte-greffe au greffon (Brosnan et al. 2007), suggérant que le précurseur des siRNAs pouvait être transporté. Toutefois, il reste possible qu’en l’absence de DCL2, DCL3 et DCL4, l’ARN en IR soit processé par DCL1 en siRNAs capables d’être transportés du porte- greffe au greffon.

Une fois produit, le signal va circuler à travers la plante grâce à deux types de transport. Le premier est un transport longue distance qui s’effectue par le phloème (Voinnet et al. 1998).

Ce transport n’est pas caractérisé chez Arabidopsis thaliana. En revanche, chez Cucurbitus maxima, ce transport est médié par la protéine PSRP1 qui est capable de lier les petits ARNs simple brin (Yoo 2004).

Après être sortis du phloème, le siRNA va passer de cellule en cellule. Dans ce type de transport, il est probable que les siRNAs passent par le plasmodesme. En effet, il a été montré que chez Arabidopsis thaliana la transmission du RNAi ne s’effectuait pas au niveau des cellules de gardes mature ne présentant plus de plasmodesmes (Voinnet et al. 1998). Chez Cucurbita maxima, les petits ARNs ne peuvent passer le plasmodesme que si ils sont pris en charge par la protéine PSRP1 (Yoo 2004). Cette protéine joue donc un rôle clef dans le

32 transport des siRNAs chez cette espèce. Il est possible qu’Arabidopsis thaliana utilise aussi une protéine pour transporter les siRNAs. Cependant, cette protéine n’est pas caractérisée actuellement et aucune protéine homologue à PSRP1 n’a pu être encore identifiée.

Le signal produit et transporté va ensuite induire le RNAi dans les cellules réceptrices. De nombreux cribles ont été mis au point afin de déterminer les protéines impliquées dans la systémie du PTGS. Ils ont montré qu’une partie des protéines impliquées dans la RdDM était nécessaire à cette induction. Cependant, suivant les cribles, les protéines impliquées ne sont pas les mêmes. Ces cribles sont basés sur la séparation spatiale des cellules produisant le signal inducteur et celles produisant la cible du PTGS. Par exemple les systèmes JAP3 et pSUC:SUL expriment un ARN en IR sous le contrôle du promoteur du gène SUC2 qui est exprimé dans les cellules compagnes du phloème. Ces ARNs en IR sont processés en siRNAs complémentaires aux ARNm de la PHYTOENE DESATURASE (PDS) dans le cas de JAP3, et de SULPHUR (SUL) dans le cas de SUC:SUL (Himber et al. 2003; Smith et al. 2007). Le passage de ces siRNAs aux tissus périphériques du mésophylle permet la dégradation de l’ARNm PDS ou SUL dans ces tissus ou l’ARN en IR n’est pas exprimé. PDS et SUL étant tous deux impliqués dans l’accumulation de la chlorophylle, les plantes JAP3 et SUC:SUL présentent une disparition de la chlorophylle autour des veines des feuilles (Himber et al. 2003; Smith et al. 2007). Dans ces deux systèmes, Pol IV et RDR2 sont requis pour que le silencing ait lieu dans le mésophylle (Dunoyer et al. 2007; Smith et al. 2007). Un autre système, appelé PDSi repose sur la production de siRNAs PDS grâce à un promoteur inductible. L’addition ponctuelle d’un composé chimique permet d’induire le PTGS dans les feuilles traitées et de visualiser la systémie du PTGS dans les nouvelles feuilles (Dong et al. 2011). Dans ce système, la systémie du PTGS requiert Pol IV et DCL3 mais pas RDR2 (Dong et al. 2011). Enfin, le transport longue- distance d’un signal de PTGS par greffe nécessite Pol IV, RDR2, AGO4 mais aussi RDR6 (Brosnan et al. 2007). Pol IV est la seule protéine impliquée dans tous les cas. Cette protéine semble donc jouer un rôle central dans le mécanisme. Il reste toutefois à comprendre comment une protéine pour le moment impliquée uniquement dans la RdDM peut contribuer à initier la mise en place de PTGS dans les cellules réceptrices.

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II. JMJ14 et NAC52, deux protéines liées à la transcription, affectent le PTGS

II. 1 Mise en place d’un crible génétique afin d’identifier les gènes impliquées dans le S-PTGS

II.1.1 Obtention de lignées portant le transgène p35S:uidA

Dans le but d’identifier les gènes impliqués dans le PTGS, mon équipe a réalisé une transformation de plantes d’Arabidopsis thaliana de l’écotype Columbia avec une construction portant le gène bactérien uidA codant pour la -GLUCURONIDASE (GUS) (Jefferson et al. 1987) sous le contrôle du promoteur viral 35S (Elmayan et al. 1998).

Théoriquement, les plantes doivent transcrire fortement le gène uidA et produire la protéine GUS dans l’ensemble de la plante. Cette protéine possédant une activité enzymatique naturellement absente chez Arabidopsis thaliana, il est possible de détecter sa présence facilement et surtout de la quantifier (Jefferson et al. 1987).

La transformation a été réalisée avec la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie entraine une insertion stable mais aléatoire dans le génome des plantes. L’expression du transgène va donc varier suivant le contexte génomique de l’insertion et suivant la manière dont le transgène est inséré au sein du génome. Plusieurs transformant portant une construction identique vont donc se comporter différemment (Kim & Gelvin 2007). Cela explique que plusieurs lignées au comportement différent ont pu être isolées à partir de la transformation (Elmayan et al. 1998).

Les lignées 6b4 et L1 portent ce même transgène p35S:uidA. Elles diffèrent toutefois par la position de l’insertion, le nombre de copies du T-DNA inséré et l’arrangement de ces copies au site d’insertion. La lignée L1 déclenche le S-PTGS spontanément à chaque génération (Figure 6). Celui-ci se met en place très tôt au cours du développement. Ainsi, dès l’âge de 5 jours, il ne reste dans la plante L1 que 10% de l’activité GUS présente dans une plante L1/rdr6

34 chez laquelle le S-PTGS est bloqué par la mutation rdr6 (Elmayan et al, 1998). A 11 jours, il ne reste plus chez L1 que 5% de l’activité GUS présente dans L1/rdr6 et à 18 jours moins de 1%

(Elmayan et al. 1998). La lignée 6b4 au contraire ne déclenche jamais le S-PTGS spontanément (Figure 6), et l’activité GUS est la même dans les plantes 6b4 et 6b4/rdr6 (Parent et al. 2015b).

Figure 6 : Evolution de l’activité enzymatique GUS des transgènes L1 et 6b4 au cours du temps Les courbes représentent une moyenne d’activité GUS et les valeurs sont en unité de (fluorescence.(ug.min)-1). Les barres d’erreurs représentent des écarts types.

Les lignées 6b4 et L1 produisent un ARN issu de la transcription permissive (en anglais readthrough) du transgène pNos:Npt-tNos à travers le terminateur bactérien tNos, qui se prolonge dans le transgène p35S:uidA-tRbcS avec une orientation inverse (Parent et al.

2015b). Après clivage au site de polyadénylation, deux ARNs sont produits : un ARNm Npt coiffé et polyadénylé, traduit en protéines conférant la résistance à la kanamycine, et un ARN uidA non coiffé. Aucun ARN readthrough n’est produit par le transgène p35S:uidA-tRbcS qui utilise un terminateur de plante plus efficace que le tNos. La transcription des transgènes pNos:Npt-tNos et p35S:uidA-tRbcS est plus forte au locus L1 qu’au locus 6b4. Ceci a été mis en évidence par des expériences de run-on (Elmayan et al. 1998) et par RT-qPCR en fond rdr6 (Parent et al. 2015b), et est visible en comparant le niveau de résistance à la kanamycine des deux lignées (Parent et al. 2015b) ou le niveau d’activité GUS des lignées 6b4 et L1/rdr6. La quantité d’ARN aberrant uidA non coiffé est par conséquent plus grande chez L1 que chez 6b4

0 300 600

5 jours 11 jours 28 jours 42 jours 62 jours

GUS activité (FLUO.(ug.min)-1)

L1 6b4

35 (Parent et al. 2015b), et échappe en partie à la dégradation par le RQC, ce qui explique vraisemblablement le déclenchement spontané du S-PTGS chez L1. En faveur de cette hypothèse, des mutations dans le RQC, par exemple xrn4, conduisent à une augmentation de la quantité d’ARN aberrant uidA non coiffé chez 6b4, ce qui induit un déclenchement spontané du S-PTGS de 6b4 (Gy et al. 2007; Parent et al. 2015b).

Une dernière lignée, appelée Hc1, portant le même transgène p35S:uidA que les lignées 6b4 et L1, montre un comportement intermédiaire. Cette lignée induit spontanément le PTGS mais uniquement si les plantes portent l’insertion à l’état homozygote (Elmayan et al. 1998). De plus, uniquement 20% des plantes initient le PTGS à chaque génération (Elmayan et al. 1998).

Les plantes Hc1 sont donc très utilisées afin de déterminer si une mutation favorise ou inhibe le PTGS.

Il faut savoir que l’utilisation des lignées L1, 6b4 et Hc1 est soumise à une restriction importante. En effet, le croisement de ces lignées avec des plantes portant un autre promoteur 35S conduit très souvent à une répression transcriptionnelle du transgène p35S:uidA, masquant donc le PTGS (Daxinger et al. 2008; Mlotshwa et al. 2010). Ceci est un problème important puisque les mutants d’insertions T-DNA des collections SALK, GABI et WISC contiennent un promoteur 35S. Les lignées 6b4, Hc1 et L1 ne peuvent donc pas être croisées avec des mutants de ces collections.

II.1.2 Identification des mutations jmj14 et sgs1

Les plantes L1 ont été mutagénéisées avec de l’ethyl-méthane sulfonate (EMS) (Elmayan et al.

1998). Les plantes présentant une activité GUS supérieure à L1 ont ensuite été récupérées puis isolées. Les mutants chez lesquels on observe une levée du PTGS ont été appelés suppressors of gene silencing (sgs). De nombreux gènes SGS ont pu être identifiés : NAC52 (SGS1), RDR6 (SGS2), SGS3, AGO1 (SGS4), HEN1 (SGS5), MET1 (SGS6), SDE5 (SGS7), JMJ14 (SGS8), et HPR1 (SGS9) (Mourrain et al. 2000; Morel et al. 2002; Boutet et al. 2003; Jauvion et al. 2010; Le Masson et al. 2012; Butel et al. 2017).