Les acteurs de la régulation transcriptionnelle

Introduction

Figure 1: Représentation des différents niveaux de compaction de l’ADN. Adaptéd’après une illsutrationde la revue NewScientist(www.new

Introduction La régulation de l’expression génique

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A.1. La régulation de l’expression génique

Si la plupart des cellules d’un organisme donné contiennent une information génétique identique, au sein de cet organisme, chaque type cellulaire possède un profil d’expression génique qui lui est en partie propre. En effet, sur les quelques 35.000 gènes contenus dans le génome humain, seul un nombre limité est exprimé au sein d’un même type cellulaire, et la nature ainsi que le nombre et le taux d’expression de ces gènes diffèrent d’un type cellulaire à l’autre, selon la spécificité tissulaire ou l’influence environnementale notamment.

La base de cette différence d’expression, est la régulation spatio-temporelle de la transcription. La régulation transcriptionnelle des gènes implique la participation de différents acteurs, qu’ils soient communs à la régulation de l’ensemble des gènes ou plus spécifiques d’un gène donné.

Nous tenterons dans la suite de ce chapitre de décrire de façon succincte l’implication et le rôle de chacun de ces acteurs dans la régulation transcriptionnelle.

Les acteurs de la régulation transcriptionnelle

La première étape de la régulation transcriptionnelle dépend dans un premier temps de l’organisation du génome dans le noyau. En effet, afin de s’adapter à la taille contraignante du noyau, la longue molécule d’ADN est confinée dans le noyau sous la forme d’une structure condensée nommée chromatine (Figure 1). Cette structuration dense a pour effet de restreindre fortement l’accès aux séquences régulatrices de la transcription des gènes, et est de facto, associée à une inhibition de leur expression. Ces séquences régulatrices, aussi nommées promoteurs, sont composées d’une région dite minimale (core promoter), située directement en amont du site d’initiation de la transcription et comprenant des éléments communs à la majorité des gènes, ainsi que deux autres régions dites proximale et distales. La région distale d’un promoteur peut se situer en amont ou en aval du promoteur minimal ; son degré d’éloignement de ce dernier pouvant être relativement élevé. Notons que l’orientation de cette région importe peu quant à son activité, qu’elle soit stimulatrice (enhancer) ou répressive (silencer) de la transcription.

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La séquence promotrice d’un gène est reconnue par deux familles de protéines. En effet, le promoteur minimal est reconnu par les facteurs généraux de la transcription qui, associés à l’ARN polymérase de type II (RNAPII), constituent la machinerie basale de transcription. En ce qui concerne les promoteurs proximaux et distaux, ils sont reconnus au niveau de la séquence nucléotidique par des facteurs de régulation de la transcription qui peuvent moduler de manière fine l’activité des facteurs généraux de la transcription et ainsi contrôler l’expression spatio-temporelle des gènes (pour revue, Lee and Young, 2000).

A.1.1. La chromatine

L’organisation de l’ADN génomique en la structure compacte qu’est la chromatine est notamment assurée par les protéines histones. En effet, ces dernières s’organisent en un cylindre d’octamères constitué de deux hétérodimères des histones H2A et H2B et de deux hétérodimères des histones H3 et H4 (Luger et al., 1997 ; Ramakrishnan, 1997) (Figure 2, panel A) autour duquel s’enroulent 146 paires de bases (pb) d’ADN génomique afin de former l’unité structurelle de la chromatine : le nucléosome.

L’agencement des nucléosomes le long de l’ADN, s’organise sur environ 200 pb ; sur les quelques 50 pb séparant deux nucléosomes est fixée l’histone H1 (Figure 2, panel B). Les queues amino-terminales des histones H3 et H4 dépassent du corps globulaire de l’octamère d’histone et, par leur charge positive, assurent l’interaction avec l’ADN, chargé négativement (Fischle et al., 2001).

Dans une telle structure compacte, les sites de reconnaissance pour les facteurs généraux de la transcription ainsi que pour des facteurs de transcription spécifiques peuvent s’avérer peu accessibles, et la transcription se voit ainsi régulée de manière négative (Petrie et al., 2003). Aussi pour initier la transcription, la chromatine doit être remodelée en une structure moins compacte.

Il existe différents mécanismes permettant de déstabiliser la structure chromatinienne et ainsi permettre la transcription des gènes. Ces mécanismes impliquent diverses enzymes capables de modifier la structure nucléosomale. On peut distinguer trois mécanismes de modification de la structure chromatinienne (Lee and Young, 2000 ; Narlikar et al., 2002) :

- La modification covalente des histones assurées par des enzymes qui modifient directement les histones en agissant sur leur charge et dès lors sur leur affinité pour l’ADN.

- La modification non covalente des histones qui est un processus mécanique médié par des enzymes qui, via un processus ATP-dépendant, modifient la conformation du nucléosome et provoquent un déplacement de ce dernier le long de l’ADN.

- La méthylation de l’ADN, assurée par divers enzymes, participe aussi à l’élaboration de la structure chromatinienne.

A.1.1.1. Les modifications covalentes du nucléosome

Comme nous l’avons mentionné précédemment, les protéines histones du nucléosome possèdent une extrémité amino-terminale chargée positivement présentant une forte affinité pour la double hélice d’ADN. Les modifications covalentes des histones ciblent des acides aminés (Aa) spécifiques de cette région des protéines histones. Ces Aa sont les cibles de multiples modifications post-traductionnelles telles que l’acétylation, la méthylation, la phosphorylation, la glycosylation, l’ubiquitinylation ou encore la sumoylation (Lacoste and Cote, 2003; Petrie et al., 2003; Santos-Rosa and Caldas, 2005). De telles modifications altèrent la charge des protéines histones et, dès lors, l’interaction entre les histones nucléosomales et l’ADN associé.

L’acétylation et la désacétylation des histones

L’acétylation des histones consiste en un transfert réversible d’un groupement acétyl (provenant de l’acétyl-co-enzyme-A) sur les résidus lysines des queues amino-terminales des histones (Gao et al., 2002).

La neutralisation par le groupement acétyl des charges positives des résidus lysines conduit à une déstabilisation de la structure nucléosomale par perte d’affinité des histones pour la double hélice d’ADN. Dès lors, il s’ensuit un relâchement de la structure chromatinienne permettant un accès plus facile à l’ADN pour les facteurs de transcription (Anderson et al., 2001; Lee et al., 1993; pour revue, Nusinzon and Horvath, 2005) (Figure 3).

Le transfert du groupement acétyl est assuré par des protéines nucléaires possédant une activité histone acétyl-transférase (HAT). Chez les mammifères, il existe à ce jour 12 HATs caractérisées parmi lesquelles les protéines CBP/p300, TAFII250, pCAF (CBP-associated factor) ou encore SRC1 (Verdone et al., 2005), toutes décrites comme des co-activateurs transcriptionnels. Les auteurs s’accordent sur l’existence d’un lien entre l’acétylation des résidus lysines des protéines histones, causant de facto le relâchement de la chromatine, et l’activation de la transcription des gènes cibles.

Si l’acétylation des histones est médiée par des protéines à activité HAT, le processus inverse, la désacétylation, peut être catalysée par des protéines possédant une activité histone désacétylase (HDAC). Ces enzymes permettent, par la désacétylation des lysines situées sur les queues amino-terminales des histones, le recompactage de la chromatine en une structure dense et ainsi inhibent l’activité transcriptionnelle de la région ciblée (Hassig et al., 1998;

Nusinzon and Horvath, 2005) (Figure 3).

Les protéines à activité HDAC sont classifiées en trois groupes distincts selon notamment leur taille, celle de leur domaine catalytique, leur localisation subcellulaire ou encore leur mode d’action :

- Les HDACs de Classe I : Ce groupe est composé des HDACs 1, 2, 3, 8, 11 et RPD3. Ces enzymes, dont la localisation est subnucléaire et d’un poids moléculaire variant entre 40 et 55 kDa, possèdent un profil d’expression ubiquiste. Relativement compactes, elles sont principalement composées d’un domaine catalytique (pour revue, Thiagalingam et al., 2003).

- Les HDACs de Classe II : Composé des HDACs 4, 5, 6, 7, 9, 10 et HDA1, ce groupe diffère du précédent notamment par le poids moléculaire (100 à 130 kDa) de ses membres mais aussi par le profil d’expression restreint à certains tissus, profil variant selon la protéine HDAC concernée. La seule exception à cette expression restreinte est la protéine HDAC 10 dont l’expression est plus ubiquiste. Structurellement, les protéines HDACs de cette classe se caractérisent par un domaine catalytique hautement conservé en position carboxy-terminale de la protéine et un long domaine non catalytique en position amino-terminale ; seules HDAC 6 et 10 diffèrent

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structurellement au sein de ce groupe par la présence d’un second domaine catalytique en position amino-terminale (pour revue, Yang and Gregoire, 2005).

Les protéines HDACs des deux classes décrites ci-dessus nécessitent généralement une association à d’autres protéines partenaires pour assurer leur fonction de désacétylase des histones. Parmi ces partenaires notons les co-répresseurs SMRT/N-Cor ou encore mSin3A qui permettent l’activation des enzymes HDACs (Thiagalingam et al., 2003). Dans le cas de mSin3A, il a été démontré que ce dernier pouvait aussi recruter la O-GlcNAc transférase (O- linked N-acétylglucosamine) afin de réprimer la transcription en parallèle avec la désacétylation des histones (Yang et al., 2002).

- Les HDACs de Classe III : Ce groupe est composé de 7 protéines Sirtuins (SIRT 1 à 7) qui sont notamment impliquées dans le maintien de la forme silencieuse de la chromatine. Les substrats de leur activité désacétylase peuvent être tant des protéines histones que non histones telle que p53. Ces protéines sont aussi caractérisées par une dépendance vis-à-vis du cofacteur NAD⁺ (pour revue, Denu, 2005).

L’acétylation et la désacétylation des queues amino-terminales des histones, et plus particulièrement la régulation fine de ces deux mécanismes, semblent être les mécanismes majeurs de la régulation transcriptionnelle des gènes.

La phosphorylation des histones

La phosphorylation est la seconde modification post-traductionnelle des queues amino- terminales d’histones que nous décrirons ici.

Le principal substrat de phosphorylation est l’histone H3 et plus particulièrement la sérine 10 de l’histone H3. La phosphorylation de cet acide aminé peut donner lieu à des effets totalement antagonistes. En effet, la phosphorylation de la sérine 10 de l’histone H3 est nécessaire à la condensation chromosomique car elle permet le recrutement de la condensine (Nowak and Corces, 2004) mais elle joue aussi un rôle important dans l’activation transcriptionnelle en permettant notamment l’acétylation de la lysine 14 de la même histone (Lo et al., 2001) ou encore en étant associée à l’activation transcriptionnelle des gènes précoces c-jun, c-fos et c-myc (Lacoste and Cote, 2003; Strelkov and Davie, 2002). L’histone

H3 est aussi phosphorylée sur d’autres résidus comme les sérines 28 et thréonine 11 lors de l’initiation de la condensation chromatinienne (pour revue, Santos-Rosa and Caldas, 2005).

L’histone H2 est aussi ciblée par la phosphorylation et plus particulièrement la sérine 139 de l’isoforme H2AX. Cette modification facilite la réparation post-réplicative de l’ADN suite au recrutement de la cohésine, un complexe protéique servant à maintenir groupées les chromatides sœurs durant la réplication (Unal et al., 2004). D’autres résidus des histones ont aussi été caractérisés comme pouvant être phosphorylés, il s’agit notamment de la sérine 28 de l’histone H4, de la sérine 14 de l’histone H2B ou encore de la sérine 1 de l’histone H4 ; toutefois le rôle de ces modifications est encore en cours d’étude à ce jour (Lacoste and Cote, 2003).

La méthylation des histones

La méthylation des histones touche les résidus arginines et lysines des queues amino- terminales d’histones. Cette modification post-traductionnelle est médiée par les protéines histone méthyl-transférases (HMT) (Zhang and Reinberg, 2001) qui assurent l’addition de un, deux, voire trois (à ce jour uniquement sur résidu lysine) groupes méthyl sur leurs résidus cibles.

L’histone H3 apparaît comme l’histone la plus méthylée avec l’histone H4. A contrario de l’acétylation qui est corrélée à une activation transcriptionnelle, la méthylation des histones peut aussi bien conduire à une activation ou à une répression de la transcription suivant la nature du résidu modifié et la combinaison de cette modification avec d’autres modifications pouvant affecter les histones, cette combinaison de modifications étant appelée « histone code » (pour revue, Santos-Rosa and Caldas, 2005).

La méthylation des résidus arginines des histones H3 et H4 par les PRMT (protein arginine methyltransferase) est corrélée avec l’activation de la transcription de plusieurs gènes. En effet, il semble exister une synergie entre la méthylation sur arginine et l’acétylation des histones. Ce phénomène peut être expliqué par l’interaction physique qui existe entre les arginine méthylases et les histone acétyl-transférases, formant ainsi des complexes co-activateurs. Notons l’exemple de l’arginine 3 de l’histone H4, qui une fois

La méthylation des lysines est retrouvée sur plusieurs résidus des histones H3 et H4.

Comme nous l’avons mentionné précédemment, la méthylation des résidus lysines peut aussi bien conduire à une activation transcriptionnelle qu’à une répression. En effet, la méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 est corrélée à une activation transcriptionnelle : les lysines, dès lors qu’elles sont méthylées peuvent servir de point d’ancrage à la protéine Cdh1p via son chromodomaine ; cette dernière pouvant recruter une activité HAT (Pray-Grant et al., 2005).

Par opposition à cet exemple, la méthylation des lysines 9 et 27 de l’histone H3 est associée à une répression transcriptionnelle via le recrutement, respectivement de HP1, qui joue un rôle direct dans la condensation chromatinienne et le silencing (Répression transcriptionnelle) des gènes (Daniel et al., 2005), et du complexe répressif Polycomb, responsable quant à lui de la répression transcriptionnelle et la maintenance de méthylation de l’ADN (Cao et al., 2002).

Jusqu’il y a peu, la méthylation des histones était considérée comme un processus irréversible, notamment lié au fait que le temps de demi-vie des histones et des lysines méthylées sont identiques (pour revue, Bannister et al., 2002). Très récemment, des enzymes capables de déméthyler tant les résidus arginines que lysines ont été découvertes. Il s’agit notamment pour les résidus arginines et lysines des déméthylases PADI4 et LSD1. La déméthylase PADI4 est capable de convertir les résidus arginines monométhylées ou non méthylées en résidus citrulline (Cuthbert et al., 2004; Wysocka et al., 2006) alors que LSD1 peut uniquement déméthyler les lysines diméthylées, notamment la lysine 4 de l’histone H3 que précédemment nous avons mentionnée comme méthylée (Forneris et al., 2005; Shi et al., 2004). La Figure 4 résume les différentes modifications post-traductionnelles des histones connues à ce jour.

Ubiquitinylation et sumoylation des histones

Les lysines d’histones peuvent subir au niveau de leur groupement ε amine les modifications d’ubiquitinylation et de sumoylation. La manière dont ces deux modifications influencent l’organisation nucléosomale n’est pas encore bien connue. Il est toutefois démontré que l’ubiquitinylation des histones est généralement associée à une augmentation de l’expression génique, alors que la sumoylation induit un effet opposé.

Il apparaît en effet que les histones, principalement H2A mais aussi H2B et H3, peuvent être ubiquitinylées, et que cette modification est associée à une augmentation de l’activité transcriptionnelle. Dans le cas de l’histone H2B, il a été démontré dans la levure que sa mono- ubiquitinylation est nécessaire à la méthylation des lysines 4 et 79 de l’histone H3, méthylation qui est corrélée à l’activation transcriptionnelle (Dover et al., 2002; Sun and Allis, 2002). En revanche, la diminution d’expression observée en cas de sumoylation semble être associée à un recrutement via les substrats sumoylés de deux co-répresseurs, HDAC1 et HP1 (Santos-Rosa and Caldas, 2005).

Mentionnons finalement le fait que les histones sont aussi sujettes à la glycosylation (Levy-Wilson, 1983) et à la glycation (Talasz et al., 2002) in vitro et in vivo ; mais à ce jour aucun rôle fonctionnel à ces modifications n’a pu être avancé (pour revue, Ausio et al., 2001)

A.1.1.2. Les modifications non covalentes du nucléosome

L’organisation chromatinienne en nucléosome peut être remodelée via des complexes multi- protéiques dont l’activité est dépendante de l’ATP. Ces complexes de remodelage de la chromatine hydrolysent l’ATP via leur sous-unité catalytique à activité ATPase, et, au moyen de l’énergie ainsi libérée, provoquent un déplacement nucléosomal suite à la modification physique de la structure chromatinienne par torsion de l’ADN. Le déplacement nucléosomal permet ou restreint l’accès à des régions de régulation transcriptionnelle (Kingston and Narlikar, 1999 ; Narlikar et al., 2002).

Les complexes de remodelage de la chromatine sont classifiés en 3 familles selon l’homologie de séquence de leur sous-unité catalytique (Langst and Becker, 2004; Xue et al., 1998), il s’agit des familles SWI/SNF, ISW1 et Mi2-NURD (Figure 5). Chacune de ces familles présente des domaines spécifiques, tel qu’un bromodomaine pour la famille SWI/SNF, un domaine SANT pour la famille ISW1 ou encore un chromodomaine et un domaine PHD pour Mi2, qui reflètent les préférences de chaque famille de complexe de remodelage de la chromatine pour tel ou tel substrat. En effet, les mécanismes de remodelage, et donc l’exposition de l’ADN nucléosomal aux facteurs de transcription, serait rendue possible par des mécanismes différents selon le complexe de remodelage impliqué. Par exemple, les complexes SWI/SNF semblent altérer l’enroulement de l’ADN autour du core

(formant le nucléosome) d’histone, de telle façon que le nucléosome adopte une forme altérée stable permettant une plus grande accessibilité de l’ADN. Les complexes ISW1 semblent, quant à eux, être capables de faire glisser les octamères d’histones le long de l’ADN, relocalisant ainsi les nucléosomes sans toutefois créer de forme altérée stable comme c’est le cas pour les complexes SWI/SNF (Korber and Horz, 2004; Langst and Becker, 2004). S’il semble que ces deux mécanismes puissent avoir en commun la génération d’une boucle d’ADN à la surface de l’octamère d’histone, ils diffèrent tant par la taille de la boucle ainsi formée que par sa vitesse de propagation le long du nucléosome. Toutefois, les deux mécanismes font intervenir à un moment donné une rupture d’interaction entre les histones et l’ADN.

A.1.1.3. La méthylation de l’ADN

En plus des modifications covalentes ou non des histones, l’ADN est lui-même sujet à une modification covalente : la méthylation. Cette modification de l’ADN est associée à un verrouillage réversible de l’expression des gènes, et cible presque exclusivement les résidus cytosines de régions spécifiques riches en dinucléotides CpG (Dinucléotide composé d’une cytosine suivi d’une guanine) (Fuks, 2003; Fuks, 2005).

Chez l’humain, trois enzymes méthylant activement les cytosines ont été identifiées. Il s’agit des méthyl-transférases de l’ADN Dnmt1, 3a et 3b (Bestor, 1988; Okano et al., 1999;

Rountree et al., 2001). Comme nous l’avons mentionné ci-dessus, cette modification dite

« épigénétique », car elle n’affecte que l’activité du génome sans en altérer la séquence (Fuks, 2003), réprime la transcription génique notamment via le recrutement de protéines à domaine MBD (Methyl CpG Binding Domain) qui reconnaissent de façon sélective les dinucléotides CpG méthylés. Ces protéines MBD sont elles-mêmes capables de recruter une activité HDAC assurant ainsi la désacétylation des histones, et, de facto, la condensation de la chromatine (Fuks et al., 2001; Rountree et al., 2001). MeCP2, l’une des protéines à domaine MBD parmi les plus étudiées, peut ainsi recruter, via son domaine de répression transcriptionnelle, le complexe Sin3A-HDAC (Jones et al., 1998; Nan and Bird, 2001) mais aussi des protéines à activité HMT qui assurent une méthylation des histones notamment sur la lysine 9 de l’histone H3 (Fuks, 2003; Fuks, 2005) (Figure 6). Plus récemment, une autre connexion entre la méthylation de l’ADN et la méthylation des histones a été démontrée puisque un lien étroit

entre les méthyl-transférases de l’ADN et EZH2, un membre des Polycomb group protein, a été identifiée (Vire et al., 2006).

A.1.2. La machinerie basale de transcription

Lorsque la chromatine est relâchée, la machinerie basale de transcription peut se positionner sur l’ADN pour initier la transcription génique. Chez les eucaryotes, la machinerie basale de transcription est composée de l’ARN polymérase de type II (RNAPII) (Orphanides et al., 1996) et de six GTFs (General Transcription Factors) : TF_IIA (Transcription Factor IIA), TF_IIB, TF_IID, TF_IIE, TF_IIF et TF_IIH (Roeder, 1991). Ces derniers, à l’exception de TF_IIB qui est un simple polypeptide de 35 kDa, sont des complexes multiprotéiques composés d’un assemblage de 2 à 14 protéines différentes (pour revue, Martinez, 2002).

La RNAPII ne reconnaît ni ne lie directement l’ADN. Aussi, afin d’initier la transcription, elle s’associe aux GTFs qui sont capables de reconnaître divers éléments du promoteur core (pour revue, Lagrange et al., 1998), et ceci afin de former ce que l’on appelle le complexe de pré-initiation (PIC) au niveau du promoteur minimal (Hampsey, 1998;

Orphanides et al., 1996). La mise en place du complexe du PIC commence par la liaison sur la boîte TATA, située à environ 30 pb en amont du site d’initiation de la transcription, du complexe TFIID, composé de la protéine TBP (TATA Binding Protein) qui médie la liaison à la boîte TATA, et de facteurs associés nommés TAFIIs, qui interagissent avec l’INR (site d’initiation de la transcription : +1). La liaison du complexe TFIID est ensuite stabilisée via une interaction entre TBP et les complexes TFIIA et TFIIB qui lient l’ADN de part et d’autre de la boîte TATA (Nikolov et al., 1995; Geiger et al., 1996; Tan et al., 1996; Tsai and Sigler, 2000). Le complexe ainsi formé permet le recrutement, via TFIIB, de TFIIF associé à la RNAPII. Afin de compléter le PIC, le complexe TFIIE est recruté ; ce dernier permettant lui aussi le recrutement d’un complexe TFIIH dont l’activité kinase permet l’initiation de la transcription (pour revue, Buratowski and Zhou, 1992; Nakajima et al., 1988; Martinez, 2002).

Il existe cependant un second modèle d’assemblage du PIC basé sur une observation in vivo, plusieurs GTFs peuvent être associés et ce, indépendamment de leur liaison à l’ADN. Ce complexe, par ailleurs nommé holoenzyme, comprend outre la RNAPII, les facteurs de

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transcription TFIIE, TFIIF et TFIIH (Malik and Roeder, 2000). Ainsi, le complexe TFIID-IIA-

IIB recruterait en une fois l’holoenzyme au niveau du promoteur minimal, limitant les étapes de formation du PIC. Les deux modèles d’assemblage du PIC que nous venons d’évoquer sont présentés à la Figure 7.

Dans les deux cas que nous venons de décrire, l’établissement de la machinerie basale de transcription débute par la liaison de TBP à la boîte TATA. Toutefois, il existe des promoteurs qui ne contiennent pas de tels motifs de liaison pour TBP. Dans ce cas, le complexe TFIID est recruté et stabilisé sur l’ADN via l’interaction des TAFIIs qui le composent, et notamment TAFII110, avec l’INR mais aussi avec d’autres facteurs de transcription tels que Sp1 ou CREB (Azizkhan et al., 1993; Duhr et al., 2001; Zhou and Chiang, 2001).

A.1.3. Les facteurs régulateurs de la transcription

La transcription initiée via le promoteur core peut être modulée positivement ou négativement par les facteurs régulateurs de la transcription. L’action de ces facteurs de transcription s’effectue par la reconnaissance de séquences nucléotidiques spécifiques des régions proximales et distales du promoteur minimal. Ils contrôlent ainsi l’expression de leurs gènes cibles. Dans le cadre de ce mémoire, nous nous limiterons à faire une description non exhaustive des différents facteurs de transcription actuellement caractérisés ; aussi après une brève description générale, nous décrirons plus en détails les facteurs de transcription de la famille Ets et plus particulièrement les membres du groupe PEA3 qui font l’objet du présent travail.

A.1.3.1. Les domaines fonctionnels des facteurs de transcription

Les facteurs de transcription sont des protéines modulaires caractérisées par la présence d’un domaine de liaison à l’ADN (en abrégé DBD pour DNA Binding Domain). De surcroit, d’autres domaines sont aussi requis pour leur activité, domaines parmi lesquels on retrouve au moins un domaine de modulation de la transcription mais aussi des domaines de dimérisation, nécessaires au facteurs de transcription qui ne peuvent agir que sur la forme de dimères, un domaine (ou un site) de translocation nucléaire ou encore un domaine de fixation pour un

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l’action est conditionnée par la liaison de l’hormone au niveau de ce domaine de fixation (Evans, 1988; Green and Chambon, 1988).

Les domaines de liaison à l’ADN

Les domaines de liaison à l’ADN permettent à un facteur de transcription donné de reconnaître une séquence nucléotidique spécifique. La grande conservation de ces domaines au sein de différentes espèces ainsi que leur structure permettent une classification des facteurs de transcription en familles et sous-familles (Narlikar and Hartemink, 2006;

Patikoglou and Burley, 1997 ). On distingue ainsi quatre grandes familles (Figure 8) :

- Le motif hélice-boucle-hélice basique ou bHLH (basic Helix-Loop-Helix), caractérise des facteurs de transcription homo- ou hétérodimériques. Ce motif est composé de deux hélices α, qui interagissent avec les hélices α du partenaire qui compose le dimère, ainsi que d’un domaine riche en acides aminés basiques, qui permettent l’interaction avec l’ADN via la formation de liens ioniques avec les ponts phosphodiesters de l’ADN (pour revue, Ledent et al., 2002; Jones, 2004).

- Le motif hélice-coude–hélice ou HTH (Helix-Turn-Helix) consiste en deux hélices α reliées entre elles par une boucle β, (pour revue, Warren, 2002; Aravind et al., 2005).

Une variante de ce motif de liaison à l’ADN dit « ailée » constitue notamment les facteurs de transcription de la famille Ets (Donaldson et al., 1994)

- Le motif de fermeture éclair à leucine ou LZ (Leucine Zipper). On retrouve ce motif chez des facteurs de transcription homo- ou hétérodimériques, il est constitué d’une hélice α riche en résidus basiques permettant l’interaction avec l’ADN, et d’une seconde hélice α permettant la dimérisation avec l’hélice homologue du partenaire. Dans ce motif, les leucines sont présentes au minimum en quatre exemplaires et séparées les unes des autres par sept acides aminés. De cette périodicité résulte une localisation des résidus leucines du même côté de l’hélice, ce qui contribue à la création d’une zone d’interaction hydrophobe avec le domaine homologue (pour revue, Vinson et al., 2002;

Vinson et al., 2006).

- Le motif en doigt de Zinc ou ZnF (Zinc Finger). Le facteur de transcription possède dans ce cas un domaine riche en résidus cystéines, liant un ou plusieurs atomes de zinc, permettant à la protéine d’adopter une structure tridimensionnelle spécifique. Le nombre exact de résidus cystéines présents au sein du motif permet une classification en sous- famille (pour revue, Leon and Roth, 2000).

Dans ces conditions, les facteurs de transcription de ces quatres familles possèdent une conformation tridimensionnelle contenant au moins une hélice α dont la largeur correspond à celle du sillon majeur de l’ADN, à savoir 1,2 nm, ce qui permet à cette hélice de s’y insérer parfaitement afin d’interagir spécifiquement avec les nucléotides de la double hélice (Lehninger et al., 2005).

Les domaines régulateurs

Comme nous l’avons mentionné précédemment les facteurs de transcription peuvent agir positivement ou négativement afin de moduler la transcription d’un gène. Dès lors, il existe chez ces protéines des domaines dits régulateurs nommés « domaines activateurs » ou

« domaines répresseurs » selon le rôle qu’ils assument. Si ces domaines sont moins bien caractérisés que les domaines de liaison à l’ADN, ils peuvent toutefois être classifiés en se basant notamment sur leur composition en acides aminés.

Selon une telle classification, il existe des domaines activateurs riches en résidus acides tels que les acides aspartiques et/ou les acides glutamiques que l’on retrouve par exemple au sein des facteurs de transcription p53 et Sp1 (Ma and Ptashne, 1987; Courey et al., 1989) ou encore des domaines activateurs riches en résidus prolines comme c’est le cas pour le facteur de transcription CTF (Mermod et al., 1989).

En ce qui concerne les domaines dits « répresseurs », ceux-ci sont bien moins caractérisés que leurs homologues activateurs. Toutefois, la richesse d’un domaine en résidus hydrophobes, tels que des alanines, peut être associée à une fonction répressive de ce domaine (Hanna-Rose and Hansen, 1996) comme c’est le cas pour le facteur répresseur de la transcription Dr1 ( Yeung et al., 1994; Kim et al., 1997; Nagano and Shiokawa, 1999)

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Il faut néanmoins noter que, si elle peut contribuer à l’activité de la protéine, la présence d’un domaine activateur ou répresseur au sein d’un facteur de transcription n’en détermine toutefois pas de façon obligatoire la fonction. En effet, selon le contexte, un activateur transcriptionnel peut être associé à une répression si, par exemple, il empêche la liaison d’un autre facteur de transcription (dans le cas de régions génomiques cibles chevauchantes) ou qu’il s’associe à des cofacteurs influençant eux-mêmes la transcription de manière positive ou négative. Dès lors la notion d’activateur ou de répresseur de la transcription dépend parfois plus du contexte dans lequel se situe le facteur de transcription que de lui-même.

A.1.3.2. Modulation de l’activité des facteurs de transcription

L’activité des facteurs de transcription, qu’elle soit répressive ou activatrice, peut elle-même être modulée par différents mécanismes que nous décrirons succinctement ici pour les développer dans le chapitre concernant les membres du groupe PEA3. Parmi ces mécanismes, on retrouve notamment les modifications post-traductionnelles ou encore les interactions avec d’autres protéines qui peuvent influencer tant la liaison du facteur de transcription à l’ADN que moduler son association avec d’autres protéines (Alvarez et al., 2003; Marmorstein and Fitzgerald, 2003)

Les modifications post-traductionnelles

Outre l’effet des modifications post-traductionnelles sur la structuration de la chromatine, ces dernières peuvent aussi influencer l’activité des facteurs de transcription. Ainsi la phosphorylation, la méthylation, l’acétylation, l’ubiquitinylation ou la sumoylation peuvent moduler l’affinité du facteur de transcription ciblé par un partenaire protéique ou l’ADN mais aussi influencer sa localisation subcellulaire, voire directement moduler son activité intrinsèque.

Parmi les plus étudiées, la phosphorylation des facteurs de transcription sur les résidus sérines et thréonines assure un rôle primordial dans la régulation de l’expression génique.

Ainsi par exemple, la phosphorylation du facteur CREB permet son association avec le facteur CBP (Kwok et al., 1994). Les facteurs de transcription de la famille Ets subissent aussi cette modification comme nous le décrirons plus loin. Chez ces facteurs, la

phosphorylation peut influencer tant la liaison à l’ADN que l’activité intrinsèque du facteur de transcription ou encore sa capacité à lier d’autres protéines (pour revue, Sharrocks, 2001;

Tootle and Rebay, 2005). Un autre exemple des multiples conséquences de la phosphorylation sur les facteurs de transcription est celui du récepteur aux androgènes qui, lorsqu’il est phosphorylé, est protégé de la dégradation et stabilisé sous sa forme dimérique (Blok et al., 1998). De surcroît, ce phénomène entraîne une hypersensibilité du récepteur à son ligand ce qui se traduit par une augmentation de son activité transcriptionnelle (pour revue, Edwards and Bartlett, 2005)

Outre les histones, les protéines à activité HAT peuvent aussi acétyler les facteurs de transcription tels que p53 (Gu and Roeder, 1997), E2F-1, E2F-2 et E2F-3 (Martinez-Balbas et al., 2000; Marzio et al., 2000). Ainsi, dans la plupart des cas, l’acétylation du facteur de transcription augmente sa capacité à interagir avec l’ADN et augmente donc sa capacité à réguler l’expression génique (Wade et al., 1998; Muth et al., 2001). Pour exemple, citons le cas de la protéine p53 pour laquelle l’acétylation au niveau de la région carboxy-terminale (Ct) affecte positivement sa liaison à l’ADN et dès lors potentialise son effet transactivateur (Gu and Roeder, 1997) (pour revue, Glozak et al., 2005).

Parmi les cibles de la sumoylation, on retrouve de nombreux facteurs de transcription.

Dans une majorité des cas connus à ce jour, la sumoylation d’un facteur de transcription conduit à une diminution de son pouvoir transactivateur (pour revue, Gill, 2003; Verger et al., 2003). Le facteur de transcription Sp3, par exemple, a été caractérisé in vivo comme cible de la sumoylation au niveau de son domaine inhibiteur ; une inhibition de la voie de sumoylation entraînant une activité transactivatrice accrue de Sp3 (Ross et al., 2002; Sapetschnig et al., 2002). D’autres facteurs de transcription tels C/EBP, c-Myb, les récepteurs aux hormones stéroïdiennes ou encore les facteurs de transcription de la famille Ets (dont nous reparlerons plus en détail dans le prochain chapitre) ont aussi été décrits sumoylés au niveau de leurs domaines inhibiteurs (pour revue, Gill, 2004). L’action inhibitrice de la sumoylation pourrait notamment s’expliquer par une altération des interactions entre le facteur de transcription ciblé et l’ADN, la chromatine ou même d’autres protéines. Dans le cas du facteur HSF, sa liaison à l’ADN est renforcée suite à la sumoylation (Goodson et al., 2001; Hong et al., 2001). De même p300 sumoylée interagit avec HDAC6, menant ainsi à une répression transcriptionnelle suite à la désacétylation des histones (Girdwood et al., 2003).

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On ne peut toutefois pas résumer l’effet de la sumoylation à un switch « tout ou rien » de l’activité du facteur de transcription ciblé. En effet, diverses observations indiquent que l’effet de la sumoylation peut aussi dépendre du promoteur et du contexte étudié. Ainsi, plusieurs études suggèrent que la sumoylation peut spécifiquement interférer avec la capacité de certains facteurs de transcription à fonctionner en synergie (Holmstrom et al., 2003).

Aussi, lorsque le récepteur aux glucocorticoïdes (GR pour glucocorticoid receptor), est présent sur de multiples sites d’un promoteur donné, il possède une région dite de « contrôle de synergie » qui inhibe son potentiel transactivateur (Iniguez-Lluhi and Pearce, 2000). Or ce motif peut faire l’objet de sumoylation, et une mutation du site de la modification post- traductionnelle entraîne un accroissement de l’activité transcriptionnelle des promoteurs ciblés par les récepteurs aux glucocorticoïdes (Le Drean et al., 2002; Holmstrom et al., 2003) ; suggérant donc que la sumoylation affecte la synergie qui peut exister entre plusieurs facteurs de transcription.

Si la sumoylation des facteurs de transcription et des histones est généralement associée à une répression de l’expression génique, il faut constater que l’ubiquitinylation des facteurs de transcription, hormis la dégradation qu’elle médie via le protéasome, aurait en fait le rôle opposé, à savoir l’activation transcriptionnelle. L’ubiquitinylation apparaît donc aussi comme cruciale dans la régulation de l’activité des facteurs de transcription (Conaway et al., 2002;

Muratani and Tansey, 2003). Si le mécanisme de régulation par l’ubiquitine le plus connu reste à ce jour la dégradation des protéines ciblées par la voie du protéasome et de facto le contrôle de leur stabilité, il n’en demeure pas moins que cette modification post- traductionnelle peut agir via d’autres mécanismes. Ainsi, la protéine Myc peut être dégradée de manière dépendante de l’ubiquitine, alors que la E3 ligase Spk2 semble nécessaire à l’activation génique dépendante de Myc ; suggérant ainsi un double rôle de l’ubiquitinylation (pour revue, Gill, 2004).

Les cofacteurs transcriptionnels

Les facteurs de transcription peuvent directement influencer la formation du PIC, comme c’est le cas pour la protéine Dr1 qui perturbe le positionnement de RNAPII au niveau du site d’initiation de la transcription (Thomas and Chiang, 2006). Toutefois, ils agissent rarement seuls mais plutôt via le recrutement de cofacteurs. Ces derniers sont des partenaires protéiques pouvant posséder une activité enzymatique leur permettant notamment la modification des

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histones et donc le remodelage chromatinien. Selon l’activité qu’ils présentent, on les nomme soit co-activateurs soit co-répresseurs de la transcription (Naar et al., 2001) (Figure 9).

Les co-activateurs transcriptionnels

Les co-activateurs agissent de plusieurs manières. En effet, ils peuvent soit servir d’interface entre les facteurs de transcription et la machinerie basale, soit agir via une activité enzymatique intrinsèque (telle que l’acétylation, la désacétylation…) qui modifie post- traductionnellement les facteurs de transcription ou la structure chromatinienne, soit servir d’adaptateur entre les facteurs de transcription et d’autres cofacteurs possédant une activité enzymatique.

Parmi les co-activateurs les mieux décrits, la protéine CBP (CREB binding protein) est nécessaire à l’activité du facteur de transcription CREB (Arias et al., 1994). Ce co-activateur possède plusieurs caractéristiques énumérées ci-dessus. CBP peut en effet interagir directement avec certains éléments du PIC tels que TF_IIB, TF_IID ou encore la RNAPII permettant ainsi leur stabilisation sur le promoteur ou, s’ils ne sont pas encore présents sur ce dernier, leur recrutement (Kee et al., 1996; Imhof et al., 1997). Via son activité HAT, CBP peut aussi acétyler les histones et dès lors participer au remodelage chromatinien (Ogryzko et al., 1996). L’activité HAT de CBP ne se limite pas aux histones. En effet, ce co-activateur a été décrit comme responsable de l’acétylation de différents facteurs de transcription parmi lesquels p53, dont l’acétylation module les capacités transactivatrices (Gu and Roeder, 1997).

CBP pourrait aussi jouer le rôle de protéine adaptatrice car elle peut interagir avec une autre protéine possédant une activité HAT, pCAF, et donc pourrait participer à son recrutement au niveau du promoteur (Yang et al., 1996).

Les co-répresseurs transcriptionnels

Par opposition aux co-activateurs, il existe des co-répresseurs dont les mécanismes d’action, s’ils sont homologues, provoquent l’effet inverse au niveau de l’expression génique, c’est-à- dire la répression.

Ainsi, le co-répresseur des récepteurs nucléaires N-Cor (Nuclear Corepressor) interagit avec les éléments de la machinerie basale TBP et TAF_II32 assemblés en complexe, initie la

dissociation de ce complexe et, de facto, empêche la formation du PIC (Muscat et al., 1998).

N-Cor et SMRT (Silencing mediator for retinoïd and thyroid receptors) sont des co- répresseurs proches constitués de domaines fonctionnels conservés capables de médier les fonctions de répression d’un grand nombre de facteurs de transcription dont les facteurs Ets (Chakrabarti and Nucifora, 1999).

Un troisième mécanisme d’action de ces co-répresseurs est le recrutement de protéines à activité HDAC qui dès lors permettent le compactage de la chromatine et donc la répression de l’expression génique (Huang et al., 2000). Ainsi N-Cor et SMRT peuvent interagir directement avec diverses HDAC (HDACs 3, 4, 5 et 7) (Kao et al., 2000) mais aussi indirectement via mSin3A qui sert de protéine adaptatrice (Yang et al., 1997; Huang et al., 2000). Outre le recrutement passif des HDACs, les co-répresseurs N-Cor et SMRT semblent aussi capables de stimuler l’activité des HDACs qu’ils recrutent (Wen et al., 2000; Guenther et al., 2001), comme HDAC3 par exemple, via leur domaine DAD (Deacetylase activating domain)

A.2. Les facteurs de transcription de la famille Ets

Les protéines de la famille Ets (E26 transformation specific ou E Twenty-Six) forment une famille de facteurs de transcription caractérisés par un domaine de liaison à l’ADN conservé, le domaine ETS (Karim et al., 1990). Initialement, la découverte de cette famille fut réalisée lors de l’étude du rétrovirus aviaire E26 qui est responsable de leucémies myélo-érythroïdes aiguës chez la poule (Radke et al., 1982; Graf et al., 1992). La caractérisation de v-ets, un des oncogènes transcrits par le rétrovirus E26 (Leprince et al., 1983; Nunn et al., 1983) a ensuite permis l’identification de ses homologues, dans un premier temps chez le poulet avec ck-ets1 (Gegonne et al., 1987) et ck-ets2 (Boulukos et al., 1988) puis chez l’homme avec h-ets1 et h- ets2 (Watson et al., 1988).

Depuis la découverte de v-ets dans les années 80, la famille des facteurs de transcription Ets n’a cessé de grandir. A ce jour, elle compte une trentaine de membres chez les mammifères, et, si l’on tient compte des isoformes issues de chaque gène, plus de septante membres (Schultz et al., 2000).

Compte tenu du grand nombre de facteurs appartenant à cette famille, nous décrirons de façon exhaustive dans la suite de ce travail les données relatives aux membres du groupe PEA3 sur lequel porte ce travail, tout en ponctuant régulièrement ces dernières d’exemples issus d’autres membres de la famille des facteurs de transcription Ets.

A.2.1. Phylogénie de la famille

Outre les gènes codant les facteurs de transcription Ets chez les Vertébrés, diverses études ont pu mettre en évidence la présence de gènes homologues chez les Métazoaires diploblastiques ou encore les Cnidaires (Degnan et al., 1993). Les études les plus précises sur les rôles de ces facteurs chez les Invertébrés ont été réalisées chez les Insectes (Drosophilia Melanogaster) et les nématodes (Caernorhabditis elegans) (pour revue, Hart et al., 2000; Hsu and Schulz, 2000; Laudet et al., 1999). A ce jour, aucun membre de la famille Ets n’a pu être mis en évidence ni chez les végétaux, ni chez les protozoaires ou les champignons. Ainsi, suite au séquençage complet du génome de Saccharomyces cerevisae, aucune séquence homologue au domaine ETS n’y a été retrouvée (Graves and Petersen, 1998). Il semble donc que les gènes

ets, tels qu’on les connaît actuellement, dérivent de l’évolution d’un gène ancestral apparu avec les métazoaires : l’amplification de telles familles de facteurs de transcription marque une étape critique dans l’évolution des organismes pluricellulaires et pourrait répondre, sans doute, aux besoins de nouveaux mécanismes de régulation de l’expression génique (Degnan et al., 1993; Graves and Petersen, 1998; Shenk and Steele, 1993).

L’analyse phylogénétique des facteurs Ets a permis de les classer en treize groupes ou sous-familles sur base de la conservation de la séquence protéique du domaine ETS, de la position de ce dernier au sein de la protéine et de l’existence éventuelle d’autres domaines structuraux ou spécifiques (Laudet et al., 1999). Les treize sous-famille identifiées sont : ETS, TEL, YAN, SPI, ERG, PEA3, ELF, DETS4, ELK, GABP, ER71, ERF et ESE (repris à la Figure 10).

En tant que facteurs de transcription, les membres de la famille Ets sont, pour la plupart, caractérisés comme activateurs transcriptionnels. Toutefois, il existe au sein de la famille quelques membres, parmi lesquels on retrouve notamment la protéine Yan chez la drosophile (O'Neill et al., 1994) ainsi que les facteurs Ets humains Erf (Sgouras et al., 1995), Net (Maira et al., 1996) et Fev (Maurer et al., 2003), caractérisés comme des répresseurs transcriptionnels.

A.2.2. Les facteurs de transcription Ets : des protéines aux domaines

Comme nous l’avons mentionné précédemment, les protéines de la famille Ets sont caractérisées comme des facteurs de transcription capables de lier l’ADN, via le domaine ETS, au niveau de séquences consensus cibles (EBS : Ets Binding Site). Outre le domaine ETS, les protéines de cette famille possèdent divers domaines dits « régulateurs » qui leur permettent de moduler la transcription de leurs gènes cibles. Ces domaines sont hétérogènes et peu conservés au sein de la famille.

A.2.2.1 Le domaine ETS

Le domaine ETS est constitué d’environ 85 acides aminés et est défini comme la signature des membres de la famille Ets à laquelle il donne son nom (Karim et al., 1990). Comme nous l’avons rapporté précédemment, c’est en partie sur base de la conservation de ce domaine que la phylogénie de la famille Ets a été réalisée, puisque ce domaine est le seul domaine conservé chez tous les membres de la famille. Ainsi, la conservation de séquences entre les domaines ETS de Ets-1 et Ets-2 est de 97%, et celle entre Ets-1 et Ese, le membre de la famille phylogénétiquement le plus éloigné de Ets-1, est encore de 37% (Laudet et al., 1999). Le domaine ETS est caractérisé, dans sa moitié carboxy-terminale, par la présence d’acides aminés basiques et hydrophobes ainsi que celle de deux résidus arginines hautement conservés au sein de la famille, tandis que la moitié amino-terminale du domaine est caractérisée par la conservation de trois résidus tryptophanes respectivement séparés par 17- 18 acides aminés (Figure 11). Notons enfin qu’une séquence de localisation nucléaire a été identifiée au sein de ce domaine (Boulukos et al., 1989).

Les structures secondaires et tertiaires du domaine ETS de plusieurs membres de la famille ont été élucidées par les techniques de RMN et de cristallographie, en présence ou non d’ADN. Ainsi, les études de structure secondaire des protéines Fli-1 et Ets-1 ont permis de déterminer que le domaine ETS est composé de trois hélices α et quatre feuillets β antiparallèles agencés de la manière suivante : α1−β1−β2−α2−α3−β3−β4 (Donaldson et al., 1994; Liang et al., 1994) (Figure 11) ; ce qui a permis de classer les membres de la famille Ets dans la superfamille des protéines à domaine hélice-tour-hélice de type « ailé » (wHTH pour winged Helix-Turn-Helix) (Donaldson et al., 1994; Liang et al., 1994; Werner et al., 1995; Donaldson et al., 1996) déjà connue chez d’autres facteurs de transcription (pour revue, Graves and Petersen, 1998).

La liaison à l’ADN de ce motif est assurée par l’hélice α3 ainsi que par les boucles situées entre les feuillet β3−β4 et les hélices α2−α3 (Sharrocks et al., 1997; Reddy et al., 2003b) (Figure 12). Notons que la conservation des acides aminés au sein du domaine ETS concerne précisément les résidus situés dans les différents éléments structuraux mentionnés ci-dessus ; ces résidus étant nécessaires tant au maintien structurel qu’à la liaison à l’ADN. En effet, les résidus arginines hautement conservés et situés au sein de l’hélice α3 sont

responsables de l’interaction physique entre le domaine ETS et l’ADN (Kodandapani et al., 1996).

La liaison à l’ADN se fait au niveau d’un site EBS, riche en bases puriques, d’environ neuf nucléotides dont le core consensus est 5’- GGAA/T -3’ (Graves and Petersen, 1998) (Figure 13). Il apparaît toutefois que les nucléotides adjacents au core consensus permettent de déterminer une certaine spécificité quant à la liaison de tel ou tel facteur Ets (Nye et al., 1992). La conservation du domaine de liaison à l’ADN impose la liaison de séquences d’ADN relativement similaires, ce qui implique qu’un même site EBS peut être reconnu par différents membres de la famille Ets (Graves and Petersen, 1998). Aussi, la spécificité d’action de chacun des membres de la famille n’est pas uniquement liée à son site de liaison à l’ADN ; le profil d’expression mais aussi les domaines régulateurs de la liaison à l’ADN ou encore les implications de partenaires protéiques sont autant d’éléments primordiaux quant à la détermination de la spécificité d’action des facteurs de transcription Ets. Ainsi, GABPα, dont le site EBS consensus est identique à celui de Er81, forme un complexe avec GABPβ pour réguler ses gènes cibles spécifiques (Brown and McKnight, 1992). De même, Ets-1 possède, à l’instar des membres du groupe PEA3, deux domaines inhibant sa liaison à l’ADN (de Launoit et al., 1997; Wang et al., 2002).

A.2.2.2 Les domaines modulateurs de la transcription

A l’inverse du domaine ETS, les domaines modulateurs de la transcription sont peu, voire pas, conservés parmi les membres de la famille Ets. Ainsi, leur structure primaire ou leur localisation au sein de la protéine peut varier (Graves and Petersen, 1998), sauf lorsque l’on compare des membres d’un même groupe.

Quoiqu’il en soit, les domaines transactivateurs des facteurs Ets ne possèdent pas de motifs communs. Néanmoins, ils sont souvent caractérisés par un enrichissement en un certain type d’acides aminés (Graves and Petersen, 1998). Ainsi les domaines transactivateurs de Sap-1 et Elk-1 sont riches en résidus sérines et prolines (Bhattacharya et al., 1993), tout comme un des domaines transactivateurs des protéines Erg et Fli-1 alors que leur second domaine transactivateur est composé de résidus de type acide (Rao et al., 1993; Siddique et

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al., 1993). Dans le cas de Pu.1 par exemple, le domaine transactivateur présente un enrichissement en résidus glutamines (Klemsz and Maki, 1996).

Chez les membres de la famille Ets caractérisés comme des répresseurs transcriptionnels, les domaines represseurs de la transcription ont été identifiés. A titre d’exemple, la protéine Erf possède, dans sa partie carboxy-terminale, un domaine nommé ERD (Erf Repressor Domain) de 58 acides aminés (Sgouras et al., 1995). Le facteur Tel possède un domaine de répression central de 50 acides aminés situé entre le domaine POINTED et le domaine ETS (Chakrabarti and Nucifora, 1999; Lopez et al., 1999). Enfin, le facteur Fev possède un domaine carboxy-terminal d’environ 140 résidus riches en alanine (Maurer et al., 2003).

Outre le domaine ETS, le domaine POINTED est peut être le seul autre domaine qui présente une certaine conservation au sein de certains membres de la famille Ets (Jousset et al., 1997). En effet, on retrouve ce domaine dans six des treize groupes composant la famille et ce, en position amino-terminale de la protéine (Klambt, 1993). Ce domaine se structure en une pelote hydrophobe formée par le repliement de 5 hélices α et semble être impliqué dans les processus d’interaction protéique et plus particulièrement les processus d’homo- et d’hétéro-dimérisation de certains facteurs Ets (Slupsky et al., 1998). Citons l’exemple de la protéine Tel pour l’oligomérisation de laquelle le domaine POINTED est nécessaire et la délétion de ce dernier entraînant l’impossibilité pour la protéine d’assurer son rôle répresseur (Lopez et al., 1999).

A.2.3. Rôles biologiques

Des profils d’expression très variés, ainsi que la grande variabilité au niveau des structures de leurs domaines régulateurs laissent suggérer que les différents membres de la famille Ets interviennent au sein d’un large éventail de rôles biologiques.

Ces facteurs sont impliqués dans de multiples processus tant physiologiques tels que l’embryogenèse, que pathologiques tels que la tumorigenèse et la métastase (Seth and Watson, 2005). Des expériences de transgenèse et de recombinaison homologue chez la souris ont notamment révélé l’implication des membres de la famille Ets dans des processus aussi

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variés que l’hématopoïèse, l’angiogenèse, l’immunité (Gallant and Gilkeson, 2006) ou le développement du système nerveux.

Au niveau moléculaire, les facteurs de transcription Ets sont impliqués dans la régulation transcriptionnelle de nombreux gènes parmi lesquels des gènes codant des facteurs de transcription (dont les gènes ets eux-mêmes), des gènes impliqués dans la tumorigenèse, l’apoptose, la régulation du cycle cellulaire ou des gènes codant des protéases, des récepteurs cellulaires et des molécules de surface (pour revue, Sementchenko and Watson, 2000 ; Seth and Watson, 2005; de Launoit et al., 2006).

Cette variabilité des rôles biologiques nous amène dès lors à nous focaliser sur la description plus précise des données relatives aux membres du groupe PEA3. Nous ponctuerons néanmoins nos descriptions par quelques exemples relatifs aux autres membres de la famille des facteurs de transcription Ets.

Les facteurs de transcription du groupe PEA3

A.2.4. Organisation génétique et évolution au sein des espèces

Parmi les treize groupes qui composent la famille Ets, le groupe PEA3 est composé de trois membres : erm (etv5) (Monte et al., 1994; Nakae et al., 1995), er81 (etv1) (Brown and McKnight, 1992; Jeon et al., 1995; Monte et al., 1995) et pea3 (etv4 ou e1af) (Xin et al., 1992; Higashino et al., 1993). Comme indiqué dans la Figure 13, les formes humaines et murines de ces gènes sont structurées en treize (er81) ou quatorze (erm et pea3) exons distribués sur 19 à plus de 85 kpb d’ADN génomique et agencés de façon similaire. La séquence codant le domaine ETS se situe invariablement au niveau des exons 11 à 13 (Monte et al., 1996; Coutte et al., 1999a; Coutte et al., 1999b). Il est intéressant de noter la particularité des gènes erm et pea3 (Ishida et al., 2006) qui possèdent chacun en 5’ deux exons alternatifs non traduits (1a et 1b) selon le type cellulaire notamment. Chez l’homme, les positions chromosomiques respectives des trois gènes sont les suivantes : erm sur le chromosome 3 en position 3q27-29 (Monte et al., 1994; Nakae et al., 1995), pea3 et er81 respectivement sur les chromosomes 17 et 7, en position 17q22 (Isobe et al., 1995; Osborne- Lawrence et al., 1995) et 7p22 (Jeon et al., 1995)

Introduction Les facteurs de transcription du groupe PEA3

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Erm, er81 et pea3 ont aussi été caractérisés dans d’autres espèces de Vertébrés telles que chez la poule (Gallus Gallus) (Lin et al., 1998), le poisson zèbre (Danio rerio) (Munchberg et al., 1999; Roussigne and Blader, 2006), ou le Xénope chez lequel seul er81 a été identifié à l’heure actuelle (Xenopus laevis) (Munchberg and Steinbeisser, 1999; Klein et al., 2002). Les trois membres ont aussi été retrouvés par prédiction dans les banques d’ADN chez plusieurs mammifères tels que le taureau (Bos taurus), le chien (Canis familiaris) ou le rat (Rattus norvegicus).

A.2.5. Des activateurs transcriptionnels aux domaines conservés

D’une taille avoisinant les 500 acides aminés (Pea3, Er81 et Erm font respectivement 481, 477 et 510 Aa), les membres du groupe PEA3 sont caractérisés au niveau de leur structure primaire par une identité de séquence globale de l’ordre de 40% (pour revue, de Launoit et al., 1997). Cette conservation d’identité de séquence augmente au sein de régions bien délimitées comme le domaine ETS conservé à 95%. De même, dans la partie amino-terminale un domaine de 32 Aa riche en résidus de type acide est conservé à plus de 85%. Le domaine carboxy-terminal, d’une longueur de 61 Aa, est conservé à plus de 50% (de Launoit et al., 1997) (Figure 15, panel A). L’alignement de séquence des trois protéines indique que le gène ancestral commun aux trois membres du groupe a dû subir deux évolution successives ; la première dissociant pea3 des deux autres (de Launoit et al., 1997) (Figure 15, panel B).

A l’instar des autres membres de la famille Ets, il n’existe que des données partielles relatives à la structure secondaire des membres du groupe PEA3. Ainsi le domaine amino- terminal a été caractérisé par dichroïsme circulaire et spectrométrie infrarouge, révélant que 15 des 32 Aa qui le composent sont structurés en une hélice α (Defossez et al., 1997).

Les membres du groupe PEA3 sont caractérisés, dans la majorité des conditions expérimentales, comme activateurs transcriptionnels (Xin et al., 1992; Monte et al., 1995;

Laget et al., 1996). Les domaines hautement conservés amino- et carboxy-terminaux sont responsables de leur pouvoir transactivateur. De plus, ils peuvent agir en synergie, impliquant donc que chacun de ces domaines agisse selon des mécanismes différents (Nakae et al., 1995;

Janknecht, 1996; Laget et al., 1996). La région centrale aussi nommée CIDD (Central

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inhibitory domain of DNA binding), correspondant chez Erm aux Aa 203 à 297, ainsi que le domaine carboxy-terminal sont impliqués dans l’inhibition de la liaison à l’ADN (Kurpios et al., 2003; Laget et al., 1996 ). De plus, il apparaît que les régions situées de part et d’autre du domaine transactivateur amino-terminal régulent négativement l’activité transactivatrice de Pea3 et Erm (Laget et al., 1996; Bojovic and Hassell, 2001). Enfin, le domaine carboxy- terminal semble aussi être impliqué dans la stabilisation de Pea3 (Takahashi et al., 2005). La Figue 16 schématise ces différents domaines et leurs fonctions.

A.2.6. Modulation du potentiel régulateur des facteurs de la famille Ets

L’importante similitude séquentielle des membres du groupe PEA3, notamment au niveau du domaine ETS, suggère que les promoteurs ciblés au travers des sites EBS seront sensiblement les mêmes, avec un core consensus défini 5’-GGAA/T-3’ similaire à celui ciblé par les autres membres de la famille Ets (de Launoit et al., 1997). Aussi la détermination de la spécificité d’action des membres du groupe PEA3, à l’instar des autres protéines Ets, fait notamment intervenir des interactions avec d’autres protéines en vue de réguler leurs gènes cibles.

A.2.6.1. Partenaires protéiques et régulation transcriptionnelle

Erm est capable d’une interaction directe avec des éléments de la machinerie basale de transcription tels que TBP, TAFII60 et TAFII40, tous trois dans le complexe TFIID (Defossez et al., 1997). Parmi les autres facteurs de transcription qui interagissent physiquement avec Erm, sont décrits le récepteur nucléaire aux androgènes qui régule négativement la transactivation induite par Erm (Schneikert et al., 1996) ou encore c-Jun, un composant du dimère AP-1 (Nakae et al., 1995). De plus, Er81 (Goel and Janknecht, 2003), Pea3 (Liu et al., 2004) et Erm (Brenner, Baert et de Launoit, données non publiées) sont capables d’interagir avec le co-activateur transcriptionnel CBP/p300 et donc de recruter son activité HAT. Par ailleurs, Er81 est aussi capable d’interagir avec un autre cofacteur possédant une activité HAT : pCAF (Goel and Janknecht, 2003). Enfin, Pea3 est capable d’interagir avec le facteur de transcription USF-1 afin de réguler de façon synergique la transcription de leur gène cible sans toutefois se lier directement à l’ADN, agissant comme un co-activateur transcriptionnel (Firlej et al., 2005).

Introduction Les facteurs de transcription du groupe PEA3

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Si les membres du groupe PEA3 interagissent avec différents acteurs de la régulation transcriptionnelle, ils sont aussi capables d’interaction avec les protéines responsables de la modulation du potentiel régulateur des facteurs de transcription. Ainsi, Er81 peut interagir avec RSK-1 (p90 ribosomal S6 kinase 1), une des kinases de la voie des MAPK (Mitogen activated protein kinase) (Wu and Janknecht, 2002) et Pea3 et Erm peuvent interagir avec Ubc9 (Ubiquitin Conjugating Enzyme 9), l’enzyme de conjugaison impliquée dans le processus de sumoylation (Degerny et al., 2005; Gocke et al., 2005).

A.2.6.2. Modifications post-traductionnelles des membres du groupe PEA3 : implication sur la régulation transcriptionnelle

Comme la plupart des facteurs de transcription, les membres du groupe PEA3 sont modifiés de manière post-traductionnelle (Figure 17). Ces modifications contribuent à la spécificité d’action de ces facteurs de transcription en modulant leur potentiel transactivateur.

La phosphorylation est à ce jour la plus étudiée des modifications post-traductionnelles qui touchent les membres du groupe PEA3. Ces derniers sont notamment phosphorylés sur différents résidus sérines et thréonines par les kinases ERK-1 et ERK-2 (Extracellular signal- regulated protein kinase), des kinases de la voies de signalisation des MAPK résultant en l’augmentation du potentiel transactivateur des facteurs de transcription du groupe PEA3 (Janknecht, 1996; Janknecht et al., 1996; O'Hagan et al., 1996; Bosc et al., 2001). La voie des MAPK n’est pas seule responsable de la phosphorylation des membres du groupe PEA3.

Ainsi l’activation de la kinase SEK (SAPK/ERK kinase) augmente les capacités transactivatrices de Pea3 via l’induction de la voie SAPK/JNK (Stress-activated protein kinase / c-Jun N-terminal kinase) (O'Hagan et al., 1996). Enfin, la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA) est à l’origine de la phosphorylation de deux membres du groupe PEA3, Erm et Er81 (Janknecht et al., 1996; Coutte et al., 1999b) sur un résidu sérine situé au début du domaine ETS. Dans ce cas, la conséquence fonctionnelle de la phosphorylation de Erm et Er81 par la PKA se traduit par une induction de leur pouvoir transactivateur ainsi que par une diminution de leur capacité à lier l’ADN (Baert et al., 2002; Wu and Janknecht, 2002).

La phosphorylation n’est pas la seule modification qui touche les protéines du groupe PEA3 ; en effet, les modifications post-traductionnelles sur résidus lysines telles que l’acétylation, la sumoylation et l’ubiquitinylation ciblent également ces facteurs de

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transcription. Ainsi, p300, suite à son activation par la voie des MAPK est capable d’acétyler Er81, et dès lors d’induire une augmentation de son pouvoir transactivateur et de sa liaison à l’ADN (Goel and Janknecht, 2003).

Erm et Pea3 ont récemment été décrites comme pouvant faire l’objet de sumoylation : ajout covalent de polypeptides SUMO (Small ubiquitin-related modifier) suite à l’interaction avec une enzyme spécifique de cette voie, la E2 ligase UbC9 (Degerny et al., 2005 ; Gocke et al., 2005). En effet, la protéine Erm peut être sumoylée sur quatre lysines situées dans un consensus optimal pour cette modification. Ces sites sont conservés au sein du groupe PEA3 et se situent dans le domaine central CIDD de la protéine. La sumoylation de Erm semble affecter négativement son pouvoir transactivateur sans toutefois influencer sa liaison à l’ADN, sa stabilité ou sa localisation subcellulaire (Degerny et al., 2005). Erm et Pea3 ne sont pas les seuls membres de la famille Ets concernés par une telle modification post- traductionnelle. Ainsi, par exemple, le facteur Elk-1 est aussi sujet à la sumoylation. Dans ce cas, Elk-1 sumoylé recrute une HDAC, ce qui implique une connexion entre les processus de sumoylation et de désacétylation dans l’inhibition de la transcription induite par ce facteur de transcription (Yang and Sharrocks, 2004). De plus, la sumoylation de Elk-1 et donc l’inhibition de son activité, peut être levée suite à la phosphorylation de cette dernière par ERK-1 ; la phosphorylation induisant une activation du co-activateur transcriptionnel p300 préalablement recruté (Li et al., 2003; Yang et al., 2003a; Yang et al., 2003b). Il existe donc dans le cas de Elk-1 un contrôle strict de son activité transactivatrice par l’interconnexion de différentes voies de modifications post-traductionnelles et l’association de cette dernière avec des partenaires protéiques (Figure 18). Ce phénomène n’est pas sans rappeler l’interconnexion qui existe entre les différentes modifications touchant les protéines histones (pour revue, Santos-Rosa and Caldas, 2005).

La dernière modification rapportée à ce jour sur les membres du groupe PEA3 est l’ubiquitinylation qui consiste en l’ajout de un (mono-) ou plusieurs (polyubiquitinylation) polypeptides d’ubiquitine sur des résidus lysines. Généralement, cette modification conduit à la dégradation des protéines ciblées via le protéasome 26S. Il a récemment été démontré que Pea3 subit cette modification post-traductionnelle (Takahashi et al., 2005).

A.2.7. Rôles biologiques des facteurs de transcription du groupe PEA3

A.2.7.1. Implication dans l’embryogenèse et la morphogenèse

Les facteurs de transcription erm, er81 et pea3 sont exprimés chez la souris, lors du développement de nombreux organes, tels que les poumons, les glandes salivaires ou encore les reins, et ce dans les dérivés des trois feuillets embryonnaires que sont l’endo-, le méso– et l’ectoderme. Ces trois facteurs sont souvent coexprimés dans les mêmes organes, mais généralement dans des compartiments tissulaires différents. Par exemple, les gènes pea3 et erm, sont dans un premier temps préférentiellement exprimés dans les épithélia en développement des glandes salivaires ou des poumons alors que er81 voit son expression restreinte au compartiment mésenchymateux avoisinant (Chotteau-Lelievre et al., 1997;

Chotteau-Lelievre et al., 2001).

Le développement d’organes épithéliaux comme les poumons, les reins ou encore la glande mammaire est orchestré par des interactions tissulaires séquentielles et réciproques. La morphogenèse de branchement, une des étapes parmi les plus cruciales du développement des organes glandulaires, nécessite par exemple des interactions entre les compartiments épithéliaux et mésenchymateux. Il apparaît que les trois membres du groupe PEA3 sont fortement exprimés lors de ce phénomène et ce suivant un profil d’expression commun aux différents organes glandulaires mentionnés précédemment : erm est principalement exprimé dans la partie distale des bourgeons épithéliaux alors que pea3 est restreint à l’épithélium en croissance. Si ces derniers sont aussi légèrement exprimés dans le mésenchyme adjacent, on retrouve surtout dans ce compartiment l’expression de er81 (Chotteau-Lelievre et al., 2001;

Chotteau-Lelievre et al., 2003). Ce profil d’expression distinct selon les compartiments ne se limite pas à la morphogenèse de branchement mais est aussi retrouvé durant la conversion du mésenchyme en épithélium comme c’est le cas lors du développement rénal (Chotteau- Lelievre et al., 2003). Ce phénomène de conversion épithéliale est associé in fine à une quasi- extinction de l’expression de pea3 et erm dans le compartiment épithélial. Dans le cas du développement pulmonaire chez la souris, l’importance de Erm a été démontrée suite à l’utilisation d’un dominant négatif. En effet, ce dernier induit de sévères anomalies dans le développement de cet organe suite à l’inhibition ou le retardement de la différenciation cellulaire des précurseurs distaux (Liu et al., 2003).