Identification des gènes impliqués dans la suppression de jmj14 chez les

IV.2.3.a Approche ciblée

Les profils 5S et PDS du mutant soj-9-5-1-1 sont caractéristique d’un mutant dcl3. Ce suppresseur doit donc porter une mutation dans le gène DCL3. Pour tester cette hypothèse,

soj-9-5-1-1 a été croisé avec le mutant dcl3-1. Toutes les plantes obtenues à partir de ce

98 suppresseur et que cette mutation est responsable de la suppression de l’effet de jmj14 sur le silencing de PDS chez JAP3.

IV.2.3.b Tests d’allélisme

Afin de ne pas avoir à séquencer tous les suppresseurs pour identifier les gènes mutés, nous avons réalisé des tests d’allélisme avec les mutants ago4-5, dcl3-1 et hda6 (rts1-1). Nous avons inclus hda6 car des expériences indépendantes réalisées préalablement au laboratoire avaient révélé que la mutation hda6 augmente le silencing de PDS chez JAP3 (Figure 28).

Le croisement soj-1-4-4-1 x dcl3-1 a donné des plantes présentant des nervures blanches (Figure 28), indiquant qu’une mutation de DCL3 est responsable de la suppression de l’effet de jmj14 chez ce suppresseur dont le profil 5S n’avait pas été analysé (Figure 28). Le croisement soj-10-2-1-1 x hda6 (rts1-1) a donné des plantes présentant des nervures blanches (Figure 28) indiquant qu’une mutation de HDA6 est responsable de la suppression de l’effet de jmj14 chez ce suppresseur. Ce résultat est d’ailleurs consistent avec l’effet du suppresseur sur les siRNA 5S (Figure 27) puisque la mutation hda6 augmente l’accumulation des siRNAs 5S (Elmayan et al. 2005). Le séquençage du gène HDA6 a révélé la substitution d’une guanine en adénine conduisant au remplacement de la glycine en position 170 par acide glutamique. Les croisements réalisés avec les 16 autres suppresseurs n’ont pas révélé d’autres allèles ago4, dcl3 ou hda6, ce qui nous amené à séquencer directement le génome de ces mutants.

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Figure 28 : Identification ciblé de certains suppresseurs intermédiaires

A : Photographie des plantes JAP3 et JAP3/rts1-1 âgées de 22 jours et cultivées en conditions de jours longs.

B : Photographie des plantes issus du croisement indiqué et des témoins semés âgées de 41 jours et cultivées en terre en conditions de jours long.

C : Photographie des plantes issus du croisement indiqué et des témoins âgées de 19 jours et cultivées en terre en conditions de jours long.

IV.2.3.c Séquençage des suppresseurs Principe de l’analyse

Pour identifier les gènes mutés chez les autres mutants soj récessifs, nous avons réalisé un séquençage de leur génome. Pour cela, nous sommes partis du croisement JAP3/L1/jmj14 x

soj et nous avons identifié les descendants F2 portant la mutation à l’état homozygote,

c’est-à-dire présentant des nervures blanches, les plantes hétérozygotes ou sauvage pour la mutation soj étant vertes. En extrayant l’ADN d’une cinquantaine des plantes à nervures blanches, la mutation supprimant jmj14 est enrichie alors que les autres mutations induites par la mutagénèse à l’EMS ségrégent aléatoirement. Après séquençage, la mutation d’intérêt doit donc apparaître dans la totalité des reads (100%), alors que les mutations non liées

100 ségrégent et n’apparaissent que chez une fraction des reads. En effectuant le ratio correspondant au nombre de reads mutés sur l’ensemble des reads obtenus à chaque position du génome, il est donc possible d’identifier le gène portant la mutation causant la suppression de jmj14.

Le contrôle JAP3/L1/jmj14, soj-2-5-3-1 (allélique à ago4-5), soj-1-4-4-1 (allélique à dcl3-1), et 8 suppresseurs soj intermédiaires qui ne sont pas alléliques à ago4-5, dcl3-1 et hda6 (rts1-1) ont été envoyés au séquençage. L’identification des mutations et de leur position a été effectué grâce à un programme appelé ‘’mutdetect’’ développé par le service informatique de l’Institut Jean Pierre Bourgin. Une fois l’ensemble des mutations obtenues, un premier filtrage a permis de ne garder que les mutations correspondant à une transition C->T ou G->A. Un second filtrage a permis de récupérées les mutations situées dans la partie transcrite du gène (hors intron, 5’-UTR ou 3’UTR). Enfin, toutes les mutations retrouvées à la fois chez les mutants

soj et JAP3/L1/jmj14 ainsi que toutes les mutations retrouvées sur deux soj différents ont été

retirées de l’analyse. Grâce à un second programme développé par le service informatique de l’IJPB, le ratio allèle muté sur allèle sauvage de l’ensemble des mutations restantes a été placé sur un graphique représentant les 5 chromosomes d’Arabidopsis thaliana. Une courbe de régression de type LOESS a ensuite permis d’obtenir les profils visibles dans chacun des suppresseurs (Figure 29).

Grâce à ces représentations graphiques, la zone où est localisée la mutation responsable de la suppression de jmj14 est aisément identifiable car elle présente un ratio mutation/sauvage proche de 100%. En s’éloignant de notre mutation, ce ratio diminue jusqu’à atteindre 50% qui représente le moment où la mutation ne subit aucun biais de sélection. Ainsi, notre mutation est située au niveau du pic formé par la courbe de Loess dans la zone proche des 100%. Dans notre cas, cette méthode a été très efficace. En effet, le pic est aisément identifiable pour chacun des suppresseurs analysés (Figure 29). Les gènes portant des mutations de type EMS présentes à l’état homozygote dans la zone identifiée ont ensuite été listés. La liste obtenue a été croisée avec une liste de gènes impliqués dans le RNAi établie par l’équipe. Grâce à cette méthode, nous avons pu identifier plusieurs gènes SOJ.

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Figure 29 : Représentation graphique de l’analyse du séquençage des suppresseurs soj

Les descendants F2 des plantes issues du croisement JAP3/L1/jmj14 x soj montrant une restauration du silencing de PDS jmj14 ont été séquencées. Les données obtenues ont été filtré et une représentation graphique a été effectuée. Chaque point présent sur les courbes correspond à une mutation de type EMS présente uniquement chez le soj analysé. La position de la mutation sur les chromosomes est indiquée en abscisse. La valeur des ordonnées correspond au ratio du nombre de read mutés sur le nombre de read sauvage. La courbe en bleu est une courbe de régression de LOESS basé sur les mutations. Les points proches de 100% ont été indiqués en rouge (ratio > 90%). Ils correspondent aux mutations fixées dans les descendants et sont de bons candidats pour trouver le gène responsable de la suppression.

Gènes identifiés

Pour mémoire, soj-10-2-1-1 présente une mutation dans HDA6.

soj-2-5-3-1 présente une mutation dans AGO4 comme prévu par les tests d’allélisme.

soj-1-4-4-1 présente une mutation dans DCL3, également comme prévu par les tests

d’allélisme. La mutation crée un frameshift qui interrompt la protéine. soj-1-2-3-1-2 porte également une mutation dans DCL3 au niveau du site donneur du 18ème intron. Par ailleurs, les plantes issues du croisement entre soj-1-2-3-1-2 et soj-1-4-4-1 présentent un silencing de

PDS (Figure 30).

soj-5-3-1-1, soj-6-1-3-1 et soj-7-1-2-1 portent tous trois une mutation dans le gène MOM1.

Afin de déterminer si ces mutations mom1 sont bien causales, ces trois soj ont été croisés les uns avec les autres et avec mom1 afin de vérifier qu’ils formaient bien un seul et même groupe

103 de complémentation. Les descendants de ces croisements présentaient tous des nervures blanches indiquant qu’ils font tous partie du même groupe de complémentation (Figure 30).

soj-3-4-3-1 et soj-6-3-3-1 portent une mutation dans le gène FDM5. Ce gène code pour une

protéine de la famille SGS3. Cette famille comprend 14 membres, dont SGS3 qui est impliqué dans le PTGS, et 6, dont FDM5, qui sont impliqués dans la RdDM (Xie et al. 2012). Le croisement entre soj-3-4-3-1 et soj-6-3-3-1 montre clairement qu’ils sont alléliques, et seul le gène FDM5 est muté à la fois dans soj-3-4-3-1 et dans soj-7-1-2-1 (Figure 30). Il est donc très vraisemblable que FDM5 soit responsable de la suppression de jmj14. Des tests d’allélismes avec un mutant fdm5 sont en cours pour le vérifier.

soj-3-5-2-1 porte une mutation dans le gène AT1G08600, aussi appelé CHR20 ou ATRX.

AT1G08600 code une protéine à domaine SNF2-like. Plusieurs protéine à domaine SNF2-like ont déjà été associés à la RdDM (Kanno et al. 2004; Smith et al. 2007). Le croisement entre JAP3 et un mutant atrx portant un T-DNA inséré dans le septième exon produit en F2 des plantes présentant un silencing de PDS aggravé par rapport à JAP3 (Figure 30). Le génotypage de ces plantes est en cours afin de déterminer si la mutation atrx est causale de ce phénotype. Un test d’allélisme entre soj-3-5-2-1 et ce mutant atrx est également en cours.

soj-7-3-4-1 porte une mutation dans le gène PIAL2 qui code pour protéine interagissant avec

MOM1 (Han et al. 2016). Un test d’allélisme entre soj-7-3-4-1 et un mutant pial2 portant un T-DNA inséré dans le septième exon est également en cours.

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Figure 30 : Confirmation des résultats obtenus par le séquençage des suppresseurs

A : Photographie des plantes mom1 âgées de 19 jours cultivées en conditions de jours long. B : Classification phylogénétique des différentes CHRs présentent chez Arabidopsis thaliana. En rouge sont marquées les CHRs impliquées dans la RdDM et/ou du TGS. En bleu est indiqué ATRX qui au vu de son effet sur JAP3 pourrait être impliqué dans la RdDM. La figure est adaptée de la figure 1 de cet article (Shaked et al. 2006).

C : Photographie de plantes mom1 ou fdm5 âgées de 23 jours cultivées en conditions de jours long.

D : Photographie d’une plante atrx âgée de 24 jours cultivées en conditions de jours long. E : Photographie des plantes dcl3 âgées de 19 jours cultivées en conditions de jours long.

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