Bilan sur l’étude de sgs1

Dans ce chapitre, nous avons vu que le mutant sgs1 affectait la transcription des transgènes comme le fait un mutant jmj14, ce qui appuie l’idée que JMJ14 et NAC52 participent conjointement à la régulation des transgènes. Cependant, sgs1 contrairement à jmj14 ou d’autres allèles de NAC52 conduit à une diminution drastique de l’accumulation des ARNm

SGS3. Cette diminution affecte donc les voies du PTGS qui requièrent SGS3 telles la voie des trans-acting siRNA ou le S-PTGS. Il est néanmoins possible de complémenter cet effet avec un

transgène p35S:SGS3 afin d’étudier l’effet de la mutation de nac52 sur le PTGS de L1. Dans ce cas, nous nous retrouvons avec un phénotype très proche de celui d’un mutant jmj14. D’ailleurs, sur des lignées réalisant du PTGS indépendamment de SGS3, le mutant sgs1 présente la même spécificité envers les transgènes que le mutant jmj14 (Figure 38). L’ensemble de ces résultats appuie l’idée que JMJ14 et NAC52 affecte de la même manière la transcription et le PTGS issus des transgènes.

Nous avons aussi montré que le complexe était capable de se lier au niveau du transgène 6b4. Cet accrochage dépend de la fixation de JMJ14 sur le promoteur 35S et conduit à l’accumulation de NAC52 sur l’ensemble du gène GUS (Figure 39). Il est alors possible de supposer que cet accrochage va jouer un rôle sur la transcription et peut être sur le PTGS. Enfin, NAC52 faisant partie du complexe mais ayant un comportement légèrement différent de JMJ14 sur l’accrochage, nous avons décidé de réaliser un crible génétique sur les plantes

JAP3/sgs1. Même si les résultats sont préliminaires et nécessitent d’être confirmé, il semble

que ce crible ait en partie identifié les mêmes suppresseurs que ceux identifiés sur

JAP3/L1/jmj14 (Tableau 5). Ainsi, il est quasiment certains que les suppresseurs forts soient

des allèles ago4 et que deux des suppresseurs intermédiaires soient des allèles dcl3 (Figure 41). Enfin, trois suppresseurs identifiés présentent un comportement très intéressant puisque qu’ils restaurent le PTGS sans augmenter la production de siRNAs (Figure 41 & Figure 42).

152

Discussion

153 Deux cribles génétiques indépendants visant à identifier les gènes cellulaires contrôlant le PTGS des transgènes ont permis d’isoler des mutants jmj14, suggérant un lien entre l’histone déméthylase JMJ14 et le PTGS (Searle et al. 2010; Le Masson et al. 2012). Une première caractérisation du mutant isolé par notre équipe avait montré que jmj14 réduit la transcription des transgènes d’un facteur deux (Le Masson et al. 2012). Cependant, cet effet transcriptionnel n’explique pas à lui seul l’effet du mutant sur le PTGS, en particulier l’absence de manifestation du PTGS systémique. Mon travail visait donc d’une part à comprendre le rôle de JMJ14 dans le PTGS et d’autre part à approfondir l’étude du rôle de JMJ14 sur la transcription des transgènes. Par ailleurs, je me suis intéressé à un autre mutant, sgs1, isolé du même crible et présentant de fortes similitudes de comportement avec jmj14. Ce mutant est perturbé dans un facteur de transcription, NAC52, qui interagit physiquement avec JMJ14 (Ning et al. 2015; Zhang et al. 2015b).

Caractérisation du rôle de JMJ14 sur le PTGS

Sur les systèmes de S-PTGS, jmj14 conduit à la coexistence de siRNAs et d’ARNm uidA (Figure 11 & Figure 13). Ce phénotype est étonnant puisqu’il est attendu qu’une cellule initiant le PTGS conduise à la dégradation de tous les ARNm qu’il cible. Ce phénotype particulier signifie que le PTGS est toujours initié par certaines cellules de la plante, mais pas dans toutes. JMJ14 semble donc requis pour que le PTGS affecte l’ensemble de la plante lors du S-PTGS. La présence d’une mutation jmj14 dans une plante 6b4 où le RQC est déficient comme dans

6b4/xrn4/jmj14, montre lors du test de coloration GUS que l’activité de la protéine est

présente dans l’ensemble de la feuille (Figure 13). Cela signifie que les cellules initiant le PTGS ne sont pas localisées au niveau de régions particulières mais sont réparties sporadiquement sur l’ensemble de la feuille Ainsi, le S-PTGS semble être initié spontanément uniquement par quelques cellules de la feuille. Il faudra ensuite la mise en place d’une systémie pour que l’ensemble de la feuille soit affectée. Au vu du phénotype de jmj14 sur le S-PTGS, JMJ14 doit être impliqué dans cette systémie.

Ce rôle est confirmé par les expériences de greffes qui montrent que des parties aériennes

154 des parties aériennes 6b4 déclenchent le PTGS lorsqu’elles sont greffées sur des racines L1 (Figure 12), signifiant que jmj14 a bloqué l’induction du PTGS de 6b4 par les racines L1. Au contraire, l’induction du PTGS dans la partie aérienne des plantes 6b4 greffées sur des racines

L1/jmj14 montre que le signal induisant le PTGS est toujours produit et qu’il est bien

transporté dans les plantes mutantes jmj14 (Figure 12). Par conséquent, JMJ14 est requis pour que le signal inducteur du PTGS soit reconnu, traité ou induit dans la partie aérienne.

Afin de tester cette hypothèse, nous avons regardé l’effet de jmj14 sur différents systèmes d’IR-PTGS. Les systèmes 6b4/306 et GFPIR initient l’IR-PTGS de façon constitutive puisque le transgène exprimant l’ARNm ciblé par le PTGS (uidA ou GFP) et le transgène produisant un ARN en IR induisant le PTGS sont exprimés sous le contrôle du même promoteur 35S. Les deux transgènes s’expriment donc toujours dans les mêmes cellules. La systémie du PTGS n’est donc pas requise sur ces deux systèmes. La mutation jmj14 n’affecte pas ce type de PTGS, ce qui soutient notre hypothèse.

Au contraire, les systèmes d’IR-PTGS JAP3 et SUC:SUL initient le PTGS au niveau des nervures. Le phénotype visuel de ces plantes est un silencing de PDS (pour JAP3) ou de SUL (pour

SUC:SUL) sur une quinzaine de cellules du mésophylle autour des veines, consécutif à la

systémie du PTGS. Sur ces systèmes, jmj14 conduit à une absence de silencing systémique de

PDS ou de SUL.

Le fait que les transgènes induisant l’IR-PTGS localement soient affectés par jmj14 alors que ceux induisant de l’IR-PTGS constitutif ne le soient pas, renforce donc notre hypothèse que JMJ14 est impliquée dans la systémie du PTGS.

Le système amiRSUL exprime un ARN en IR processé en miRNA au niveau des nervures et comme SUC:SUL conduit au silencing de SUL dans les cellules du mésophylle autour des veines. Ce système ressemble fortement au système SUC:SUL si ce n’est qu’il produit des miRNAs et non pas des siRNAs (Fenselau de Felippes et al. 2010). Le fait que les plantes amiRSUL/jmj14 aient un phénotype équivalent aux plantes amiRSUL signifie que jmj14 n’affecte pas la systémie de ce type de PTGS. Ceci implique que JMJ14 n’est pas impliquée dans la systémie des miRNAs qui présentent par ailleurs une mobilité extrêmement réduite, contrairement aux siRNAs (Schwab et al. 2009). Ces résultats suggèrent que le signal transitant à travers la plante

155 est un précurseur double-brin de siRNA, un siRNA double brin, un siRNA simple brin accroché à une protéine reconnaissant spécifiquement les duplex de siRNAs et pas les duplex de miRNAs avant séparation des brins, ou encore un siRNA simple brin modifié biochimiquement avant séparation des brins de façon à le distinguer d’un miRNA sous sa forme simple brin.

Pour résumer, JMJ14 agit sur la systémie du PTGS des transgènes et plus particulièrement au niveau des cellules recevant le signal inducteur. On peut alors postuler deux actions possibles. Il pourrait être impliqué dans l’entrée du signal depuis l’extérieur de la cellule vers l’intérieur de la cellule. JMJ14 étant une protéine nucléaire, il est peu probable qu’elle agisse au niveau de la paroi cellulaire (Zhang et al. 2015b). Son action pourrait donc être indirecte et passer par la dérégulation d’un gène endogène régulant la systémie du PTGS. JMJ14 pourrait aussi affecter les étapes se déroulant après que le signal soit entré dans la cellule et avant que le PTGS soit initié. Son action pourrait être directe, au niveau de la chromatine, ou indirecte, en dérégulant un gène lui-même impliqué dans cette étape.

156

Figure 43 : Représentation graphique de l’effet de la mutation jmj14 sur le PTGS initié par les transgènes

Dans ces schémas, les cercles blanc représentent des cellules n’ayant pas induit le PTGS, les cercles gris ceux qui exécutent le PTGS en réponse au signal reçu et les cercles noirs ceux qui induisent du PTGS et produisent un signal. Lors de l’IR-PTGS constitutif, toutes les cellules exprimant le transgène initient le PTGS. jmj14 et nac52 n’affectent pas ce type de PTGS. Lors du S-PTGS ou de l’IR-PTGS induit localement, seules quelques cellules initient le PTGS. Ces dernières produisent un signal qui induit par systémie le PTGS aux cellules adjacentes. Dans l’IR-PTGS induit localement, les cellules qui reçoivent le signal exécutent le PTGS mais ne produisent pas de signal à leur tour. Par conséquent, le PTGS ne sera pas induit aux cellules éloignées des nervures. Au contraire, dans le S-PTGS, les cellules qui reçoivent le signal exécutent le PTGS et produisent à leur tour un signal qui induit du PTGS dans les cellules adjacentes. A terme, toute la feuille finira par subir le S-PTGS. Que l’on soit dans de l’IR-PTGS local ou le S-PTGS, les mutations de jmj14 et nac52 affectent la systémie du PTGS. Les cellules initiant le PTGS spontanément continuent à être induite et à produire un signal. Cependant, les cellules adjacentes ne déclenchent pas le PTGS. Dans le cas du PTGS induit par des miRNAs, la systémie est moins forte qu’avec les siRNAs en fond sauvage, mais elle est insensible à jmj14.

Mise en évidence de l’existence de deux complexes impliqués dans

la régulation des transgènes

Afin de mieux caractériser JMJ14, nous avons recherché les protéines avec lesquelles elle interagit. Pour cela, nous avons effectué une expérience de tap tag. Les protéines NAC52, NAC50 et RCC1 ont ainsi été identifiées (Tableau 1). NAC52 semble jouer un rôle aussi important que celui de JMJ14 dans la régulation des transgènes. NAC52 est un facteur de transcription à domaine NAC qui conjointement avec JMJ14 a été impliquée dans la régulation transcriptionnelle des gènes endogènes (Ning et al. 2015; Zhang et al. 2015b). Nous avons pu montrer dans ce travail que la mutation nac52 conduit au même effet transcriptionnel sur L1 et 6b4 que la mutation jmj14 (Butel et al. 2017). De plus, comme les mutants jmj14, les mutants nac52 affectent l’IR-PTGS induite localement (JAP3 ou SUC:SUL) mais n’affectent pas l’IR-PTGS constitutif (6b4/306) (Figure 31).

La similarité des phénotypes des mutants jmj14 et nac52 et l’existence d’une interaction entre JMJ14 et NAC52 suggère donc qu’ils forment un complexe impliqué dans la régulation transcriptionnelle des transgènes et dans le PTGS qu’ils initient.

157 RCC1 n’est pas impliqué dans la systémie du PTGS comme le montre l’absence d’effet visuel sur le silencing de JAP3 (Figure 16). Cependant, le mutant rcc1 qui a été testé, conduit à la diminution de l’activité GUS des plantes Hc1 d’un facteur deux (Figure 16). Cet effet rappel fortement l’effet des mutants jmj14 ou nac52 sur 6b4 et L1 (Le Masson et al. 2012; Butel et

al. 2017). rcc1 pourrait donc conduire au même effet transcriptionnel que jmj14 et nac52, ce

qui l’impliquerait dans la régulation transcriptionnelle des transgènes. Sachant que RCC1 fait partie d’une famille protéique impliquée dans l’export des molécules du noyau vers le cytoplasme (Hadjebi et al. 2008), il est tentant d’imaginer que la protéine permette l’export des ARNm uidA ou des ARNm issu d’un gène impliqué dans la transcription du transgène. On peut donc supposer qu’il existe un complexe JMJ14-NAC52-RCC1 impliqué dans la régulation transcriptionnelle des transgènes. Si l’existence de ce complexe se confirme, et vu que rcc1 n’est pas impliqué dans la systémie du PTGS, cela signifierait qu’il est possible de découpler l’action de JMJ14 et de NAC52 sur la transcription des transgènes de leur action sur le PTGS.

NAC52 faisant partie intégrante du complexe régulant les transgènes, un tap tag a aussi été effectué sur la protéine. Il a permis l’identification de JMJ14, NAC50 et SCPL45, ce dernier n’interagissant pas avec JMJ14 (Tableau 2). Les premiers résultats obtenus suggèrent que la protéine pourrait avoir un rôle sur la systémie du PTGS. En effet, le silencing des plantes

JAP3/scpl45 semble réduit comparativement aux plantes JAP3 (Figure 19). L’effet de scpl45

sur JAP3 est toutefois moins important que celui de jmj14 ou de nac52. Cela pourrait être dû à la présence de SCPL46 qui présente une forte ressemblance au niveau de la séquence peptidique avec SCPL45 et qui pourrait jouer un rôle redondant. Il serait donc intéressant de regarder l’effet du double mutant scpl45 scpl46 sur JAP3. SCPL45 fait partie d’une famille de peptidases qui contient aussi des protéines jouant le rôle d’acyl-transférases ou de lyases (Fraser 2005). Il serait donc très hasardeux de postuler des hypothèses quant à sa fonction pour le moment.

SCPL45 pourrait donc être impliqué dans la régulation de la systémie du PTGS et définirait un second complexe JMJ14-NAC52-SCPL45. Il faut noter qu’à l’heure actuelle, l’effet de SCPL45 sur la transcription des transgènes n’a pas été testé.

158 Ces résultats suggèrent donc l’existence de deux complexes de régulation des transgènes. Le premier serait composé de JMJ14, NAC52 et RCC1 et serait impliqué dans la régulation transcriptionnelle des transgènes. Le second serait composé de JMJ14, NAC52 et SCPL45 et serait impliqué dans la systémie du PTGS. Des confirmations devront toutefois être réalisées pour pouvoir véritablement affirmer l’existence de ces deux complexes. A noter que NAC50, bien qu’interagissant avec JMJ14 et NAC52, ne semble pas jouer de rôle majeur sur la régulation transcriptionnelle des transgènes et la systémie du PTGS (Figure 17). C’est pourquoi, pour simplifier la suite de la discussion, je me focaliserai uniquement sur JMJ14 et NAC52 qui sont impliqués dans les deux types de régulations.

Caractérisation du mode d’action de JMJ14 et de NAC52 sur la

transcription des transgènes

Pour comprendre la régulation de la transcription des transgènes par JMJ14 et NAC52, nous avons testé l’interaction des protéines taguées FLAG-JMJ14 et NAC52-GFP sur le transgène

6b4. Les résultats suggèrent que les deux protéines s’accrochent suivant une séquence bien

particulière. JMJ14 se fixe au niveau du promoteur 35S du transgène 6b4, permettant ensuite le recrutement de NAC52 sur l’ensemble du gène uidA (Figure 39). La similarité de phénotype entre les mutants jmj14 et nac52 (Butel et al. 2017), et le déroulement en deux étapes de la fixation du complexe suggèrent fortement que les modifications de la transcription et de la chromatine sont dues à l’action de NAC52. Cela signifie que dans ce contexte, JMJ14 ne joue pas un rôle d’histone déméthylase et servirait uniquement au recrutement de NAC52 au niveau du gène uidA. Ce constat peut sembler étonnant mais explique pourquoi les mutants

jmj14 conduisent à une légère diminution des marques H3K4me3 qui est cohérente avec la

diminution du niveau de transcription, alors qu’une absence d’activité déméthylase devrait théoriquement conduire à une augmentation de l’accumulation des marques H3K4me3 sur les gènes ciblés (Le Masson et al. 2012). L’activité déméthylase de JMJ14 sur le promoteur du transgène est donc soit négligeable, soit bloquée. Ce cas de figure rappelle un type de régulation précédemment observé chez la drosophile avec l’homologue de JMJ14 nommé LID (Secombe et al. 2007). L’interaction de LID avec le facteur de transcription D-Myc conduit, en

159 effet, à l’inhibition de son activité déméthylase sans pour autant que ne soit affecté sa capacité à lier l’ADN (Secombe et al. 2007). Il permet alors à D-Myc d’accéder et de réguler l’expression de ces cibles. La régulation mise en évidence chez Arabidopsis thaliana avec JMJ14 et NAC52 pourrait suivre un cheminement similaire.

Pour aller plus loin, nous avons cherché à comprendre comment JMJ14 et NAC52 affectent la transcription des transgènes. Nous avons montré que la baisse de la transcription du transgène 6b4 en fond muté pour jmj14 ou nac52 est due à une méthylation de novo du promoteur du transgène uidA par l’ADN méthyltransférase DRM2 (Butel et al. 2017). En effet,

un niveau normal de transcription est restauré chez le double mutant jmj14 drm2, Ce

résultat suggère que la présence de JMJ14 et de NAC52 empêche l’action de DRM2 sur le transgène 6b4, prévenant ainsi la diminution de sa transcription.

Figure 44 : Action transcriptionnelle du complexe JMJ14 / NAC52

Dans un fond sauvage, JMJ14 (J) va se fixer au niveau du promoteur du gène GUS de 6b4 permettant le recrutement de NAC52 (N). Cette dernière va alors se fixer tout le long du transgène empêchant l’action de DRM2 (D) sur le gène GUS. Dans un fond muté pour jmj14, NAC52 ne va pas pouvoir s’accrocher sur le transgène. DRM2 va alors venir méthyler les cytosines présentes au niveau du promoteur du gène (bâtonnets noirs), conduisant à une diminution de la transcription des ARNm GUS. Dans un fond muté pour sgs1, JMJ14 va se fixer au niveau du promoteur mais NAC52 n’étant pas présent, DRM2 va pouvoir venir méthyler le gène et ainsi diminuer la transcription.

160 Ces résultats ont été obtenus sur le transgène 6b4. Cependant il est probable que cette régulation soit commune à l’ensemble des transgènes affectés par la mutation jmj14. En effet, chez jmj14, les transgènes L1, pSUC2:IR-PDS ou p35S:NIA2 présentent tous une diminution de l’accumulation des ARN codés par le transgène (Le Masson et al. 2012), Jauvion, 2010). On peut donc imaginer que l’accrochage de JMJ14 puis de NAC52 sur les transgènes permette de bloquer l’action de DRM2 sur ces transgènes.

La question qui se pose alors est de savoir si cette régulation est généralisable à l’ensemble des transgènes. En regardant les gènes régulés par JMJ14 et NAC52, nous nous sommes rendu compte que les ARNm produits par les gènes SUC2 et le gène PDS ne sont pas dérégulés chez

jmj14 ou nac52 (Ning et al. 2015; Zhang et al. 2015b), alors que les ARNs produits par le

transgène pSUC2:IR-PDS (JAP3) sont affectés par la mutation jmj14 (Jauvion, 2010). Ceci suggère que ce n’est pas la séquence du promoteur qui est reconnu, mais plutôt son origine transgénique. Cela est d’ailleurs renforcé par le fait que ni le promoteur 35S, ni le promoteur

SUC2 ne contiennent les séquences consensus qui ont été caractérisées comme étant la cible

de JMJ14 et de NAC52 (Ning et al. 2015; Zhang et al. 2015b). L’action transcriptionnelle de JMJ14 et de NAC52 sur les transgènes semble donc dépendre de paramètres différents de ceux qui ont été mis en évidence sur les gènes endogènes.

Cette différence dans la régulation des gènes endogène et des transgènes implique qu’il existe certainement une marque non identifiée pouvant être reconnue par certaines protéines, dont JMJ14 et NAC52. Logiquement cette marque doit être mise en place lors de l’insertion du transgène dans le génome. Au moins trois évènements pourraient définir une telle marque :

1 : Les transgènes présenteraient une séquence consensus située en dehors du promoteur et permettant le recrutement de JMJ14 et de NAC52. Par exemple, cette séquence pourrait correspondre aux bordures du plasmide Ti inséré par

Agrobacterium tumefaciens

2 : La cassure de l’ADN nécessaire pour qu’il y ait insertion du transgène dans le génome pourrait être responsable du dépôt de la marque. En effet, il est documenté que les lésions de l’ADN induisent l’apparition de siRNA par un mécanisme dépendant de NRPD1 (Wei et al. 2012; Schalk et al. 2017). Il est possible que lors de l’insertion des