Thesis
Reference
Etude du contenu en sucres de l'épinard (Spinacia oleracea L. cv.
Nobel) et d'autres plantes, pendant la variation de photopériode
DEGLI AGOSTI, Robert
Abstract
The long-day plant spinach (Spinacia oleracea cv. Nobel) remains vegetative in short-days (SD) of 8 hours of light (8:16 L:D). With 4-weeks old vegetative plants, the photosynthetic activity directly controls the total sugar content in the primary leaves and petioles. When the plants are transferred to continuous light (photo periodic transfer in LL), the total sugar content is sharply increased 2 to 3 hours after the beginning of the photoperiodic transfer. Glucose, fructose and sucrose are the main soluble sugars present in spinach leaves and petioles as indicated by TLC and HPLC techniques. During the photoperiodic transfer the glucose and fructose content increases 5 to 8 fold in the leaves and petioles by comparison with the content at the end of the light period during SDs. The sucrose content is also increased during photoperiodic transfer, but to a lesser extent. This phenomenon is called the "glucose effect"
and is also observed in some other photoperiodic plants such as the long-day plants Coleus (Coleus blumei Benth.) and mustard (Sinapis alba L.), and the short-day plant Chenopodium rubrum (ecotype 184). In SD [...]
DEGLI AGOSTI, Robert. Etude du contenu en sucres de l'épinard (Spinacia oleracea L.
cv. Nobel) et d'autres plantes, pendant la variation de photopériode. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 1985, no. 2174
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:43546
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:43546
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ETUDE DU CONTENU EN SUCRES DE L'EPINARD
<SPINACIA OLERACEA L. cv. NOBEL) ET D'AUTRES PLANTES, PENDANT LA VARIATION DE PHOTOPERIODE
THE SE
PRESENTEE A LA FACULTE DES SCIENCES DE L'UNIVERSITE DE GENEVE
POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR ES SCIENCES BIOLOGIQUES
PAR
RoBERTO DEGLI AGOSTI
DE
GE NEVE
Thèse no 2174
Genève
Imprimerie de la section de Physique
1985
autorise l'impression de la présente thèse, sans exprimer d'opinion sur les propositions qui y sont énoncées.
GENi;VE, le 17 décembre 19 85
Thèse
Le Doyen :
H , &., J~
Armand BUCHS
Je remercie également le Dr M. BONZON pour la lecture attentive et critique de ce travail.
Je remercie le Prof. E. WAGNER de l'Université de Freiburg im Breisgau (R.F. Allemagne) pour avoir accepté de faire partie du jury et pour 1 'accueil toujours chaleureux qu'il m'a réservé lors de mes séjours à Freiburg.
De même, je remercie le Prof. T. GASPAR de 1 'Université de
Liège (Belgique) et le Prof. B. MILLET de 1 'Université de Besançon (France) d'avoir bien voulu accepter d'être membres du jury.
Que tous ceux, et ils sont nombreux, qui de près ou de loin, ont participé à la réalisation de ce travail trouvent également ici 1 'expression de ma très profonde gratitude.
PAGE 1. INTRODUCTION
1.1 Généralités
1.2 Synthèse et distribution du saccharose 3
1 .2.1 Métabolisme du saccharose 5
1 .2.2 Distribution du saccharose 9
2. BUT DU TRAVAIL 15
3. MATERIEL ET METHODES 17
3.1 Matériel et conditions de culture 17
3.1.1 L'épinard 17
3.1.2 La moutarde 17
3.1.3 Le Coleus 17
3.1.4 Le chénopode 18
3.1.5 Le Pharbitis 18
3.2 Méthodes 19
3.2.1 Mesure de la croissance et du poids frais 19
3.2.2 Dosage des protéines 19
3.2.3 Dosage des chlorophylles 20
3.2.4 Le dosage des sucres 20
3.2.4.1 Echantillonnage 20
3.2.4.2 Extraction 22
3.2.4.3 Les sucres totaux 24
3.2.4.4 Chromatographie en couche mince (CCM) et chromatogra- 26 phie liquide à haute pression (HPLC)
3.2.4.5 Glucose et fructose 27
3.2.4.6 Le saccharose 32
3.2.4.7 L'amidon 36
3.2.5 Le dosage du malate 37
3.2.6 Les analyses d'efflux 39
3.2.7 L'infiltration 40
3.2.8 Activités enzymatiques 41
3.2.8.1 L'invertase 41
3.2.8.2 La glucose-6-phosphate déhydrogénase 42 3.2.9 Mouvement des feuilles de 1 'épinard 42 3.2.9.1 Mesure de 1 'angle entre deux feuilles primaires 42
3.2.9.2 Mesure continue du mouvement 43
3.2.10 Coupes histologiques de 1 'apex d'épinard 44
3.2.11 Traitements chimiques divers 44
3.2.12 Statistique 44
3.2.13 Résolution numérique d'un système (2) d'équations 45 différentielles
4. RESULTATS 4.1 L'épinard
4. 1.1 Evolution des sucres totaux en jour court et lors du transfert photopériodique
4.1.2 Analyses qualitatives
4.1.2.1 Chromatographie en couche mince (CCM)
4.1.2.2 Chromatographie liquide à haute pression (HPLC) 4. 1.3 Evolution des sucres lors de différents traitements
photopériodiques et chimiques
4.1.3.1 Dosages dans la feuille, le pétiole et 1 •hypocotyle de 1 •épinard
4.1.3.2 Mise en évidence de deux types de réponse du glucose lors du transfert photopériodique chez 1 •épinard 4.1.3.3 Autres traitements inducteurs ou non de la floraison
a) Transfert inducteur mimé
b) Action de 1 •acide gibbérellique
c) Effet d•un inhibiteur de la photosynthèse: le DCMU d) Effet d•un inhibiteur de la respiration: 1 •azide e) Effet du chlorure de lithium
4.1.3.4 Effet de 1 •intensité lumineuse
4.1.4 Mise en évidence de 1 •effet du stress sur le 11phénomène glucose ..
4.1.5 Discussion
4.2 Quelques précisions sur "l'effet glucose" dans les pétioles de 11épinard
4.2.1 11Source11 du phénomène glucose
4.2.2 Cinétique du transport de 111 •effet glucose .. de la feuille vers le pétiole
4.2.3 Rôle de 1 •invertase
4.2.3.1 Tests de la mesure de 1 •activité invertasique in vitro 4.2.3.2 Estimation de la constante de Michaelis (Km) de
1 •invertase du pétiole de 1 •épinard
4.2.3.3 Activité de 1 •invertase lors du transfert en lumière continue
4.2.3.4 Variation du pH optimum
4.2.3.5 L•invertase est-elle excrétée?
4.2.4 Les analyses de 1 •efflux du glucose 4.2.5 Discussion
4.3 Modélisation de 11l'effet glucose ..
4.3.1 Elaboration du modèle
4.3.2 Evaluation des paramètres du modèle 4.3.3 Simulations
4.3.4 Cas du chénopode 4.3.5 Discussion
PAGE 47 47 47 48 48 50 53 53 61 64 66 67 69 71 71 74 78 87 95 95 96 102 103 106 106 108 110 112 123 127 128 130 139 144 152
~-~ Le mouvement des feuilles de l'épinard: indicateur de 1•organisation du temps interne de la plante
4.4. 1 Etude du mouvement de l'épinard par la mesure de 1 'angle form6 entre les feuilles primaires
4.4.1.1 Effet de 1 'intensité d'éclairement
4.4. 1.2 Evolution du mouvement lors de la croissance de
1 'épinard
4.4.2 La mesure en continu du mouvement
4.4.2.1 Mesure continue du mouvement de la feuille de 1 'épinard en jour court et lors du transfert photopériodique
4.4.2.2 Effet de l'ajout unique d'une durée variable d'obscurité sur le mouvement foliaire de 1 'épinard
4.4.3 Discussion
4. 5. 1 4. !) • 2 4. ~). 3
4.5.4
Relation entre "l'effet glucose .. et le rythme foliaire, généralisation du phénomène
[ffet du ~JCD 24 Effet du JCD 40
Dosage du glucose dans le pétiole et la feuille du
r'u /1 · w: ~ en jour court et l ors du transfert en lumière continue
Evolution du glucose lors de différents traitements photopériodiques chez la moutarde
Discussion 5. CONCLUSION 6. RESUM[
7. SUM~~/\RY
B. BIBLIOGRAPHIE
155 157 161 161 167 167 170 175 181 183 186 189 190 194 195
203 205 207
plus particulièrement de la photosynthèse. D'une manière simplifiée, cette dernière peut se décrire comme suit:
Dans cette réaction, 1 a 1 umi ère fournit l'énergie 1 i bre nécessaire permettant aux organismes chlorophylliens de produire, à partir du gaz carbonique et de 1 'eau (molécules inorganiques), un dégagement d'oxy- gène et des molécules organiques: les sucres. C'est avec ces derniers et 1 eur énergie que l'es sentie 1 de tous 1 es organismes vivants est construit.
La simplicité apparente de cette équation cache toutefois une réalité beaucoup plus complexe (Halliwel, 1981; Govindjee, 1982a; Govindjee, 1982b; Jensen, 1980). Par exemp 1 e, 1 a photosynthèse ne produit pas exclusivement des sucres, mais également des acides organiques et des acides aminés. Il faut donc considérer ce phénomène comme une compo- sante intégrée d'une part dans le métabolisme du carbone et de 1 'azo- te, et d'autre part en relation avec les autres processus fondamentaux que sont la respiration et la photorespiration.
D'un premier point de vue, l'interaction de 1 a 1 umi ère avec 1 es plantes possède un aspect essentiellement quantitatif, c'est-à-dire lié à 1 'intensité de 1 'éclairement. Plus il y aura de lumière, plus il y aura d'assimilation du carbone et donc de croissance. Ceci, à condi- tion d'être dans le domaine physiologique adéquat et qu'il n'y ait pas d'autres facteurs environnementaux limitants (température par ex.).
Cependant, cette interaction ne se limite pas uniquement à ce premier aspect. Par exemple, il existe chez les plantes supérieures un pigment particulier, le phytochrome, qui peut effectuer, en quelque sorte, la mesure re 1 at ive de 1 a qua 1 i té de 1 umi ère reçue dans certaines zones discrètes du spectre électromagnétique (rouge clair: 660 nm et rouge lointain: 730 nm). Ce photorécepteur est susceptible, dans certaines circonstances, d'influencer la croissance et la différenciation
(photomorphogenèse, Mohr, 1972).
Enfin, la durée de 1 'éclairement (photopériode) et de 1 'obscurité quo- tidienne (nyctopériode) peuvent également contrôler la croissance et le développement (photopériodisme, Garner & Allard, 1920; Evans, 1975). La reproduction, et donc la survie de 1 'espèce, est, chez cer- taines plantes, liée à la durée du jour et de la nuit. Ce phénomène a une importance considérable, car la longueur de la journée peut varier significativement au cours de 1 'année dans la nature (voir Salisbury, 1981; Vince-Prue & Cockshull, 1981). Dans ce domaine on classe, de manière simplifiée, les plantes en trois grandes catégories selon la réponse photopériodique: les plantes dites indifférentes, qui, en des- sus du minimum trophique fleurissent quelle que soit la photopériode;
1 es p 1 antes de jours courts, chez 1 es que 11 es 1 a reproduction est uniquement favori sée par des durées quotidien nes de 1 umi ère i nféri eu res à une certaine v a 1 eur (photo péri ode critique: environ 11 heures), et enfin, les plantes de jours longs, dont la floraison est enc 1 enchée 1 orsque 1 a durée 1 umi neuse est su péri eure à une va 1 eur critique et spécifique du jour (environ 11 heures). De nombreux particularismes existent suivant les plantes considérées (Vince-Prue, 1975; Bernier et al., 198la; Bernier et al., 198lb; Salisbury, 1981).
En ce qui concerne la participation de la photosynthèse à la florai- son, des cas ont été observés où un apport artificiel de sucres dans des conditions photopériodiques défavorables accélère la mise à fleur aussi bien chez des plantes de jour court (Lang, 1952; Takimoto, 1960;
Ki mur a , 1 9 6 3 ; C umm i n g , 1 9 6 7 a ) que de jour 1 on g ( Bod son et a 1 . , 1 9 7 9 ; Me 1 chers & Lang, 1942; Fri end et a 1 . , 1984). Dans ce dernier cas, 1 es résultats des expériences où la floraison est inhibée par la dichlo-
al., 1969; Friend et al., 1979), ou par de 1• air sans co
2 durant un allongement de la photopériode menant habituellement à la floraison, suggèrent une participation active de la photosynthèse (Bodson et al., 1977; Quedado & Friend, 1978). c•est dans ce sens que 1 •on peut aussi interpréter 1 es résultats où des éc 1 ai rements 1 umi neux é 1 evés favo- ri sent 1 a mi se à fleurs (Have 1 ange & Ber ni er, 1983; Bodson et a 1 . , 1977) et compensent partiellement le manque d•allongement de la durée du jour. Ce dernier traitement n • a cependant pas toujours un te 1 effet, par exemple, chez la moutarde, qui est une plante de jour long, un éc 1 ai rement intense, donné pendant 1 a péri ode 1 umi neuse su pp 1 é- mentaire inductrice de la floraison, inhibe cette dernière. De même, si 1 • on donne une atmosphère dépourvue de co
2 durant cette péri ode inductrice: aucune i nhi bit ion de 1 a fl or ai son n • est observée ( Bodson et a 1 . , 1977) . Ces que 1 ques exemp 1 es, mont rent qu • i 1 est g 1 ob a 1 ement très difficile d•attribuer à la photosynthèse un rôle purement trophique ou une action plus spécifique qui serait responsable de la génération de signaux, ou de substances (précurseurs ? ) spécifiques pour la floraison (voir aussi Bernier et al., 198la; Bernier et al., 1981 b) .
Ce qui émerge de ces dernières considérations est une impression de
11flou scientifique .. qui n•est pas tant dû au manque d•expériences dans ce domaine, mais surtout au fait que le, ou les, mécanismes moléculai- res contrôlant la floraison ne sont toujours pas connus.
1.2. Synthèse et distribution du saccharose
La photosynthèse qui a lieu dans les chloroplastes des feuilles deve- loppées assure la production des molécules organiques nécessaires à la croissance et au maintien du métabolisme non seulement de la feuille même, mais aussi d•autres parties de la plante tels que les tissus et organes hétérotrophes (racine, tige, pétiole~ méristèmes) et les jeunes feuilles en croissance, où la photosynthèse locale n•est pas suffisante. Ainsi, une plante doit organiser dans 1 •espace et le temps une distribution efficace et appropriée des produits photosyntétiques.
Chaque feuille évolue success i verne nt d un état de consommateur ( i rn- port) vers un état de producteur (export), la transition s 1 effectue généralement lorsque la taille de la feuille atteint la moitié de sa dimension maximale (Giaquinta, 1978; Fellows & Geiger, 1974; Thrower,
l 962) .
Lorsque l1on donne du carbone radioactif (14
co
2) à une feuille d1une plante il est possible de suivre dans le temps et l1espace dans quelles molécules organiques le carbone marqué se retrouve.Koch et Schrader ( 1984), ont obtenu le bilan suivant avec du 14
co
2donné pendant 2 heures à une feuille de soja: dans celle-ci, un tiers de la rad i oact i vi té se retrouve dans 11 ami don (polymère de réserve situé dans les chloroplastes et constitué de glucose), et les deux-ti ers dans des substances organiques solubles. Dans ces dernières, 70 à 80% sont des sucres, 8-17% des acides aminés et 3-14%
des acides organiques.
Dans le pétiole (organe de transit de la sève élaborée) toute la ra- dioactivité est soluble et 87-97% se retrouve dans les sucres, 3 à 12%
dans les acides aminés et moins de 2% dans les acides organiques.
Après un temps d1observation de plusieurs jours une certaine part de la ra di oact i vi té a été relâchée dans 11 atmosphère sous forme de
co
2(respiration), le reste est incorporé dans la paroi, les protéines et les lipides (Kagawa & Wong, 1985).
Ces observations sont tout à fait représentatives: la plus grande partie de la radioactivité (14
co
2) est fixée dans des sucres, vérita- bles molécules 11Carrefour11 à partir desquelles diverses voies métabo- liques sont possibles.laquelle les sucres circulent des sites de production vers ceux de consommation (Ziegler, 1975; Komor, 1983; Weiler & Ziegler, 1981;
Zimmermann, 1957; Zimmermann, 1960; Arnolds, 1968; Swanson, 1959).
Le saccharose est aussi le plus abondant et le plus commun des disac- charides dans 1 es tissus des p 1 antes, i 1 peut être précurseur de 1 a plupart des molécules organiques (lipides, protéines, polysaccharides des parois, sucres de réserves des graines, etc.,.). C'est aussi sous cette forme que 1 es réserves des gr ai nes sont converti es durant 1 a germination pour fournir 1 'énergie et les précurseurs nécessaires à la croissance et au déve 1 oppemenet. Enfin, c'est aussi 1 a source métabolique immédiate pour le maintien de la vie des plantes pendant 1 'obscurité (Duffus & Duffus, 1984; Akazawa & Okamoto, 1980; Ap Rees, 1984).
1.2.1. Métabolisme du saccharose
Le saccharose est un oligosaccharide à 12 carbones constitué de deux molécules de monosaccharides à 6 carbones, le glucose et le fructose réunis entre eux par une liaison B (1-2):
OH OH
glucose fructose
Sa biosynthèse a 1 i eu dans 1 es feui 11 es au moyen de 1 'ensemb 1 e des réactions données dans 1 e schéma sui va nt (Geiger & Gi aqui nt a, 1982;
Duffus
&
Duffus, 1984):<.1 >
GAP.-
<2
>~DHAP . p.
4 A 1
<3>~
FBP
chloroplaste
cytoplasme
<4>h.P·
G6P .. <S> ~F6P
1! 8>
<6>
saccharose·P~~accharose p.
<9>
G1~iDPG
UTP7
ADP
(1): Translocateur du phophate (Pi) (2): Triose phosphate isomérase ( 3) : Aldolase
(4): Fructose 1,6-bisphosphatase (5): Phosphohexose-isomérase (6): Phosphoglucomutase
(7): UDF-glucose pyrophosphorylase (8): Saccharose synthétase
(9): Saccharose phosphate phosphatase G6P: glucose 6-phosphate
G1P: glucose 1-phosphate PPi: pyrophosphate
hydroxyacétone phosphate (DHAP) et le glycéraldéhyde 3 phosphate (GAP) qui sont les principaux produits photosynthétiques exportés du chloro- plaste (Walker, 1976; Heldt et al., 1977; Robinson & Walker, 1976;
He ber, 1974). Cet export { 1 } est stoechi ométri quement 1 i é à 1• influx d • orthophosphate (Pi) grâce au 11trans 1 ocateur de phosphate ..
1 oc a 1 i sé sur 1 a membrane interne de 1• enve 1 oppe du ch 1 or op 1 aste, qui est imperméable aux autres intermédiaires du cycle de Calvin.
Dans le cytoplasme le DHAP est isomérisé en GAP par la triose phospha- te isomérase { 2 } . Ces derniers produits se condensent grâce à 1 •aldolase { 3 } en fructose-6-disphosphate (FBP) qui est ensuite converti en fructose-6-phosphate (F6P) par la fructose bisphosphatase { 4 } . Le F6P, par 1 a phosphohexose i somérase { 5 } , puis 1 a phos- phoglucomutase { 6 } , et enfin par la UDP-glucose-pyrophosphorylase { 7} est transformé en UDP-glucose (UDPG). L•UDPG et le F6P donnent du saccharose phosphate (saccharose P) avec 1 a saccharose phosphate synthase ( { 8 } : SPS) et, enfin, la saccharose phosphate phosphata- se ( { 9 } : SPP) 1 ibère 1 e saccharose. Le bi 1 an pour 1 a synthèse de ce sucre est le suivant:
4 tri oses phosphates + 3 H2
o
---.~1 saccharose + 4 PiLa libération du phosphate inorganique favorise la sortie continue des trioses phosphates du chloroplaste par le 11translocateur du phospha- te... Lorsqu • on di mi nue 1 e phosphate inorganique cytop 1 as mi que, 1 es trioses phosphates sont retenus à 1 •intérieur du chloroplaste, ce qui a pour effet de réduire la photosynthèse et de favoriser 1 •accumula- tion d•amidon (Chen-seh et al., 1975; Herold & Lewis, 1977).
L • é 1 aborat ion du saccharose vi a 1 a réaction coup 1 ée de 1 a SPS et 1 a SPP est en généra 1 considérée comme étant 1 a voie prédominante de synthèse de ce sucre (Ap Rees, 1984; Duffus
&
Duffus, 1984; Akazawa&
Okamoto, 1980; Doehlert & Huber, 1983; Doehlert & Huber, 1984; Amir &
Preiss, 1982).
L' équi 1 i bre de ces 2 réactions enzymatiques est te 1 qu' i 1 constitue pratiquement une étape irréversible in vivo .
De plus, 1 'apparition de la SPS paraît être très étroitement corrélée avec 1 'acquisition de la capacité exportatrice de la feuille, ce qui n • est pas 1 e cas des autres enzymes anabo 1 i ques ou catabo 1 i ques du saccharose (Gia qui nt a, 1978; Si 1 vi us et a 1., 1978). Une fluctuation journa 1 i ère de 1 • activité de cet enzyme a été observée chez 1 e soja (Kerr et al., 1985; Huber et al., 1984; Rufty et al., 1983) suggèrant la participation d'une horloge biologique.
Une autre enzyme clef dans la biosynthèse du saccharose est la fruc- tose bisphosphatase (Harbron et al., 1981; Stitt et al., 1983b); elle est aussi très fortement régulée, notamment par une molécule très importante: le fructose 2,6 bisphosphate (Cseke et al., 1984; Preiss, 1984; Stitt et al., 1983a).
D'autres enzymes interviennent dans le métabolisme de ce sucre:
- la saccharose synthétase qui catalyse la réaction suivante:
(Cardini et al., 1955; Echeverria & Humphreys, 1984):
saccharose + UDP<ll\lll ..- UDP glucose + fructose
Cette réaction est pratiquement à l'équilibre et est réversible. Elle possède une activité faible dans les feuilles (Giaquinta, 1978). Bien que 1 'on pense que la saccharose synthétase intervienne principalement dans le catabolisme du saccharose, étant donné sa présence plus élevée dans les tissus consommateurs (Delmer
&
Albersheim, 1970; Claussen et a 1 . , 1985) , sa capacité de fonctionner dans 1 es deux sens peut être importante pour déterminer la concentration de saccharose in vivo .- 11invertase qui catalyse la réaction pratiquement irréversible suivante:
saccharose + H20----•~glucose + fructose
Cette enzyme est en général particulièrement active dans les régions à
croissance rapide où sa présence est corrélée à 1 •hydrolyse du saccharose transporté en hexoses nécessaires à 1 a croissance et au métabolisme (Geiger & Giaquinta, 1982). Toutefois, elle est aussi présente dans les feuilles où son rôle reste obscur (Giaquinta, 1980).
1.2.2. Distribution du saccharose
La distribution du saccharose dans les plantes peut être subdivisée en 3 processus: 1) le mouvement des cellules productrices vers les vais- seaux secondaires du phloème dans la feuille; 2) la translocation via 1 e ph 1 oème vers d • autres organes; 3) 1 e re 1 âchement dans 1 es tissus consommateurs.
Bien qu•il n•y ait aucun modèle définitif pour aucun de ces processus, il est utile de schématiser les principales tendances des connaissan- ces actuelles dans ce domaine (voir par ex. à propos de 1) la discus- sion critique de Wilson et al., 1985).
1) Le mouvement du saccharose vers les vaisseaux secondaires du phloème.
Le schéma sui va nt résume 1 es données actuelles (Geiger & Gi aqui nt a, 1982; Delrot
&
Bonnemain, 1985):mésophylle
1 fixation du co2 (chloroplastes) 2 synthèse du saccharose
3 efflux (perte ?) de saccharose avec récupération 4 stockage temporaire dans la vacuole
5 mouvement symplastique via les plasmodesmes 6 cellule "spécialisée" avec antiport K+-S
phloème
7 diffusion dans l'apoplasme =mouvement apoplastique
8 cotransport H+-S dans les cellules compagnes du phloème avec 9 sortie du K+ pour compenser la charge
10 : pompe ac 1ve a t . .... H+
11: concentration du S dans les veines du phloème secondaire 12: mouvement de translocation du S.
Le mouvement de ce sucre vers 1 es v ais seaux du ph 1 oème secondai re s'effectue principalement par voie symplastique via les plasmodesmes { 5}, seule une partie du trajet est apoplastique { 7} (Geiger &
Gi aqui nt a, 1982). On observe dans 1 a feui 11 e au moins deux poo 1 s de saccharose dont 1 'un est cytoplasmique et 1 'autre vacuolaire { 4 } , ce der ni er ne cons ti tuant qu'un dépôt temperai re (Fon dy & Geiger,
1980; Gerhardt & Heldt, 1984; Geiger et; al., 1983; Kaiser & Heber,
1984).
Un mécanisme de "récupération" { 3 } du saccharose qui diffuse hors des cellules du mésophylle peut être envisagé d'après les résultats de Wi 1 son et a 1 . ( 1985), même si certains travaux suggèrent que 1 e relâchement des produits photosynthétiques est faible et non spécifi- que (Kaiser et al., 1979).
Dans ce contexte on peut envi sa ger que 1 a sortie du saccharose dans 1 'apoplasme { 6 } s'effectue dans des cellules spécialisées qui se si- tueraient de préférence dans le voisinage immédiat des vaisseaux se- condaires du phloème (Geiger
&
Giaquinta, 1982). De ces dernières cel- lules, le saccharose sortirait via un antiport avec le K+ { 6 } (Kaiser et al., 1979; Doman & Geiger, 1979; Huber & Morel and, 1980;Hu ber & More 1 and, 1981). I 1 serait repris par 1 es ce 11 u 1 es compagnes du phloème au moyen d'un cotransport avec des protons { 8 } . Le gra- dient de protons étant entretenu grâce à une ATPase à H+ { 10 } (Geiger, 1975; Giaquinta, 1983; Delrot & Bonnemain, 1978, 1981; Malek
&
Baker, 1977).Cho et Komor (1980) ont montré que 1 'entrée de H+ avec le saccharose se fait vraisemblablement par un symport et est corrélée avec la sor- tie K+ { 9 } . Ce dernier processus n'est pas couplé mécaniquement à 1 'entrée du saccharose -H+, mais résulte d'un mouvement passif permet- tant la compensation de la charge due à la dépolarisation transitoire du potentiel de membrane.
Des cellules compagnes le saccharose peut se diriger vers les cellu- les criblées du phloème par diffusion ou via des plasmodesmes { 11 } particulièrement nombreux et spécialisés à ce niveau (Geiger et al.,
1973; Gamalei & Pakhomova, 1981), afin de rejoindre le flux de la sève élaborée { 12 } .
2) Translocation dans le phloème
De nombreuses théories ont été proposées pour expliquer le transport du saccharose dans les cellules criblées du phloème (cf. Wardlaw, 197 4; Zimmermann & Mi 1 bu rn, 1975). Elles se di vi sent en deux catégo- ries principales: celles qui soutiennent que ce processus est actif, à savoir que 1 • énergie nécessaire pour un te 1 dép 1 acement est fournie tout le long des vaisseaux du phloème, et celles dites passives qui s'y opposent en localisant le processus actif uniquement au niveau du remplissage (point no { 10} ) du schéma précedant). La tendance ac tue 11 e semb 1 e favoriser 1 a deuxième a 1 ternat ive (Cou 1 son et a 1 . , 1972; Geiger & Giaquinta, 1982; Geiger, 1975; Delrot & Bonnemain, 1985). On en voudra pour illustration 1 'expérience de Coulson et al., (1972), qui ont refroidi localement un pétiole de betterave.
L'abaissement de température a pour effet d'inhiber la respiration et également la teneur en ATP locale sans toutefois affecter le flux des sucres dans le phloème.
Le mécanisme proposé est celui qui se fonde sur 1 'hypothèse du flux de masse ( 11 pressure-fl OW11 ou encore théorie de Münch, cf. Canny, 1975) qui peut être schématisé de la façon suivante:
rac1ne
.
PS: photosynthèse T : transpiration s ; saccharose
feui lie
phloème des feuilles { 1 } , crée une diffusion de 1 'eau paral- lèle { 2 } , ce qui provoque une pression à ce niveau. Cette pression diminue le long du phloème, car le saccharose diffuse dans les tissus consommateurs { 3 } , 1 a différence de pres si on serait ainsi responsable du mouvement du saccharose dans le phloème.
On peut souligner à ce propos que la vitesse de déplacement de la sève élaborée est considérable puisqu'elle se situe entre 1 et 4 cm par mi- nute (Giaquinta, 1980; Canny, 1975).
3) Le relâchement du saccharose dans les tissus consommateurs
Il s'agit de l'aspect de la distribution du saccharose qui est le moins bien connu. Plusieurs types de processus ont été observés. Ils dépendent du maté rie 1 ex ami né, de 1 'organe ou du tissu et peut être même de 1 'état du déve 1 oppement ( Gi aqui nt a et a 1 . , 1983; De 1 rot &
Bonnemain, 1979).
Le schéma suivant, repris de Gi aqui nt a et a 1 . ( 1983), i 11 ustre cette situation:
phloème
Le saccharose (s) peut être hydrolysé par une invertase liée à la paroi { 1}. Le glucose (g) et le fructose (f) ainsi produits sont transportés dans 1 e cytop 1 asme où 1 e saccharose peut être à nouveau synthétisé { 6 } pour être finalement déposé dans la vacuole (par ex.
canne à sucre, voir Glasziou et Gayler, 1972). Alternativement { 2 } , il peut être capté par un transporteur spécifique. Enfin { 3}, il peut être 11relâché11 du phloème par voie symplastique via les plasmo- desmes. L'invertase peut être présente dans la paroi { 1 } , dans le cytoplasme { 4 } , ou encore dans la vacuole { 5 } .
Les végétaux supérieurs doivent posséder une organisation particuliè- rement efficace qui leur permette de gérer à la fois dans 1 'espace et le temps leurs ressources nutritives dérivées de la photosynthèse afin d'assurer une croissance et un développement aussi harmonieux que pos- sible.
En prem1ere analyse, on peut considérer une plante comme un réseau hautement intégré dont les 4 fonctions fondamentales seraient les sui- vantes: production (photosynthèse), consommation (catabolisme des produits de la fonction précédente), distribution (circulation de la sève élaborée d'une feuille productrice vers des tissus consommateurs) et stockage (amidon p. ex.).
Le but de ce travai 1 est ce 1 ui d'examiner si , et à que 1 moment, 1 es interrelations de ce réseau sont altérées pendant la modification des conditions environnementales et plus précisément, de la photopériode.
C'est par le dosage des sucres que cette question sera approchée. En effet, comme i 1 a été montré au chapitre précédant, ces substances sont inévitablement associées aux quatre fonctions fondamentales mentionnées ci-dessus.
L'épinard sera la principale plante utilisée car, d'une part, il possède une exigence photo périodique pour fleurir ( p 1 ante de jour long: PJL) et, d'autre part, parce qu'il fait, et a fait, 1 'objet de nombreux travaux dans le Laboratoire de Physiologie végétale de l'Université de Genève, dans le cadre d'un programme de recherche sur 1 es mécanismes de l'induction de 1 a fl or ai son ( Greppi n, 1975:
Auderset, 1979; Bonzon, 1977; Penel, 1976; Cao, 1981; Fontana, 1983;
Fredj, 1977; Montavon, 1984; Tsala, 1984; Karege, 1981; Lenk et al.,l981). Les autres plantes étudiées seront la moutarde (PJL), le CoLeus (PJL) et le Chénopode (plante de jour court: PJC).
Le protocole expérimental de base est très simple, il est le suivant:
L'épinard est maintenu jusqu'à 1 'âge de 4 semaines en photopériode de jour court, c'est-à-dire, en alternances de lumière et d'obscurité de 8 et 16 heures respectivement (état végétatif). La modification environnementale consiste à prolonger la durée de la phase lumineuse à cette époque (traitement transfert). Les sucres sont extraits des feuilles et des pétioles.
Un tel travail peut également se justifier par la nécessité de suivre en détail l'évolution dans le temps des sucres lors d'un traitement photopériodique. L'absence pratiquement totale de ce type d'expérience dans la littérature a en effet de quoi surprendre lorsqu'on sait 1 'im- portance qu'occupe le métabolisme des sucres chez les végétaux supé- rieurs.
3.1. MATERIEL ET CONDITIONS DE CULTURE 3. 1 . 1 . L'épi nard
Les akènes d'épinard (Spinacia oLeracea L.cv. Nobel) sont semés dans du terreau; après 1 semaine, les plantules sont repiquées, à raison de 4 par pot (dim. 9 x 9 x 9 cm), dans du terreau, ou plus rarement, de la vermiculite. Elles sont arrosées 3 fois par semaine avec une solution nutritive (Sinesol 0,3 0/00) jusqu'à l'âge de 4 semaines, date de leur utilisation la plus fréquente. L'épinard, plante de jour long (van Oorschot, 1960; Parlevliet, 1966), est maintenu à l'état végétatif grâce à une photo péri ode de jour court dès 1 e semis ( 8 heures de 1 umi ère et 16 heures d'obscurité) . La germination et 1 a croissance sont obtenues dans des enceintes climatisées (phytotrons) où la température est maintenue constante à 20° ± 0.5°C, et 1 'humidité relative de 70% ( ± 5%) à la lumière et de 50% ( ± 5%) à 1 'obscurité.
L' éc 1 ai rement 1 umi neux qui est diffusé par des tubes fluorescents (Sylvania "daylight" F40Tl2 de 40 watts) est de 6000 lux au niveau moyen des feui 11 es, ce qui correspond à une énergie de 20.6 W/m2
(400-700 nm, Spectroradiometer ISCO).
3.1.2. La moutarde
Les graines de moutarde (Sinapis aLba L.), plante de jours longs (Bernier et a 1., 1981) sont semées dans du terreau, dans 1 es mêmes conditions que l'épinard. Les plantules sont utilisées soit après 1 semaine, soit après 2 mois en jour court (état adulte).
3.1.3. Le coleus
Des lots de coleus (CoLeus bLumei Benth. cv.golden bedder) sont obte- nus par bouturage d'une souche maintenue continuellement en jour
court. Les plants sont utilisés après 2 mois de culture. Comme 1 •épi- nard et la moutarde, le coleus est une plante de jour long et se main- tient à 1 •état végétatif dans ces mêmes conditions de culture
( Dupperex, 1965) .
3.1.4. Le chénopode
Les graines de chénopode (Chenopodium rubrum L. écotype 184) sont dispersées sur un mi 1 i eu nutritif so 1 ide et p 1 acées dans une boîte transparente fermée, (Mi 1 i eu de Hoagl and, voir Cummi ng, 1969: 5 mM Ca(N03)
2, 5 mM KN03, 2 mM MgS04, 1 mM KH2Po4, 2.86 mg/1 de H3
Bo
3,1.8mg/1 de MnC12.4 H20, 0.11 mg/1 de ZnC12, 0.05 mg/1 de CuC12.2H2
o,
0.025 mg/1 de Na2Moo4.2 H20, 10 mg/1 d•acide diaminotétra-acétique ferri que, pH 5. 5-5.8; 8 g/1 d • agar). La germination est obtenue par des a 1 ternances de température de 32.5° à 1
aoc'
d 1 une durée de 12 heures chacune, pendant 4~ jours; après un jour su pp 1 émentai re ( 24 heures) à 20°C, les plantules sont immédiatement utilisées. Dans une première ex péri en ce, 1• éc 1 ai rement 1 umi neux ( 6000 1 ux) conti nu est assuré par des tubes 11COO 1 whi te11 (Genera 1 El ectri cs); dans une deuxième, par des tubes 11daylight11 (Sylvania, 20 W, 6000 lux). Le chénopode est une plante de jour court: maintenu en lumière continue, il reste végétatif (Cumming, 1959; Cumming, 1969).3.1.5. Le pharbitis
Les graines de pharbitis (Pharbitis nil Choisy cv Violet) sont d•abord traitées à 1 •acide sulfurique concentré pendant 50 min puis, après un lavage adéquat, laissées pendant 12 heures dans de 1 •eau. Les graines sont mi ses sur du papi er humi di fié pour 1 a germination pendant 24 heures à 1 •obscurité à 26°C; les plantules sont alors sélectionnées et débarassées de leurs enveloppes. Le développement se fait dans de la vermiculite en lumière continue (tubes Sylvania 11daylight11, 5000 lux, T: 20°C, H.r.: 70%), pendant 6 jours avant d1être utilisées. Le pharbi ti s est une p 1 ante de jour court, i 1 reste végétatif dans 1 es conditions de culture qui sont décrites (Imamura, 1967).
3.2.1. Mesure de la croissance et du poids frais
La croissance est estimée en suivant 1 •évolution au cours du temps de la longueur des pétioles et des limbes. Le poids frais est obtenu par gravimétrie. Avec un échantillon de 16 plantes, 1 •erreur relative est suffisamment faible ( ~ 3%) pour permettre une seule estimation par lot.
3.2.2. Dosage des protéines
Les protéines sont dosées au moyen d • un réactif prêt à 1• emp 1 oi : 1 e Bio-Rad (micro Bio-Rad, Bio-Rad Laboratori es, München, FRG), dont 1 a réaction co 1 orée qui en ré su 1 te est quantifiée au spectrophotomètre (SP 1700 Ultraviolet spectrophotometer, Phillips, Pye Unicam), par la mesure de 1 •absorption à 595 nm (A
595). (fig. 3.1)
0 5 10 15 20 25 Protéines [ 11 g]
Figure 3.1 Courbe d'étalonnage des protéines avec de la gammaglobu- line de boeuf lyophylisée.
3.2.3. Dosage des chlorophylles
Les ch 1 orophyll es tot a 1 es sont dosées se 1 on Brui n sm a ( 1961 ) . Dans de l'acétone à 80% (V /V), 1 a concentration est donnée par 1 a formule suivante : chytot (mg/ml)= A652 x 27.8.
3.2.4. Le dosage des sucres 3.2.4.1. Echantillonnage
A 1 'exception du chénopode où 1 'ensemble des deux cotylédons est pré- levé, chez toutes les autres plantes, des rondelles (diamètre: 0,3 cm) sont préparées à partir du limbe et un segment à partir du pétiole ou de l'hypocotyle (fig. 3.2 et table 3.1). Les autres modalités parti- culières d'échantillonnage seront expliquées en temps opportun.
Figure 3.2 Schéma d'une plante d'épinard âgée de 4 semaines, avec les différents types de prélèvements.
Epinard 4 sem. feuilles disques 4 (l) x 16 2
primaires (3-4) x 4 0,5
(l) x 4 0,5
pétioles segments de l cm 2 (l) x 16 2
primaires (3-4) x 4 0,5
(l) x 4 0,5
hypocotyle segments de l cm '1 (3-4) x 4 0,5
(l) x 4 0,5 N
Moutarde l sem. cotylédons disques 4 (l) x 16 2
pétioles segments de 0,5 cm 2 (l) x 16 2
2 mois pétioles de segments de l cm 2 (3) x 4 2
feuilles bien développées
Col eus 2 mois feuilles bien disques '16 ( 3) x 4
développées
pétioles segments de l cm 2 (3) x 4 2
Chénopode 5~ j. cotylédons cotylédons •;> ,_ (l) x 30 2
Une technique d'extraction efficace doit satisfaire aux exigences suivantes: rapidité, reproductibilité, possibilité d'extraire totale- ment plusieurs substances dans le même milieu et stabilité de ces der- nières jusqu'au dosage. L'extraction alcoolique est assez souvent uti- lisée (Singh & Maclachlan, 1983; Upmeyer & Keller, 1973; Müller &
Jacks, 1983; Ebell, 1969, par ex.).
L'élimination des protéines permet de diminuer le risque d'une post- dégradation enzymatique des sucres. A cet effet, une extraction de rondelles cotylédonaires de pharbitis est faite en présence de diffé- rentes teneurs en éthanol par broyage au patter. Après cen- trifugation (8000 g, 7 min, 4°C, Microfuge Beckman) de cet extrait, les protéines et les chlorophylles sont dosées dans le surnageant.
On observe que la présence de protéines dans le surnageant dépend de la proportion d'éthanol dans le milieu d'extraction et qu'au delà de 70% (V/V) d'éthanol elles sont totalement précipitées dans le culot, mais la chlorophylle n'est alors plus éliminée (fig. 3.3).
50 Ethanol [010]
100
Figure 3.3 Profil d'extraction dans le surnageant des protéines
<•)
et de la chlorophylle (0) totale en fonction de la pro- portion éthanol/ eau (V/V) après centrifugation de l'ext- rait.
grandes séries d'extractions. Elle nécessite en effet un broyage à la main, une centrifugation, la séparation du culot de son surnageant et divers pipettages.
En ce qui concerne l'extraction du glucose, il a été possible de montrer que cette procédure est équivalente à une autre méthode beaucoup plus rapide: l'extraction à l'éthanol 80% à chaud sans broyage du matériel végétal (fig.3.4).
300
...
r.tJ
-
Q) 0e
200... ~ Q) r.tJ 0 (.)
-
::sc.:>
Nb. de disques
Figure 3.4 Extraction du glucose de disques cotylédonaires de Phar- bi tis (éthanol 80%) au moyen d'un broyage au potter ( e )
ou dans un tube mis dans un bain-marie à 100°C ( 0 ) .
C'est cette technique qui sera utilisée couramment: les extraits sont obtenus en introduisant les tissus dans des tubes en verre contenant 1 'éthanol 80%, le tube est alors fermé, afin de le rendre étanche et soumis au bain-marie (l00°C) pendant 15-30 min (fig. 3.5).
75 Il Il
y:;
Cl) 50
0
e
..5
Cl) en 0 C) ::::s
G
250 10 30 50 70 90 110
Temps d'extraction [min]
Figure 3.5 Evolution de la quantité de glucose obtenue par 32 seg- ments de pétioles d'épinard mis dans 2 ml d'éthanol 80%
dans des tubes fermés au bain-marie à 100°C.
3.2.4.3. Les sucres totaux
Les sucres totaux sont dosés au moyen de l' anthrone ( Yemm & Wi 11 i s, 1954) selon la procédure suivante: 1 ml d'anthrone (Merck, p.a., a,2%
W/V dans H 2sa
4 conc.) est ajouté à a,5 ml d'extrait dans des tubes maintenus à aoc, puis, ces derniers sont immergés simultanément dans un bain-marie à saoc, pendant la minutes. Refroidis de nouveau à aoc, puis portés à température ambiante, la densité optique de la couleur bleue-verte qui s'est développée est immédiatement lue au spectrophotomètre à 63a nm (fig. 3.6).
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0.05
Glucose [ ll moles]
Figure 3.6 Courbe d'étalonnage de la réaction de l'anthrone avec du glucose pur.
Les extraits alcooliques contenant (entre autres) de la chlorophylle qui interfère avec la coloration; il s'est révélé nécessaire de puri- fier légèrement l'extrait initial au moyen d'une pré-colonne SEP PAK Cl8 Ovaters Associates, Inc.). A cet effet 0,6 ml d'extrait sont in- jectés à 1 'aide d'une seringue dans la colonne, qui est ensuite éluée par 1. 5 ml d'eau dans 1 es que 1 s on retrouve p 1 us de 97% des 'sucres (fig. 3. 7). La pré-co 1 on ne est condition née et régénérée en sui va nt les instructions du fabricant.
100
~
...--- 1---1
1 2 3 4 5
No. de la fraction
Figure 3.7 Profil d'élution (test anthrone) d'une colonne SEPPAK C18 (fraction 1: 0,6 ml, fraction 2-5: 1 ml).
Cette procédure est très reproductible, puisque le glucose ajouté dans 1 'extrait de base est entièrement retrouvé dans 1 'é 1 uat. La ch 1 oro- phyll e est é 1 i mi née, de même que certaines substances suscept i b 1 es d'interférer avec 1 'anthrone comme des glycoflavonoïdes, par exemple.
La coloration obtenue par un extrait 11purifié11 est convertie en équivalent 11 moles de glucose grâce à la droite d'étalonnage (fig.
3.6).
3.2.4.4. Chromatographie en couche mince (C.C.M.) et chromatographie liquide à haute pression (H.P.L.C.)
a) C.C.M.
La C.C.M. des sucres a été faite comme décrit par Gauch et al. (1979).
Des plaques d'aluminium recouvertes de silica gel 60 (Merck, art.
5553) ont été ut i 1 i sées et p 1 acées dans des cuves à chromatographie CAMMAG. La phase mobile est un mélange d'acétonitrile/eau (85/15 V/V).
La révélation des sucres se fait grâce à un réactif à base de thymol (Merck, 0.5 g de thymol dans 95 ml d'éthanol 95% + 5 ml d'H
2
so
4 conc.
p.a.), par spray sur le chromatogramme séché. L'apparition de tâches
étuve à 120°C pendant 5 à 10 minutes.
b) H.P.L.C.
Les analyses des sucres par H.P.L.C. ont été réalisées dans les labo- ratoires TECATOR en Suède par K. Thente, grâce à Mr. R. Bürer (Instru- menten Ge se 11 schaft, Genève) sur un apparei 11 age H. P. L. C. de TE CA TOR
(5931 liquid chromatograph) équipé d'un détecteur de réfraction inter- férent i e 1 à haute précision ( 5902 interference refractometer). Les conditions de chromatographie étaient les suivantes:
Colonne: nucleosil-NH2, 125 x 4 mm, 5 ~ rn Phase mobile: acétonitrile/eau (75/25 V/V) Flux: 0.9 ml/min
Température: 23°C
Volume d'injection: 40 ~ 1
L'échantillon, (extrait de pétioles d'épinard, 0,8 g P.F. dans 8 ml d' éthano 1 80%) a été évaporé à sec au rotavapor, puis repris par de l'eau. La chlorophylle est éliminée par passage sur une colonne SEP PAK Cl8. A nouveau évaporé à sec à 70°C, 1 'extrait est dissout dans de 1 'eau, puis de 1 'acétonitrile (cane. finale 75%) avant d'être injecté.
3.2.4.5 Glucose et fructose
La mesure du glucose et du fructose dans un mélange hétérogène néces- site une technique qui soit très sensible et particulièrement spécifi- que. Le choix s'est porté sur un dosage enzymatique réalisé au moyen de 1 'hexokinase (HK; E.C. 2.7.11) et de la glucose-6-phosphate déhy- drogénase (G6PDH, E.C. 1.1.1.49) dont le principe est le suivant (Bergmeyer et al., 1974):
1. hexose+ ATP~hexose-6-P + ADP (hexose= glucose, fructose, mannose)
2. glucose-6-P +NADP+ G
6
PDH~gluconate-6-P + NADPH + H+3. fructose-6-P~glucose-6-P
Grâce à la réaction 2, il est possible de doser le glucose en mesurant soit au spectrophotomètre l'augmentation de l'absorption à 340 nm, soit au fl uori mètre 1 a fluorescence due à l'apparition de 1 a forme réduite du cofacteur NAD PH. Dans 1 es conditions décri tes p 1 us loin, une molécule de glucose correspond à la réduction d'une molécule de NADP+.
Le dosage du fructose (Bernt & Bergmeyer,l974) est réalisé au moyen de 1 'adjonction dans le même milieu réactionnel de 1 'enzyme phosphogluco- se-isomérase (PGI, E.C. 5.3.1.9, réaction 3).
Le milieu de réaction pour la mesure par fluorescence est le suivant:
au tampon (Tris-HCl 0.05 M, MgC12 2 mM à pH 8.1, ATP.0.3 mM, NADP+
0.05 mM), qui contient 1 'enzyme G6PDH (0.7 U/ml) est ajouté 1 •extrait à doser. La fluorescence endogène est mesurée (zéro) et les réactions enclenchées par 1 'adjonction de 1 'HK (conc. finale 3.5 U/ml,réaction 1). Dans ces conditions le dosage se termine en 3- 5 min. Le fructose peut alors être détecté dans la même cuvette en ajoutant la PGI (3.5 U/ml concentration finale= conc. f.). A l'exception du Tris et du MgC12 qui proviennent de Merck, tous 1 es autres produits sont de Boehringer, Mannheim.
La fluorescence est mesurée dans un spectrofluorimètre (Aminco-Bowmann spectrofl uori met er, équipé d • un photon-counter, Ami nco), re 1 i é à un enregistreur à papier (linear recorder, Linear Instruments, Corp.).
L'augmentation de la fluorescence due au NADPH montre un pic situé à une 1 ongueur d • onde d • ex citation de 340 nm, avec une fluorescence maximale à 480 nm (fig. 3.8). Chaque ligne de niveau équivaut à 3.125 cm sur l'enregistreur (échelle à 2 mV). Le maximum F 340/480 vaut 40.63 cm. Dans un souci de standardisation, il a été choisi de définir que 40 cm (F 340/480; 2 mV) équivalent à 1 nmole de NADPH (respective- ment de glucose ou de fructose). Cette valeur est contrôlée et réajus- tée régulièrement.
A
,...,
e
r=..., r= 0
340
•.-4
""" co
"""
•.-4
u Il<
Cl)
..-<
280
400 460
À émission [nm]
À émission [nm]
Figure 3.8 Courbes de niveaux de la fluorescence. A: réactif complet pour le glucose. B: adjonction de 1 nmole de glucose.
La droite d•étalonnage à partir d•un standard de glucose (concentra- tion vérifiée au spectrophotomètre par un test enzymatique HK/G6PDH) est linéaire jusqu•à 5 nmoles de glucose (fig. 3.9}.
..-...
~
s
1500 00 ... ~
0 ~
M ~
Cl) lOO
(.)
=
Cl) (.)
If)
Cl)
~
0 ='
-
~
50
0 5
Glucose (•) ou fructose (o) [nmoles]
Figure 3.9 Courbe d'étalonnage de la fluorescence due au NADPH et correspondant au glucose ( • ) et au fructose ( 0 ) .
Le degré d'extractibilité du glucose peut être apprécié sur la fig.
3. 10. Par exemp 1 e, 1 orsque des pét i o 1 es d'épi nards sont soumis à de nouve 11 es extractions ( éthano 1 80% à chaud) on obtient, re 1 at i vement au total, les valeurs suivantes: première extraction : 92%; 2ème: 7%;
3ème: 1%. Le pourcentage obtenu lors de la seconde extraction est aisément expliqué par 1 'apport de glucose restant dans les pétioles et dû à 1 a première extraction; i 1 s'agit donc d'un phénomène de di 1 u- t ion. Ainsi, tout le glucose est bien obtenu lors de la première extraction.
e
u 10-
...
0 00 ... ~
5
0 1-
~~
M t.r..
1 J 1 1 1
0 20 40 60 80 100 Ethanol [0/o]
Figure 3.10: Degré d'extractibilité du glucose en fonction du pourcentage d'ethanol dans l'extrait, broyage au patter (épinard).
L'adjonction de glucose (ou de fructose) directement dans la cuvette de mesure ou lors de 1 'extraction s'est révélée être tout à fait cumu- lative dans toutes les situations. Le test n'est pas modifié vis-à-vis de ces deux hexoses, même en présence de concentration d'autres sucres 20 fois supérieures, pour autant que la zone de linéarité ne soit pas dépassée.
La conservation des extraits se fait à -20°C. Dans ces conditions, et après 28 jours, le dosage du glucose vaut 97,4% de la valeur au temps zéro, soit une perte de 2,6%. En ce qui concerne les pétioles d'épi- nard, 1 'erreur relative de mesure du glucose est fonction du nombre de p 1 antes par extrait (fig. 3. 11 ) . De nombreux ré su 1 tats sont obtenus par une seule extraction avec 16 plantes, dans ce cas 1 'erreur;relati- ve est inférieure à 10% sur chaque point.
... 30
~ 0
...
Cl) >
·~ ~
ctS 20
-
Cl) ~~ :::s
Cl)
~ ~
tJJ 10
1 2 4 8
Nb. de plantes par extrait
Figure 3.11: Evolution de l'erreur relative en fonction du nombre de plantes d'épinard par extrait (pétioles).
3.2.4.6. Le saccharose
Le saccharose est constitué d'une molécule de glucose et de fructose.
Le principe de son dosage est le suivant:
saccharose + H20 invertase ~fructose + glucose
L'invertase (E.C. 3.2. 1.26) hydrolysant le saccharose à pH acide (4.5), le test se déroule en 2 temps: d'abord 1 'hydrolyse qui produit le glucose, puis le dosage de ce même glucose. La quantité de saccha- rose est généralement obtenue en tenant compte du glucose endogène par calcul de la différence de glucose après et avant 1 'hydrolyse. Cepen- dan4 si du saccharose est ajouté à un extrait de pétiole d'épinard, il n'est pas entièrement retrouvé après le dosage ( ~ 40-80% suivant les cas). Cet inconvénient est dû à la présence de glucose (et de fructose) qui interfère avec ce test (fig. 3.12). Il se révèle donc
1 e saccharose. Ceci se réa 1 ise au moyen d'une incubation dans un milieu fortement alcalin oQ les sucres réducteurs (glucose, fructose) sont très instables par rapport aux sucres non réducteurs tels que le saccharose (van Handel, 1968).
100
Q) ::s
0"
·~ ~ IQ) 0
..= .1-J
.g
~ ::R 50
Q) Cl)
0 ~
..= ca
C,) C,) ca rJ'J
Il
0 1 2 3
Rapport glucose/ saccharose
Figure 3.12: Interférence du glucose dans le test classique du saccharose (voir texte).
La figure 3.13 montre la destruction du glucose dans une solution de NaOH 0, 1 M et 1 e dosage correct du saccharose qui y est 1 i é. La pro- cédure finalement adoptée tient compte des variations de pH nécessai- res et est la suivante: évaporation de l'extrait alcoolique (50 11 1,
95°C, 10 min); adjonction de 10 p 1 de NaOH O,lM; incubation (5 min, 95°C); cent ri fugati on et hydrolyse par l'invertase ( 30 p 1 de tampon Na-Acetate O,lM pH 4.5, contenant de 1 'invertase, B -fructosidase conc. f. 50 U/ml , Boehri nger). Après 20 min à température ambiante, 1 'inversion est achevée et le pH réajusté par adjonction de 10 p 1 de Tris 2M pH 8.8 (fig. 3. 14), le glucose peut alors être dosé. L'étalon- nage du saccharose au moyen de cette procédure est représenté à la fi- gure 3.15.
L'adjonction de saccharose lors de l'extraction s'est dès lors révélée être tout à fait cumulative.
150
,...
e
10~
0 5 10 15 20
Temps à 95°C dans O.IM NaOH [min]
Jîi!rure J .13: Dosage du saccharose ( 0 ) et destruction du glucose ( •
dans un mélange de glc/saccharose de 4/1. Le niveau de saccharose théorique est représenté en traits interrom- pus.
!4.--
e
...:2.0 00
~ 10
...
0 ~
M t.r...
0
1
2
J
4 Temps [min]
-
-
6
Figure 3.14: Cinétique d'hydrolyse du saccharose dans un extrait de pétioles d'épinards (glucose • ). L'adjonction de Tris 2M pH 8.8 avant l'incubation avec l'invertase inhibe totale- ment 1 'hydrolyse ( A ) •
80
8
60... (.) 0
::! 00
0 ~ 40
~
Figure 3.15
0.8 1.2 1.6 2.0
Saccharose [nmoles]
Etalonnage du dosage du saccharose.
