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Etude par HATR/IR-TF de la membrane plasmique des feuilles d'épinard avant et après induction florale
BELLAMINE, Jalil, GREPPIN, Hubert, ARRIZABALAGA, Philippe
Abstract
La spectroscopie infrarouge a été jusqu'à ces dernières années un outil puissant d'investigation, essentiellement réservé aux chimistes spectroscopistes et analyticiens. Le développement de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourrier (IR-TF), associée à la mesure HA TR (horizontal attenuated total reflection) a favorisé l'application de cette technique à l'identification et à la caractérisation de matériels biologiques complexes.
BELLAMINE, Jalil, GREPPIN, Hubert, ARRIZABALAGA, Philippe. Etude par HATR/IR-TF de la membrane plasmique des feuilles d'épinard avant et après induction florale. Analusis , 1993, vol. 21, no. 5, p. 31-33
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:120606
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'étude par spectroscopie infra- rouge à .transformée de Fourrier (IR-TF) permet tant l'analyse vi- brationnelle de composés isolés purs que la caractérisation et l'identifica- tion de systèmes biologiques complexes [1-2]. Dans ce cas, l'enregistrement des spectres est facilité par l'utilisation d'un dispositif HA TR (horizontal attenuated to- tal reflection) [3]. En effet, cette technique est particulièrement adaptée pour l'étude d'échantillon dont l'absorption est si intense que la mesure classique par transmittance est très délicate, voire im- possible dans certains cas.L'induction florale chez l'épinard (Spinacia oleracea cv Nobel) est un phéno- mène où de nombreuses modifications précoces sont observées dans la mem- brane plasmique des feuilles et des apex [4]. Elles comprennent l'épaississement de la membrane plasmique [5], la com- position en stérols [6], la sensibilité de l' ATPase à proton vis-à-vis del' acide in- dole-3 acétique et du vanadate [7].
Nous présentons ici des résultats de l'étude par spectroscopie HATR/IR-TF concernant des modifications caractéris- tiques de la membrane plasmique des feuilles d'épinard lors de son passage, par induction, de l'état végétatif à l'état floral.
*Laboratoire de physiologie végétale, 3, place de l'université, 1211 Genève
** Ecotox, 23, avenue Sainte-Clotilde, 1211 Genève
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5Étude par HATR/IR-TF de la membrane plasmique des
feuilles d'épinard avant et après induction florale
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Bellamine, H Greppin*, Ph Arrizabalaga**La spectroscopie infrarouge a été jusqu'à ces dernières années un outil puissant d'investigation, essentiellement réservé aux chimistes
spectroscopistes et analyticiens. Le développement de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourrier (IR-TF), associée à la mesure HA TR (horizontal attenuated total reflection) a favorisé
/'application de cette technique à l'identification et à la caractérisation de matériels biologiques
complexes.
• Préparation de la fraction microsomale riche en membrane plasmique
Les plantes d'épinard sont cultivées en jour court de 8 h de lumière et 16 h d' obs- curité, pendant 4 semaines dans un phy- totron (20 ± 1 °C, 80 ± 5% d'humidité
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pendant la période de lumière et 60 ± 5%
pendant la période d'obscurité). Les feuilles sont prélevées et broyées dans un tampon d'extraction. Les microsomes bruts récupérés à partir de ce broyat sont resuspendus dans un tampon phosphate (KH2P04: Na2HP04, 5 mM, pH 7.8). La membrane plasmique est purifiée par partition de phase en utilisant un sys- tème de deux polymères : le polyéthylé-
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Fig l. Spectres HATR/IR-TF de la membrane plasmique purifiée par partition de phas~ à partir des plantes d'épinard végétatives (VEG) et induites à fleurir par 24 h de lum1ere continue (LUM). La partie encadrée montre la fenêtre spectrale sélectionnée qui présente les dissimilarités majeures entre les deux types de population de plantes.
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Fig 2. Spectres dérivées secondes calculés à partir des spectres d'absorptions (fenêtre spectrale 1 800-1 500 cm-1) de la membrane plasmique des feuilles d'épinard à l'état végétatif (VEG) et induite par 24 h de lumière continue CLUM).
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Fig 3. Courbes de corrélation des spectres dérivées secondes calculés à partir des spectres d'absorption (fenêtre spectrale 1 800-1 500 cm-1). A. Les intensités des spectres dérivées secondes de deux échantillons de la même préparation de la membrane plasmique des feuilles d'épinard à l'état végétatif (VEG 1 et VEG2) sont comparées entre elles. B. Les intensités des spectres en dérivées secondes de la membrane plasmique des feuilles d'épinard à l'état végétatif sont comparées à celles de la membrane plasmique des feuilles d'épinard à l'état induit par 24 h de lumière continue.
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ne glycol et le dextran selon la méthode de kjellbom [8]. Seule la fraction U2 est récupérée et centrifugée. La membrane plasmique ainsi purifiée est resuspen- due dans le tampon Hépés-Tris 50 mM, pH6.7.
Afin d'étudier les modifications liées au phénomène de la floraison, la mem- brane plasmique est préparée à partir de plantes cultivées en jour court puis in- duites à fleurir, soit par 24 h de lumière continue, soit par traitement à l'acide gibbérellique [5] (1 mM).
• Mesures
spectroscopiques
Les vésicules de la membrane plasmique ( 50 g en équi valent protéines) sont dépo- sées sur le cristal de sélénium de zinc (ZnSe, 45) du dispositif HATR. Elles sont séchées sous vide jusqu'à obtention d'un film transparent. Les spectres sont alors enregistrés dans une fenêtre de 4 000 à 650 cm-1, avec une résolution de 4 cm·1 et un gain de 1. Le spectrophotomètre !R- TF utilisé est de type 1720-X muni d'un détecteur FR-DTGS. Le spectre de trans- mission obtenu est converti en spectre d'absorption et le spectre dérivée se- conde est calculé à l'aide du logiciel IRDM (Infrared Data Manager - Perkin Elmer).
• Choix de critères d'évaluation
Les spectres en dérivée seconde sont dé- coupés en fenêtres suivant la nature des fonctions chimiques des substances constituant la membrane plasmique.
Chaque fenêtre est digitalisée et la ma- trice correspondante est exportée vers un tableur (Excel 3.0). Nous avons utilisé le coefficient de corrélation de Pearson (r) comme un paramètre de mesure de similitude entre les spectres IR de la membrane plasmique de l'épinard.
Puisque les spectres sont divisés en plusieurs fenêtres spectrales, la compa- raison est faite entre deux échantillons pour chaque fenêtre sélectionnée.
Le spectre d'absorption dans l'IR de la membrane plasmique résulte de la su- perposition des bandes d'absorption de tous les composés qui la constituent. Le spectre obtenu est très complexe, dû au nombre, à la largeur, à l'intensité et à l'énergie des bandes (fig 1). L'élabora- tion d'une méthode de caractérisation de l'état d'une plante nécessite donc une paramétrisation des données spectrales.
Les spectres d'absorption dans l'IR des membranes des feuilles à l'état végé- tatif ont été comparés entre eux, puis comparés à ceux des plantes induites soit par la lumière, soit par l'acide gibbé- rellique (fig 2). L'étude des coefficients de corrélation de Pearson a été effectuée pour les différentes fenêtres spectrales et montre qu'une forte similitude peut être obtenue (0.927 < r < 0.999), pour chaque fenêtre spectrale sélectionnée, lorsque les membranes plasmiques des plantes Analusis Magazine, 1993, v 21,
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végétatives sont comparées entre elles (fig 3A). Par.contre, lorsque le spectre de la membrane plasmique des plantes vé- gétatives est comparé à celui de la mem- brane plasmique des plantes induites à fleurir par la lumière ou par l'acide gib- bérellique, une différence majeure est observée au niveau de la fenêtre spec- trale 1 800-1 500 cm-1, les spectres res- tant similaires dans les autres fenêtres.
En effet, pour cette fenêtre, le coefficient de corrélation de Pearson est de 0.613 lorsque les plantes végétatives sont com- parées à celles induites par 24 h de lu- mière continue (fig 3B). Il est de 0.809 lorsque les plantes végétatives sont com- parées à celles induites par l'acide gibbé- rellique.
• Conclusion
L'utilisation de la spectroscopie HATR/IR-TF nous a permis de détermi- ner des variations spectrales liées à la modification de la membrane plasmique de feuilles d'épinard, lors de son passage del' état végétatif à l'état floral. Elle peut ainsi être considérée comme un outil nouveau, performant et rapide dans ce domaine d'investigation.
Les variations les plus importantes se situent dans la zone 1500-1 800 cm-1, do- minée par la vibration d'allongement de
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la liaison C=O du groupe carboxyle des acides gras et des groupes amides I et II des résidus peptidiques des protéines, et la vibration d'allongement de la liaison C=C de la chaîne hydrocarbonée des aci- des gras et des groupes aromatiques.
Les résultats obtenus confirment les variations quantitatives des protéines et des stérols observées dans notre labora- toire.
Le changement du taux d'insatura- tion des acides gras n'a pas été démontré jusqu'à présent chez la feuille d'épinard, et fera l'objet d'une étude ultérieure. •
• Références
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