Etude in vitro des efflux de glucose de pétioles d'épinard (Spinacia oleracea cv. Nobel) avant et après la variation de photopériode inductrice de la floraison

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Etude in vitro des efflux de glucose de pétioles d'épinard (Spinacia oleracea cv. Nobel) avant et après la variation de photopériode

inductrice de la floraison

DEGLI AGOSTI, Robert, GREPPIN, Hubert

Abstract

Study of the in vitro glucose release from spinach petioles (Spinacia oleracea cv. Nobel) before and after the photoperiodic induction of flowering.- The kinetics of the in vitro glucose release from isolated spinach petioles show the presence of two main pools of glucose. When spinach plants are submitted to a photoperiodic induction of flowering, the great increase in glucose content takes place in only one of the two pools. We suggest that it corresponds to the vacuolar compartment.

DEGLI AGOSTI, Robert, GREPPIN, Hubert. Etude in vitro des efflux de glucose de pétioles d'épinard (Spinacia oleracea cv. Nobel) avant et après la variation de photopériode inductrice de la floraison. Saussurea , 1989, vol. 19, p. 75-83

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Etude in vitro des efflux de glucose de pétioles d'épinard (Spinacia oleracea cv. Nobel) avant et après la variation de photopériode inductrice de la floraison

RÉSUMÉ

ROBERT DEGLI AGOSTI

&

HUBERT GREPPIN

DEGLI AGOSTI, R. & H. GREPPIN (1989). Etude in vitro des efflux de glucose de pétioles d'épinard (Spinacia oleracea cv. Nobel) avant et après la variation de photopé- riode inductrice de la floraison. Saussurea 19: 75-83. En français, résumés français et anglais.

Les cinétiques de relargage in vitro du glucose par des fragments de pétioles d'épinard montrent la présence de deux pools de glucose. Lors du transfert photopériodique induc- teur de la floraison, 1 'augmentation considérable du glucoses 'opère essentiellement dans un seul de ces deux pools. Ce dernier pourrait correspondre au compartiment vacuolaire.

ABSTRACT

DEGLI AGOSTI, R. & H. GREPPIN (1989). Study of the in vitro glucose release from spinach petioles (Spinacia oleracea cv. Nobel) before and after the photoperiodic induc- tion of flowering. Saussurea 19: 75-83. In French, French and English abstracts.

The kinetics of the in vitro glucose release from isolated spinach petioles show the presence of two main pools of glucose. When spinach plants are submitted to a pho- toperiodic induction of flowering, the great increase in glucose content takes place in only one of the two pools. We suggest that it corresponds to the vacuolar compartment.

Introduction

En jour court (8:16 h lumière:obscurité), la teneur en sucres libres (glucose, fructose et saccharose) de l'épinard augmente pendant la phase lumineuse, puis diminue à l'obscu- rité. Lors du transfert photopériodique (prolongation de la phase lumineuse du jour court), on observe une augmentation particulièrement rapide et importante pour le glu- cose et le fructose dès 1 à 3 heures supplémentaires. Ce phénomène s'observe aussi bien dans les feuilles que dans les pétioles (DEGLI AGOSTI, 1985).

Une analyse mathématique de ces résultats dans les pétioles d'épinard permet d'expli- quer l'évolution du glucose, lors du jour court et du transfert, par l'intervention de deux

CODEN: SAUSDH

ISSN: 0373·2525 19 75 (1989)

SOCIÉTÉ BOTANIQUE

©

DE GENÉVE 1989

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pools ou "ensembles" (1 et II, DEGLI AGOSTI & GREPPIN, 1987b). Le premier (1) n'est pas orienté dans le temps, sa teneur est uniquement dépendante de la présence ou de l'absence de lumière. Le second (Il) est la cause de l'augmentation rapide observée lors du transfert photopériodique; il est lié à la photophase critique pour la floraison de l'épi- nard et orienté dans le temps (DEGLI AGOSTI & GREPPIN, 1987b).

Dans ce travail nous nous proposons d'étudier ces deux pools dans les pétioles isolés d'épinard par une approche expérimentale (analyse d'efflux) et de déterminer si certaines de leurs caractéristiques varient lors du transfert photopériodique inducteur de la flo- raison.

Les analyses d'efflux peuvent être décrites de la manière suivante: lorsqu'un objet biologique (pétiole d'épinard, par ex.) est immergé dans une solution, des substances s'en échappent. Les caractéristiques cinétiques du relargage sont liées aux propriétés structuro-fonctionnelles internes tissulaires et cellulaires (réseau membranaire) de l'objet biologique considéré et des gradients physico-chimiques créés avec l'extérieur. Dans le cas où le milieu extérieur est constitué d'eau distillée (hypotonie maximale), alors la diffusion de certaines substances vers celui-ci peut suivre une fonction exponentielle:

conc. milieu ext. = conc. totale initiale (1-exp(-Kt)) Où K est la constante cinétique d'efflux (min-I) et t le temps (min).

La constanteK est un reflet des propriétés structuro-fonctionnelles de l'objet biologi- que considéré. Dans le cas où une même substance provient de plusieurs "ensembles", il est possible de les distinguer en utilisant la théorie de l'analyse compartimentale au non- équilibre (ATKINS, 1969) appliquée aux mesures de l'efflux global.

A savoir:

conc. milieu ext. =

L

conc. totale initialei (1-exp(-Kit))

Où i est un indice du nombre de compartiments. Soit, par exemple, deux ensembles caractérisés respectivement par deux constantes KI et K2, avec K2 > > KI (env. 10 x).

KI peut être déduit du graphe de:

ln(conc. totale initiale - conc. milieu) = f(temps)

En effet, la composante KI apparaîtra sous forme d'une droite décroissante facile à analyser (pente = -KI et ordonnée à l'origine = ln(conc. totale initiale!) = Al). Puis, en soustrayant cette première composante aux données initiales et en calculant le loga- rithme, on obtient:

ln(conc. totale initiale - conc. milieu - AJ(1-exp(-Klt))) = fttemps)

=

composante 1

Et en effectuant le graphe de ce logarithme en fonction du temps, il est alors possible, de la même manière que pour KI et Al, d'estimer K2 et la conc. totale initiale2 = A2.

Si le relargage est bien diffusionnel pour les deux ensembles, alors les droites ont un bon coefficient de corrélation et la somme des composantes calculée suit la courbe expéri- mentale.

Matériel et méthodes

Les akènes d'épinard (Spinacia oleracea L. cv. Nobel) sont semés dans du terreau.

Après une semaine, les plantules sont repiquées, à raison de 4 par pot (dim. 9 x 9 x 9 cm), dans du terreau. Elles sont arrosées 3 fois par semaine avec une solution nutritive

(Sinesol 0.030Jo). L'épinard, plante de jour long (PARLEVLIET, 1966), est maintenu à l'état végétatif grâce à une photopériode de jour court (8 heures de lumière et 16 heures d'obscurité), jusqu'à l'âge de 4 semaines, date de son utilisation. La température des phytotrons est maintenue constante à 20 ± 0.5°C et l'humidité relative est de 70 ± 50Jo à la lumière et de 50 ± 50Jo à l'obscurité. L'éclairement lumineux qui est diffusé par des tubes fluorescents (Sylvania "Daylight" F40T12 de 40 watts) vaut 6000 lux au niveau moyen des feuilles, ce qui correspond à une énergie de 20.6 W/m2 (400-700 nm, mesuré avec le Spectroradiotomètre ISCO). Le transfert en lumière continue s'effectue en prolon- geant la phase lumineuse du jour court. Les plantes sont laissées dans la même enceinte pour éviter tout stress.

L'extraction du glucose est faite à partir des plantes âgées de 4 semaines, en introdui- sant les segments de pétioles des feuilles primaires dans des tubes en verre contenant de l'éthanol à 800Jo. Le tube est fermé et soumis au bain-marie (100°C) pendant 15-30 min.

Le dosage du glucose et du fructose dans l'extrait alcoolique ou aqueux s'opère grâce à une technique enzymatique très spécifique et sensible, au moyen des enzymes hexoki- nase, phosphoglucose isomérase et glucose-6-phosphate déhydrogénase (BERGMEYER

& al., 1974), adaptée au spectrofluorimètre (DEGLI AGOSTI ^& GREPPIN, 1987a). La concentration de glucose dans la cuvette de mesure est directement proportionnelle à la fluorescence due au NADPH. Celle-ci est mesurée à une longueur d'onde d'excitation de 340 nm et d'émission de 480 nm (F340/480) et donnée en cm, 40 cm correspondent à une concentration de 1 nmole de glucose dans un volume de 200 J.!l.

Pour obtenir l'efflux du glucose des pétioles d'épinard, ces derniers sont découpés en fragments de 2 mm de longueur (50 pétioles x 7 fragments). Après un lavage dans de l'eau distillée de 30 min, ils sont délicatement et rapidement essuyés avec du papier

"Kleenex", 50 fragments sont utilisés pour mesurer la concentration totale initiale et le restant est immergé dans 6 ml d'eau distillée (pH env. 7) avec une agitation douce et conti- nue. Des aliquotes de très petit volume (40 J.!l) sont prélevées pour l'analyse des sucres (glucose, fructose).

Dans tous les cas, la quantité (poids frais) et le nombre de fragments de pétioles d'épi- nard utilisés sont les mêmes.

Résultats

Les cinétiques d'efflux du glucose des pétioles issus de plantes d'épinard sont repré- sentées à la figure 1.

Au premier abord, la diffusion du glucose hors des pétioles de jour court peut paraî- tre semblable à celle des pétioles en transfert, si l'on tient compte de la quantité logique- ment plus élevée dans ce dernier cas. La réalité est un peu plus complexe. Il faut, en effet, tenir compte du fait que pendant un même intervalle de temps, la quantité de glucose (par rapport à la quantité totale initiale), qui a diffusé dans le milieu est de 480Jo pour les pétioles des plantes transférées et de 690Jo pour celles en jour court (à 16 h locales).

Ainsi, lorsque les résultats de la figure 1 sont représentés en quantité de glucose dif- fusé dans le milieu par rapport à la quantité totale initiale de glucose, alors les cinétiques d'efflux apparaissent clairement distinctes avant et après le transfert photopériodique (fig. 2). On remarquera également que ces cinétiques sont fort similaires même sous deux intensités d'éclairement différentes données pendant l'expérience.

Toutefois, d'après ces résultats, il n'est pas encore possible de savoir si les caractéristi- ques diffusionnelles des pétioles ont réellement changé. Dans ce but nous utiliserons la technique de l'analyse d'efflux que nous ne décrirons en détail que pour l'expérience repré- sentée à la figure 1.

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30 ..!!. è

1

_u

= 20 :§

0 .,

... ₀

~ ...

"'·

•

..

¹⁰

40 . 60 80 100 120

Temps [min.]

Fig. 1.- Evolution de la diffusion du glucose relâché par des pétioles d'épinard en suspension dans de l'eau distillée.

<•>=

pétioles de plantes en fin de jour court (JC 16). (0): pétioles de plantes ayant subi un allongement de la phase lumineuse du jour court d'une durée de 16 heures (transfert, T + ^08). V éclairement lumineux donné pendant le jour court et le prolongement de la lumière lors de cette expérience est de 8500 lux (30 Wm-2).

Fig. 2. -Evolution du glucose relatif (glucose relâché/glucose total initial x 100) dans le temps de l'expérience de la figure 1 (Â, L':.) et d'une autre expérience(.-, \7) avec un éclairement lumineux de 6000 lux (20 Wm-2).

1oor---,

80 JC16

! 60 40

20

Temps [min.]

79 Dans un premier temps, on opère, à partir de la courbe ajustée des données de la figure 1, la transformation suivante:

Y'(t) = Quantité initiale totale - Y(t)

où Y(t) est la quantité totale de glucose qui a diffusé dans le milieu au temps t. Cette opération (Y'(t)) ne représente rien d'autre que la cinétique de disparition du glucose des pétioles.

Le graphe du logarithme naturel de Y'(t) est représenté à la figure 3 (courbes supérieu- res). Grâce à cette représentation, il est possible d'extraire une première composante à partir des derniers points qui forment une droite (coeff. corr. -0.995). A savoir, pour la pente (KI) de JC 16: 0.0043 (min-I) et une ordonnée à l'origine ln(Al) de 2.077. La pente représente une caractéristique liée aux propriétés de diffusion, tandis que l'ordon- née à l'origine représente (après transformation), la "dimension" (contenu en glucose) de la composante considérée.

Comme on peut le constater à la figure 3, il reste encore une différence considérable entre les données et cette droite. Ceci suggère la présence d'une autre composante diffu- sionnelle dont il faut tenir compte. On obtient les caractéristiques de cette seconde compo- sante en procédant comme suit: on soustrait à Y'(t) la première composante calculée:

Y"(t) = Y'(t)- Alexp(-Klt)

On représente à nouveau le logarithme naturel de Y"(t) (fig. 3, droites inférieures).

Dans ce cas, il s'agit de droites ( coeff. corr. -0. 990). Les paramètres de diffusion s' obtien- nent de la même manière qu'auparavant, par l'ajustement d'une droite de régression et valent pour la pente (K2) de JC 16: 0.058 (min-1), avec l'ordonnée à l'origine ln(A2) de 1.88.

Il est alors possible de représenter l'évolution de ces deux composantes, ainsi que leur somme et comparer cette dernière avec les données originales (fig. 4 pour le jour court et fig. 5 pour le transfert photopériodique).

Le tableau 1 donne les caractéristiques des deux expériences présentées dans ce travail.

60 90 120

Temps [min.]

Fig. 3.- Représentation logarithmique de Y'(t) (voir texte), il s'agit des deux courbes supérieures (0: T + 08, e: JC 16) et représentation logarithmique de Y"(t) (voir texte), il s'agit des deux droites inférieures (0:

T + 08, e: ^{JC 16).}

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JC 16

30

Temps [min.)

Fig. 4.- Représentation de l'évolution des deux composantes d'efflux du glucose dans le temps pour des pétioles de plantes de jour court (JC 16), (e): composante 1, ~):composante II et

<•>

somme des deux composantes,

avec (0): les données expérimentales.

Fig. 5.- Représentation de l'évolution des deux composantes d'efflux du glucose dans le temps pour des pétioles de plantes en transfert (T + 08). (0): composante 1, (Y'): composante II et (0) somme des deux composantes,

avec (->: les données expérimentales.

T +08

30 .!!. Ë

]

u 0

= 20 :§

0 00

i

'"'

..

¹⁰ _Il

Temps [min.]

Ensemble de diffusion 1 Ensemble de diffusion II

Efflux

Ki Al K2 A2 total(%) en

(min-i) (F340/480) (Min-i) (F340/480) 120 min

(cm) (cm)

Exp. A (30 Wm-2)

JC 16 ... 0.0043 7.98 0.058 6.55 69

T + 08 ... 0.0033 46.55 0.060 9.43 48

-23117o 483117o 3117o 44117o

Exp. B (20 Wm-2)

JC 16 ... 0.0062 2.65 0.049 1.73 72

T + 08 ... 0.0041 19.89 0.068 2.82 45

-33117o 651117o 39117o 63117o

Tableau 1.-Récapitulation des caractéristiques de diffusion du glucose des pétioles d'épinard dans de l'eau, obtenues par l'analyse d'efflux. K est la constante de diffusion, A est la quantité totale initiale de glucose de

la composante considérée.

Les pourcentages en dessous des valeurs expriment la différence entre JC16 et T + 08.

Les résultats de ces analyses montrent l'évolution des deux composantes avant et après le transfert photopériodique.

Lorsqu'on compare les constantes de diffusion (K) entre JC 16 et T + 08, les diffé- rences ne sont pas vraiment significatives. En effet, pour une erreur de -5o/o sur la quan- tité initiale totale du dosage du glucose, nous obtenons pour l'expérience B (6000 lux, T + 08) les valeurs suivantes: KI = 0.0033 min-I et pour K2 = 0.045 min-I. Ce résultat ne signifie nullement qu'il n'y ait pas de modifications des propriétés de perméabilité membranaire vis-à-vis du glucose in vivo. Ce fait montre que la diffusion in vitro est essentiellement contrôlée par le gradient osmotique considérable dans lequel s'effectue ces diffusions. Dans ce même sens EHWALD & al. (1984) ont montré l'importance de l'osmolarité du milieu extérieur pour la diffusion de substances (sucres, K + ). Si l'on peut admettre que cette technique ne permet pas de détecter des différences significatives dans les constantes d'efflux du glucose (K) de JC 16 et T

+

08, en revanche deux ensem- bles diffusionnels sont bien mis en évidence. Le fait le plus remarquable étant la modifica- tion après transfert photopériodique du premier pool de glucose, alors que le second pool ne montre pas une telle augmentation.

On notera finalement que le glucose dosé dans le milieu extérieur n'est pas dû à une hydrolyse du saccharose par une invertase. En effet, le saccharose n'est présent dans ce milieu qu'en très faible quantité (limite de la détection), le pH du milieu n'est pas opti- mum pour une telle activité (varie de 7.0 à 6.2) et, enfin, le fructose qui diffuse dans le milieu ne se présente pas de manière équimolaire au glucose, mais dans un rapport environ 5 fois moindre.

Discussion

Les résultats de l'analyse d'efflux de glucose des pétioles d'épinard avant et après la variation de photopériode inductrice de la floraison corroborent l'analyse mathémati- que qui a été faite de l'augmentation de ce sucre, à savoir la présence d'un pool particulier de glucose intervenant lors de l'induction (DEGLI AGOSTI & GREPPIN, 1987b).

Si l'on représente schématiquement les résultats de ce travail (fig. 6), on observe que le pool 1 est celui qui varie lors du transfert de l'épinard en lumière continue. Le fait

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Efflux de glucose (pétioles d'épinard) jour court transfert

08h 16h 08h

·- -

·-- ^....

(1) n 0

-o 3

0

"' a

m ~

(2)

Fig. 6. - Représentation schématique des variations en teneur de glucose des "ensembles" 1 et II lors du jour court et du transfert photopériodique. La surface de chaque cercle est proportionnelle à la quantité de glucose

présent à l'heure indiquée.

que le pool II n'augmente pas du tout dans les mêmes proportions implique obligatoire- ment une séparation dans l'espace (compartimentation) de ces deux "ensembles" de glucose.

On remarquera également (tableau 1) que l'augmentation photopériodique du glu- cose s'effectue dans le pool où la diffusion vers le milieu extérieur est la moindre. Ce résultat permet d'expliquer clairement le fait paradoxal que la diffusion (en 2 h) se trouve diminuée lors du transfert (voir fig. 2).

Les travaux d'autres chercheurs montrent que la diffusibilité de sucres et d' électroly- tes dépend de la nature de la plante et du tissu (30-900Jo en 2-3 h) et surtout de la tonicité du milieu extérieur (BURG&al., 1964; EWHALD&al., 1984; ELLIS&SPANSWICK, 1987; SIMON, 1977). Ces auteurs observent une diffusion beaucoup plus élevée dans de l'eau que dans une solution hyper- ou isotonique (seulement 10-20% en 2-3 h). Dans l'eau, ils observent également la présence de plusieurs "composantes" (2 à 3). Ils attri- buent en général celle dont la diffusibilité est la moindre à la vacuole ou à la vacuole et au cytoplasme. La composante rapide semble relever de l'espace extracellulaire (apo- plasme). Toutefois, ces attributions semblent être discutables (EWHALD & al., 1984).

En ce qui concerne nos résultats, l'association du pool 1 avec la vacuole ( + cytoplasme?) nous paraît être une bonne hypothèse, car le glucose provient vraisemblablement de l'hydrolyse du saccharose par une invertase acide soluble qui se situerait dans la vacuole (DEGLI AGOSTI, 1985).

Les résultats présentés ne permettent pas de montrer s'il existe, pour un pool donné, une modification des constantes cinétiques de diffusion (K), car la précision atteinte n'est pas suffisante d'une part, et, d'autre part, parce que le gradient établi entre le pétiole et le milieu extérieur est maximum ce qui contraint la diffusion à être purement chimique (passive). Ce fait se trouve illustré par la nature exponentielle des courbes obtenues. De plus, BURG & al., (1964) montrent que dans le cas où le milieu extérieur est de l'eau, le Q10 est typique d'un tel type de processus de diffusion.

Finalement, il nous paraît que l'utilisation de cette technique simple reste promet- teuse et devrait pouvoir permettre, grâce à un contrôle judicieux du milieu extérieur, d'examiner si les propriétés membranaires de perméabilité sont modifiées lors de l'induc- tion chez l'épinard; ce qui nous semble particulièrement intéressant au vu des récents résultats qui indiquent un changement de l'organisation des membranes lors de l'induc- tion de la floraison chez cette plante (AUDERSET & al., 1986; PENEL & al., 1988).

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Adresse des auteurs: Laboratoire de physiologie végétale, Université de Genève, Pavillon des isotopes, 20, boulevard d'Yvoy, CH-1211 Genève 4, Suisse.