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Rôle de la rémorine et des nanodomaines membranaires
dans la signalisation de la réponse aux phytovirus
Anne-Flore Deroubaix
To cite this version:
Anne-Flore Deroubaix. Rôle de la rémorine et des nanodomaines membranaires dans la signalisation de la réponse aux phytovirus. Biologie végétale. Université de Bordeaux, 2019. Français. �NNT : 2019BORD0292�. �tel-03092248�
THÈSE PRÉSENTÉE POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR DE
L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX
ÉCOLE DOCTORALE des Sciences de la Vie et de la Santé SPÉCIALITÉ : Biologie Végétale
Par Anne-Flore DEROUBAIX
Rôle de la rémorine et des nanodomaines membranaires
dans la signalisation de la réponse aux phytovirus
Sous la direction de : Mme Véronique GERMAIN co-directeur : M. Sébastien MONGRAND
Soutenue le 6 décembre 2019 Membres du jury :
M. GALLUSCI Philippe Président
M. GALLOIS Jean-Luc Rapporteur
Mme COTELLE Valérie Rapportrice
Examinateur Invitée Invitée M. MICHON Thierry
Mme GERMAN-RETANA Sylvie Mme GERMAIN Véronique M. MONGRAND Sébastien
Professeur de l'Université de Bordeaux Directeur de Recherche INRA
Maître de conférences - Univ. de Toulouse Directeur de Recherche INRA
Directeur de Recherche INRA
Maître de conférences – Univ.de Bordeaux
En premier lieu, je remercie tout d’abord l’ensemble des membres de mon jury pour m’avoir fait l’honneur d’évaluer ce travail, Mmes V.Cotelle, S. German-Retana, MM. JL Gallois, T. Michon, P. Gallusci.
Je remercie mes directeurs de thèse : Véronique pour ton implication et ton suivi au quotidien du travail, même si nos manières de travailler sont assez différentes (je n’aurais finalement jamais réussi à écrire un planning des manips digne de ce nom mais j’y crois encore). Merci Sébastien pour ton suivi de l’avancée de la thèse ton enthousiasme et tes efforts pour maintenir la cohésion de l’équipe REM.
J’aimerais remercier JJB, le grand chef du LBM : « un grand pouvoir implique de grandes responsabilités », tu me l’as prouvé en accourant chaque jour pour m’ouvrir la porte quand j’arrivais avec mes plantes. Merci aux membres de mon équipe REM, Marion et Térézinha pour votre aide (et le partage des bons plans chocolatiers de Bordeaux et du Brésil). Merci à Super-FreDo, toujours fidèle à son poste, au top de la science, et toujours partant pour travailler notre étude parallèle de l’effet de l’alcool sur les lipides de la membrane plasmique. Merci à mon adjudant-chef Éric pour avoir su restaurer l’ordre, la discipline et le travail au sein du labo. Merci de m’avoir surtout suivi à fond dans mes délires. Un très grand merci revient au super bureau du bas, qui peu à peu est devenu LE repère où il fait bon s’y arrêter : Thanks a lot, Yoko, Christophe and also Mag for your kindness, sweets and contagious good mood.
Un énorme merci à Yohann, pour toutes nos discussions, nos éclats de rire au break de 16h (bien souvent précurseurs de portes qui se claquent chez les voisins) et tous les conseils précieux que tu as pu me donner pour mener à bien ce travail. Avec toutes les plaques de chocolats testées, analysées, décortiquées, (ou avalées d’un coup surtout à la Framboise Cranberry) on a dû relancer l’économie de Lindt du pays. Merci d’être tjs la quand il faut. Un grand remerciement pour mes collègues de bureau, résistant encore et toujours à l’envahisseur : Amazigh, merci pour ton calme olympien à tout épreuve et ton soutien sans faille depuis le master. Rodrigo (ou futur Jacob Michel ?), merci de ton super état d’esprit de champion (le sport c’est la vie… mais là c’est le temps du pâté) et d’être rentré dans tout mes délires passagers ou permanents.
Au labo, Adiilah sans Anne-Flore, c’est un peu comme Ben sans Nuts, Astérix sans Obélix, Starsky sans Hutch ça n’existe pas. Un énorme MERCI my friend et binôme de toujours pour avoir été toujours là dans les bons et mauvais moments de cette thèse. Merci d’avoir été ma « jauge de normalité », de m’avoir défendue et soutenue quoi qu’il arrive. Merci pour ton aide très précieuse et conseils, pour toutes ces « mission SOS escape », ses sorties, ses cafés (Bordeaux n’a vraiment plus de secrets pour nous), ces « C’est quoi son problème ?? », ces tentatives d’instaurer une ambiance et toutes les heures à s’amuser avec pas grand-chose.
Je tiens également à remercier l’ensemble des membres de l’équipe de Virologie pour m’avoir accueillie au sein de leur labo sans poser de questions, avec toujours le sourire et une bonne humeur communicative même à 9h le mardi matin. Faire les Aussois avec certains d’entre vous a été une expérience géniale (de la bonne neige, des skis, une bonne ambiance et ok, « un peu » de virologie, what else ?). Merci plus particulièrement à Sylvie pour ta gentillesse et toute ton aide pour m’expliquer au mieux le monde des virus. Merci à Luc, Vincent S., pour votre bonne humeur (même quand on a dix mille plantes à broyer) merci pour votre soutien. Merci TiMi pour tous les conseils si précieux que tu m’as apportés et ta vision des choses, moteur de motivation. Merci Guillaume L. de m’avoir sortie quasi tout l’été la tête de la rédac, ça m’aura permis de trouver l’inspi dans des endroits inattendus de Bordeaux et m’aura bien fait rire.
Merci également au laboratoire GALF d’Avignon et plus particulièrement à Jean Luc et Nathalie (et l’ensemble de leur équipe) pour leur accueil dans cette belle région avignonnaise. Merci pour votre bonne humeur, c’était vraiment un plaisir de venir maniper chez vous (même le cagibi me manque). Merci pour tout les restos et bonnes adresses / bon plans d’Avignon, vous pouvez venir découvrir Bordeaux et le bassin quand vous voulez.
Un énorme merci à mes amis d’avoir toujours répondu présent durant toutes ces années d’études : un trèèèèès grand MERCI à Calypso pour toutes nos sorties à travers Bordeaux et ses alentours depuis la licence 3 : merci pour toutes les soirées heureuses, foireuses, pluvieuses, soirées canap en mode mamie assumée, soirées panique restos, tentatives de shopping, sorties montagne ou mer, sorties ciné qui ont amélioré mon anglais (ou pas). Merci de m’avoir soutenue dans les bons et pires moments / défendue / écoutée avec patience et de m’avoir poussée à révéler qui était le patron dans cette thèse. Un grand merci à Pauline pour ton soutien, tes encouragements même à l’autre bout de l’Europe. Merci pour toutes ces soirées du master mythiques, à refaire le monde dans notre QG du jeudi, rue Duffour Dubergier et notre combo parfait chinois /
Merci pour toutes les heures passées au téléphone (les appels « vite fait » qui se transforment vite en deux heures), ces éclats de rire. Merci également à Samy de répondre toujours présent quoi qu’il arrive, pour ton soutien depuis la licence, tes conseils avisés, et de m’avoir évadée avec tes trips canadiens. Merci à Kévin pour l’encouragement, les conseils sportifs, pro, techniques, et nombreux messages qui ont su égayer mes journées lab.
Je remercie également l’ensemble des sportifs que j’ai pu côtoyer de près et de loin, boosteur de motivation, à aller chercher toujours plus loin toujours plus fort. Merci au petit groupe des boxeuses pour toutes ces soirées training qui finalement m’auront permis d’être ultra réveillée la nuit pour finir cette thèse. Merci aux nombreuses salles de sport, Parc Peixotto et autres pour m’avoir permis de me défouler même a 7h du mat. A mon punching balll pour avoir supporté mes coups sans jamais broncher une seule seconde et à mon violon électrique d’avoir supportée mes humeurs rockeuses.
Enfin je terminerais par le plus important à mes yeux, un énorme merci à ma famille. Un grand merci à mon grand frère préféré, Alexandre pour tes encouragements sans faille tous les WE, et ta façon de transformer un truc pourri en un truc marrant (alors, on fait un Pot au feu ?). Merci d’avoir fait exercer mon bibi durant ma thèse en jouant au déménageur breton avec tes meubles 4 fois (OK tu m’as aidé 4 fois aussi) toujours dans la bonne humeur. Merci d’être toujours présent quelque soit l’activité du moment (Brico-bricolons / le débroussaillage pour les nuls) et d’avoir écouté tous les vendredis avec Po, sans jamais trop tomber dans les bras de Morphée les péripéties et potins croustillants de la semaine. Merci à ma sœur préférée Aurélie, pour ton soutien constant même à 12 031,3 km de là, pour toutes ces conversations Skype, avec la voix hachée coupée les « hein j’ai rien compris ça capte mal » les « ah t’es flou » mais qui sont précieuses tous les dimanches. Merci pour les vacs d’été de rigolade et toutes les douceurs typiques quand Pippin est de retour.
Un énorme MERCI à ma mère pour t’être occupée de tout durant toutes mes années d’études, pour qu’on soit bien et qu’on ne manque de rien. Merci pour tous les WE sportifs, les heures à Vita à constater nos évolutions musculaires et perf, et toutes les sorties mer / Pyrénées qui m’ont fait oublier les tracas du labo. Merci surtout d’avoir toujours refusé de t’écrouler, alors que d’autres le font sans complexe pour des problèmes cent fois plus futiles.
Enfin un très grand et particulier merci à mon père, qui nous manque terriblement. Merci de nous avoir toujours poussés à faire ce qu’on voulait, de nous avoir encouragés et d’avoir toujours été extrêmement présent, à chaque étape de notre vie, pour nous 4. Merci pour toutes les valeurs que tu nous auras transmises. Même si cette thèse ne représente que le millième que ce que tu as pu accomplir dans ta carrière, elle t’est dédiée, comme tous les projets que nous entreprenons.
“ Go back?" he thought. "No good at all! Go sideways? Impossible! Go forward? Only thing to do! On we go!" So up he got, and trotted along with his little sword held in front of him and one hand feeling the wall, and his heart all of a patter and a pitter.”
Abréviations ______________________________________________________________ 1 Introduction de la thèse ______________________________________________________ 5 Introduction _______________________________________________________________ 8 Introduction Partie I : Mouvements des virus et défenses des plantes ___________________________ 9 I. Cycle viral des phytovirus _______________________________________________________ 9 II. Mouvement intercellulaire des phytovirus _______________________________________ 10 II.1 Les plasmodesmes : pores obligatoires pour le trafic de cellule à cellule chez les plantes _________ 10 II.2 Stratégies virales de détournement des plasmodesmes ____________________________________ 13 III Les Potexvirus : généralités et présentation des virus étudiés _______________________ 14 III.1 Généralités ______________________________________________________________________ 14
1-Le PVX ____________________________________________________________ 14 2-Le PlAMV __________________________________________________________ 15 III.2 Les protéines du Triple Gene Block TGB : multifonctionnelles et impliquées dans le mouvement intercellulaire du PVX __________________________________________________________________ 16 III. 3 Rôle de la protéine de capside dans le mouvement intercellulaire des Potexvirus ______________ 18 III-4 : Protéines cellulaires hôtes impliquées dans le mouvement intercellulaire du PVX _____________ 18 IV Potyvirus ___________________________________________________________________ 19 IV.1 Généralités sur le genre des Potyvirus et espèces virales étudiées __________________________ 19 IV.2 Cycle et mouvement intercellulaire des Potyvirus _______________________________________ 21 IV.3 Facteurs de l'hôte impliqués dans le mouvement intercellulaire des Potyvirus ________________ 23 V. Le mouvement en systémie ____________________________________________________ 25 V.1 De la feuille inoculée à la feuille systémique ____________________________________________ 25 V.2 Facteurs viraux et facteurs de l'hôte impliqués dans le mouvement systémique des Potexvirus et Potyvirus ____________________________________________________________________________ 26 V.3 Facteurs cellulaires inhibant le mouvement viral dans le phloème ___________________________ 27 VI Défense des plantes : la contre-attaque des plantes________________________________ 28 VI.1 Immunité des plantes : la course aux armements entre le virus et son hôte ___________________ 28 VI.2 Les résistances dominantes contrôlées par des gènes de type R et les résistances récessives aux Phytovirus ___________________________________________________________________________ 28 VI.3 Mécanismes et inhibition du RNA-silencing lors des interactions plante-virus __________________ 31 VI.4 Suppression du silencing par les virus __________________________________________________ 34 VI Défenses des plantes par la voie de l’autophagie __________________________________ 35 Introduction- partie II : les Rémorines, protéines marqueurs des nanodomaines impliquées dans la réponse aux phytovirus ________________________________________________________________ 36 Introduction- Partie III : La signalisation calcique et les Calcium dépendant kinases (CPK) __________ 78
I. Le calcium dans la cellule végétale : transport et signalisation ________________________ 79 II. Les Calcium-dependent Protein Kinases, les CPKs et leurs protéines associées les CRKs __ 80 II.1 CPKs : une large famille de protéines kinases _____________________________________________ 80 II. 2. Régulation des CPKs _______________________________________________________________ 81 II. 3 Diversité des localisations tissulaires et subcellulaires des CPKs _____________________________ 83 II. 4 Fonctions des CPKs : entre redondance et diversités fonctionnelles _________________________ 85 II. 5 Fonctions biologiques des CPKs en réponse aux stress biotiques ____________________________ 85
Objectifs de la thèse ________________________________________________________ 92 Partie I : Comprendre le rôle de la phosphorylation de StREM1.3 sur la propagation
intercellulaire des Potexvirus et identifier la ou les kinase(s) impliquée(s) dans cette
phosphorylation. ___________________________________________________________ 98 Contribution et résumé de l'article _______________________________________________________ 100 Article : REM1.3's phospho-status defines its plasma membrane nanodomain organization and activity in restricting PVX cell-to-cell movement ____________________________________________________ 106 Partie II : Développement d’un pathosystème chez Arabidopsis pour l’étude en système homologue des mécanismes moléculaires mis en jeu dans la fonction des rémorines du groupe 1 lors de la propagation virale des Potexvirus. ___________________________ 147
Article : The nanodomain-located REMORIN and its phosphorylating kinase CPK3 both restrict Plantago Asiatica Mosaic Virus propagation _______________________________________________________ 150 Données non montrées dans l'article : ____________________________________________________ 177 Partie III : L’effet antagoniste de REM est-il généralisable à d’autres genres viraux ? ___ 179
I. Pathosystème N.benthamiana / TuMV __________________________________________________ 181 Premières conclusions des études sur le pathosystème N.benthamiana / TuMV ________________ 185 II. Vers le pathosystème Arabidopsis thaliana – TuMV _______________________________________ 188 Infections des racines par le TuMV ____________________________________________________ 190 Conclusions Partie III __________________________________________________________________ 193 Discussion _______________________________________________________________ 194 Résumé des résultats __________________________________________________________________ 194 Discussion / Perspectives ______________________________________________________________ 198 Conclusion finale __________________________________________________________ 222 Références _______________________________________________________________ 225 Annexes _________________________________________________________________ 249 Annexe I. Tableau REM ________________________________________________________________ 250 Annexe II. Productions scientifiques - Communications - Formations suivies _____________________ 262
ABREVIATIONS
ABA : Abscisic Acid-signaling
ADF : facteur dépolymérisant d'actine AGO : Argonaute
AltMV : Alternanthera mosaic virus AS : Acide Salicylique
AtCINV1 : Cytosolic Invertase 1 AUX : Auxine
BAK1 : BRI1 : Brassinosteroid Intensive1- Associated Kinase
BCTV : Beet Curly Top Virus BD : domaine polybasique
BiFC : Bimolecular Fluorescence Complementation
BNYVV : Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV)
BR : Brassinostéroides
BSCTV : beet Severe curly top virus CalsS : calloses synthase
CAM: calmodulines
CBF : C-repeat binding factor CBLs : B like calcineurines
CBSV : Cassava Brown Streak Virus CC : cellules compagnes
CCD : Charge Coupled Device CCD cDNA : coding deoxyribonucleic acid CI : Cylindical Inclusion
CIPK : Protéines Kinases Interagissant avec les CBLs
CMV : Cucumber Mosaic Virus Co- IP : Co-ImmunoPrecipitation CP : Protéine de Capside
CPK : Calcium-dependent protein kinases
CRISPR- cas 9 : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR associated protein 9
CRK : CDPK-related kinases
CTL1 : choline transporter like gene DAMP : Motifs moléculaires associés aux dégâts
DBP : DNA-binding protein DCL : Dicer-like
DREB : dehydration-responsive
element binding protein
DRM : Detergent-Resistant Membrane DT : Desmotubule
EGTA : Ethylene Glycol Tetraacetic Acid
eIF4E, G : Eukaryotic initiation factor 4E or 4G
ERD4 : Early- Responsive to
Desydratation4
ESM1 : Epithiospecific Modifier 1 ETS : Effector-Triggered Susceptibility EV : Extracellular vesicles
EV : vésicules extracellulaires EXO70B1 : Exocyst complex 70B1
F2KP:6‐phosphofructo‐2‐kinase/fructo se‐2,6‐bisphosphatase.
FAH : fatty acid 2-hydroxylase (FAH) FB1 : Fumonisine B1
Flg : flagelline bactérienne
Flg22 : 22-amino acid peptide derived from the bacterial flagellum protein FLIM : Fluorescence Lifetime Imaging , FLS2 : Flagellin Sensitive 2
FRET-FLIM : Förster resonance
energy transfer by fluorescence
lifetime imaging)
GFP : Green Fluorescent Protein GSD1: Grain Setting Defect1
GIPC : Glycosyl Inositol Phosphoryl Ceramides
gluCer : glucosylCeramide
GPI : glycosylphosphatidyl inositol anchored proteins
GSL : glucanes synthases
GTR1 : Glucosinolate Transporter 1 HC-Pro : Helper Component-Protease HEN1 : HUA Enhancer 1
hp : hairpin
hpREM10.2 : transgenic Nicotiana benthamiana line expressing a genetic construct (hairpin) inducing the post-transcriptional gene-silencing of Group 1 REMORINs
HR : Hypersensitive response - réponse d’hypersensibilité
HSFB2a : Heat Shock Transcription Factor B2a HSFB2a
ICS1 : isochorismate synthase1 IDP : intrinsically disordered protein
ISE2 : increased size exclusion limit 2 JA : Jasmonic acid- acide jasmonique JAX1 : Jacalin type lectin required JD : jonction auto-inhibiteur (JD) KCS : 3-cétoacyl-CoA synthase KingG : Kinésin G
LMV : Lettuce Mosaic Virus
LYM2 : Lysin Motif
Domain-Contenubg GFP Ancgored Protein 2
MAMP : microbe-associated
molecular pattern - Motif moléculaire
associé aux microbes
MAPK : Mitogen-Associated Protein Kinase
mCherry : fluorescent protein member of the mFruit family, derived from the red fluorescent protein DsRed PD-PM: Plasma membrane of Plasmodesmata MCTP : Multiple C2 domain and Transmembrane region Proteins
MCTP : Multiple C2 domain
transmembrane protein
MIFE : mesure de flux ionique par microélectrode (MIFE)
MP : Membrane Plasmique
NbADF3 : Nicotiana benthamiana Actin Depolymerizing Factor
NbDREPP : developmentally regulated plasma membrane protein Nicotiana benthamiana
NbEXPA1 : α-expansine 1 de Nicotiana benthamiana
NB-LRR : Nucleotide binding
site leucine rich repeat (NB–LRR) NbPCIP1 : PVX CP-Interacting Protein 1
nCBp : novel cap binding protein NIa-Pro : Nuclear inclusion A-protease
NIb : Nuclear inclusion B
NIK1 : NSP (Nuclear Shuttle Protein Interacting Kinase 1
NO : Monoxyde azote
NPR : Non Expressor of Pathogenesis Related
OGs : Oligogalacturonides ORF : Open Reading Frames P1 : Protein 1
P3 : Protein 3
PA : phosphatidic acid
PAL : Phénylalanine Ammonia-Lyase
PAMP : Pathogen-associated
molecular pattern - motifs
moléculaires associés aux
pathogènes
PBS1 : Protein kinase superfamily protein PBS1
PCaP1 : Plasma membrane
associated Cation binding Protein 1 PCD : Programmed Cell Death PCR : polymerase chain reaction PD : plasmodesmes PdBG1 et PdBG2 : Plasmodesmata β-Glucanase 1 et 2 PDCB : PlasmoDesmata Callose Binding Proteins PDF1.2 : Plant Defensin 1.2 PEN3 : PENetration3
PepRSV : Pepper Ringspot Virus PGA : Polygalacturonides
PI4,5P2 :
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
PI4,P :
phosphatidylinositol-4-phosphate
PIPO : Pretty Interesting Potyviridae ORF
PlAMV : Plantago Asiatica Mosaic Virus
PM : Protéines de Mouvement PMV : Papaya Mosaic Virus
pp34 : phosphorylated protein of 34 kilodaltons
PPI: protein-protein interaction PPU : Pore Plasmodesma Units PPV : Plum Pox Virus
PR : Pathogenesis Related PS : PhosphatyldilSérine
PTGS : post-transcriptional gene silencing transcriptionnel
PTI : PAMP-Triggered Immunity PVA : Potato Virus A
PVX : Potato virus X PVY : Potato Virus Y
RdRp : ARN polymérase ARN-dépendante
RE : Réticulum Endoplasmique REM : Rémorine (REM) - Remorin
StREMAAA : StREM1.3S74A T86A S91A
REM-CA : REMORIN C-terminal Anchor
StREMDDD: StREM1.3S74D T86D S91D
REM WT : non-mutated StREM1.3 RFP : Red Fluorescent Protein
RISC : RNA-induced silencing complex RLKs : receptor-like kinases
RNP : ribonucléoprotéique ROS : Reative Oxygen Species
RPM 1 : Resistance to Pseudoomonas Syringae PV. Maculicola 1
RSV : RICE STRIP VIRUS
RTM : Restricted Tobacco etch virus Movement
SBWMV : Soil-borne wheat mosaic virus
SDE5 : Silencing Defective 5 SE : Sieve Elements
SEL : Sixe Exclusion Limit
SGS3 : Suppressor of gene silencing 3
SGT1 : Small Glutamine- rich tetratricopeptide - suppresseur d’allèle G1
SID2 : SA deficient 2 ADMISSION SIM 3D : Structured illumination microscopy - microscopie à super-résolution tridimensionnelle
siRNA : short interfering RNA SLAC 1 : S-type Anion Channel
SLAH3 : Silent S-Type Anion Channel Subnit.
SMV : Soybean Mosaic Virus
SnRK1 : SNF1-related protein kinase 1 spt-PALM : Single particle tracking
Photo Activated Localization
Microscopy
ssNMR : solid-state nuclear magnetic resonance
StADF2 : Solanum tuberosum Actin Depolymerizing Factor 2
STED : stimulated-emission depletion SuSy : Saccharose Synthase
SYTA : Synaptogamine
TBBMV : Tobacco vein banding mosaic virus
TCV : Turnip crinkle virus TEV : Tobacco Etch Virus TGB : Triple Gene Block
TGS : transcriptional Gene Silencing TIP : TGB-interacting protein
TIRF : total internal reflection
fluorescence microscopy TIRF) TMV : TobaCco Mosaic Virus ToMV : Tomato Mosaic Virus TPK1 : Two-pore potassium TuMV : Turnip Mosaic Virus
TVCV : Turnip Vein Vlearning Virus : TVBMV : Tobacco vein Banding Mosaic Virus
UGT1 : UDP-glucose transférase VLCFA : Very Long Chain Fatty Acid VPg : Viral Protein genome-linked VRC : Viral replication Complex
VSR : Viral Suppressor of RNA silencing
WT : Wild Type
INTRODUCTION DE LA THESE
Les plantes vivent dans un environnement dynamique, en permanence soumises à des stress à des contraintes environnementales biotiques ou abiotiques. Pour assurer leur survie et leur pérennité, ces organismes vivants développent et ajustent constamment de nombreuses stratégies pour se défendre et se prémunir des attaques par les agents pathogènes. Ainsi, en réponse à une infection, ou à l'attaque d'un insecte par exemple, des modifications de l'expression de gènes liées au stress perçu, induisent une réponse défensive plus ou moins spécifique (Pelham 1966). Globalement, cette réponse dépend de trois facteurs : 1 / le type d'agent pathogène ; 2 / l'espèce de plante infectée et 3 / les conditions environnementales (Erb 2018; Obrępalska-Stęplowska et al. 2015). Parmi les stress biotiques, actuellement 50 % des maladies émergentes des plantes sont causées par des virus (Anderson et al. 2004). L'infection virale est la plus difficile à contrôler car il n'existe pas à ce jour de remède permettant de lutter efficacement et à grande échelle, causant ainsi les pertes les plus importantes dans le monde agricole (Marwal, Prajapat, and Gaur 2016).
Les virus sont des parasites, hôtes obligatoires des cellules végétales. Le succès de l'infection va globalement dépendre de 1/ une bonne efficacité de réplication et 2/ un transport efficace et rapide du virus du lieu d'inoculation aux feuilles les plus éloignées de ce lieu. Pour se propager d'abord de manière locale, les phytovirus détournent à leur profit les plasmodesmes (PDs), structures clés pour la communication intercellulaire et pour le transport moléculaire (macronutriments, solutés, facteurs de transcriptions....). Structurellement, les PDs permettent la continuité des membranes entre cellules adjacentes et ont une taille d'exclusion limite (Sixe Exclusion Limit : SEL), qui en théorie ne permet pas le passage des virus. Néanmoins, ces derniers réussissent à détourner les PD en augmentant la SEL. La callose, un polymère de β1-3 de glucose déposé au niveau du cou des PD est bien établie pour limiter la SEL. Néanmoins, les événements de signalisation permettant ce dépôt de callose sont encore assez mal caractérisés (Zavaliev et al. 2011).
Pour tenter de comprendre les phénomènes défensifs engagés par la plante au niveau du passage intercellulaire des virus, notre équipe s'intéresse plus particulièrement aux événements de signalisation survenant au sein de la membrane plasmique (MP). La MP végétale constitue une des premières barrières majeures contre les microbes pathogènes. Les modèles actuels structuraux de la MP décrivent une hétérogénéité lipidique et l'existence d'interactions spécifiques lipides-lipides, protéines-protéines et lipides-protéines, conduisant à des enrichissements locaux dynamiques et coopératifs de composants appelés ‘nanodomaines’. Les nanodomaines sont définis comme une petite région de la MP (10-200 nm de large), enrichis en stérols, et protéines et lipides spécifiques comme les phosphoinositides (PIP) (Brown 2017; Furt et al. 2010; Pike 2006). Marqueurs des nanodomaines (Mongrand et al. 2010; Sylvain Raffaele et al. 2007), les Rémorines (REMs) constituent une famille multigénique de six groupes, localisée dans le feuillet cytosolique de la MP. Plusieurs études, impliquant divers groupes de REMs ont montré leur implication dans la réponse hormonale (Gui et al. 2016), ou encore ont montré un effet agoniste ou antagoniste sur l'infection par différentes phytovirus, les bactéries, les champignons et les oomycètes (S. Fu et al. 2018; Son, Oh, and An 2014) (Bozkurt et al. 2014; Lefebvre et al. 2010). Proposées comme des protéines d'échafaudage, les REMs du groupe 1 et 6 ont été retrouvées à la MP bordant les PD, appelée PD-MP (Fernandez-Calvino et al., 2011; Raffaele et al 2009). En plus d'être situées dans PM nanodomaines, les REMs subissent une phosphorylation une modification post-traductionnelle qui est déclenchée par les stress biotiques ou abiotiques, voir par exemple (Reymond et al. 1996; Widjaja et al. 2009). La fonction biologique exacte de la phosphorylation et de ses implications structurelles reste toutefois inexplorée. Notre équipe a précédemment montré que chez la tomate et Nicotiana benthamiana, la surexpression de l’isoforme 3 du groupe 1 de Solanum tuberosum (StREM1.3) limitait la propagation de cellule-à-cellule du Potato Virus X (PVX), un Potexvirus, sans affecter la réplication virale (S. Raffaele et al. 2009).
Dans ce contexte, le but de cette thèse a consisté à comprendre les mécanismes moléculaires médiés par REM, qui conduisent à la limitation de la propagation virale des Potexvirus mais aussi des Potyvirus. Pour disséquer les événements, nous avons orienté plus précisément nos recherches de façon à répondre à trois questions : 1 / quel(s) rôle(s) fonctionnel(s) et biologique(s) donner à
la phosphorylation de REM dans la propagation intercellulaire ? 2 / Quelle(s) kinase(s) est / sont responsable(s) de la phosphorylation de REM ? 3 / L'effet antagoniste de REM est-il également applicable aux Potyvirus, qui est le genre avec le plus grand nombre d’espèces et qui cause le plus de dégâts agronomiques ? Dans ce cadre, mon introduction est divisée en trois volets : le premier consacré aux interactions plantes-virus, le second à une revue en cours sur les REM et le troisième aux kinases dépendantes du calcium (calcium dependent protein kinase (CPK)), dont l’une s’est révélée comme phosphorylant REM.
INTRODUCTION PARTIE I : MOUVEMENTS DES VIRUS ET
DEFENSES DES PLANTES
I. Cycle viral des phytovirus
Les phytovirus sont des agents infectieux parasites obligatoires c’est-à-dire qu’ils ne peuvent pas survivre sans un hôte. Ils possèdent un acide nucléique sous forme d’ARN ou d’ADN simple ou double brin portant l’information génétique (4 à 10 gènes) protégée par des protéines de capside. Les gènes viraux codent pour des protéines qui dans une cellule vivante hôte remplissent des fonctions nécessaires à sa survie.
Le mode de transmission des virus d’une plante à l’autre se fait essentiellement par des vecteurs biologiques : insectes comme les pucerons et cicadelles, nématodes (cas des tobravirus et nepovirus dont le virus du court-noué) mais aussi des champignons (cas des bymovirus dont le virus de la mosaïque jaune de l’orge). Les vecteurs comme les insectes provoquent des blessures au niveau de la feuille et injectent grâce à leur stylet des particules virales dans le cytoplasme des cellules de l’hôte. Le vecteur va ensuite piquer une autre plante et transmettre à nouveau le virus : c’est la transmission horizontale. Plus rarement, la transmission des virus peut se faire par la graine ou le pollen (transmission verticale). Dans le cas des plantes cultivées, certaines pratiques culturales telles que le greffage, la taille ou encore l’irrigation, pour les virus dont la structure leur permet de résister en dehors de l’hôte comme par exemple les tobamovirus, peuvent disséminer très facilement les virus d’une plante à l’autre.
Le cycle infectieux viral comprend plusieurs étapes clés, résumées dans la Figure 1 avec l'exemple d'un virus à ARN+.
(Jarsch et al. 2014) we(Ormancey et al. 2017). u RhoGDI (Wu et al. 2013). s (Valérie Cotelle and Leonhardt 2016; Ormancey et al. 2017; Yip Delormel and Boudsocq 2019)
(Lucas, Ham, and Kim 2009). ) (Linnik et al. 2013)(Jens Tilsner et al. 2013) (Scholthof, 2000)(Maule, Faulkner, and Benitez-Alfonso 2012) de (Röder, Dickmeis, and Commandeur 2019) de (Lico, Benvenuto, and Baschieri 2015) (Linnik et al. 2013). de (X. Zhang et al. 2015)
1 ), Genomic RNA 2 _______. Nucleus endoplasmic reticulum plasma membrane cellwall PD-PM path
,,
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1
·.
3 5'e
•
CP RdRp 7 3' 4 3' �-
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1
. plasmodesma \..
Virus callase synthase � � �-1,3-glucanase 5' Cell 1 -5'1
3' /5 MP proteins1
Cell 2 Cell 1 Cell 2 RdRp Viral RNA CP proteins MP proteins RibosomesFigure 1. Représentation schématique du cycle d'infection des phytovirus a ARN+.
Le virus pénetre dans une cellule végétale
a
la faveur d'une blessure ou piqüre de l'insecte vecteur [Étape 1]. Apres décapsidation et libération de l'ARN viral [Étape 2: Décapsidation], la machinerie de traduction de l'hote prend en charge l'ARN viral et permet de traduire en particulier la réplicase virale (ARN polymérase ARN dépendante ou RdRp [Étape 3] La RdRp est utilisée pour générer un brin de polarité négative (brin -)a
partir de l'ARN de polarité positiva du virus [étape 4]. Au sein d'un « Viral replication Complex » (VRC), cet ARN- est,a
son tour utilisé pour générera
la fois l'ARN viral de sens positif [étape 5 : Réplication] et un second round de traduction permet en particulier l'expression des protéines de mouvement (PM) et la protéine de capside (CP) [étape 6]. L'ARN viral de polarité positive est ensuite encapsidé par la CP pour former de nouvelles particules virales [étape 7] qui peuvent etre transmises par les vecteurs eUou permettre, avec l'aide des protéines PM, le passage vers une cellule adjacente pour y initier un nouveau cycle viral [étape 8]. L'ouverture des plasmodesmes est régulée par le dépot de callase dans la paroi cellulaire entourant le col du plasmodesme. Les callases synthases et les [3-1,3-glucanases localisées dans les PD contrólent le turnover de la callase, qui détermine si le PD est ouvert (a gaucha) ou fermé (a droite) permettant ou non le mouvement intercellulaire des virus. D'apres (Scholthof, 2000) (Maule, Faulkner, & Benitez-Alfonso, 2012).II. Mouvement intercellulaire des phytovirus
II.1 Les plasmodesmes : pores obligatoires pour le trafic de cellule à cellule chez les plantes
A la différence du système animal, les cellules végétales possèdent une paroi pecto-cellulosique : elles ne peuvent donc communiquer entre elles que par le biais de canaux complexes et dynamiques appelés plasmodesmes (PD). Ils assurent la continuité du réticulum endoplasmique (RE) entre les cellules voisines grâce au desmotubule (DT) (RE compressé), rattaché à la MP par des attaches protéiques nommées « tether » en anglais (B. Ding, Turgeon, and Parthasarathy 1992; Nicolas et al. 2017). Les PD sont donc des nanopores cylindriques qui traversent la paroi entre deux cellules adjacentes, d’une longueur de 100-300 nm (suivant l’épaisseur de la paroi). Ils permettent le passage de solutés, mais également de petits ARNs et de facteurs de transcription entre cellules voisines.
Selon le modèle actuel, ce transfert des molécules se produit dans le manchon cytoplasmique, situé entre le RE et la MP. La constriction de cet espace, par dépôt de callose dans la paroi cellulaire autour des PD est supposée être le principal régulateur de la SEL (Vatén et al. 2011). Néanmoins, des travaux récents suggèrent une image plus complexe dans laquelle le manchon cytoplasmique n’est pas directement lié à la perméabilité des pores (Nicolas et al. 2017; Yan et al. 2019). Deux morphotypes de PD ont été caractérisés en fonction de l’état de croissance et de différenciation des tissus, à l'apex racinaire d'Arabidopsis âgées de 6 jours et sur des cellules cultivées d'Arabidopsis âgées de 3 à 13 jours Les PD de type I, nouvellement formés, présentent un contact si étroit (~ 2–3 nm) entre la MP et le RE, qu'aucun espace intermembranaire n’est visible par tomographie électronique (Nicolas et al. 2017). Au cours de la croissance et de la différenciation cellulaire ultérieure, le pore s'élargit séparant les deux membranes qui restent connectées par des rayons visibles, laissant un espace cytosolique (PD de type II). Cependant, de façon contre intuitive, malgré l'absence de manchon cytoplasmique visible, les PD de type I ont une perméabilité plus grande que les PD de type II. Des données récentes suggèrent que les contacts étroits entre la MP et le RE favoriseraient en fait le transfert de molécules de cellule à cellule (Nicolas et al. 2017).
Figure. 2. Modèle de régulation de la callose au niveau des plasmodesmes
La quantité de callose est régulée par des callose synthases (CalS) et et Plasmodesmata β-Glucanases (PDBG). La callose est stabilisée par les protéines liant la callose au PD (Plasmodesmata Callose Binding Protein PDCB), qui pourraient inhiber l'activité de PDBG. PDBG et PDCB ont des ancres glycosylphosphatidyl inositol anchored proteins GPI spécialisées, qui les attachent aux micro-domaines de la MP, régions riches en sphingolipides. Le dépôt de callose est renforcé par l'acide salicylique (AS) et par les espèces réactives d'oxygène (ROS), dans un mécanisme impliquant les protéines PDLP. Certaines PDBG sont régulées par des hormones, y compris les auxines (AUX). La callose restreint l'ouverture entre (le desmotubule (DT) et la PM. La localisation de différentes protéines placées sur le schéma (Kinésin G KingG, Formin2, Rémorine (REM), Synaptogamine SYTA, l’ α-expansine NbEXPA1) est putative.
Les membranes au sein du PD sont donc physiquement connectées, mais peu d’études ont montré les composants moléculaires présents au sein de ces attaches RE-MP ainsi que leur fonction sous-jacente. Très récemment, le groupe d’E. Bayer au LBM, Bordeaux a fourni les preuves de l’implication de ces attaches d’une famille de protéines : les MCTPs (Multiple C2 domain and Transmembrane region Proteins), dont certains membres sont déjà décrits comme des régulateurs-clés du trafic intercellulaire et de la signalisation de cellule à cellule (Brault et al. 2019). Les MCTPs, localisées et enrichies aux PDs, font partie d’une famille multigénique et ont une topologie similaire à celle des protéines "tether" connues qui lient la MP au RE chez les animaux et chez les plantes (comme par exemple les Extended-Synaptotagmins, Synaptotagmins) (Pérez-Sancho et al. 2015)(L. Liu et al. 2018). Leur domaine transmembranaire est ancré dans le RE du coté C-terminal tandis que leurs domaines C2 dans le domaine N-terminal interagissent avec les lipides anioniques de la MP. Par ailleurs, le double mutant mctp3/mctp4 chez Arabidopsis induit des défauts de développement de la plante, une réduction du trafic de cellule à cellule, une altération de la fonction et de la composition des PDs. L’expression de MCTP4 dans un mutant de levure dépourvu de tether restaure partiellement la liaison RE-MP.
L’environnement lipidique membranaire des PDs est particulier, avec un enrichissement en sphingolipides complexes avec des acides gras saturés à très longue chaîne (Very Long Chain Fatty Acid, VLCFA) et des stérols (Grison et al. 2015). Les stérols jouent un rôle dans la régulation de la perméabilité des PDs: l’inhibition de la synthèse des stérols par une approche pharmacologique affecte le ciblage des protéines localisées dans les PD et, en fin de compte, l'homéostasie de la callose (Grison et al. 2015; Z. Zhang et al. 2017). De récentes données identifient également les sphingolipides comme régulateurs de la structure des PDs lors de la maturation du type I vers le type II (Yan et al. 2019). Cependant, les modes d'action des stérols et des sphingolipides sur les PD semblent différents puisque le taux de callose n’est pas affecté dans les mutants déficients en sphingolipides.
Tableau 1 : protéines impliquées dans la perméabilité des PDs.
Protéines impliquées dans le turnover de la callose
La callose peut couvrir toute la longueur du canal du PD ou être plus concentrée autour des régions des cols des PDs (Radford and White 1998; Vatén et al. 2011). Le dépôt de callose est régulé positivement et négativement par des protéines associées aux PD. Les PlasmoDesmata Callose Binding Proteins (PDCB) et les calloses synthases (CALS) promeuvent le dépôt alors que les β-Glucanases vont la dégrader (Levy et al. 2007; Maule, Faulkner, and Benitez-Alfonso 2012) (Fig 1). A. thaliana possède 12 CALS et 50 β-1,3-glucanases dont les deux isoformes Plasmodesmata β-Glucanase 1 et 2 (PdBG1 et PdBG2) (Benitez-Alfonso et al. 2013) sont impliquées dans la régulation du métabolisme de la callose spécifiquement au niveau des PDs.
De nombreuses protéines impliquées dans la voie de sécrétion RE-Golgi, mais aussi localisées dans les chloroplastes ou impliquées dans le réseau du cytosquelette interviennent dans la modulation de la perméabilité des PD en réponse aux stress biotiques. Une liste non exhaustive est donnée dans le tableau 1.
Outre les composants endogènes susmentionnés impliqués dans la modulation de la structure et la conductivité des PDs, la SEL est également sensible aux stimuli environnementaux tels que les phytohormones (auxine, acide gibbérellique, acide salicylique) la chitine et le calcium (Fig 2).
II.2 Stratégies virales de détournement des plasmodesmes
Le diamètre des PDs est trop petit pour laisser diffuser passivement les particules virales ou les complexes ribonucléoprotéiques (RNP) viraux. Pour réussir l’infection des feuilles inoculées et envahir les cellules voisines depuis celle initialement infectée (mouvement à courte distance), les virus doivent développer des stratégies pour augmenter la SEL des PDs. Le mouvement d’un virus de cellule à cellule nécessite donc l’implication de protéines codées par le génome viral appelées protéines de mouvement (PM) qui en particulier dilatent les PD en augmentant la SEL (Heinlein 2015).
Selon les genres viraux, deux stratégies principales sont observées pour augmenter la SEL des PD : 1 / Stratégie dépendante de la formation d’un tubule formé par des PM virales à l’intérieur du PD entrainant une réorganisation majeure des PDs avec la perte du DT central. Ce tubule forme un conduit par lequel des particules virales peuvent se déplacer d’une cellule à une autre ; 2 / Stratégie ne modifiant pas la structure du PD et décrite ci-dessous.
Ce n’est pas la particule virale qui se propage, mais un complexe RNP comportant la MP capable de se fixer à l’ARN ou l’ADN génomique viral (Pitzalis and Heinlein 2017). Ces RNPs interagissent avec la machinerie cellulaire et vont modifier la SEL des PDs en utilisant une, ou deux ou trois PM selon le genre viral, correspondant respectivement aux genres tobamovirus (Pitzalis and Heinlein 2017), carmovirus (Navarro and Pallás 2017) et Potexvirus (M.-R. Park, Jeong, and Kim 2014).
La superfamille « Triple Gene Block » (TGB) représente une classe importante de MPs, codées par des virus taxonomiquement divers (Verchot-Lubicz et al. 2010b). Dans cette superfamille, les trois gènes nécessaires au mouvement sont organisés en cadres ouverts de lecture (ORFs ou Open Reading Frames) qui se chevauchent et fonctionnent de concert pour assurer les mouvements intercellulaires. Parmi les 9 genres viraux possédant ces gènes, on retrouve le genre des Potexvirus.
Figure 3 : Représentation schématique du génome du Potato virus X (PVX)
(A) Micrographie électronique à transmission et représentation schématique du PVX. Barre d'échelle = 500 nm. Adapté de (Röder, Dickmeis, & Commandeur, 2019). (B) Organisation génomique du PVX : les protéines traduites à partir de l’ de ARN génomique et des ARNs subgénomiques sont indiquées. RdPR: ARN polymérase dépendante de l'ARN; Triple gene block codant les protéines TGB1 / 2 / 3;. La coiffe 5 'et la queue polyA sont indiquées. Adapté de (Lico, Benvenuto, & Baschieri, 2015)
III Les Potexvirus : généralités, présentation
des virus étudiés et mouvements intercellulaires
III.1 Généralités
Les Potexvirus appartiennent à la famille des Alphaflexiviridae (Adams et al. 2004). Le génome est constitué d’un ARN monopartite de polarité positive contenant cinq ORFs chevauchants : l'ORF 1 code pour la réplicase virale (ARN polymérase ARN-dépendante RdRp), la seule protéine virale absolument nécessaire à la réplication virale (Jens Tilsner et al., 2013) ; (Beck, Guilford, Voot, Andersen, & Forster, 1991; Jens Tilsner et al., 2012 ; ). Les ORF 2 à 4 correspondent au module "TGB" codant respectivement pour les protéines TGB1 (25 kDa), TGB2 (12 kDa) et TGB3 (8 kDa). L’ORF5 code pour la protéine de capside virale (Capsid Protein CP) qui intervient dans le mouvement viral et l'encapsidation de l'ARN viral (Santa Cruz et al. 1998) (Fig. 3).
Durant ma thèse j’ai travaillé avec deux espèces virales du genre Potexvirus : le Potato virus X (PVX) et le Plantago Asiatica Mosaic Virus (PlAMV).
1- Potato virus X ou PVX
Le PVX est présent dans le monde entier dans les zones de production de pomme de terre. Sa transmission de plants à plants se fait principalement par voie mécanique, par contact entre les plantes soumises aux frottements (machines, hommes, animaux). La gamme d'hôtes de PVX est principalement limitée aux Solanacées, et certaines Amaranthaceae. Il a été inclus parmi les agents pathogènes ayant un impact économique important et parmi le « top 10» des virus d’intérêt scientifique (K. B. G. Scholthof et al. 2011). Les symptômes induits peuvent être aggravés par la co-infection par d'autres virus, en particulier le Potato Virus Y (PVY), un phénomène également appelé «synergisme» (Syller 2012).
Les particules de PVX ont une structure filamenteuse d'environ 500 nm de longueur et 15 nm de diamètre. Le virion présente une symétrie hélicoïdale, une surface fortement hydratée et profondément cannelée (Parker, Kendall, and Stubbs 2002). Il est constitué d’un génome d’ARN de polarité positive simple brin d’environ 6,4 kb (Huisman et al. 1988; Skryabin et al. 1988), enveloppé dans une coque
protéine résultant de l’assemblage d’environ 1 300 unités de CP, avec 8,9 unités de CP par tour d'hélice (Kendall et al. 2008) (Fig 3).
2- Plantago asiatica mosaic virus (PlAMV)
Virus flexueux de 490 à 530 nm de long, 11 à 13 nm de large, le PlAMV contient une seule molécule ARN simple brin linéaire de polarité positive d’environ 6 kb, encapsidée dans un arrangement hélicoïdal de 1000-1500 CP (Solovyev et al. 1994) (Adams et al 2009).
Le PlAMV a initialement été signalé par Kostin et Volkov (1976) chez des plantes naturellement infectées en Extrême-Orient russe. La plupart des hôtes naturels du PlAMV identifiés à ce jour sont des plantes vivaces (Lys par exemple). Le virus est assez stable dans les milieux de plantation contaminés, et très facilement transmissible par la sève (DeKock 2013 ;(Conijna 2014). Le génome du PlAMV est composé comme tous les Potexvirus de 5 ORFs. Cependant, le chevauchement de sa CP avec TGB3 constitue une exception dans ce genre. Il a été choisi dans ce travail car il infecte Nicotiana benthamiana mais également Arabidopsis thaliana (Minato et al. 2014; Yamaji et al. 2012).
Figure 4 : Modèle du mouvement de cellule à cellule du PVX impliquant les protéines TGBs Le complexe ribonucléoproteique TGB1-ARN viral se lie à des vésicules formées par TGB2 et TGB3
associées au RE. Les granules mobiles se déplacent le long du réseau RE, en utilisant le cytosquelette d'actine et les protéines motrices de la myosine pour la motilité. Après passage du complexe TGB1-ARNv au travers du pore, TGB2 et TGB3 sont transférées du RE à la MP et recyclées par la voie d’endocytose de la MP vers le RE . Adaptée de (Lucas, Ham, & Kim, 2009). A à D : Images de microscopie illustrant ce modèle : (A) La TGB2 marquée à la GFP, s'associe à des vésicules endocytaires (B) Colocalisation de GFP-TGB2 et FM4-64 (marqueur de la membrane plasmique) dans la membrane des vésicules. (B) TGB1 sous forme de structure en bâtonnet dans le cytoplasme. La MP est marquée avec FM4-64. Dans l'encart : les protéines de TGB1 sont localisées le long de la MP et au niveau d’un PD(C) TGB2 marquée avec la mRFP au niveau des vésicules. Les flèches montrent les vésicules et GFP-TGB3 (en vert) marque le réseau RE et les vésicules (flèches)). (D) TagRFP-TGB2 et TGB3 co-localisent avec GFP-CP au sein du PD (flèche) (Linnik, Liesche, Tilsner, & Oparka, 2013)(Jens Tilsner et al., 2013).
III-2 Les protéines du Triple Gene Block TGB : multifonctionnelles et impliquées dans le mouvement intercellulaire du PVX
Les trois protéines du TGB sont nécessaires au mouvement du PVX. La protéine TGB1 peut modifier la SEL des PDs mais aussi se déplacer de cellule à cellule (Howard et al. 2004; Artemis Perraki et al. 2014; Y. Yang et al. 2000). Cependant, elle ne peut pas cibler efficacement les PDs sans la présence de TGB2 et de TGB3 (Linnik et al. 2013; Schepetilnikov et al. 2005). Néanmoins cette théorie a été contredite par (Artemis Perraki et al. 2014) qui ont montré que même en absence de TGB2 et TGB3, TGB1 est dirigée au niveau des PDs. Cependant les deux modèles s’accordent à dire que TGB1 ne peut pas passer le pore du PD sans TGB2 et TGB3. En outre, TGB1 se lie à la région non traduite en 5’ de l’ARN viral de manière spécifique (Lough et al. 1998, 2000), elle est activatrice de traduction (Atabekov et al. 2000) et fonctionne également comme une hélicase d'ARN et ATPase et est un suppresseur viral du «RNA silencing » (Atabekov et al. 2000; Chiu et al. 2010; Voinnet, Lederer, and Baulcombe 2000a). (Howard et al. 2004) ont montré que muter le domaine hélicase ou ATPase de TGB1 entraine une accumulation cytoplasmique de TGB1 et une diminution de près de 90 % du mouvement de cellule à cellule du PVX (Howard et al. 2004).
Les deux protéines TGB2 et TGB3 sont des protéines membranaires associées au RE. Plus précisément, TGB2 contient 2 domaines transmembranaires en hélice et un domaine central conservé. Une mutation dans le domaine central de TGB2 entrainant une perturbation du domaine transmembranaire conduit à l’inhibition du mouvement intercellulaire (Mitra et al. 2003). Par ailleurs, une mutation perturbant le segment transmembranaire N-terminal de TGB3 abolit son association avec le RE conduisant également à une inhibition du mouvement de cellule à cellule du virus. L’association membranaire de ces deux protéines est donc nécessaire au mouvement du virus. TGB3 interagit à la fois avec TGB1 et TGB2, et peut entrainer TGB1 et TGB2 du cytosol à la périphérie (Jens Tilsner et al., 2013 ; Schepetilnikov et al., 2005). Ensemble, TGB2 et TGB3 induisent des petites vésicules granulaires dérivées du RE, nécessaires pour le mouvement intercellulaire (Ju et al. 2007). Un modèle de mouvement intercellulaire des Potexvirus est proposé en figure 4.
Au cours de l'infection, le PVX peut former de grands complexes amorphes dans la région périnucléaire, appelés historiquement « corps X » (Fig 5). Ces complexes en forme de X, situés à la périphérie du noyau sont essentiels au succès du mouvement intercellulaire (Jens Tilsner et al. 2013). TGB1 joue un rôle central dans la formation des corps X en participant au remodelage des filaments d’actine, des membranes du RE et du Golgi, et au recrutement des protéine TGB2 et TGB3 (Linnik et al. 2013). Ces corps contiennent les protéines virales, de l' ARN viral, et des protéines de l’hôte (Ju et al. 2007; Linnik et al. 2013; Mitra et al. 2003). La microscopie à super-résolution tridimensionnelle (SIM 3D) et l’immunolocalisation par microscopie électronique à transmission ont montré que le corps X présente une structure en couches, avec au niveau de la région la plus interne, des agrégats de TGB1 et de filaments d’actine qui s’enroulent en spirales. Des granules de TGB2 / TGB3 sont localisés à la surface des agrégats de TGB1; (Fig 4) les virions encapsidés s’accumulent sur la face la plus externe du corps X (Ju et al., 2007; Linnik et al., 2013b; Mitra et al., 2003 ; Bamunusinghe et al., 2009; J. Tilsner et al., 2012). Il a été proposé que la réplication de l'ARN viral prenne place dans la couche située entre les agrégats de TGB1 et les granules de TGB2 / TGB3, car de nombreux ARN viraux non encapsidés ont été observés dans cette zone (Ju et al. 2007). De plus, l’infection par le PVX induit également à l’entrée des PD, des complexes ayant une composition et une structure similaires aux corps X périnucléaires qui sont essentiels au mouvement intercellulaire du PVX (Tilsner et al., 2013 ).
L’ensemble de ces observations suggèrent donc que les corps amorphes formés par le PVX sont des « usines » où sont couplés traduction et réplication, encapsidation des particules et mouvement intercellulaire pour ceux situés aux abords des PD (J. Tilsner et al., 2012) (Ju et al. 2007) Cependant, les sites de réplication précis au sein des corps amorphes restent méconnus.
Figure 5 : Inclusions de TGB1 dans les compartiments membranaires du corps-X marqués par TGB2 et TGB3
(A) Vue d'ensemble en microscopie confocale de cellules vivantes infectées par PVX. GFP-CP avec
des X body périnucléaires (n: noyau). Barre d'échelle = 50 µm (B) Image 3D-SIM haute résolution. Encart : filaments de virions individuels à une résolution<100 nm. Échelle = 10 µm (C) Agrégats de TGB1-TagRFP résolus par microscopie confocale, échelle = 5 µm (D) Images SIM 3D haute résolution de TGB1-TagRFP et GFP-TGB2 dans un pseudo-VRC (X-Body) Echelle = 5 µm (E) images 3D-SIM de TGB1-TagRFP et TGB3-GFP. échelle = 5 µm. Adaptée de (Linnik et al., 2013).
III-3 Rôle de la protéine de capside dans le mouvement intercellulaire des Potexvirus
De nombreuses études ont montré que la CP joue un rôle clé dans le mouvement de cellule à cellule des Potexvirus (Verchot-Lubicz 2007) (Fedorkin et al. 2000; Verchot-Lubicz 2005). De manière assez claire, une délétion des 18 acides aminés C-terminaux de la CP du PVX entraine une diminution du mouvement intercellulaire du PVX (Fedorkin et al. 2000). Contrairement au PVX, pour le PlAMV, c’est le domaine N-terminal et non C-terminal de la CP qui semble être plus important dans le mouvement intercellulaire (Fedorkin et al. 2000). Cette différence prouve que les mécanismes moléculaires régissant le mouvement intercellulaire peuvent différer entre espèces virales au sein d’un même genre.
III-4 Protéines cellulaires hôtes impliquées dans le mouvement intercellulaire du PVX
Pour permettre son mouvement de cellule à cellule, le complexe de mouvement viral interagit avec des facteurs cellulaires de l'hôte au niveau de l'orifice
des PD (Lucas, 2006; Morozov & Solovyev, 2003; Verchot-Lubicz, 2005).
Cependant, les interactions impliquant le complexe de mouvement et le -ou les- facteurs cellulaires de l'hôte restent floues à ce jour. Un certain nombre de travaux ont décrit les interactions in vivo ou in vitro entre des protéines de la plante et les protéines du TGB, mais sans démontrer de façon non ambigüe leur effet sur la propagation virale. Les travaux de (Fridborg et al. 2003) qui ont montré que la protéine TIP (TGB-interacting protein) qui interagit avec TGB2 elle-même, interagit avec l'enzyme β-1,3-glucanase qui régule la SEL par dégradation de la callose (Fridborg et al. 2003).
La protéine TGB1 du PVX interagit physiquement avec la REM (S. Raffaele et al. 2009). Les travaux de (A. Perraki et al. 2012; Artemis Perraki et al. 2014) montrent que REM est capable de limiter l’augmentation de la perméabilité des PDs qui est induite par TGB1. De manière cohérente, la surexpression de REM dans Nicotiana benthamiana entraine une diminution de la propagation virale du PVX, sans cependant affecter sa réplication (Artemis Perraki et al. 2014; S. Raffaele et al.
2009). De plus, REM est capable de diminuer la perméabilité des PD. Notre équipe a récemment découvert que REM était phosphorylée par CPK3, une protéine kinase dépendante du calcium, et que cette phosphorylation était nécessaire à sa fonction de restriction du mouvement de cellule à cellule du PVX (Artemis Perraki et al. 2018). Ces travaux, auxquels j’ai participé, constituent la première partie du chapitre des résultats.
IV Les Potyvirus
IV.1 Généralités sur le genre des Potyvirus et espèces virales étudiées La famille des Potyviridae représente plus de 30 % des espèces de virus de plante à ARN de polarité positive connus (Fauquet et al. 2005). Cette famille regroupe une importante classe de pathogènes causant de nombreuses pertes de rendements en agriculture. Le comité international sur la taxonomie des virus a reconnu les Potyviridae comme la deuxième plus grande famille de virus de plante après les Geminiviridae. La famille des Potyviridae regroupe actuellement huit genres contenant près de 200 espèces répertoriées (Wylie et al. 2017). Les Potyvirus, le genre majeur de la famille des Potyviridae, est aussi le plus désastreux du point de vue économique. Plusieurs espèces de Potyvirus touchent des plantes d’intérêt agronomique comme les arbres fruitiers à noyaux infectés par le Plum Pox virus (PPV) ou virus de la Sharka, un pathogène de quarantaine en France, le soja par le Soybean mosaic virus (SMV), le colza par le Turnip Mosaic Virus (TuMV), la pomme de terre par les Potatovirus virus A et Y (PVA et PVY). Les Potyvirus sont transmis par les pucerons et infectent plus de neuf familles de plantes (Urcuqui-Inchima, Haenni, and Bernardi 2001; Walsh and Jenner 2002).
Le génome des Potyvirus est constitué d’un ARN simple brin de polarité positive d’environ 10 kb, codant pour au moins 11 protéines virales (Chung et al. 2008; Revers and García 2015) (Voir Fig 6). La molécule d’ARN est polyadénylée à son extrémité 3’ et est liée de manière covalente à une protéine virale liée au génome- viral protein genome-linked (VPg) à son extrémité 5’. Le génome est traduit en une seule polyprotéine d’environ 340-370 kDa, qui est ensuite clivée en 10 protéines individuelles par des protéases virales (P1), Helper Component Protéinase (HC-Pro) et la protéine d’inclusion nucléaire (NIa-Pro) (Rajamäki et al. , 2004 ;
Figure 6 : Représentation schématique du génome du TuMV
Le cercle représente la protéine virale VPg liée au génome. Les deux lignes horizontales courtes représentent les régions non codantes 5 'et 3', respectivement. La grande boîte représente le long cadre de lecture ouvert (nucléotides 131 à 9625) codant pour la polyprotéine virale. La protéine PIPO (nucléotides 3079 à 3258) est indiquée par une barre grise. P3N-PIPO est indiquée en vert et CI en rose. La queue poly (A) est représentée par (A)n. Par souci de clarté, les tailles relatives des protéines matures ne sont pas dessinées à l’échelle. P1 : Protein 1 HC-Pro (Helper Component-Protease) ; P3 (Protein 3) ; 6K1 (6-kDa peptide 1) ; CI (Cylindrical Inclusion protein) ; 6K2 (6-kDa peptide 2) ; VPg (Viral Protein genome-linked) ; NIa-Pro (Nuclear inclusion A-protease) ; NIb (Nuclear inclusion B ou RdRp virale) CP (Coat protein). Adaptée de (Wei et al., 2010)
Revers and Garcia, 2015). Un deuxième petit ORF appelé « Pretty Interesting Potyviridae ORF » (PIPO) enchâssé dans la séquence de P3, entraîne la traduction d’une onzième protéine fonctionnelle de fusion avec la région N-terminale de P3 appelée P3N-PIPO, conséquence d’un glissement de la réplicase virale lors de la synthèse de l'ARN viral (Chung et al. 2008; Olspert et al. 2015; Rodamilans et al. 2015). Cette protéine P3N-PIPO produite en très petite quantité, est impliquée dans le mouvement de cellule à cellule des Potyvirus, probablement via le recrutement de la protéine d’inclusion cylindrique (Cylindical Inclusion CI) au niveau des PDs (Vijayapalani et al. 2012; Wei et al. 2010). Les Potyvirus ne possèdent pas donc une PM unique mais plusieurs protéines virales multifonctionnelles qui sont impliquées dans le passage du génome viral de cellule à cellule. Au-delà de la CP, trois protéines non structurales sont impliquées dans le mouvement des Potyvirus : CI, P3N-PIPO et la protéine 6K2 (protéine d’ancrage à la membrane de 6 KDa) (Sorel, Garcia, and German-Retana 2014) (Fig 6).
Virus étudié : le Turnip mosaic virus
Le TuMV est l'un des virus les plus abondant au monde, et est transmis par 89 espèces de pucerons (Shattuck 2010). Il infecte essentiellement des plantes de la famille des Brassicaceae. Il est capable d'infecter une très large gamme d'hôte, comprenant 418 espèces, 156 genres et 43 familles différentes. Les principaux symptômes induits par le TuMV sont un retard de croissance, de la mosaïque, des jaunissements, des boursoufflures et des recroquevillements sur les feuilles en systémie (Martín et al. 1999). Le développement des symptômes dépend de la virulence de l’isolat en question, de la sensibilité de l’hôte et des conditions environnementales.
IV. 2 Cycle et mouvement intercellulaire des Potyvirus
Les différentes étapes du cycle viral et du mouvement intercellulaire des Potyvirus sont décrites dans la Figure 7. Les virions filamenteux pénètrent dans la cellule hôte grâce à des piqures du puceron virulifère ou par inoculation mécanique. Après décapsidation, l'ARN génomique est traduit en une polyprotéine qui est ensuite traitée par trois protéases virales. Au moins six protéines virales, la CI, NIa, NIb, 6K2, HC-Pro et P3, sont impliquées dans la réplication virale. Durant le cycle viral du TuMV, un important remaniement du réseau endomembranaire a lieu et induit notamment des structures globulaires périnucléaires constituées par un regroupement de réticulum endoplasmique, de Golgi, de chloroplastes et de vésicules dérivées du RE induites par la protéine 6K2, correspondant aux complexes de réplication viraux ou Viral Replication Complex VRCs (Grangeon et al. 2013). Les vésicules induites par la 6K2 contiennent en particulier des formes de réplication ARN viral double brin, plusieurs protéines virales impliquées dans la réplication dont la RdRp, suggérant que ces vésicules sont des sites de réplication (Cotton et al. 2009). Ces vésicules induites par la 6K2 sont adressées aux PDs par la voie de sécrétion intracellulaire et sont capables de se déplacer de cellule à cellule, potentiellement par les PDs (Grangeon et al. 2013) (Agbeci, Grangeon, Nelson, Zheng, & Laliberté, 2013; Jiang, Patarroyo, Garcia Cabanillas, Zheng, & Laliberté, 2015).
Au-delà de la 6K2, les Potyvirus codent pour plusieurs protéines qui jouent un rôle dans le mouvement intercellulaire, P3N-PIPO, la CI et la CP (Wei et al., 2010; Sorel et al, 2014). La protéine CI et la CP, en plus des ARN viraux, se localisent au niveau des PDs (Roberts et al. 1998; Rodríguez-Cerezo et al. 1997). Des analyses ultra structurales à haute résolution indiquent que la CI forme des structures coniques qui sont ancrées par P3N-PIPO aux PDs (Wei et al. 2010). Des expériences de génétique inverse montrent que des mutants de TuMV affectés dans la CI ou P3N-PIPO ne sont plus capables de réaliser le mouvement de cellule à cellule (Sorel, Garcia, and German-Retana 2014; Wei et al. 2010). Récemment, (Movahed et al. 2017) ont confirmé le rôle de la CI et de P3N-PIPO dans l’adressage aux PDs des vésicules 6K2 et le rôle crucial de ces interactions pour le mouvement intercellulaire du TuMV.
Figure 7 : Modèle simplifié du cycle des Potyvirus
La protéine CI est chargée dans les vésicules induites par 6K2. Ces vésicules font partie d'une grande structure globulaire périnucléaire dans laquelle la CI est impliquée dans la traduction et la réplication virale, ainsi que dans l'inhibition des défenses de l'hôte par des interactions avec les partenaires hôtes. Un autre pool de protéines CI est recruté dans les plasmodesmes et forme des structures coniques ancrées aux PDs à l’aide de P3N-PIPO, facilitant le mouvement intercellulaire viral vers les cellules adjacentes. Le trafic intracellulaire s’effectue le long de filaments d’actine via la protéine CI ou via les microtubules avec les complexes CI –eIF4iso4E ou eIF4iso4G et amène les vésicules aux plasmodesmes. Zoom sur le plasmodesmes schématisant l’interaction CI-P3N-PIPO facilitant le passage du virion à travers le plasmodesme.
Plusieurs expériences de génétique inverse basées sur l’obtention de mutants dans la CP ont aussi montré une abolition du mouvement de cellule à cellule des Potyviridae, suggérant le rôle primordial de cette protéine structurale dans le mouvement des Potyvirus (V. V. Dolja et al. 1994) (Anindya and Savithri 2003). Par conséquent, une possibilité est que les complexes passant dans les structures coniques formées par la CI au niveau des PDs soient des complexes RNP viraux associés à la CP. La formation de ces structures coniques est transitoire. Aux stades ultérieurs de l’infection, les protéines de CI s’agrègent dans le cytoplasme en ponctuations, suggérant que la machinerie de transport de cellule à cellule est désassemblée et que le mouvement de cellule à cellule cesse (Sorel, Garcia, and German-Retana 2014).
Cependant, ce modèle de propagation de cellule à cellule via les PD pour le TuMV est encore discuté. Si, comme indiqué précédemment (Grangeon et al., 2013) ont montré que les vésicules virales infectieuses induites par 6K2 sont transportées directement dans les cellules voisines, potentiellement à travers les PD, de nouvelles études pointent un mécanisme alternatif. Très récemment, (Movahed et al. 2019) ont montré par des approches de microscopie électronique à transmission, une prolifération de corps multivésiculaires (MVBs) contenant l’ARN viral pendant l’infection par le TuMV, puis leur fusion avec la MP, entrainant la libération de microvésicules intraluminales dans l’espace extracellulaire. Le marquage immunogold a confirmé la présence de l’ARN viral dans ces vésicules. De plus, l’analyse protéomique des vésicules extracellulaires purifiées à partir de feuilles de N. benthamiana et d’A.thaliana infectées par le TuMV, couplée à des observations par microscopie électronique à balayage haute résolution a confirmé la présence de nombreuses structures vésiculaires contenant les protéines virales dans l’espace entre la MP et la paroi, appelé espace paramural, suggérant l’implication de l’espace extracellulaire dans la propagation du TuMV (Cabanillas et al. 2018; Movahed et al. 2019), déjà suggérée par (Wan and Laliberté 2015). Cette dernière hypothèse représente un grand changement de paradigme en suggérant un mode de mouvement du TuMV apoplastique.
