1 / Suite à une infection par le PVX, l'organisation latérale en nanodomaines de StREM1.3 et sa dynamique sont modifiés.
Des analyses en microscopie confocale, suite à la coloration de la callose par le bleu d’aniline ont montré une accumulation de ce polymère au niveau des PDs en présence de PVX dans N.benthamiana (Fig 1A et B), révélant la mise en place de défenses de la plante. En parallèle, la détermination de l’indice "PD index" (rapport entre l’intensité de la fluorescence de YFP-REM1.3 dans les PD marqués à l’aniline et la fluorescence dans la MP autour des PD) montre que, malgré son rôle sur la régulation des PD (Artemis Perraki et al. 2014), StREM1.3 n'est pas enrichie aux PDs en absence de PVX (Fig 1C). Cependant, en présence du PVX, une très légère augmentation du PD index est observée suggérant une relocalisation de StREM1.3 en présence du PVX au niveau des PD, associée au dépôt de callose
Précédemment, par des techniques de microscopie à haute résolution (total internal reflection fluorescence microscopy TIRF), nous avions démontré que l’organisation des nanodomaines (taille, densité) de StREM1.3 ainsi que la dynamique de StREM1.3 (mise en évidence par Single particle tracking Photo Activated Localization Microscopy spt-PALM) sont des éléments directement liés à la fonction restrictive du PVX (Gronnier et al. 2017a). Dans cette étude, le même type d’analyse a été mené par J. Gronnier afin d’étudier l’effet plus précisément l’effet de l’infection par le PVX sur la ségrégation et la mobilité de StREM1.3.sur en fonction du temps (Fig 1 D, E, F, G).
En absence de PVX, StREM1.3 apparaît immobile et confinée à la MP. En revanche, en présence de PVX, la mobilité de StREM1.3 augmente. Les
nanodomaines formés par REM sont donc aussi modulés lors de l'infection par le PVX : Ils sont moins nombreux, mais ont une taille supérieure et sont moins confinés. La proportion des StREM1.3 localisées dans les nanodomaines diminue légèrement. En revanche, par rapport à la surface totale des particules de la MP, la proportion des nanodomaines ne change pas en présence ou absence du PVX. Ces études permettent de mettre en évidence des modifications subtiles notamment de dynamique de StREM1.3, qui pourrait se relocaliser au niveau des PD lors de l’infection par le PVX, et ainsi promouvoir le dépôt de callose.
2 / Mise en évidence de l'importance de 3 sites de phosphorylation sur la partie N-terminale de REM1.3 dans la fonction restrictive au PVX via la conductance des PDs (Fig 2 et 3).
Les tests de phosphorylations de protéines in vitro ont mis en évidence une phosphorylation de StREM1.3 uniquement dans la fraction microsomale (non soluble, membranaire) des feuilles de N.benthamiana. Par ailleurs, les fractions microsomales de feuilles infectées par le PVX montrent un niveau de phosphorylation de StREM1.3 plus élevé que les fractions microsomales non infectieuses, montrant que le PVX induit la phosphorylation de StREM1.3 (Fig 2A, B) par une activité kinase située dans la fraction membranaire, et plus particulièrement au niveau de la MP.
Plus précisément, nous avons montré également que l’expression des deux protéines virales TGB1 et la CP entrainent, séparément, une phosphorylation de StREM1.3 plus importante que les autres protéines du PVX testées. Conformément à ce résultat, une version de PVX avec une délétion de TGB1 (PVXΔTGB1) a diminué les niveaux de phosphorylation de StREM1.3 par rapport aux extraits de PVX (Fig S3D).
Les prédictions in silico de la séquence protéique de StREM1.3 (Fig 3A) ont décelé des régions avec des sites potentiels de phosphorylation localisés dans la partie N-terminale de la protéine, qui est constituée par une région de désordre intrinsèque. Pour la caractérisation fonctionnelle de la phosphorylation, nous avons choisi, parmi les scores les plus élevés de prédiction de phosphorylation au sein du domaine intrinsèque N-terminal, trois sites de phosphorylation putatifs de sérine (S) / thréonine (T) présents dans REM1.3 N, à savoir S74, T86 et S91. Par la suite, les
mutants phosphoablatifs (StREM1.3AAA) et phosphomimétique (StREM1.3 DDD) à ces trois sites ont été générés. En bon accord, les tests de kinase de phosphorylation de StREM1.3 in vitro ont montré que la phosphorylation du mutant phosphomimétique était abolie (Fig 3B et C).
Au niveau fonctionnel, le triple mutant phosphoablatif, YFP-REM1.3 AAA s’est révélé totalement inactif quant à la limitation du mouvement de cellule à cellule de PVX et d’autre part, à la régulation de la perméabilité des PD. Réciproquement, le
mutant triple phosphomimétique de REM1.3, RFP-REM1.3 DDD est apparu totalement
fonctionnel, à l'instar de StREM1.3. Des analyses combinatoires des différents phosphosites ont révélé que chacune des 3 positions était importante pour la fonctionnalité de StREM1.3 (Fig 3D).
3 / Le phospho-statut de StREM1.3 module sa ségrégation latérale dynamique dans les sous-compartiments de la MP et de la MP environnant les PD, nommée PD-MP (Fig 4).
De la même façon que StREM1.3 non muté, ces deux variants sont localisés à la MP et ne semblent pas enrichis au niveau des PD. Cependant, les tests d’aniline blue indique une diminution de la quantité de callose au niveau des PD et du PD index dans le mutant phosphoablatif, alors que la version phosphomimetique phénocopie StREM1.3 non mutée (Fig 4B et 4C). On peut donc suggérer que la version de StREM1.3 phosphorylée semble donc davantage cibler la PD-MP pour le déclenchement du dépôt de callose.
En accord avec ces résultats, l'analyse de l'organisation supramoléculaire a montré que la mobilité de StREM1.3 au sein de la MP changeait en fonction de son phosphostatut (Fig 4D, E, F, G) :
- Le mutant phosphomimétique est moins confiné et plus mobile à la MP, comme StREM1.3 WT.
-Les nanodomaines formés par la version phosphomimétique occupent une surface plus petite de la MP totale, et leur densité est légèrement réduite.
En revanche la taille des nanodomaines pour les deux versions est similaire
a
la version WT.4 / CPK3 induit la phosphorylation de StREM1 .3 de maniere calcium dépendante (Fig 5).
Les tests de phosphorylation in vitro de StREM1 _3N (domaine N-terminal de StREM1 .3) ont permis de montrer une activité maximale de la kinase dans la fraction
de microsomes purifiés et plus particulierement associée
a
la MP dans les DRM (Fig5A et B). De plus, des tests pharmacologiques ont montré que l'Ethylene Glycol Tetraacetic Acid, l'EGTA, un chélateur de Ca2+ inhibe l'activité de la kinase. Pour
déterminer si la kinase phosphorylant StREM1 .3, activée par le PVX est sensible
a
larégulation par le calcium, nous avons effectué des phosphorylations in vitro de StREM 1.3
a
partir de microsomes de N. benthamiana sains et infectés par le PVX,puis regardé l'activité de la phosphorylation dans ces deux fractions en fonction de
concentrations différentes de calcium libre, allant de O
a
100 µM. Ces tests ont révéléque l'activité kinase présente une sensibilité élevée au calcium avec une activité
optimale en présence de 1 O µM de Ca 2+ libre :
a
cette concentration, uneaugmentation d'un facteur 5 de la phosphorylation de REM1 .3 N dans des feuilles infectées par le PVX est observée, nous permettant de circonscrire la ou les kinase(s) phosphorylant StREM1 .3 au groupe de protéines kinases dépendantes
de Ca2 +liées
a
la membrane plasmique (CPK).Parmi les classes de kinases régulées par le calcium, les CPKs ont la
caractéristique unique de détecter et répondre d'elles-mémes
a
la signature calciquepar une activité enzymatique.
De plus, de précédentes études protéomiques chez Arabidopsis avaient
identifié CPK3 et AtREM1 .3 comme étant enrichies en fractions MP, PO et DRM.
(Fernandez-Calvino et al. 2011 b; Kierszniowska, Seiwert, and Schulze 2009). Enfin,
une étude a montré que AtREM1 .3 est phosphorylée IN VITRO par CPK3 (MEHLMER
ET AL. 2010). L'ensemble de ces informations nous a conduits
a
la kinase CPK3 comme bonne candidate pour la phosphorylation de StREM1 .3. En bon accord, des tests de kinases in vitro ont pu montrer que CPK3 est capable de phosphoryler fortement la partie N-terminale de StREM1 .3 en présence de calcium (Fig 5D). De maniere intéressante, CPK3 peut phosphoryler AtREM1 .2, qui a également un effetrestrictif sur la propagation du PVX, comme StREM1.3. Pour ces expériences, l’ajout de calcium est une condition essentielle pour induire la phosphorylation des REM par CPK3 (Fig 5 D, E). En bon accord, le variant StREM1.3n’est plus phosphorylé par CPK3 in vitro (Fig 5F).
5 / CPK3 interagit in planta avec les REM du groupe 1, limite la propagation du
PVX de manière dépendante de StREM1.3
Des expériences d’interactions protéine-protéine in planta par Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) ont montré que la CPK3 constitutivement
active, CPK3CA et StREM1.3, StREM1.3 AAA et StREM1.3 DDD interagissent
ensemble au niveau de la MP in planta (Fig 6C).
La surexpression transitoire de CPK3-RFP seule induit une réduction des
foyers d’infection à PVX-GFP, ce qui suggère QUE CPK3 joue un rôle important dans
les réponses antivirales contre le PVX (Fig 6D). Pour tester la relation épistatique entre StREM1.3 et CPK3 au niveau fonctionnel, des tests de propagation dans des lignées de N. benthamiana sous-exprimant les REM du groupe 1 montrent une augmentation du mouvement de cellule à cellule du PVX-GFP dans des feuilles inoculées (Fig 6E). Ce test a ainsi démontré que la capacité de CPK3CA à limiter le mouvement du PVX était altérée dans ces lignées, indiquant de ce fait que les REM du groupe 1 pourraient être un substrat direct de CPK3 in vivo (Fig 6E).
L’ensemble de ces données nous ont conduit à dresser un modèle hypothétique de travail présenté en figure 1. Les résultats nous permettent de montrer que les cellules infectées de N.benthamiana détectent le PVX, et ensuite déclenchent l’activation de CPK3. Nous avons pu montrer que CPK3 interagit avec NbREMs et AtREMs, phosphoryle le domaine intrinsèquement désordonné (IDP) de REM et restreint l'accès PD SEL et PVX. Enfin, les données spt-PALM ont suggéré que le phospho-état de REM modifie la dynamique des nanodomaines au sein de la MP avec une augmentation de REM au voisinage de PD-MP, qui à son tour, est crucial pour la limitation du mouvement de cellule à cellule PVX en régulant le dépôt de callose à PD. Pris ensemble, ces résultats proposent une pertinence fonctionnelle de la phosphorylation de REM et de l'organisation des nanodomaines au sein de la MP pour modifier la SEL des PD. Néanmoins, certaines zones d’ombres restent encore à explorer : par exemple, le phosphocode exact de REM en réponse au virus,
et son implication fonctionnelle sont encore inconnus. De plus, Nous ne savons pas comment la phosphorylation affecte la localisation et la fonction des nanodomaines au PD. Par ailleurs, REM semble être une protéine d’échafaudage, interagissant avec un nombre élevé de partenaires protéiques. Cependant nous ne savons pas précisément quels partenaires protéiques interagissent avec REM phosphorylée, entrainant la réponse antivirale
(PhosphoREM-domain 2019 répondre à ces questions.
Figure 1 : Modèle hypothétique montrant, suite à l'infection par le PVX, l'activation de StREM1.3 après la phosphorylation par CPK3
protéine kinase dépendante du calcium du groupe 2 qui à son tour phosphorylerait StREM1.3, altérant ainsi sa conformation. Ce changement de conformation conféré par la phosphor
incidence sur la capacité potentielle de StREM1.3 à interagir avec d’autres protéines, qui pourraient, à leur tour, être impliquées dans une voie de signalisation contribuant à l'accumulation de callose à l’entrée des PD, limitant ainsi la propagation de cellule à cellule du PVX.
et son implication fonctionnelle sont encore inconnus. De plus, Nous ne savons pas comment la phosphorylation affecte la localisation et la fonction des nanodomaines ailleurs, REM semble être une protéine d’échafaudage, interagissant avec un nombre élevé de partenaires protéiques. Cependant nous ne savons pas précisément quels partenaires protéiques interagissent avec REM phosphorylée, entrainant la réponse antivirale au PD. Dans le cadre de la prochaine ANR domain 2019-2023), de futures analyses devraient nous permettre de
Figure 1 : Modèle hypothétique montrant, suite à l'infection par le PVX, l'activation de phosphorylation par CPK3. Après l’infection, un signal calcique activerait une protéine kinase dépendante du calcium du groupe 2 qui à son tour phosphorylerait StREM1.3, altérant ainsi sa conformation. Ce changement de conformation conféré par la phosphor
incidence sur la capacité potentielle de StREM1.3 à interagir avec d’autres protéines, qui pourraient, à leur tour, être impliquées dans une voie de signalisation contribuant à l'accumulation de callose à
la propagation de cellule à cellule du PVX.
et son implication fonctionnelle sont encore inconnus. De plus, Nous ne savons pas comment la phosphorylation affecte la localisation et la fonction des nanodomaines ailleurs, REM semble être une protéine d’échafaudage, interagissant avec un nombre élevé de partenaires protéiques. Cependant nous ne savons pas précisément quels partenaires protéiques interagissent avec REM phosphorylée, au PD. Dans le cadre de la prochaine ANR 2023), de futures analyses devraient nous permettre de
Figure 1 : Modèle hypothétique montrant, suite à l'infection par le PVX, l'activation de Après l’infection, un signal calcique activerait une protéine kinase dépendante du calcium du groupe 2 qui à son tour phosphorylerait StREM1.3, altérant ainsi sa conformation. Ce changement de conformation conféré par la phosphorylation aurait une incidence sur la capacité potentielle de StREM1.3 à interagir avec d’autres protéines, qui pourraient, à leur tour, être impliquées dans une voie de signalisation contribuant à l'accumulation de callose à
RESEARCH ARTICLE