Les Calcium-dependent Protein Kinases, les CPKs et leurs protéines associées les CRKs

II. 1- CPKs : une large famille de protéines kinases

Les CPKs constituent la troisième et la plus grande famille de capteurs de calcium. Elles sont présentes chez les plantes, les algues vertes et les protistes unicellulaires (Hamel, Sheen, and Séguin 2014) Les CRKs ne sont présentes que chez les plantes (Hrabak 2003). Les CPKs ont la caractéristique unique de posséder à la fois un domaine senseur de calcium (CaM like domain) et un domaine kinase (Fig 2). De ce fait, les CPKs n’ont pas besoin de passer par des intermédiaires et vont, une fois activées par le calcium, réguler les protéines cibles par phosphorylation (Cheng et al. 2002; Harper, Breton, and Harmon 2004). En revanche, les CRKs ont des mains EF dégénérées et sont donc incapables de lier les ions calciques (Harper, Breton, and Harmon 2004).

La taille de la famille des CPKs varie selon les espèces (Valmonte et al. 2014). Le génome d' Arabidopsis contient 34 gènes de CPKs divisés en quatre sous-groupes et 8 CRKs (Hrabak 2003) (Fig 1).

II.2. Régulation des CPKs

A- Régulation par le calcium

La sensibilité au calcium de 14 CPKs d’Arabidopsis a été étudiée, révélant des diversités, certaines étant sensibles à de faibles concentrations, d’autres à de fortes concentrations, ce qui pourrait être dû à des variations dans les séquences EF hands (Boudsocq et al. 2012; Boudsocq and Sheen 2013). Seule exception notable dans les CPK d’Arabidopsis : AtCPK25 ne possède pas de main EF et est donc calcium indépendante. Certaines CPKs ne réagissent pas au calcium, malgré une bonne liaison de l’ion. Outre les problèmes d’aspects techniques, la liaison au calcium pourrait réguler ainsi d’autres aspects de l’activité kinase comme par exemple les interactions protéiques (Zou et al. 2010).

B- Régulation par la phosphorylation

Des études ont pu montrer que plusieurs CPKs s’autophoshorylent sur des sites Ser/Thr in vitro, et sont détectées comme des phosphoprotéines in vitro (Hegeman et al. 2006; Nemoto et al. 2011; Swatek et al. 2014). Quelques sites d’autophosphorylation conservés ont été cartographiés sur tous les domaines des CPKs, en dehors de la région JD (Hegeman et al. 2006). Néanmoins, toutes les CPKs ne réalisent pas l’autophosphorylation et le rôle de cette autophosphorylation n’est pas encore clairement défini. Par exemple, l'autophosphorylation in vitro active une CPK d’arachide (Arachis hypogea) mais inhibe celle chez le haricot (Psophocarpus tetragonolobus (Chaudhuri, Seal, and DasGupta 1999; Saha and Singh 1995). La phosphorylation dans les régions CaMLD et la VNTD peut affecter divers phénomènes tels que la sensibilité au calcium, la spécificité du substrat ou encore la localisation des protéines. En effet, par exemple, l’autophoshorylation de NtCDPK1 sur S6 et T21 diminue l’affinité de liaison et la phosphorylation de l’un de ses substrats mais au contraire augmente celles d’autres substrats (Ito et al. 2017) Quelques études menées in vitro ont pu montrer que certaines kinases étaient capables de phosphoryler d'autres CPKs, par exemple (L. N. Zhao et al. 2013), ouvrant des pistes pour expliquer comment les kinases insensibles au calcium fonctionnent. Néanmoins, des validations biochimiques et fonctionnelles restent à réaliser.

Il semblerait que la déphosphorylation soit aussi importante que la phosphorylation dans le contrôle des voies de signalisation. En effet, par exemple, une phosphatase soluble provenant de pousses de haricots déphosphoryle in vitro la CPK1 autophosphorylée (Ganguly and Singh 1999). Cette action libère l’effet inhibiteur de l'autophosphorylation et suggère l'existence d'une boucle de rétroaction. une interaction complexe entre les protéines kinases et les phosphatases importante dans la régulation de certaines activités des CPKs est alors suspectée.

C - Régulation par les protéines 14-3-3

En plus du calcium, les CPKs peuvent aussi être régulées par des protéines ubiquitaires chez tous les eucaryotes et très conservées, les protéines 14-3-3 (Valérie Cotelle and Leonhardt 2016; Ormancey et al. 2017). Les 14-3-3 se fixent à plusieurs centaines de protéines au niveau des phosphosites de type Ser/Thr. De part cette liaison, les protéines 14-3-3 vont pouvoir moduler de nombreux paramètres de leurs cibles, tels que leur activité (par masquage de leur séquence phosphorylable indispensable à leur fonction par exemple), leur stabilité, leur localisation subcellulaire ou encore leur participation à des complexes protéiques. Chez les plantes, les protéines 14-3-3 sont impliquées dans de nombreux processus physiologiques, notamment le métabolisme, la signalisation hormonale, les régulations stomatiques et la réponse aux facteurs de stress abiotiques et biotiques (H. Fu, Subramanian, and Masters 2000). Par exemple, chez Arabidosis, qui compte 13 isoformes de protéines 14-3-3, un des isoformes a été caractérisé par des expériences de mutagénèse dirigée comme un facteur de susceptibilité aux Potyvirus (Carrasco et al. 2014).

Fonctions des interactions 14-3-3 / CPK

Bien qu'aucun domaine de liaison n'ait été validé à ce jour sur aucune CPK, AtCPK1 a été la première CPK découverte comme régulée par les protéines 14-3-3 in vitro sur le site N-terminal (Camoni, Harper, and Palmgren 1998). Par la suite, les interactions in vitro observées des protéines 14-3-3 avec les protéines AtCPK1 et AtCPK3 (V. Cotelle 2000; Moorhead et al. 1999), ont été confirmées in vivo suggérant des fonctions biologiques de ces interactions (Chang et al. 2009; J. Gao et al. 2014; Lachaud et al. 2013). Si l'activité de CPK3 n'est pas activée in vitro par l'interaction avec 14-3-3 (Moorhead et al. 1999), l'interaction de CPK1 avec les

protéines 14-3-3 semble en revanche augmenter son activité de phosphorylation (Camoni, Harper, and Palmgren 1998). Néanmoins, dans des études sur des cellules en suspension d'Arabidopsis privées de sucres montrent que les CPK3 seront clivées suite à une perte d'interaction avec 14-3-3, suggérant plutôt un rôle protecteur de ces protéines vis à vis des CPKs (V. Cotelle 2000).

Quelques études ont suggéré qu'une interaction plus complexe entre CPKs et

les protéines 14-3-3 se produit probablement car les protéines 14-3-3 peuvent également être des substrats de CPKs (Ormancey et al. 2017; Swatek et al. 2014). En effet, des analyses MS ont permis de découvrir que les protéines 14-3-3 contenaient plusieurs sites de phosphorylations, et des analyses d’activité kinase in vitro ont pu établir que les protéines 14-3-3 sont phosphorylées in vitro à plusieurs sites par les CPKs (Swatek et al. 2014). Un exemple de réponse biologique montrant la régulation des protéines 14-3-3 par les CPKs a été observé après l'application de la fumonisine B1, une toxine produite par le champignon nécrotrophe Fusarium moniliforme (Lachaud et al. 2013). Cette toxine induit la mort cellulaire programmée des plantes (Programmed Cell Death, PCD) en provoquant l'accumulation de bases sphingoïdes à longue chaîne (LCB) telles que la phytosphingosine (PHS) chez Arabidopsis. L'augmentation des niveaux de PHS cellulaire entraîne une élévation de la concentration de calcium cytosolique, ce qui active AtCPK3. Il a été montré in vitro que AtCPK3 phosphoryle ensuite les protéines 14-3-3 en un site situé à l’interface de ses dimères (Lachaud et al. 2013). La phosphorylation de 14-3-3 favorise la dissociation du complexe 14-3-3 – CPK3 (Gökirmak et al. 2015) entrainant le clivage protéolytique de AtCPK3 (Lachaud et al. 2013).

II. 3- Diversité des localisations tissulaires et subcellulaires des CPKs Les CPKs sont largement répandues dans les plantes et ont une expression ubiquitaire dans différents tissus, notamment les racines, les feuilles, les fleurs, les siliques, etc. Cependant, certaines CPKs ont une distribution étendue dans la plupart des tissus, tandis que d'autres sont exprimées plus spécifiquement (Bamunusinghe et al. 2009; Monaghan et al. 2014). Au niveau cellulaire, les CPKs sont abondamment présentes dans le méristème, le xylème, le pollen, les cellules de garde et les cellules embryonnaires (Boudsocq and Sheen 2013). Les CPKs ont une localisation subcellulaire variée, comprenant le cytosol, le noyau, la MP, le RE, le

tonoplaste, les mitochondries, les chloroplastes, les gouttelettes lipidiques et les peroxysomes (Boudsocq and Sheen 2013). 28 CPKs d’Arabidopsis sont prédites myristoylées au niveau de la glycine 2, une modification co-traductionnelle impliquée dans le ciblage membranaire (ajout covalent d’un acide myristique, un acide gras saturé à 14 atomes de carbone, C14:0; (Towler et al. 1988)), ce qui a été observé aussi in vitro. Cette myristoylation a été confirmée in vivo par une analyse par spectrométrie de masse pour 13 CPKs (Majeran et al. 2018).

En plus de la myristoylation, une palmitoylation réversible sur une cystéine est présente chez 9 CPKs d’Arabidopsis pour maintenir l’association à la membrane. Le caractère réversible de cette modification post-traductionnelle par ajout d’un acide gras saturé à 16 atomes de carbone (C16:0) permet aux CPKs concernées de naviguer entre la MP et d’autres compartiments subcellulaires pour y effectuer différentes fonctions dépendantes des stimuli perçus. Les mutations à ces sites d’acylation peuvent modifier la fonction des CPKs révélant l’importance de la précision de leur localisation, comme par exemple observé avec AtCPK6. Cette kinase régule le canal anionique de type lent, Slow Anion CHANNEL 1, SLAC1 dans le mouvement stomatique avec AtCPK3. La forme mutante, non palmitoylée

(mutation de la 3^ème Cystéine en Sérine, C3S) et non myristolyée (mutation de la 2^ème

Guanine en Alanine, G2A) de CPK6 ne peut pas complémenter la perte de fonction du double mutant nul cpk3,6 qui indique que la localisation membranaire de AtCPK6 est nécessaire pour réguler SLAC1 à la membrane plasmatique (Saito et al. 2018).

La distribution tissulaire des CPKs, ainsi que leurs localisations subcellulaires spécifiques chez les plantes suggèrent un grand potentiel d'activation de substrats et leurs implications fonctionnelles dans nombreuses voies de transduction du signal (Boudsocq and Sheen 2013; Simeunovic et al. 2016).

II. 4- Fonctions des CPKs : entre redondance et diversités fonctionnelles La présence des CPKs dans tous les tissus entraine une multitude de cibles potentielles, et les implique dans de nombreuses voies de signalisation allant des

processus hormonaux, développementaux, aux réponses aux stress

environnementaux biotiques et abiotiques (Boudsocq and Sheen 2013; Cheng et al. 2002; Ludwig, Romeis, and Jones 2004).

Les progrès génétiques, biochimiques et physiologiques ont permis une caractérisation fonctionnelle plus fine des CPKs en découvrant leurs cibles putatives. Les CPKs apparaissent comme des protéines souvent redondantes, augmentant la difficulté pour découvrir chacune de leurs fonctions précises. De plus, la diversité

des capteurs de Ca²⁺ et de leurs cibles en aval ajoute une seconde couche de

spécificité, permettant la transduction de divers stimuli primaires en réponses biologiques distinctes (Hashimoto and Kudla 2011).

De manière globale, des approches de génétique inverse et classique ont permis de montrer l’implication de certaines des CPKs d’Arabidopisis dans la croissance et la régulation du tube pollinique (Gutermuth et al. 2013; L. N. Zhao et al. 2013), dans la régulation de la signalisation florale (Kawamoto et al. 2015), mais aussi dans la régulation, la détection et le transport des nutriments (Chiou et al 2005). A côté de ces aspects développementaux, des exemples illustrent le rôle des CPKs dans la réponse à des stimuli abiotiques et biotiques. La plupart des études sur le stress abiotique se sont concentrées sur la sécheresse et les conditions salines : CPK6 est un régulateur positif de la tolérance au stress salin et au déficit

hydrique (Xu et al. 2010). De façon remarquable, la surexpression de OSCDPK6 du riz

a donné des plants de riz résistantes au froid, au sel et à la sécheresse (Saijo et al. 2000). D’autre part, au niveau des cellules de garde, AtCPK6 et AtCPK3 régulent la fermeture des stomates induite par l’acide abscissique (ABA) (Mori et al. 2006).

II. 5- Fonctions biologiques des CPKs en réponse aux stress biotiques L'immunité des plantes repose sur la perception des PAMPs / MAMPs tels que les peptides de type flagelline bactérienne Flg22 ou encore les chitines fongiques pour déclencher les défenses PTI et ETI (Voir partie 1 Introduction). Les CPKs vont être impliquées dans ce schéma en contrôlant notamment la reprogrammation de la

Figure 3 : Fonctions des CPK d'Arabidopsis thaliana dans l'immunité des plantes.

Plusieurs CPK sont impliquées dans la PTI (en rouge) induite par la perception de PAMP (par exemple flg22) et de DAMP Motifs moléculaires associés aux dégâts (par exemple oligogalacturonides ), et dans ETI (pourpre) induite par des effecteurs avirulents (Avr) lors d'une infection bactérienne ou fongique. Les CPK déclenchent également une défense contre les herbivores (jaune) et les virus ( bleu). Les réponses médiées par la CPK incluent la régulation des gènes dans le noyau, le burst oxydatif, la PCD, la signalisation hormonale, la production de composés antimicrobiens (comme les phytoalexines) et le dépôt de callose. Les substrats directs de CPK sont représentés en orange.(Yip Delormel & Boudsocq, 2019)

transcription, les burst oxydatifs, la signalisation hormonale, la biosynthèse des composés antimicrobiens et la PCD (Fig 3).

A- Les CPKs dans la réponse PTI/ETI

Les CPKs vont ainsi intervenir lors de la réponse immunitaire basale PTI et lors de la réponse plus élaborée et robuste ETI. Récemment, 4 CPKs d’Arabidopsis (CPK4/5/6/11) ont été identifiées en tant que régulateurs positifs redondants des réactions de défense, suite à la perception de motifs moléculaires bactériens et fongiques comme par exemple flg22 pour Pseudomonas syringae (Boudsocq et al. 2010; Dubiella et al. 2013). Ainsi, ces CPKs vont à la fois déclencher l'expression de gènes de défense, tels que NDR1/HIN1-like protein 10 (NHL10), ou la peroxydase anionique PER4 par exemple, mais aussi induire une production des ROS en phosphorylant la RBOHD, une NADPH oxydase (Dubiella et al. 2013; X. Gao and He 2013). La production de ROS pourra conduira à la PCD. Toutes les CPKs ne vont pas contrer les pathogènes, certaines se révèlent être des régulateurs négatifs de la signalisation immunitaire. C’est le cas pour AtCPK28, décrit comme un régulateur négatif de la signalisation immunitaire innée chez les plantules : AtCPK28 phosphoryle directement la Ser/Thr kinase BIK1 nécessaire au déclenchement de la signalisation de défense induite par les PAMPs, ce qui conduit à sa dégradation et donc à une diminution de la production de ROS (Monaghan et al. 2014; Wang et al. 2018).

La régulation des gènes de défense peut être réalisée indirectement par CPK, par l'intermédiaire d'un médiateur. Par exemple, la surexpression transitoire de AtCPK5 ou AtCPK11 déclenche l'accumulation d'AS à travers l'expression du gène de biosynthèse du SA comme SID2 / ICS1 (SA deficient 2 ADMISSION / isochorismate synthase1), conduisant à un large spectre de résistance aux pathogènes (Coca and San Segundo 2010; Dubiella et al. 2013). Par ailleurs il a été montré que AtCPK1 phosphoryle la phénylalanine ammonia-lyase (PAL) in vitro, qui est une enzyme clé dans la défense des plantes, notamment impliquée dans une autre voie de production de AS (Cheng et al. 2001). Bien que le rôle de la phosphorylation de PAL dans la défense ne soit pas clair, cette découverte conforte encore l'idée que AtCPK1 joue un rôle crucial dans l'accumulation d’AS, en réaction de défense. De plus, une accumulation des composés anti microbiens, des phytoalexines ont été

retrouvées dans les cellules de soja surexprimant AtCPK1 (Cheng et al. 2001; Veremeichik et al. 2019).

L’utilisation d’un crible génomique couplé à des analyses génétiques a permis de montrer que l’expression constitutive de la forme active de AtCPK4, AtCPK5, AtCPK6 ou AtCPK11 induisait modérément l’expression d’un gène marqueur de la réponse ETI, le facteur de transcription WRKY46 (X. Gao and He 2013). Les WRKY sont un groupe de facteurs de transcription spécifiques aux plantes, impliqués dans la reprogrammation de la transcription au cours de divers processus biologiques, en particulier dans les réponses de défense (Rhudson et al., 2010). Un grand nombre de gènes d' Arabidopsis WRKYs sont régulés de façon transcriptionnelle lors d'une infection par un agent pathogène (J. Dong, Chen, and Chen 2003) et fonctionnent comme régulateurs négatifs dans la défense des plantes. Des analyses bio-informatiques sur la séquence des acides aminés des WRKY prédisent des résidus putatifs phosphorylables par les CPKs (Cheng et al. 2002; X. Gao and He 2013), indiquant que les CPK pourraient contrôler la reprogrammation transcriptionnelle dans la signalisation ETI vraisemblablement par la phosphorylation de WRKY. De plus, in vitro (X. Gao and He 2013) ont pu mettre en évidence la capacité de AtCPK4, AtCPK5, AtCPK6 ou AtCPK11 à phosphoryler fortement un certain nombre de WRKY, suggérant la possible redondance fonctionnelle des CPKs. Néanmoins, certaines CPKs se révèlent être assez spécifiques d'une cible: c'est le cas notamment pour AtCPK5 qui va interagir avec EXO700b1 une sous-unité du complexe exocyste, un complexe protéique octamérique conservé fixant les vésicules à la membrane plasmique pendant l’exocytose (B. He and Guo 2009). La perte de fonction de EXO70B1 entraîne une mort cellulaire de type hypersensible et les réponses de défenses contres des champignons seront activées (Stegmann et al. 2014; T. Zhao et al. 2015). Or cette défense, activée par EXO70B1 ne dépend que de CPK5 (N. Liu et al. 2017) et non de CPK4, 6 et 11, bien que toutes ces protéines jouent un rôle redondant dans l'immunité (Boudsocq et al. 2010; X. Gao and He 2013) (Voir fig 3).

Les CPKs agissent donc de manière positive ou négative sur de nombreuses cibles contribuant à un schéma complexe de la réponse immunitaire des plantes.

B- Les CPKs et les virus

Si l’importance de l’influx calcique et des CPKs dans les stress abiotiques et biotiques tels que les bactéries et les herbivores commence à être peu à peu découverte, il existe peu de données sur les réponses à l’infection virale par les CPKs, médiée par une signature calcique. Grâce à des expériences de patch clamp, (Schvarzstein 1997) a pu décrire les évènements précoces se produisant lors de la réaction hypersensible déclenchée par le Papaya Mosaic Virus (PMV). L’inoculation du virus dans des protoplastes foliaires isolés de Gomphrena globosa provoque un changement des courants, suggérant que plusieurs ions tels que le K⁺ et Ca^{2 +} contribuent au courant. Cependant, une autre étude plus récente (Shabala et al.

2011) ne constate aucune variation dans le transport du Ca^{2 +} lors de l’ajout du PVX

purifié dans des tissus du mésophylle de différentes espèces de plantes (après avoir

pelé l’épiderme) suggérant que la signalisation par Ca^{2 +} ne semble pas être

essentielle pour reconnaître les stades précoces de l'infection virale. En effet, après avoir infecté par le PVX des mésophylles de plantes hôtes et non hôtes du virus, une technique non invasive de mesure de flux tel que la technique de mesure de flux ionique par microélectrode (MIFE) couplée à des mesures FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging), a permis de mesurer les flux de Ca²⁺ et K⁺. Aucun changement significatif de concentration cytosolique calcique n’a été détecté pendant au moins 50 min après le traitement au PVX, suggérant que la libération du calcium à partir des réserves internes ne semble pas faire partie du mécanisme de transduction du signal

chez les plantes. En revanche, un efflux massif de K⁺ a été mesuré uniquement chez

la plante hôte, 10 min après inoculation virale, montrant une spécificité plante-hôte. Ces données suggèrent que les flux de K⁺ observés sont liés à la capacité de la plante à reconnaître une infection virale compatible et à activer les voies de défense adéquates. L’incubation à plus long terme (32 h) avec le virus purifié a provoqué un efflux net important de K⁺ et de Ca²⁺. Ces résultats montrent deux choses : 1/

l’importance des flux de K⁺ dans les premiers événements de reconnaissance du

PVX et 2/ indique le rôle des systèmes d’efflux de Ca²⁺ dans les cascades en aval de

la réponse des plantes à une infection virale. Cependant, cette étude réalisée sur des feuilles dont l’épiderme a été littéralement « pelé » est à prendre en compte avec précaution dans la mesure où la feuille a subi une blessure conséquente.

Des analyses transcriptomiques ont permis de voir une variation dans le niveau de transcrits de quelques CPKs en réponse aux virus (Valmonte et al. 2014). Cependant, le premier rapport démontrant clairement la participation d'une CPK -la CPK3- à l’immunité basale contre les virus a été établi récemment par notre groupe et a fait l'objet d'une publication dans PLOS Pathogens en 2018. Ce travail constituera la première partie de ma thèse.

C - Focus sur AtCPK3 (Fig 4)

Parmi les CPKs d'Arabidopsis, AtCPK3 présente un intérêt particulier car d'une part cette kinase est présente dans de nombreux compartiments subcellulaires et d'autre part elle est impliquée dans la réponse à de nombreux stress environnementaux, le développement ainsi que diverses voies de défenses. (Fig 4). La CPK3 a été localisée dans le cytoplasme et le noyau par (Dammann et al. 2003; Hooper et al. 2017), mais une association membranaire partielle de CPK3 est également visible dans leurs travaux. De plus, des approches protéomiques l'ont montrée associée à la membrane plasmique, et plus précisément aux Detergent-Resistant Membranes (DRMs) et à la vacuole, AtCPK3 possède des sites de myristoylation et de palmitoylation (Majeran et al. 2018; Yip Delormel and Boudsocq 2019)

AtCPK3 est impliquée dans les stress abiotiques

AtCPK3 a été retrouvé impliquée dans des stress abiotiques, tels que le stress salin. La régulation du déséquilibre cytosolique K⁺ / Na⁺ induit par la salinité est essentielle à la survie des plantes. Chez le mutant nul cpk3, on note une hypersensibilité saline, probablement associée à une réduction de la remobilisation du K⁺ (Mehlmer et al. 2010). En effet, AtCPK3 phosphoryle in vitro Two-pore potassium 1 (TPK1) , un