IX
ANNEXE 2 : MATERIEL ET METHODES
1. Manipulations d’ADN
1.1. Préparation, Purification et analyse des ADN plasmidiques
Les expériences de restriction ainsi que de ligation d’ADN, d’extraction phénol/chloroforme, de précipitation, d’électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide, de transformation de bactéries par choc électrique et de PCR (Polymerase Chain Reaction) ont été réalisées selon les méthodes décrites précédemment (Sambrook et al., 1989). Les expériences d’extraction d’ADN à partir de gels d’agarose ont été réalisées en utilisant le Kit DNA Extraction from Agarose (GE Health Care). Les minipréparations, maxipréparations d’ADN plasmidiques ont été réalisées via le kit DNA miniprep et midiprep ainsi que celui de Maxiprep endotoxine free pour les plasmides déstinés à être injectés en poulet (SIGMA). Toutes les constructions plasmidiques ont été générées en sous-clonant des fragments d’ADN obtenus par restriction de plasmides ou par amplification PCR à partir de plasmides contenant la séquence d’intérêt. Les séquençages de ces constructions ont été réalisés et analysés par la firme Cogenics-online.
1.2. Plasmides utilisés
Différents plasmides ont été utilisés afin de transcrire, in vitro, des sondes ARN antisens. Ces plasmides «sondes» sont repris dans le tableau 5 présenté ci-dessous. Afin de transcrire des ARNm destinés à être injectés dans les embryons de xénope, nous avons utilisé plusieurs constructions préexistantes qui nous ont été gracieusement fournies par les laboratoires qui les ont générées. De plus, nous avons généré différentes constructions destinées à servir de modèles lors de la transcription in vitro d’ARNm. Ces plasmides d’expression sont repris dans le tableau 6 et les plasmides généraux utilisés pour ces constructions ainsi que les plasmides destinés à l’electroporation en embryon de poulet sont présentés dans le tableau 7 dans les pages suivantes.
Tableau 5 : Liste des plasmides sondes
N°
plasmide Plasmide SONDE Espèce Vecteur
Enz.
restriction Polymerase
40 Tubuline Xen leavis pBKS BamHI T3
20 Slug Xen leavis ClaI Sp6
21 Emx1 Xen leavis pGEM-3 HindIII T7
27 Tlx3/Hox11L2 Xen leavis
63 Shh Xen leavis pBKS EcoRI T7
88 Neurogenin Xen leavis BamHI T3
X
102 Xiro3 Xen leavis pGemT NcoI Sp6
111 Xash3 Xen leavis pBKS NotI T3
114 Ngn2 Xen leavis
117 CLC-K Xen leavis pBSK NotI T7
157 Krox20 Xen leavis pGemT EcoRI T7
276 Sox3 Xen leavis pBSK- EcoRI T7
315 Nephrin Xen leavis SalI T7
354 Xash1 Xen leavis pCRII SpeI T7
437 TH Xen leavis pBSK NotI T7
550 BLIMP1/ Prdm1 Xen leavis
569 Prdm12 Xen leavis pCMV-sport6 SalI T7 572 Prdm8 Xen leavis
575 Prdm13 Xen leavis pBSK(-) NotI T7
592 Dbx1 Xen leavis pCMV-sport6 SalI T7
593 Nkx6.2 Xen leavis pBS-KSII EcoRI T7
600 Lbx1 Xen leavis pBS-KSII SalI T7
601 Evx1 Xen leavis pBSK SalI T7
603 Vsx1 Xen leavis pGemT SalI T7
604 En1 Xen leavis ? XbaI Sp6
606 Gad1 Xen leavis Sp6
607 En2 Xen leavis pBKS XbaI T3
611 Prdm8 Xen Trop SalI T7
612 Ptf1a Xen leavis pGemT NotI T7
615 Gallus Prdm12 Poulet pBSK+ EcoRI T7
616 Zebra Prdm12 Zebra phage!!!
617 FoxP1 Xen leavis pCS2 BamHI T7
618 FoxP2a Xen leavis pCS2 EcoRI T7
619 FoxN4 Xen leavis ? NotI T7
623 Prdm14 Xen Trop pCS105 EcoR1 T3
624 Arx Xen leavis pBKS BamHI T3
624b Arx Xen leavis pBKS BamHI T4
625 Arx2 Xen leavis SalI T7
627 FoxD3 Xen leavis pBSK- EcoRI T7
633 Zebra Prdm12 Zebra pGemT NotI T7
654 Mafb Xen leavis pCS2 BamHI T7
662 lbx1 Xen leavis SalI T7
663 Lim1b Xen leavis NcoI Sp6
664 Lim1a Xen leavis XhoI T7
665 Lmx1b Xen leavis SalI T7
666 Olig3 Xen leavis Kpn1 T7
674 Nkx6.1 Xen leavis XhoI T7
3 Ngn2 Mus musculus BamHI T7
42 Prdm12 Mus musculus T3
99 Pax2 Mus musculus BamHI T3
131 Prdm13 Mus musculus NdeI T7
139 Nephrin1 Mus musculus NcoI Sp6
140 Nephrin3 Mus musculus NcoI Sp6
3 PAX6 Chicken EcoRI T7
5 CHX10 Chicken pBSK+ XhoI T7
6 En1 Chicken pBSK+ EcoRI T3
7 Evx1 Chicken EcoRI T3
8 Dbx1 Chicken pBSK+ EcoRI T7
11 Lhx5 Chicken NotI Sp6
22 Glyt2 Chicken pBSKII BamHI T7
XI
Tableau 6 : Liste des plasmides d’injections
N° Nom plasmide Espèce Vecteur Enz.
restriction Polymerase
44 LacZ Xen laevis pCS2 NotI Sp6
50 ICD Xen laevis pCS2-MT NotI Sp6
51 NeuroD Xen laevis pCS2-MT NotI Sp6
52 Neurogenin Xen laevis pCS2-MT NotI Sp6
54 Su(H)DBM Xen laevis pCS2 NotI Sp6
55 Su(H) Xen laevis pCS2
56 Su(H)Ank Xen laevis pCS2 NotI Sp6
66 XShh Xen laevis ? BamHI T7
114 Xiro3 Xen laevis pCS2 NotI Sp6
117 Xash3 Xen laevis p64T XbaI Sp6
123 StuDelta Xen laevis pCS2 NotI Sp6
272 GFP Xen laevis p565 XhoI T7
483 Xash1 Xen laevis p64T XbaI Sp6
562 Ptf1a Xen laevis pCS2 NotI Sp6
623 Prdm14 Xen laevis pCS105 NsiI T6
721 Nkx6.2 Xen laevis pCS2 NotI Sp6
722 Dbx1 Xen laevis pCS2 NotI Sp6
729 Prdm12 Xen laevis pCS2 NotI Sp6
730 Prdm12_Myc Xen laevis pCS2_Myc NotI Sp6
735 Ptf1a_GR Xen laevis pCS2 NotI Sp6
737 Prdm12ΔSET Xen laevis pCS2 NotI Sp6
738 Vsx1 Xen laevis pCS2 NotI Sp6
739 PRDM8-Trop Xen laevis pCS2 NotI Sp6
740 Evx1 Xen laevis ? HindIII T7
741 Prdm12_Flag Xen laevis pCS2_Flag NotI Sp6
742 FoxN4 Xen laevis pCS2 NotI Sp6
743 Prdm12ΔZNF Xen laevis pCS2 NotI Sp6
744 Gsh2 Xen laevis pCS107 Nsi1 Sp6
745 Gsh2_VP16 Xen laevis pCS2 SacII Sp6
746 Zf-Prdm12 Xen laevis pCS2 NsiI Sp6
748 Gsh2_VP16_GR Xen laevis pCS2 SacII Sp6
749 Dbx1-VP16 Xen laevis pCS2 NotI Sp6
750 Prdm12-VP16 Xen laevis pCS2_VP16 NotI Sp6
751 Prdm12-GFP Xen laevis pCS2 NotI Sp6
752 Pax6-Myc Xen laevis pCS2 NotI Sp6
753 Dn_Pax6_Flag (idem #834) Xen laevis pCS2_Flag Xba1 Sp6 754 Neurogenin2_GR (Ngn2_GR) Xen laevis pCS2 SfiI T3 755 Ptf1a//bHLH/Ngn2_GR Xen laevis pCS2 NotI Sp6 756 Ptf1a//C1/C2_GR Xen laevis pCS2 NotI Sp6 784 Flag-Prdm12-GR Xen laevis pCS2_Flag NotI Sp6 813 GR_Ptf1a_VP16 Xen laevis pCS2_VP16
827 pCS2_Flag_mPRDM13 Mus Musculus pCS2-Flag NotI SP6 828 pCIG_Flag_mPRDM13 Mus Musculus pCIG
829 pCS_NKX6.1 Xen laevis pCS108 AscI Sp6
832 pCS2_Pax6 Xen laevis pCS2 NotI Sp6
XII
849 EnR_PRDM12Znf alone_Flag Xen laevis pCS2-Flag NotI Sp6
Tableau 7 : Liste des plasmides généraux et d’electroporation poulet
N° plasmide Nom plasmide Vecteur
2 pBluescript pBSK
7 pCS2 pCS2
8 pCS2-MT (Myc-tag) pCS2
140 pGEX_4T3 (insert EcoRI) pGEX
303 pCS2-GR pCS2
304 pCS2-Flag-GR pCS2
503 pCIG vide pCIG
508 pCRII_PRDM12 (p1153-p1155) sous clone pCRII 509 pCRII_PRDM12 (p1154-p1155) sous clone pCRII
516 pCIG-Prdm12 pCIG 543 pCS2-Dbx1 pCS2 544 pCAGG-deltaCMV-Dbx1 pCAGG 545 5kb Dbx1-NLS-LacZ 551 pCAG-HA-Dbx1-ires-GFP pCAGG 552 pCAGG-mDelta1 pCAGG 553 pCAGG-Jagged1 pCAGG 558 pCRII_mPRDM12 pCRII
560 pGEX_4T3_PRDM12 (P.Inj# 729) pGEX 561 pGEX_4T3_PRDM12∆SET (P.Inj# 737) pGEX 562 pGEX_4T3_PRDM12∆ZnF (P.Inj# 743) pGEX 575 PRDM13 full length (fantom E130110K18)
585 mPRDM13_pGEMT sous clone pour pCS2 pGEMT 586 mPRDM13_pGEMT sous clone pour pCIG pGEMT
591 pCAGG_Nkx6.1 pCAGG 592 pGST_PRDM3 pGST 593 pGST_PRDM16 pGST 582 pCIG_EGFP pCIG 828 pCIG_P13 pCIG 808 pCIG-Flag_P13 pCIG 827 pCS2-flag_P13 pCS2 832 pCS2_Pax6 pCS2 842 pCS2-flag_P13ΔPR pCS2 40 Prdm12 pCAGG_IRES_Puro (NRI) 41 Prdm12∆ZnF pCAGG_IRES_Puro (NRI) 42 Prdm12∆PR pCAGG_IRES_Puro (NRI)
43 Prdm12-F117A pCAGG_IRES_Puro (NRI)
44 Prdm12-G115A pCAGG_IRES_Puro (NRI)
45 Prdm12-Z1- pCAGG_IRES_Puro (NRI)
46 Prdm12-Z2- pCAGG_IRES_Puro (NRI)
XIII
2. Transcription et traduction in vitro
Les plasmides servant de modèles pour la transcription in vitro sont préalablement digérés par une enzyme de restriction reconnaissant un site unique en aval de la séquence à transcrire. Le produit de digestion est analysé sur gel et l’ADN linéarisé est ensuite purifié par une extraction au phénol/chloroforme, une extraction au chloroforme puis est précipité à l’éthanol. Il est ensuite resuspendu dans de l’H2O traitée au DEPC (diéthyl pyrocarbonate, Sigma) à une concentration d’environ 1µg/µl.
2.1. Transcription des sondes ARN antisens marquées non radioactivement
La réaction de transcription des sondes ARN antisens est réalisée à l’aide du kit MEGAscript® (Ambion) en utilisant l’ARN polymérase adaptée (T3, T7 ou SP6) en présence de digoxigénine-11-UTP (Roche) ou de fluoréscéine-11-UTP (Roche). Le mélange réactionnel est incubé à 37°C pendant 4 heures. L’ADN plasmidique est ensuite digéré par l’ajout de DNAse I et incubation de 15 minutes à 37°C. La sonde ribonucléotidique antisens est ensuite purifiée par chromatographie d’exclusion sur billes Sephadex G50 Medium (Amersham Biosciences) équilibrées dans une solution de Tris10mM-EDTA 1mM et 0,1% SDS. La sonde ribonucléotidique antisens est précipitée à l’éthanol et le culot est resuspendu dans 20µl d’H2O traitée au DEPC. La qualité de l’ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. La sonde est ensuite diluée dans du tampon d’hybridation à 1µg/µl et conservée à -20°C.
2.2. Transcription d’ARNm synthétiques
La réaction de transcription d’ARNm synthétique est réalisée à l’aide du kit mMESSAGE mMACHINE® (Ambion) en utilisant l’ARN polymérase adaptée (T3, T7 ou SP6). Le mélange réactionnel est incubé à 37°C pendant 2 heures. L’ADN plasmidique est ensuite digéré et éliminé par l’ajout de DNAse I et incubation de 15 minutes à 37°C. L’ARNm synthétique est extrait au phénol/chloroforme et est purifié par chromatographie d’exclusion sur billes Sephadex G50 Medium (Amersham Biosciences) équilibrées dans une solution aqueuse de TE (10mM Tris, 1mM EDTA) et 0,1% SDS. L’ARNm synthétique est ensuite précipité à l’éthanol. Le culot est resuspendu dans 20µl d’H2O traitée au DEPC et conservé à -80°C. La qualité de l’ARNm est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. 2.3. Transcription – traduction couplées in vitro
XIV radioactive) à l’aide du kit "TNT SP6 Coupled Transcription-Translation System®" (Promega) en suivant les instructions de la firme. Les produits de réaction sont analysés par électrophorèse sur gel 10% SDS-PAGE. Après migration, le gel contenant des réactions marquées radioactivement, est fixé 20 minutes dans une solution aqueuse contenant 10% d’acide acétique et 10% de méthanol. Le gel est séché 1 heure et placé dans une cassette au contact d’un film autoradiographique. Le film est développé après une nuit à température ambiante. Pour le gel contenant une réaction froide (protéine couplé à un Tag par exemple), il suit un processus de Western Blot standart.
3. Oligos morpholinos antisens
Les morpholinos (Gene Tools) sont des oligomères analogues synthétiques de l’ADN capable de bloquer spécifiquement l’épissage ou la traduction d’un ARNm cible. Afin d’inhiber la traduction, les séquences des morpholinos sont choisies au niveau du site d’initiation de la traduction ou dans la région 5’ non traduite située immédiatement en amont du site d’initiation de la traduction de l’ARNm ou peuvent également être choisies au niveau d’un site de jonction Intron/Exon pour bloquer l’épissage de l’ARNm (MO_Splicing). Les morpholinos, d’une longueur de 25 résidus, sont resuspendus dans de l’H2O à une concentration d’environ 1mM. L’absorbance de 5µl de la solution de morpholinos est lue à 265nm dans 995µl d’une solution 0,1M d’HCl. La concentration de la solution de morpholinos est calculée selon la formule suivante : A265 x 200/ε. Où ε est l’absorbance d’une mole de morpholinos. Les stocks de morpholinos dilués sont aliquotés et conservés à -80°C. Juste avant l’injection, les morpholinos sont dégelés et incubés 5 minutes à 65°C afin de permettre leur complète mise en solution. Après décongélation, les morpholinos peuvent être gardés à 4°C durant 2 semaines. Les séquences des différents morpholinos utilisés sont reprises dans le tableau 8 présenté ci-dessous.
Tableau 8 : Liste des Morpholinos
N° MO Nom morpholino Sequence
17 Contrôle standard_MO CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA
54 Ngn2 TGGTTAGCCCCAATGTTGCACTGAC 78 PRDM12 CCGGCAGCACCGAGCCCATCATTAA 81 EVX1 TGAGCATCTCCTTCCTGCCTTCCAT 86 DBX1 GAGCTAAGAGGCTTGGGAACATCAT 87 PAX6 GCTGTGACTGTTCTGCATGTCGAG 88 IRX3 CCGGAGGCACAGGGAATCCCCTTTT 89 PTF1a_MO CCAACTGCTCCAGGACCGTTTCCAT 91 P13_MO1 ACCCCCAGTAGTTGGCAGTGACAGA
92 P13_MO2 (splicing) AGAGACAATAGATTTGTACCTGGCC
XV
4. Manipulations xénope
4.1. Obtention et manipulation d’embryons 4.1.1. Obtention des embryons de Xenopus
4.1.1.1. Dissection des testicules
Les mâles sont anesthésiés dans une solution de 0,1% de 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS 222; Sigma) avant d’être décapité. Afin d’isoler les testicules, une incision est pratiquée au niveau de l’abdomen à travers la peau et les muscles de façon à exposer les viscères. Les testicules sont débarrassés des corps adipeux. Les testicules de X. laevis sont récupérés dans 2ml d’une solution de stockage (Leibovitz : L15). Dans cette solution, les spermatozoïdes restent en vie plusieurs jours à 4°C.
4.1.1.2. Induction de la ponte
Les xénopes de l’espèce X. laevis adultes (Nasco et Rennes) sont élevés dans des aquariums dont l’eau, à une température de 18°C, est renouvelée une fois par jour. L’ovulation est induite par l’injection, dans le sac lymphatique dorsal d’une femelle pigmentée ou albinos d’hCG (hormone gonadotropine chorionique humaine; Sigma). Les femelles X. laevis reçoivent 500U d’hCG la veille du jour désiré de la ponte. La ponte dure de 8 à 16 heures. Dès le début de la ponte et environ toutes les heures, les femelles sont squeezer (massage abdominale qui mime l’accouplement avec le mâle), ce qui permet de récolter les œufs à « sec » (sans milieu), et de favoriser la fécondation in vitro.
4.1.1.3. Fécondation in vitro et culture des embryons
XVI d’incubation (14°C, 18°C ou température ambiante). Les embryons sont récoltés au stade désiré défini selon les tables de Nieuwkoop and Faber (Nieuwkoop and Faber, 1967).
4.1.2. Micro-injections
Afin de les débarrasser de leur gangue, les embryons de X. laevis sont traités 8-10 minutes dans une solution 2% de cystéine (Sigma; 2% cystéine dans du MBS 0,1X, pH 8,0). Ils sont ensuite rincés dans du milieu 0,1X MBS et sont placés dans la solution d’injection contenant du Ficoll (Sigma; 1% Ficoll dans du 0,5X MBS). Les micro-injections sont réalisées sous une loupe binoculaire à l’aide d’un micromanipulateur MM3 (Märhauser Wetzlar) et d’un microinjecteur (PicoSpritzer II). Les aiguilles en verre sont obtenues en étirant des capillaires en verre (Harvard Apparatus) à l’aide d’une étireuse P87 (Sutter Instrument). Un volume de 5nl de solutions d’ARNm synthétiques ou de morpholinos est injecté dans les embryons. Les concentrations des ARNm synthétiques utilisées varient de 0,2ng/µl à 200ng/µl, permettant d’injecter respectivement de 1pg à 1ng dans un volume de 5nl. Les stocks de morpholinos à une concentration de 40ng/5nl (environ 1mM) sont dilués de manière à injecter 20 à 5ng de morpholinos dans un volume de 5nl. Les volumes injectés sont calibrés sous la loupe binoculaire, à l’aide d’un réticule, en ajustant le diamètre de la goutte injectée par variation du temps d’injection. Environ deux heures après l’injection, les embryons de X. laevis sont transférés dans du milieu 0,1X MBS afin qu’ils puissent continuer leur développement.
4.1.3. Manipulation des embryons et dissection de calottes animales
Afin de sélectionner les embryons albinos vivants de X. laevis et de déterminer leur stade de développement, ceux-ci sont colorés dans une solution contenant un colorant vital bleu : le Nile blue (0,01% Nile blue, 45mM K2HPO4, 5mM KH2PO4, pH 7,8).
Dans le cas d’injections d’ARNm codant pour des protéines de fusion inductibles aux glucocorticoïdes, de la dexaméthasone (Sigma), un analogue de glucocorticoïde a été ajouté au milieu de croissance des embryons (0,1X MBS) au stade désiré à une concentration finale de 10µM. Un stock de dexaméthasone est préparé dans de l’éthanol à une concentration de 10mM et est conservé à -20°C.
XVII 4.1.4. Fixation et révélation de l’activité enzymatique de la β-galactosidase
Les embryons sont placés dans des tubes en verre de 5ml et sont fixés une heure dans du MEMFA (0,1M MOPS, 2mM EGTA, 1mM MgSO4, 3,7% formaldéhyde, pH 7,4). Ils sont ensuite transférés dans de l’éthanol et conservés à -20°C. Les embryons injectés avec de l’ARNm codant pour la β-galactosidase sont fixés 40 minutes dans du MEMFA et lavés dans du tampon phosphate (23mM K2HPO4, 77mM KH2PO4, pH 6,3) pendant 15 minutes. Ils ont ensuite incubés à température ambiante dans du tampon de coloration (23mM K2HPO4, 77mM K2HPO4, 10mM K3Fe(CN)6, 10mM K4Fe(CN)6) contenant 0,15% de X-Gal (5-bromo 4-chloro-3indolyl-β- galactopyranoside ; Bioline) ou 0,15% de Red-Gal (6-chloro 3-indolyl-β-D-galactoside ; Research Organics) faisant apparaître un marquage respectivement bleu ou rouge. Les embryons sont ensuite fixés de nouveau 20 minutes dans du MEMFA et transférés dans de l’éthanol, dans lequel ils sont conservés à -20°C.
4.2. Hybridations in situ sur embryons entiers
XVIII RNase T1 (Sigma; 10u/ml) pendant 30 minutes à 37°C pour les sondes induisants un bruit de fond plus prononcé. Les embryons sont ensuite lavés 2 x 30 minutes dans du SSC 0,2x. La sonde est détectée à l’aide d’un anticorps dirigé contre la digoxigénine. Pour cela, les embryons sont lavés 2 x 15 minutes à température ambiante dans du tampon MAB (100mM acide maléique, 0,8% NaOH, 150mM NaCl, pH 7,5). Les embryons sont incubés 1 heure à température ambiante dans une solution de MAB contenant 2% de BMB (Boeringher Mannheim Blocking; Roche) et 20% de sérum d’agneau (Invitrogen) et ensuite 4 heures dans la même solution additionnée de l’anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline (Roche) dilué à 1/2000. Les embryons sont lavés dans du tampon MAB 4 x 10 minutes, sous agitation, à température ambiante, ainsi qu’un lavage supplémentaire durant la nuit à 4°C, de manière à éliminer l’excès d’anticorps. Les embryons sont lavés 2 x 5 minutes à température ambiante dans du tampon AP (Alkaline Phosphatase buffer; 100mM Tris-HCl pH 9,5, 50mM MgCl2, 100mM NaCl, 0,1% Tween-20). La réaction chromogénique est réalisée en présence de 4,5 µl de NBT (Roche; Nitro Blue Tetrazolium, 75mg/ml dans une solution aqueuse de diméthylformamide 70% concentrée) et de 3,5µl de BCIP (Roche; 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphate, 50mg/ml dans du diméthylformamide 100%) pour 1ml de tampon AP. Ces réactifs génèrent un précipité de couleur bleue foncée, après réaction avec la phosphatase alcaline. La réaction est arrêtée par incubation des embryons dans une solution de MEMFA. Le marquage non spécifique est éliminé par plusieurs lavages dans l’éthanol. Les embryons sont ensuite conservés dans du MEMFA. Pour les doubles hybridations in situ, les deux sondes, l’une marquée à la digoxigénine et l’autre à la fluorescéine sont hybridées simultanément et visualisées séquentiellement à l’aide des anticorps correspondants couplés à la phosphatase alcaline (Roche). La première sonde marquée à la fluorescéine est révélée par une réaction chromogénique à l’aide de BCIP, générant un précipité de couleur turquoise. La réaction est arrêtée par deux lavages de 30 minutes dans du méthanol 100%. Les embryons sont ensuite lavés 5 x 10 minutes dans du tampon MAB et incubés en présence de l’anticorps dirigé contre la digoxigénine comme décrit précédemment. Après lavage des embryons dans du tampon MAB, la seconde sonde est révélée au NBT et BCIP comme décrit plus haut. Les images ont été obtenues à l’aide d’une caméra vidéo Sony DXC9100P adaptée sur une loupe binoculaire Leica MZFLIII et Olympus.
4.3. Sections d’embryons
XIX dans du 1x PBS) et de 140 µl de glutaraldéhyde 25%. Le mélange se fait sur glace pour diminuer la vitesse de polymérisation provoquée par la glutaraldéhyde. Ensuite, l'embryon analysé en hybridation in situ et préalablement équilibré dans la solution de gélatine - albumine est déposé sur la couche solidifiée. Une seconde couche est coulée au-dessus de la première. Une fois la solution solidifiée, un cube est découpé dans la gélatine autour de l’embryon et collé sur le support du vibratome (752/M vibroslice tissue cutter, Campden Instruments Limited) selon l’orientation désirée. Les sections réalisées présentent une épaisseur comprise entre 30 et 45µm. Elles sont montées entre lames et lamelles dans une solution de 90% glycérol dans du 1x PBS et sont conservées à 4°C. Les images ont été obtenues à l’aide d’une caméra vidéo Sony DXC9100P adaptée sur un microscope Zeiss Axioskop 2.
4.4. Fixation et immunomarquage sur explants de calottes animales
Les calottes sont préfixées 30 min dans du MEMFA, avant d’être rincé puis redécoupées dans du PBS1X. Les caps sont ensuites refixées dans du MEMFA 30min, avant d’être déshydratées progressivement 5min (25%, 50%, 75% et 100%) dans du DENT’s (80%Methanol/20%DMSO) puis stockées à -20°C.
Les caps sont ensuites réydratées 5min dans du DENT ‘s (100%, 75%, 50% et 25%), avant d’être rincées au TBS-Tween 0,1%, 3x10min. Elles sont ensuite incubées pendant 4h dans du TBS-Tween 0,1%-5%BSA puis toute la nuit à 4°C avec l’anticorps primaire dilué dans du TBS-Tween 0,1%-5%BSA. L’anticorps est ensuite retiré et les caps sont rincées dans du Tween 0,1%-0,2%BSA 5x1h. Les caps sont denouveau bloquées 2h dans du TBS-Tween 0,1%-5%BSA, avant d’être incubées toute la nuit à 4°C avec l’anticorps secondaire dilué dans du TBS-Tween 0,1%-5%BSA. Les caps sont ensuite lavées 5x1h puis lavées toute la nuit dans du TBS-Tween 0,1%-0,2%BSA. Elles sont alors lavées dans du tampon APB puis suivent une révélation au NBT/BCIP identique à l’Hybridation in situ. L’arrêt de la réaction se fait par une incubation MEMFA 20min suivi de rinçage à l’éthanol 100% pour éliminer le bruit de fond avant d’être montées entre lame et lamelle (voir .
4.5. Coloration du cartilage au Bleu d’Alcian
XX 95%. Les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante dans une solution contenant 2% de KOH. Pour ce faire, ils sont successivement lavés pendant 10 minutes dans des solutions contenant 75% 50% puis 25% d’éthanol dans la solution de 2% KOH et 3 x dans la solution de 2% KOH. Ensuite, les embryons sont lavés successivement avec des solutions contenant 20%, 40% puis 60% de glycérol dans la solution de 2% KOH durant 1 heure sous agitation. Finalement, les embryons sont lavés avec une solution contenant 80% de glycérol dans la solution de 2% KOH durant une nuit sous agitation. Les embryons sont ensuite conservés dans du 80% de glycérol/2% KOH à 4°C. Cette technique a été employée pour une coloration avec le laboratoire de monsieur Denis Lafontaine.
4.6. RT-qPCR sur les ARN totaux d’embryons de xénope
Les embryons ont été injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec différents ARNm et/ou morpholinos. Les explants de calottes animales (environ 25 par échantillon analysé) sont disséqués au stade blastula dans un milieu Steinberg 1X (Steinberg 10X: NaCl 580mM; KCl 6,7mM; Ca(NO2)3 3,4mM; MgSO4 8,3mM; HEPES 30mM; Kanamycine sulfate 1g/l; pH 7,8) et sont cultivés dans ce même milieu. Une fois arrivés au stade voulu, les explants sont récoltés et conservés à -80°C. Les ARN totaux sont extraits en utilisant le kit RNAspin Mini RNA Isolation kit (GE Healthcare). Une PCR est ensuite réalisée sur les ARN totaux avec les amorces Histone 4 (H4) afin de s’assurer de l’élimination complète de l’ADN génomique. Après vérification, les ADNc (ADN complémentaire) sont synthétisés avec le kit iScript cDNA synthesis (Biorad). 500ng d’ARN totaux sont utilisés par réaction de transcription inverse. La réaction de qPCR a été réalisée en utilisant le kit MESA GREEN qPCR MasterMix Plus for SYBR® Assay (Eurogentec) suivant le protocole recommandé par la firme. La quantité de fragments PCR amplifiés à partir des ADNc synthétisés provenant des ARNm des gènes d’intérets, a été détectée grâce à un lecteur StepOne Plus et analysée avec le programme associé. La valeur obtenue de chaque échantillon a été normalisée avec la valeur de GAPDH, un gène ubiquitaire. Les paires d’amorces utilisées sont reprises dans le tableau 9 suivant.
Tableau 9: Liste des primers RT-QPCR
Fw/Rev Gène Espèce Séquence des amorses
Fw Histone H4_Fw X.Laevis CGGGATAACATTCAGGGTATCACT Rev Histone H4_Rev X.Laevis ATCCATGGCGGTAACTGTCTTCCT
Fw Neurogenin_Fw X.Laevis GGCGCGTTAAAGCTAACAAC Rev Neurogenin_Rev X.Laevis GCGCAAGGTCTCTATCTTGG
Fw GAPDH Fw X.Laevis TAGTTGGCGTGAACCATGAG
XXI Fw Myt1 X.Laevis TTGGGATGGTCCCATAGACT
Rev Myt1 X.Laevis TCTTGCATCTCCTGCATCTC
Fw Gad1 X.Laevis ATGGGCGTCTTACTCCAATG
Rev Gad1 X.Laevis ATGTCTACATGGCGACCACA
Fw Lim1 X.Laevis ATCGCTGCTTCACCAGGGGC
Rev Lim1 X.Laevis GGCAGTCTGACCCGAGCAGC
Fw Lbx1 X.Laevis GCAGTGCTCACCATCTC
Rev Lbx1 X.Laevis CCACATCCTCCTGATCC
Fw Prdm13 X.Laevis CTGCCGACACATGATGAAAAAGG
Rev Prdm13 X.Laevis AGATTTTGGGGGAGGCAGAAAAG
Fw Pax2 X.Laevis CAGTCAGCACGCCTGGGCAT
Rev Pax2 X.Laevis TGCCTCCAGTTGCTGCTGAGT
Fw Tlx3 X.Laevis GCCAACAAGTACAAGTGCACAG
Rev Tlx3 X.Laevis CAGGAGCCAGACTCACATTGAC
Fw VGlut1 X.Laevis TCAGTGATTTGCTTGTTACGTGTAT
Rev VGlut1 X.Laevis CATCCTCATGGATATTTTCTACACC
Fw H4 X.Laevis CGGGATAACATTCAGGGTATCACT
Rev H4 X.Laevis ATCCATGGCGGTAACTGTCTTCCT
Fw En1 X.Laevis AGGCCCCGAACAGCCTTCACT
Rev En1 X.Laevis TCCTGCTCCTTCTCCTGCACAG 4.7. Analyse de protéines
4.7.1. Extraction des protéines totales
Les explants de calottes animales (30 par échantillon analysé) sont lysés 10 minutes sur glace dans 150µl de tampon de lyse (50mM Tris-HCl pH 7,5, 150mM NaCl, 0,5% NP40, 20µM PMSF). Une pastille d’inhibiteurs de protéases (Complete Mini EDTA-free, Roche) est ajoutée pour 10ml de tampon de lyse. Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 5 minutes à 4°C et les surnageants sont récupérés. Un volume de 100µl est prélevé à partir de chaque échantillon, auquel est ajouté 25µl de tampon Laemmli 5x (tampon Laemmli 5x : 0.5M Tris-HClpH 6.8, 5% β-Mercaptoethanol, 0.1% Bromophenol Blue, 20% Glycerol). Ces échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot.
4.7.2. Western blot
XXII Elles sont ensuite incubées en présence de l’anticorps primaire à la concentration appropriée (Anti-Myc, à 1/10000; Anti-Flag, à 1/1000) dilué dans du TBST + 3-5% de lait en poudre, pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. La membrane est ensuite lavée 5 x 5 minutes dans du TBST à température ambiante et incubée avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Anti-souris, Jackson immunosource, à 1/30000; Anti-lapin (Protéine A-peroxydase), Sigma, à 1/10000) dilué dans du TBST + 3-5% lait en poudre, pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. La membrane est lavée 5 x 5 minutes dans du TBST à température ambiante. Les protéines sont détectées par chémiluminescence à l’aide du kit ECL™ Western Blotting ou ECL plus™ Western Blotting (GE Healthcare) sur film autoradiographique (Super Rx, Fujimedical). Après révélation des protéines, les membranes PVDF peuvent être réutilisées 1 à 2 x afin de détecter d’autres protéines sur la même membrane. Pour ce faire, les anticorps primaires et secondaires utilisés lors de la première détection sont éliminés de la membrane sans pour autant affecter les protéines transférées préalablement sur la membrane. La membrane est d’abord lavée 10 minutes dans du TBST et incubée 30 minutes à 55°C dans une solution de stripping (3,8g de Tris, 10g de SDS, 500ml d’eau milli Q, pH 6,7) à laquelle 750µl de β-Mercaptoethanol est ajouté par 50ml de solution de stripping. Ensuite, la membrane est lavée 3 x 10 minutes dans du TBST. La suite de la procédure est identique à celle décrite ci-dessus à partir de l’étape de saturation (1 heure dans du TBST + 3-5% de lait en poudre) jusqu’à la détection chemiluminescente des protéines.
5. Manipulations Poulet
5.1. Obtention et manipulation d’embryons de poulet
5.1.1. Obtention et préparation des embryons de poulet
XXIII 5.1.2. Micro-injections et électroporation
Les embryons de poulet sont électroporés au stade HH13-14 ce qui correspond à 48h de développement à 37°C. Avant de procéder à l’électroporation, une fenêtre doit être découpée sur le dessus de l’oeuf à l’aide de ciseaux. Sous binoculaire, nous vérifions le stade de l’embryon. Au stade HH12-13, la séance d’électroporation peut commencer. Les aiguilles en verre, réalisées avec le même matériel que pour le xénope, sont remplies des différents ADN d’intérêt, dilués à 1, 2 ou 4 µg/µl dans de l’H2O endotoxines free et 1/5 de Fast Green
(permettant de visualiser l’injection). Cette aiguille est ensuite fixée à l’injecteur Eppendorf qui permet de délivrer l’ADN d’intérêt dans le tube neural à une pression se situant entre 60-100hPa. Ensuite, les deux électrodes reliées à l’électroporateur Btx ECM 830, sont placées de part et d’autre de l’embryon et vont permettrent par la diffusion de 4 pulses de 20 volt durant 50ms ces pulses étant espacés de 400ms, l’electroporation à proprement dite. L’œuf est ensuite refermé à l’aide d’une large bande de Scotch solvant Free puis replacé dans l’incubateur à 37°C. Avant d’être arrété au stade approprié.
5.1.3. Manipulation, fixation et sections des embryons de poulet
Les embryons électroporés ayant atteints le stade souhaité HH24-25 (48H post-électroporation) et HH28-29 (4jrs post-post-électroporation), sont sortis de l’œuf, placées dans du PBS1X à 4°C (sur glace de préférence) puis sont disséqués. En effet, afin de favoriser les expériences d’hybridation in situ et d’immunomarquage, les embryons sont débarassés des diverses membranes qui les entourent ainsi que des visères et de l’allantoïde, avant d’être fixé dans du PBS1X/4%PFA Froid.
XXIV
Tableau 10: Procédure de fixation pour immunomarquage en embryons de
poulet
Developmental stages Fixation Times Cryoprotection Times Freezing Temperature e2.5 15’ 1h30’ -55°C e3.5 20’ 2h~3h -55°C e4.5 30’ 4h -55°C e5.5 45’ ON -55°C e6.5 1h ON -55°CPour les expériences d’Hybridation in situ, les embryons sont fixés soit 15 min pour ensuite laisser place à la révélation LacZ, soit fixés directement 2h à 4°C en PBS1X/4%PFA. Après Hybridation in situ, les embryons pourront être coupés au cryostat, selon la même technique que vu précédemment pour les immunomarquages.
5.2. Révélation ßGal en embryon de poulet entier
Les embryons une fois fixés 15 min (e < 9,5), 20min (e 9,5), 30min (e10,5) ou 45min (e11,5), sont rincés 2x5min en PBS stérile et RNAse Free, puis 1x en tampon β-gal (stérile et RNase Free : Na2HPO4 60 mM, NaH2PO4 40 mM K1, 10 mM MgCl2 4mM) ; avant d’être incubés toute la nuit à 30°C ou quelques heures à 37°C dans la solution de révélation du ßGal (20 µL de K3Fe(CN)6 à 200 mM ; 20 µL de K4Fe(CN)6 à 200 mM et 10 µL de X-Gal à 40 mg/mL par ml de solution). Les embryons sont enfin rincés plusieurs fois en PBS1X puis refixés à 4°C en PBS1X/4%PFA puis stockés ou alors redirigé vers l’Hybridation in situ. 5.3. Hybridation in situ sur embryon de poulet
XXV pendant une nuit à 65°C et en présence de 1mg de ribosonde pour 1 ml de solution. Le lendemain les embryons sont lavés pendant 2h à 65°C sous agitation (formamide 50%, Tween 0,1%, 1% SDS, SSC3X pH 7) et rincés 5 min en PBS1X. Ils sont ensuite incubés au moins 2 heures sous agitation dans une solution de satuation (PBS 0,1% triton 10% Serum de Veau Fœtal). Les anticorps anti-Dig couplés à la phosphatase alcaline sont dilués (1/2000) dans la solution de saturation et incubés avec les embryons pendant une nuit, à 4°C, sous agitation si possible. Les embryons sont de nouveau rincés plusieurs fois dans du PBS 0,1%triton (30 minutes, puis 1 rinçage/heure, 2 à 3 fois). Les embryons sont équilibrés dans le tampon NTMT équivalent de l’APB (Tris-base 0,1M pH9,5, MgCl2 50 mM, NaCl 0,1M) pendant 30min et l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline est révélée en présence du substrat BCIP (3ml/ml) et du chromophore NBT (3ml/ml) dilués dans le NTMT, pendant quelques heures à l’obscurité et sous agitation. Après que le marquage soit bien monté, les embryons vont subirent 2 lavages en PBS1X puis être fixés en PFA 4% et conservés à 4°C ou être coupés comme vu précédemment.
5.4. Marquage Immuno-Fluo sur section d’embryon de poulet
Les sections sont sorties du -80°C pour être réhydratées 5 min en PBS1X, puis incubées pendant 30min dans du tampon de blocage : PBS1X-TritonX-100 0,1% - 10% SVF (sérum de veau fœtal) ou HS (Horse serum) puis toute la nuit à 4°C dans ce même tampon contenant le ou les anticorps primaires dilués (liste des anticorps primaires utilisés dans le tableau 11). Le lendemain (travailler dans le noir si possible), les sections sont rincées 3x45min à 1h, dans du PBS1X-TritonX-100 0,1%, puis incubées 30min à Tp° ambiante, dans le tampon de blocage contenant le ou les anticorps secondaires dilués (généralement au 1/2000 pour les anticorps conjugés à l’Alexa-Fluor d’invitrogen voir tableau 12 ci-après). Elles sont ensuite rincées 3x45min à 1h au PBS1X-TritonX-100 0,1% et sont prêtent pour le montage et l’observation au microscope confocal.
Tableau 11: Liste des anticorps primaires
N°Ac Anticorps Firme Ref Dilution Ac Iiaire
stockag e remarques 8 tubulin acetylated sigma clone 6-11 B-1 mouse -20°C 10 Tuj BIII
Tubulin covance mouse -20°C
20 GFP roche clones 7.1
and 13.1 1/100 mouse -20°C
32 BrdU sigma 1/1000 mouse -20°C
XXVI
45 PH3 millipore 06-570 1/200 rabbit
49 GFP Invitrogen A6455 1/1000 Rabbit -20°C 57 caspase 3 active BD Pharmingen 559565 1/250 rabbit
58 VGlut1 abcam ab72311 1/1000 rabbit -20°C
59 GAB1 abcam ab59362 1/1000 rabbit -20°C
60 Calbindin D28k swant CB38 1/5000 rabbit -20°C Gift Frédéric Clotman 61 Parvalbum
in millipore MAB1572 1/1000 mouse -20°C
Gift Frédéric Clotman 62 FoxP1
(pas top) R&D systems AF4534 1/2000 goat -20°C
63 En1 DSHB clone 4G11 1/10 mouse 4°C
65 Pax6 DSHB 1/200 mouse 4°C
66 Islet1 DSHB clone
40.2D6 1/5000 mouse 4°C
70 FoxP1 abcam ab32010 1/1000 mouse -20°C
74 NRIP3 abcam ab74150 rabbit -20°C
75 NRXN3 abcam ab18523 rabbit -20°C
77 Evx1 DSHB clone 99.1-3A2 1/10 mouse 4°C
78 NeuN millipore MAB377 1/1000 mouse -20°C
82 FoxP4 abcam ab17726 rabbit -20°C
85 Pax2 (pas top) abcam ab38738 1/500 rabbit -20°C
utiliser l'aliquot de Frédéric Clotman au
1/200
86 GAD67 abcam ab26116 mouse -20°C
87 Irx3 abcam ab25703 1/500 rabbit -20°C
88 Dbx2 (pas
top) abcam ab25554 1/1000 rabbit -20°C
utiliser l'aliquot de Pierani au
1/200
Pax6 covance PRB-278P 1/4000 rabbit 4°C
Nkx6.1 -20°C
bHLHb5 Santa Cruz sc-6045 1/1000 goat -20°C
Arx BCBCore ab2815 1/500 rabbit -20°C
Pou3F1 Dr. Meijer 1/400 rabbit -20°C
Pou4F1 Santa Cruz sc-8429 1/500 mouse -20°C Nurr1 Santa Cruz sc-990 1/200 rabbit -20°C FoxP4 Genway 18-003-43528 1/500 rabbit -20°C HNF6 Santa Cruz sc-13050 1/50 Rabbit -20°C
MafA -20°C
MafB Santa Cruz sc-10022 1/50 goat 4°C Pax2 covance PRB-276P 1/100 Rabbit -20°C
Gift Frédéric Clotman
95 PRDM12
(pas bon) Santa Cruz 1/200 mouse -20°C
106 Tlx3 1/10-20000 Guinea pig -20°C 107 Tlx3 1/5-10000 Rabbit -20°C 108 Lmx1b 20000 1/10- Guinea pig -20°C 109 Lmx1b
C.Birchmeier Thomas Müller
1/5- Rabbit -20°C
XXVII
10000
115 PRDM8 Don RIKEN hyb8506SF.1 1/2000 Mouse 4°C Gift Riken
116 PRDM8 1/2000 Rabbit 4°C
117 PRDM8 Don laboratoire Dr. Ross 1/2000 Guinea pig 4°C Gift ROSS lab Lbx1 C.Birchmeier Thomas
Müller 1/10000 rabbit -20°C
Gift Thomas Müller Lhx1/5 DSHB 4F2 1/1000 Mouse 4°C Gift Frédéric Clotman
Tableau 12: Liste des anticorps secondaires
N° Ac Anticorps Espèce Firme Ref
3 mouse alexa 488 goat Invitrogen A11017
4 mouse alexa 594 goat Invitrogen
5 rabbit texas red donkey Amersham W2034U
6 mouse Cy3 (vert) sheep sigma C2181
8 mouse AP goat sigma A3562
10 rabbit AP goat chemicon AP307A
11 rabbit alexa 488 goat Invitrogen A11008 12 rabbit alexa 594 goat Invitrogen A11012 20 goat alexa 594 donkey Invitrogen A11058 21 guinea-pig alexa 488 goat Invitrogen A11073 22 rabbit alexa 350 goat Invitrogen A21068 23 goat alexa 350 donkey Invitrogen A21081 24 guinea-pig alexa 594 goat Invitrogen A11076
6. Microscopie fluo ou confocale
Des explants de calottes animales provenant d’embryons injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec des ARNm codant pour des protéines fusions à un tag Flag ont été récoltés et fixés 1h dans du MEMFA. Les explants ont ensuite été brièvement lavés dans du PBS1X et sont incubés 5 minutes dans du PBS1X contenant du DAPI (1µg/ml, Sigma) avant d’être de nouveau lavé 2 x 5 minutes dans du PBS1X. Les explants sont montés entre lames et lamelles dans du milieu de montage compatible à la fluoresecence tels que du Vectashield (Vectorlabs) ou du DAKO Fluoromount.
XXVIII La fluorescence a alors été observée à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Zeiss AxioSkop2 ou Axio Imager 2, logiciel Axiovision) ou un microscope confocal (Zeiss LSM710, logiciel ZEN2010).
