V.1 Annexes – Materiel et Méthodes

V.1 Annexes – Materiel et Méthodes

V.1.1 Matériel

V.1.1.1 Plasmides utilisés pour générer les constructions

pCS2: Le vecteur pCS2 (Turner and Weintraub, 1994) a été conçu pour permettre l’expression de protéines en embryons de xénope via la génération d’ARNm synthétique injectable. Son utilisation est aussi adaptée pour générer des ARN antisens marqués à la digoxigénine (dig-UTP) permettant d’effectuer des expériences d’hybridation in situ sur embryons de xénope. Il existe différentes variantes du vecteur pCS2. Le pCS2MT qui contient une séquence codant pour l'épitope Myc ce qui permet de générer des constructions chimériques reconnues par l'anticorps anti-Myc. Le pCS2Flag qui contient une séquence codant pour l'épitope Flag ce qui permet de générer des constructions chimériques reconnues par l'anticorps anti-Flag. Le pcS2NLSMT qui contient une séquence codant à la fois pour l'épitope Myc et le motif "nuclear localised site" (NLS) ce qui permet de générer des constructions chimériques d'une part reconnues par l'anticorps anti-Myc et d'autre part pouvant transloquer dans le noyau.

pPC97 et pPC86 : Les vecteurs pPC97 et pPC86 (Chevrey and Nathans, 1992) sont les plasmides utilisés pour la recherche de partenaires protéiques par la technique du double hybride en levures. Les vecteurs pPC97 et pPC86 nous ont été aimablement fournis par le Dr.

R. Van Wayenberg (IRIBHM). Le vecteur pPC97 permet l’expression de la protéine appât en fusion avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 (Gal4DBD) et le pPC86 permet l’expression de la protéine proie en fusion avec le domaine d’activation de Gal4 (Gal4AD).

pSG424 : Le vecteur pSG424 (Sadowski et al., 1989) contient le domaine de liaison à l'ADN Gal4(1-147) permettant l'expression de constructions de protéines de fusion. Ce plasmide est utilisé en cellules de mammifère dans des expériences de gène rapporteur sous le contrôle d'un promoteur contenant des sites UAS.

pGL3 : Le vecteur "pGL3-Promoter Vector" contient le gène luc⁺ , originaire du Photinus pyralis, qui code pour une activité luciferase "firefly" permettant des expériences de gène rapporteur en cellules de mammifère. Il contient contient un promoteur SV40 en aval du gène rapporteur permettant ainsi une expression basale de la luciferase. Ces expériences sont rapides, sensibles et quantitatives.

pBKSII : Le plasmide pBKSII (Stratagene) est un vecteur de clonage utilisé dans diverses techniques (amplification, séquençage). Son site de clonage multiple est flanqué respectivement en 5' et 3' des sites reconnnus par les polymérases T7 et T3 permettant la synthèse d'ARN synthétique. Le site de clonage multiple ansi que les deux sites T7 et T3 sont compris dans la partie N-terminale du gène lacZ. Lorsqu'un insert est incorporé dans le site de clonage multiple, les bactéries forment des colonies de couleur blanche. Dans le cas contraire, elles forment des colonies de couleur bleue.

V.1.1.2 Les constructions plasmidiques

Les constructions suivantes nous ont été aimablement fournies :

Constructions Origines Rangement*

p64T-XAsh3 Turner and Weintraub, 1994 Pl.ex.117

pBKSII Stratagene Pl.gx.2

pBKS-Elrc Lamar et al., 2001 Pl.sd.343

pBKS-XfragilXmental NIBB EST CLONE XL022n18 Pl.sd.294

pBKS-XNOS NIBB EST CLONE XL091118 Pl.sd.212

pBKS-XPLP1 EST IMAGE CLONE 6878162 Pl.sd.298

pBKS-XSox3 Penzel et al., 1997 Pl.sd.276

pBKS-XSoxD Mizuseki et al., 1998 Pl.sd.47

pCMV-p300-HA van Grunsven et al., 2003 Pl.gx.417 pCMV-SPORT6-XIA1 EST IMAGE CLONE 4959608 Pl.sd.314 pCMV-SPORT6-NZF1Xt XenTropEST CLONE xtbs28M16 Pl.sd.242 pCMV-SPORT6.1-XNeuroligin3 EST IMAGE CLONE 7020561 Pl.sd.290

pACT-mCtBP2-VP16-FLAG van Grunsven et al., 2003 Pl.gx.156 pCMX-hCtBP1-VP16-FLAG Kumar et al., 2002 Pl.gx.157 pCS105-XAxotrophin NIBB EST CLONE XL488n03 Pl.sd.293 pCS107-NZF2Xt XenTropEST CLONE TNeu029i09 Pl.sd.243 pCS107-NZF3Xt XenTropEST CLONE THdA030n24 Pl.sd.245

pCS2+ Turner and Weintraub, 1994 Pl.gx.7

pCS2-XAth3 Perron et al., 1999 Pl.ex.181

pCS2-Xebf3 Dubois et al., 1998 Pl.ex.125

pCS2-XNgnr-1 Ma et al., 1996 Pl.ex.52

pCS2-XNeuroD Lee et al., 1995 Pl.ex.51

pCS2-XNotchICD pCS2-X-Delta-1^stu pCS2-N-tubuline

Chitnis et al., 1995 Pl.ex.50 Pl.ex.123 Pl.sd.40 pCS2-LacZ

pCS2-Su(H)DBM

Wettstein et al., 1997 Pl.ex.44 Pl.ex.54 pCS2-MYC-XMTGR1 Koyano-Nakagawa et al., 2005 Pl.ex.289

pCS2-MYC-XMxi1 Klisch et al., 2005 Pl.ex.424

pCS2-MYC-XMyT1 pCS2-XMyT1

Bellefroid et al., 1996 Pl.ex.118 Pl.ex.98

pCS2-XPak3-Myr Souopgui et al., 2002 Pl.ex.425

pCS2p-XCRIPT NIBB EST CLONE XL293n04 Pl.sd.292

pCx-pCAF-FLAG van Grunsven et al., 2003 Pl.gx.418

pGL3 Promega Pl.gx.54

pGL3-LUC-HumanIA1promoter Mellitzer et al., 2006 Pl.gx.416

pPC97 Chevrey and Nathans, 1992 Pl.gx.164

pPC86 Chevrey and Nathans, 1992 Pl.gx.165

pPC97-NT-PIE8 Perez-Morga et al., 1999 Pl.gx.426

pSG424 Sadowski et al., 1989 Pl.gx.212

pSG424-Gal4DBD-XMyT1- Nterminal

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1 pSG424-Gal4DBD-XMyT1- Cterminal

Bellefroid et al., 1996 Pl.gx.208 Pl.gx.209 Pl.gx.210

* Pl.gx.: plasmides généraux, Pl.ex.: plasmides d'expression, Pl.sd.: plasmides sondes

Dans les cas de constructions de fusion, telles que les fusions contenant les séquences codant pour les épitopes FLAG et MYC, le domaine de liaison à l'ADN Gal4DBD et le motif NLS, les ADNc d'intérêt ont été amplifiés par PCR sans l’ATG initiateur de la traduction. Toutes les constructions utilisant les vecteurs pSG424, pCS2, pPC97 constituées d'un fragment ou de la séquence complète de XMyT1 ont été générées à partir de la construction pCS2-XMyT1 (Bellefroid et al., 1996). Toutes les constructions constituées d'un fragment ou de la séquence complète de XIA1 ont été générées à partir de l'EST IMAGE CLONE 4959608. Toutes les constructions ont été vérifiées par séquençage et par digestion.

Constructions Rangement*

pBKSII/NEO/DTA-Myt1L Pl.gx.425 pBLCAT2/pGL3-Luc⁺- 3AG3T(5X) Pl.gx.230

pBLCAT2/pGL3-Luc⁺ Pl.gx.231

pCS2-FLAG-XCtBP Pl.ex.280 pCS2-MYC-NLS-XMyT1RC5' Pl.ex.198

pCS2-MYC-NLS-XMyT1RC3' Pl.ex.199

pCS2-MYC- XMyT1ΔXCtBP Pl.ex.403

pCS2-MYC-NLS-ZFXIA1 Pl.ex.413

pCS2-MYC-XIA1 Pl.ex.408 pCS2-NLS-VP16-ZFXIA1 Pl.ex.414

pCS2-XIA1 Pl.ex.410 pPC97-CeXMyT1 Pl.gx.431 pPC97-RCrNZF1 Pl.gx.432 pPC97-RCrNZF3 Pl.gx.433 pPC97-RCXMyT1 Pl.gx.67 pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut1XCtBP Pl.gx.422

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut2XCtBP Pl.gx.423 pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut3XCtBP Pl.gx.424 pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut12XCtBP Pl.gx.328 pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut13XCtBP Pl.gx.329 pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut23XCtBP Pl.gx.330

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut123XCtBP Pl.gx.331

* Pl.gx.: plasmides généraux, Pl.ex.: plasmides d'expression, Pl.sd.: plasmides sondes

● Construction plasmidique en pBSKII

Le vecteur de ciblage pour l'invalidation du gène Myt1-L (pBKSII/NEO/DTA-Myt1L) comprend un bras long de 21,8 Kb compris dans le 3^ème intron de la partie codante du gène Myt-L et un bras court de 1,9 Kb compris dans l'intron situé en amont du 1^er exon de la partie codante du gène Myt1-L permettant la recombinaison homologue, une cassette de sélection positive Neomycin "NEO" (issue du plasmide pMC1NeopolyA3854) permettant de remplacer les trois premiers exons contenant l'ATG initiateur de traduction et une cassette de sélection négative "DTA" (fragment A de la Toxine Diphtérique provenant du plasmide pBL- DTA, Adachi et al., 1995) permettant d'éliminer les cellules ES ayant incorporé et subi une insertion aléatoire du vecteur de ciblage dans le génome.

● Constructions plasmidiques en pCS2

pCS2-MYC-NLS-RCXMyT1-5': nous avons amplifié par PCR un fragment de XMyT1 (AA383-AA644) codant pour le 1^er groupe à doigts à zinc et la 1^ère moitié de la région centrale (comprenant les deux premiers sites recrutant XCtBP) à l'aide des amorces 5’(EcoRI) G AAT TCA GAC ACC ATG AGG AAG AGC (amorce 358) et 5' (XbaI) TCT AGA TTT GCT GGG AGT ATC CTG CTG (amorce 360). L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit TA-cloning^® d’Invitrogen dans le vecteur pCR2^® puis extrait par digestion EcoRI/XbaI et intégré dans le pCS2MT.

pCS2-MYC-NLS-RCXMyT1-3': nous avons amplifié par PCR un fragment de XMyT1 (AA638-AA975) codant pour la 2^ème moitié de la région centrale (comprenant le troisième site recrutant XCtBP) et le 2^ème groupe à doigts à zinc à l'aide des amorces 5’(EcoRI) G AAT TCA CAG CAG GAT ACT CCC AGA AAA (amorce 361) et 5' (XbaI) TC TAG ATT CTT TCC AGC AAA AGA AGC (amorce 359). L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit TA-cloning^® d’Invitrogen dans le vecteur pCR2^® puis extrait par digestion EcoRI/XbaI et intégré dans le pCS2MT.

pCS2-MYC- XMyT1ΔXCtBP: nous avons obtenu cette construction à partir de la construction pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut123XCtBP qui contient les trois mutations ponctuelles

dirigées contre les trois motifs recrutant XCtBP au niveau de sa région centrale située entre les deux groupes à doigts à zinc. Le fragment d'intérêt a été extrait par digestion via les sites de restriction BsaI/BsgI et ensuite intégré dans le pCS2-MYC-XMyT1 substituant ainsi le fragment sauvage concerné.

pCS2-FLAG-XCtBP: nous avons amplifié par PCR la séquence codante pour la protéine complète dépourvue de l'ATG initiateur de traduction à partir du vecteur proie pPC86 contenant l'ADNc identifié comme candidat positif lors du criblage par double hybride en levure. Nous avons utilisé les amorces 5’(StuI) AGG CCT GAT AAA CAC AAA GTG AAG AGG C (amorce 523) et 5'(XbaI) TCT AGA CTA CTG ATC AGT AGG AAT TTC TC (amorce 524). L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit TA-cloning^® d’Invitrogen dans le vecteur pCR2^® puis extrait par digestion StuI/XbaI et intégré dans le pCS2 contenant l’épitope FLAG.

pCS2-MYC-XIA1: nous avons amplifié par PCR la séquence codante pour la protéine complète dépourvue de l'ATG initiateur de traduction à l'aide des amorces 5'(EcoRI) G AAT TCG CCT AAA GGT TTC CTG GTC A (amorce 703) et 5'(XbaI) TCT AGA GAA GTT GTT GCG GGC TCA GCA (amorce 704). L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit PGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion EcoRI/XbaI et intégré dans le pCS2 contenant l’épitope MYC.

pCS2-MYC-NLS-ZFXIA1: nous avons amplifié par PCR la séquence codante pour la protéine complète dépourvue de l'ATG initiateur de traduction à l'aide des amorces 5'(EcoRI) G AAT TCA CCC CTG GGC GAG TTC ATC (amorce 715) et 5'(XbaI) TCT AGA GAA GTT GTT GCG GGC TCA GCA (amorce 704). L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit PGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion EcoRI/XbaI et intégré dans le pCS2 contenant l’épitope MYC et le motif NLS.

pCS2-NLS-VP16-ZFXIA1: nous avons amplifié par PCR la séquence codante pour la protéine complète dépourvue de l'ATG initiateur de traduction à l'aide des amorces 5'(EcoRI) G AAT TCA CCC CTG GGC GAG TTC ATC (amorce 715) et 5'(EcoRI) GA ATT CCA GGC CGG GCG CAC GGG (amorce 716). L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit PGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion

pCS2-XIA1: nous avons digéré par EcoRI/Xba1 l'insert contenant la séquence complète de XIA1 et l'avons cloné dans le pCS2 en utilisant les mêmes sites de restriction.

● Constructions plasmidiques en pSG424

Afin d'empêcher l'interaction, les motifs d'interaction avec XCtBP présents dans la région centrale de XMyT1 ont été mutés à savoir le 1^er motif “PGDLS” (aa489-aa493) en

"PAAAS", le 2^ème motif PENLS (aa632-aa636) en "PAAAS" et le 3^ème motif “TLDLS”

(aa656-aa660) en “TAAAS”. Les mutations ponctuelles, générées par PCR, substituent le motif sauvage en un site de restriction NotI. Les amorces utilisées sont : pour le 1^er motif 5’GA AAA CAA CAG CAG CCT GCG GCG CGC TCC AAA A (amorce 437) et 5'GCT TTT G GA GGC GGC CGC AGG CTG CTG TTG TTT C (amorce 438), pour le 2^ème motif 5’GG GAG ATG CCA GCG GCC GCC AGT ACC AAA C (amorce 439) et 5'G TTT GGT ACT GGC GGC CGC TGG CAT CTC CC (amorce 440), pour le 3^ème motif 5’GAA AAT GGC ACT GCG GCC GCG AGC ATG AAC (amorce 441) et 5'GTT CAT GCT CGC GGC CGC AGT GCC TTT TC (amorce 442).

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut1XCtBP: cette construction, constituant la région centrale de XMyT1 dépourvue de ses doigts à zinc, contient une mutation ponctuelle dirigée contre le premier motif recrutant XCtBP. Cette construction s'est effectuée en deux étapes.

D'abord deux PCR sont réalisées comprenant d'une part l'amorce 5'(BamHI) GG ATC CCC AGA TCA CAT GAG AAA CAG (amorce 551) et l'amorce 438, d'autre part l'amorce 437 et l'amorce 5'(XbaI) TC TAG ATT GGA GAG GAA TTT CAG TTT (amorce 552). Ensuite, le produit de ces deux premières PCR a été combiné pour effectuer une troisième PCR à l'aide des amorces 551 et 552 afin de reconstituer l'insert complet de la région centrale comprenant la mutation ponctuelle. L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit pGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion BamHI/XbaI et intégré dans le pSG424.

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut2XCtBP: cette construction, constituant la région centrale de XMyT1 dépourvue de ses doigts à zinc, contient une mutation ponctuelle dirigée contre le deuxième motif recrutant XCtBP et s'est effectuée en deux étapes. D'abord deux PCR sont réalisées comprenant d'une part les amorces 551 et 440, d'autre part les amorces

439 et 552. Ensuite, le produit de ces deux premières PCR a été combiné pour effectuer une troisième PCR à l'aide des amorces 551 et 552 afin de reconstituer l'insert complet de la région centrale comprenant la mutation ponctuelle. L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit pGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion BamHI/XbaI et intégré dans le pSG424.

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut3XCtBP: cette construction, constituant la région centrale de XMyT1 dépourvue de ses doigts à zinc, contient une mutation ponctuelle dirigée contre le troisième motif recrutant XCtBP et s'est effectuée en deux étapes. D'abord deux PCR sont réalisées comprenant d'une part les amorces 551 et 442, d'autre part les amorces 441 et 552. Ensuite, le produit de ces deux premières PCR a été combiné pour effectuer une troisième PCR à l'aide des amorces 551 et 552 afin de reconstituer l'insert complet de la région centrale comprenant la mutation ponctuelle. L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit pGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion BamHI/XbaI et intégré dans le pSG424.

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut12XCtBP: cette construction, constituant la région centrale de XMyT1 dépourvue de ses doigts à zinc, contient deux mutations ponctuelles dirigées contre les premier et deuxième motifs recrutant XCtBP et s'est effectuée en deux étapes. D'abord deux PCR sont réalisées sur la construction pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1- mut1XCtBP comprenant d'une part les amorces 551 et 440, d'autre part les amorces 439 et 552. Ensuite, le produit de ces deux premières PCR a été combiné pour effectuer une troisième PCR à l'aide des amorces 551 et 552 afin de reconstituer l'insert complet de la région centrale comprenant les deux mutations ponctuelles. L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit pGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion BamHI/XbaI et intégré dans le pSG424.

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut13XCtBP: cette construction, constituant la région centrale de XMyT1 dépourvue de ses doigts à zinc, contient deux mutations ponctuelles dirigées contre les premier et troisième motifs recrutant XCtBP et s'est effectuée en deux étapes. D'abord deux PCR sont réalisées sur la construction pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1- mut1XCtBP comprenant d'une part les amorces 551 et 442, d'autre part les amorces 441 et 552. Ensuite, le produit de ces deux premières PCR a été combiné pour effectuer une

région centrale comprenant les deux mutations ponctuelles. L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit pGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion BamHI/XbaI et intégré dans le pSG424.

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut23XCtBP: cette construction, constituant la région centrale de XMyT1 dépourvue de ses doigts à zinc, contient deux mutations ponctuelles dirigées contre les deuxième et troisième motifs recrutant XCtBP et s'est effectuée en deux étapes. D'abord deux PCR sont réalisées sur la construction pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1- mut2XCtBP comprenant d'une part les amorces 551 et 442, d'autre part les amorces 441 et 552. Ensuite, le produit de ces deux premières PCR a été combiné pour effectuer une troisième PCR à l'aide des amorces 551 et 552 afin de reconstituer l'insert complet de la région centrale comprenant les deux mutations ponctuelles. L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit pGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion BamHI/XbaI et intégré dans le pSG424.

pSG424-Gal4DBD-RCXMyT1-mut123XCtBP: cette construction, constituant la région centrale de XMyT1 dépourvue de ses doigts à zinc, contient trois mutations ponctuelles dirigées contre les premier, deuxième et troisième motifs recrutant XCtBP et s'est effectuée en deux étapes. D'abord deux PCR sont réalisées sur la construction pSG424-Gal4DBD- RCXMyT1-mut23XCtBP comprenant d'une part les amorces 551 et 438, d'autre part les amorces 437 et 552. Ensuite, le produit de ces deux premières PCR a été combiné pour effectuer une troisième PCR à l'aide des amorces 551 et 552 afin de reconstituer l'insert complet de la région centrale comprenant les trois mutations ponctuelles. L’insert a été sous- cloné à l’aide du kit pGEM-T Vector SystemI^® de Promega dans le vecteur pGEM-T^® puis extrait par digestion BamHI/XbaI et intégré dans le pSG424.

● Construction plasmidique en pPC97

pPC97-CeXMyT1: nous avons amplifié par PCR la séquence codante pour la protéine complète Myt1 de C.elegans à l’aide des amorces 5’(Sal1) GG TCG ACT GCC CAT CAG GAA AAG CTT GCA (amorce 829) et 5' (Not1) GGC GGC CGC TTG CTG CAT TTG GAA TTG TGT C (amorce 830). Le produit PCR a directement été digéré par SalI et NotI puis ligué dans le pPC97 en utilisant ces mêmes sites de restriction.

pPC97-RCrNZF1: nous avons amplifié par PCR la séquence codante pour la région centrale de la protéine NZF1 de rat à l’aide des amorces 5’(Sal1) GG TCG ACT GCT GCT GCA GAA AAA CTG GCA (amorce 824) et 5' (Not1) GGC GGC CGC CTT TTT GCT TTC CTT GCT TGA GGG T (amorce 825). Le produit PCR a directement été digéré par SalI et NotI puis ligué dans le pPC97 en utilisant ces mêmes sites de restriction.

pPC97-RCrNZF3: nous avons amplifié par PCR la séquence codante pour la région centrale de la protéine NZF3 de rat à l’aide des amorces 5’(Sal1) GG TCG ACT GAA AAG TTG GCA ATG ACC CAG (amorce 826) et 5' (Not1) GGC GGC CGC GAG ATC TCG TGT GTG GAG CTT (amorce 827). Le produit PCR a directement été digéré par SalI et NotI puis ligué dans le pPC97 en utilisant ces mêmes sites de restriction.

pPC97-RCXMyT1: nous avons amplifié par PCR la séquence codante pour la région centrale situé entre les deux groupes à doigts à zinc de XMyT1 à l’aide des amorces 5’(Sal1) G TCG ACA AGA TCA CAT GAG AAA CAA CAG (amorce 144) et 5'(Not1) GC GGC CGC GGA GAG GAA TTT CAA TTT AAA (amorce 145). L’insert a été sous-cloné à l’aide du kit TA-cloning^® d’Invitrogen dans le vecteur pCR2^® puis extrait par digestion SalI/NotI et intégré dans le pPC97.

Les linéarisations pour générer des ARNm synthétiques micro-injectables et des ARN antisens pour les hybridations in situ

Constructions Types* Enzymes de restriction

ARN polymérase

Elrc Pl.sd.343 EcoRI T7

Ep.Keratin Pl.sd.36 EcoRI SP6

FLAG-XCtBP Pl.ex.280 NotI SP6

LacZ Pl.ex.44 NotI SP6

MYC-XIA1 Pl.ex.408 NotI SP6

MYC-XMxi1 Pl.ex.424 NotI SP6

MYC-XMyT1 Pl.ex.118 NotI SP6

MYC-XMyT1ΔXCtBP Pl.ex.403 ApaI SP6

MYC-XMyT1RC5' Pl.ex.198 NotI SP6

MYC-XMyT1RC3' Pl.ex.199 NotI SP6

MYC-ZFXIA1 Pl.ex.413 NotI SP6

Notch/ICD Pl.ex.50 NotI SP6

N-tubuline Pl.sd.40 NotI SP6

NZF1Xt Pl.sd.242 SacII T7

NZF2Xt Pl.sd.243 EcoRI T7 NZF3Xt Pl.sd.245 EcoRI T7

Sox3 Pl.sd.276 EcoRI T7

SoxD Pl.sd.47 NotI T7

Su(H)DBM Pl.ex.54 NotI SP6

XAsh3 Pl.ex.117 XbaI SP6

XAth3 Pl.ex.181 NotI SP6

XAth3 Pl.sd.41 NotI T7

XAxotrophin Pl.sd.293 SalI T3

XCRIPT Pl.sd.292 BamHI T3

XDelta1^stu Pl.ex.123 NotI SP6

Xebf3 Pl.ex.125 NotI SP6

XIA1 Pl.ex.410 NotI SP6

XIA1 Pl.sd.314 SalI T7

XfragilXmental Pl.sd.294 NotI T7

XMTGR1 Pl.sd.297 NcoI T7

XMyT1 Pl.ex.98 NotI SP6

XNeuroD Pl.ex.51 NotI SP6

XNeuroD Pl.sd.69 XbaI T7

XNeuroligin Pl.sd.290 SmaI T7

XNgnr1 Pl.sd.88 BamHI T3

XNgnr1 Pl.ex.52 NotI SP6

XNOS Pl.sd.212 SmaI T7

XNotch1 Pl.sd.85 ClaI SP6

XPak3 Pl.ex.425 NotI SP6

XPak3 Pl.sd.115 EcoRI T7

XPLP1 Pl.sd.298 EcoRI T7

XSo3 Pl.sd.276 EcoRI T7

XSoxD Pl.sd.47 NotI T7

ZFXIA1-NLS-VP16 Pl.ex.414 NotI SP6

* Pl.inj : plasmides d'expression, Pl.sd : plasmides sondes

V.1.2 Produits, milieux et solutions utilisés

V.1.2.1 Produits

35S Methionine Amersham Isopropanol Merck

3-amino-1,4-triazole

(3AT) Qbiogene KCl Merck

P³²UTP (800ci/nmole) Amersham Kit de séquençage BigDye

Terminator Biovallée

Acétate de sodium Sigma

aldrich Kit MEGAscript® Ambion

Acétone Merck Kit Midiprep® Qiagen

Acide acétique Merck Kit mMESSAGE

mMACHINE^TM Ambion

ADN sperme de saumon Sigma

aldrich Kit TA-Cloning® Invitrogen

Agar Difco Kit Western Blot ECL+ Amersham

Agarose Bioline Klenow Enzyme Bioline

Antibiotique Ampicilline Sigma

aldrich Lait écrémé en poudre Gloria Nestlé Antibiotique Tétracycline Sigma

aldrich Leu, Trp, His, Ade sulfate Qbiogene Bactéries de souche XL1-

Blue Stratagène LiCl Sigma aldrich

Bacto Trypon Difco Luciferase Assay System kit Promega

Bacto Yeast Extract Difco Machine PCR Biozyme

BCIP Boehringer Membrane Nitrocellulose

Hybond Bio-rad

Billes de verre 425- 600µm

Sigma

aldrich Membrane PVDF Hybond Bio-rad β-mercapto éthanol Sigma

aldrich Méthanol Merck

Bromure d'éthidium Sigma

aldrich MgSO4 Sigma aldrich

BSA Invitrogen MOPS Sigma aldrich

Cell Lysis Reagent Promega NaCl Sigma aldrich

CHAPS Sigma

aldrich NaOH Merck

Chloroforme Merck NBT Boehringer

CPRG Roche Nile Blue Sigma aldrich

Cuvette électroporation

0,2cm Bio-rad M-MLV Reverse Transcriptase Gibco

DEPC Merck MS222 Sandoz

Detergent-Compatible

Protein Assay Bio-rad Persulfate d'ammonium Sigma aldrich D-MEM Invitrogen pGEM-T Vector SystemI Promega

DMSO Invitrogen Phenol Merck

DNAse I Roche Protéinase K Sigma aldrich

dNTP Bioline PVP-40 Sigma aldrich

DTT Sigma

aldrich QIAquick® Purification kit Qiagen

EDTA Sigma

aldrich QIAquick® Extraction kit Qiagen Electroporateur

GenePulser II Bio-rad qPCR Core kit SYBR GreenI Eurogentec Enzymes de Restriction Fermentas Penicillin/Streptomycin Invitrogen

Enzymes de Restriction Roche Random Primingkit Invitrogen Enzymes de Restriction Bioline RNAse A et RNAse T Sigma aldrich

Ethanol Merck RNAseOUT Gibco

FBS Gibco RNAsin Roche

Ficoll Merck SC-His-Leu-Trp-Ade sulfate Biosciences

Film autoradiographique Kodak SDS Merck First Strand Buffer Gibco Sépharose G50 Amersham

Formaldéhyde Merck T4 DNA Ligase Bioline

Formamide Merck TEMED Serva

FUGENE 6 Invitrogen TNT Sp6 Coupled Reticulocyte

Lysate System Promega

Gélatine Merck Triethanolamine Sigma aldrich

Glucose Merck TriPure Roche

Glutaraldéhyde Sigma

aldrich Tris Merck

Glycérol Merck Triton 100X Sigma aldrich

HCG Sigma

aldrich Trypsin Gibco

HCl Merck Tween 20 Sigma aldrich

Héparine Sigma

aldrich UTP-digoxigenin Roche

HEPES Merck X-gal Bioline

Hot GoldStart polymerase Eurogentec XL1-Blue Bactery Stratagene Hyperladder III Bioline Yeast Nitrogene Base Biosciences Inhibiteur de protéases

EDTA free Roche

V.1.2.2 Milieux de culture

● Milieu LB (Luria Bertani) pour culture de bactéries :

Bacto Trypton (50g), Bacto Yeast extract (25g), NaCl (25g), pour un milieu solide ajouter 10g d’Agar, qsp 5000ml puis ajuster le pH à 7,2, autoclaver pendant 20 minutes à 120°C (Conservation à température ambiante).

● Milieu SD pour culture de levures en milieu sélectif :

SD sans Histidine/Leucine/Tryptophane/Adénine sulfate (0,2g), Yeast Nitrogene Base (3,4g), Glucose (10g), compléments en acides aminés en fonction des besoins (Adénine sulfate à 10mg/ml (5ml), Histidine à 10mg/ml (5ml), Leucine à 10mg/ml (5ml), Tryptophane à

10mg/ml (5ml)), pour un milieu solide ajouter 10g d’Agar, qsp 500ml H2O MilliQ puis ajuster le pH à 5,8 et autoclaver pendant 20 minutes à 120°C (Conservation à 4°C).

● Milieu YPD (Yeast Peptone Dextrose) pour culture de levures :

Bacto Trypton (10g), Bacto Yeast extract (5g), Glucose (10g), Adénine sulfate (0,2g), pour un milieu solide ajouter 10g d’Agar, qsp 500ml H2O MilliQ puis ajuster le pH à 5,8 et autoclaver pendant 20 minutes à 120°C (Conservation à 4°C).

● Milieu YT (Yeast Triptone) pour préparation de bactéries électrocompétentes :

Bacto Trypton (8g), Bacto Yeast extract (5g), NaCl (5g), qsp 5000ml puis ajuster le pH à 7,2 et autoclaver pendant 20 minutes à 120°C. (Conservation à 4°C)

V.1.2.3 Solutions

● Gel d’acrylamide pour migration protéique :

Gel running à 10% : acrylamide 30% (4ml), Tris à 1,5M (3ml), SDS 10% (120µl), APS 10%

(120µl), TEMED (12µl), qsp 12ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

Gel stacking : acrylamide 30% (1064µl), Tris à 1M (2ml), SDS 10% (80µl), APS 10%

(80µl), TEMED (8µl), qsp 8ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Tampon alcaline phosphatase (AP) pour HIS sur embryons de xénope :

Tris à 1M (50ml), MgCl2 à 1M (25ml), NaCl à 5M (10ml), Tween 20 20% (2,5ml), qsp 500ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Tampon de chargement d'ADN/ARN :

Glycerol (25 ml), Tris-HCl pH7,6 1M (1ml), EDTA 0,5M (2ml), Bromophenol blue (50mg), Xylene cyanol (50mg) ou orange G (50mg), qsp 50ml H2O.

● Solution cystéine 2% pour lyser la gangue des œufs de xénope :

L cystéine hydrochloride H2O (10g), ajuster à pH 7,8, qsp 500ml H2O MilliQ (A préparer fraîchement)

● Tampon Denhart’s 100X pour xénope :

BSA (2g), PVP-40 (2g), Ficoll 400 (2g), qsp 100ml H2O DEPC (Conservation à -20°C).

● Solution de dépigmentation pour embryons de xénope :

SSC 20X (2,5ml), H2O2 30% (340μl), Formamide (5ml), qsp 10ml H2O.

● Solution de fécondation pour œufs de xénope :

NaCl à 5M (12,5ml), KCl à 2,5M (750µl), Na2HPO4 à 1M (7,58ml), MgCl2 6H2O à 1M (7,58ml), HEPES à 5M (7,77ml), NaOH à 5M (5,75ml), ajuster à pH 7,8, CaCl2 à 5M (1,5ml), qsp 500ml H2O MilliQ (A préparer fraîchement).

● Solution Ficoll pour micro-injection des œufs de xénope :

Ficoll 10% (50ml), qsp 500ml MBS 1X (Conservation à température ambiante).

● Solution gélatine-albumine pour sections d'embryons de xénope au vibratome :

PBS 10X (45ml), Gélatine (2,2g), qsp 450ml H2O MilliQ. Chauffer la solution à 60°C et laisser refroidir. Albumine (135g), Sucrose (90g). Pour l’emballage ajouter 150µl de glutaraldéhyde à 2ml de solution gélatine-albumine.

● Tampon d'hybridation in situ (HIS) pour embryons de xénope :

Formamide 100% (1000ml), SSC à 20X (50ml), Torula RNA à 50mg/ml (20ml), Héparine à 10mg/ml (10ml), tampon Denhart’s à 100X (10ml), Tween 20 20% (5ml), CHAPS 10%

(10ml), EDTA à 0,5M (20ml), qsp 1000ml H2O DEPC (Conservation à -20°C).

● Tampon d'Immonoprécipitation (IP) :

Tris à 1M (25ml), NaCl à 5M (30ml), NP40 1% (5ml), EDTA à 0,5M (5ml), qsp 500ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Tampon Laemmli pour chargement de protéines :

Tris à 1M (0,5ml), SDS 10% (1ml), Glycerol (1ml), Bromo-Phenol Blue 1% (30µl) qsp 5 ml Formamide 100% (Conservation à -20°C).

● Tampon de lyse pour IP :

Tampon IP (10ml), PMSF à 100mM (100µl), une pastille d’inhibiteurs de protéases, qsp 500ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Tampon de lyse pour levures :

Tris à 1M (5ml), EDTA à 0,5M (2ml), NaCl à 5M (10ml), Triton 100X 10% (100ml), SDS 10% (50ml), qsp 500ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Tampon MAB pour HIS sur embryons de xénope :

Acide maléique (6g), NaCl (4,2g), ajuster le PH à 7,5, qsp 100ml H2O MilliQ (Autoclaver et conserver à température ambiante).

● Solution MBS 10X (Modified Barth Solution) pour élevage des embryons de xénope : NaCl (51,3g), KCl (0,748g), NaHCO3 (2,02g), HEPES (23,83g) à dilur dans 800ml d’eau.

Ajouter environ 7ml NaOH 4M jusqu'à obtention pH7,5. Ajouter ensuite MgSO4.2H2O (2,02g), Ca(NO3)2.4H2O (0,78g), CaCl2.2H2O (0,6g), qsp 1000 H2O MilliQ (Conservation à 4°C)

● Solution MEM (10X) pour xénope :

MOPS (203,9g), EGTA à 0,5M (20ml), MgSO4 à 1M (5ml), qsp 500ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Solution MEMFA pour fixer les embryons de xénope :

MEM 10X (10ml), Formaldehyde 37% (10ml), qsp 100ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Solution de migration pour IP :

Tampon de transfert 10X (100ml), Méthanol (200ml), qsp 1000ml H2O MilliQ (Conservation à 4°C).

● Tampon NETS pour extraction d'ARN total :

NaCl à 0,3M (3ml), EDTA à 0,5M (0,1ml), Tris à 1M (2,5ml), SDS 20% (2,5ml), ajuster le pH à 7,5, qsp 10ml H2O DEPC (Conservation à température ambiante).

● Solution Nile blue 0,01% pour coloration des embryons albinos de xénope :

Faire tampon KPO4 pH7,8 50mM : K2HPO4 à 1M (45,5 ml), KH2PO4 à 1M (4,6ml), qsp 1000ml . Ajouter 0,1g de Nile blue puis agiter puis filtrer avec un filtre à café.

● Solution PBS 1X (phosphate buffer saline) :

NaCl (8g), KCl (0,2g), KH2PO4 (0,2g), NaH2PO4 2H2O (0,4g), Na2HPO4 12H2O (2,7g) qsp 1000ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Tampon phosphate pour marquage lacZ sur embryons de xénope :

H3PO4 à 1M (50ml), ajuster le pH à 6,3, qsp 500ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Solution de ponte pour xénope :

NaCl à 5M (48ml), KCl à 2,5M (800µl), NaHCO3 à 1M (8ml), MgSO4 à 1M (3,32ml), Tris à 1M (60ml), ajuster le pH à 7,8, Ca (NO3)2 4H2O (20µg), CaCl2 2H2O (58µg), qsp 2000ml H2O MilliQ (A préparer fraîchement).

● Tampon de précipitation d'ADN/ARN (NAOAC 3M pH5,5) :

NaOAC (246g) dans 850ml H2O. Ajuster le pH avec HAc (96%). Ajouter qsp 1000ml H2O.

● Solution PTw pour HIS sur embryons de xénope :

Tween 20 20% (2,5ml) qsp PBS 500ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Tampon de rétrotranscription 3X :

First Strand Buffer 5X (500µl), DTT 0,1M (250µl), 83µl d'H2O MilliQ (Conservation -20°C).

● Solution de RNAse A à (1mg/ml) :

RNAse A (11g), NaOAC 0,01M pH5,5 (10ml). Porter 5 minutes à 100°C puis laisser refroidir lentement à température ambiante. Ajuster pH avec Tris-HCl 1M. Faire aliquots stockés à -20°C.

● Tampon SSC 20X pour HIS sur embryons de xénope :

NaCl (175,3g), citrate de sodium (88,2g), qsp 100ml H2O MilliQ (Autoclaver et conserver à

● Solution de Steinberg 10X pour culture de calottes animal de xénope :

NaCl (33,9g), KCl (0,5g), Ca(NO3)2 (1 ,05g), MgSO4 (3,09g), HEPES (7,15g), Kanamycine sulfate (1g), qsp 1000ml H2O MilliQ. Ajuster le pH à 7,8. Utilisation de la solution Steinberg 1X avec 0,1% BSA.

● Tampon TAE 50X (pour gel d'agarose "TAE 0,5X" et tampon de migration d'ADN/d'ARN

"TAE 0,5X") :

Tris 5M (40ml), EDTA à 0,5M (10ml), qsp 100ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Solution TBST pour IP :

Tris à 1M (20ml), NaCl à 5M (150ml), Tween20 (1ml) qsp 1000ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

● Solution TELT pour extraction d'ADN plasmidique à partir de culture de bactéries :

Tris-HCl (0,6g), EDTA (2,33g), LiCl (10,6g), Triton 100x (400 μl), qsp 100ml H2O. Ajuster le pH à 7,5. Ajouter avant utilisation 10μl de lysozyme (10mg/ml) pour 100μl de solution TELT.

● Solution de transfert 10X pour IP :

Tris (30g), Glycine (144g), SDS 10% (50ml), Méthanol (250ml), qsp 1000ml H2O MilliQ (Conservation à 4°C).

● Solution triéthanolamine (TEA) pour HIS sur embryons de xénope :

TEA (1,33ml), acide acétique (100μl), qsp 100ml H2O MilliQ. Ajuster le pH7-8 (Conservation à température ambiante).

● Tampon X-Gal pour coloration d'embryons de xénope :

K3Fe(CN)6 à 10mM (400µl), K4Fe(CN)6 à 10mM (400µl), X-Gal 15% (40µl), qsp 4ml Tampon phosphate (Conservation à -20°C).

● Tampon X-Gal pour coloration de levures en milieu solide :

Tampon Z (3ml), β-mercapto éthanol (2,7µl), X-Gal 10% (10µl) (Conservation à -20°C).

● Tampon Z pour coloration X-gal au CPRG de levures en milieu liquide :

MgSO4 à 1M (500µl), KCl à 2,5M (2ml), NaH2PO4 à 0,5M (40ml), Na2HPO4 à 1M (30ml), qsp 500ml H2O MilliQ (Conservation à température ambiante).

V.1.3 Logiciels informatiques

VectorNTI v6 (InforMax.Inc), Reference Manager v11 (Thompson ISI ResearchSoft), Microsoft Office 2003 (Microsoft Corporation), Paint Shop Pro v9 (Jasc Software), Photoshop 6.0 (Adobe®), GenAmp 5700 System Software (PE Applied Biosystems), IrfanView (Vienna University of Technology), Chromas 1.45 (Technelysium), Emboss Interface (www.be.embnet.org), Primer3 (http://cbr-rbc.nrc-cnrc.gc.ca/cgi- bin/primer3_www.cgi), Xenopus Database "XDB" (http://xenopus.nibb.ac.jp), National Center for Biotechnology Information "NCBI" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), DataBase of Transcriptional Start Sites "DBTSS" (http://dbtss.hgc.jp), The Eukaryote Promoter Database

"EPD" (http://www.epd.isb-sib.ch), I.M.A.G.E. Consortium (http://image.llnl.gov), Ensembl Genome Browser (http://www.ensembl.org/), Eukaryotic Genomics "JGI" (http://genome.jgi- psf.org), Xenbase (http://www.xenbase.org).

V.1.4 Méthodes

V.1.4.1 Préparation, purification et analyse des ADN plasmidiques

V.1.4.1.1 Clonages

Les constructions plasmidiques ont été réalisées suivant la méthode suivante : la séquence codante de l’ADNc d’intérêt est amplifiée par PCR en utilisant les amorces appropriées, soit à partir de clones provenant d’une banque d’EST (NIBB ou IMAGE consortium), soit à partir d’une banque d’ADNc d'embryons de xénope au stade neurula tardif (banque générée par le Dr. R. Van Wayenbergh, IRIBHN – IBMM – ULB). Le fragment d’ADN amplifié est

analysé par électrophorèse sur gel d’agarose puis extrait et purifié à l’aide du kit QIAquick^® (Qiagen). Le sous-clonage du fragment d’ADN amplifié est réalisé à l’aide du kit TA- cloning^® (Invitrogen). Les inserts ainsi que les vecteurs sont digérés par les enzymes de restriction apropriées. Après digestion, les fragments d’ADN sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose, extraits et purifiés. Les vecteurs cibles (50ng) et les inserts (150ng) sont ligués avec l’enzyme T4 ADN ligase (Bioline) à 14°C pendant une nuit. Les plasmides recombinants sont transformés dans la souche bactérienne XL1-Blue (Stratagene), les bactéries sont étalées sur boîtes de milieu LB solide avec un antibiotique de sélection et mises en culture à 37°C pour une nuit. Les clones positifs sont testés par PCR en utilisant des amorces spécifiques. Les clones positifs confirmés sont ensuite amplifiés en culture de grand volume puis purifiés à l’aide du kit Midiprep^® (Qiagen). Les plasmides obtenus ont été vérifiés par séquençage (kit Biovallée).

V.1.4.1.2 Préparation des bactéries électrocompétentes

Une colonie bactérienne de souche XL1-Blue provenant d’une boîte fraîchement striée est utilisée pour ensemencer 50ml milieu LB avec 15µg/ml de tétracycline. La culture est incubée une nuit à 37°C sous agitation. Ensemencer deux fioles de 500ml avec chacune un volume de 25ml de milieu YT et incuber pendant environ 2 à 3 heures à 37°C sous agitation jusqu’à obtention d’une DO de 0,8. Répartir les cultures dans 6 biberons stériles et incuber pendant 20 minutes sur glace. Centrifuger les biberons à 4000 rpm pendant 20 minutes à 4°C, vider les surnageants et resuspendre les culots dans 400ml d’H2O milliQ stérile à 4°C. Les cultures sont réparties dans 2 biberons stériles, centrifuger les biberons à 4000 rpm pendant 20 minutes à 4°C. Vider les surnageants et resuspendre les culots dans 200ml de glycérol 10% stérile à 4°C. Centrifuger la solution à 4000 rpm pendant 20 minutes à 4°C, vider le surnageant et resuspendre le culot dans 50ml de glycérol 10% stérile à 4°C. Centrifuger la solution à 4000 rpm pendant 20 minutes à 4°C, vider le surnageant et resuspendre le culot dans 10ml de glycérol 10% stérile à 4°C. Centrifuger la solution à 4000 rpm pendant 20 minutes à 4°C, vider le surnageant et resuspendre le culot dans 1 volume de glycérol 10%

stérile à 4°C. Aliquoter les bactéries par 50µl, les congeler dans de l'azote liquide et les conserver à -70°C.

V.1.4.1.3 Transformation, étalement et sélection des bactéries

Un aliquot de 50µl de bactéries électrocompétentes est décongelé sur glace. Un volume de 2µl de solution contenant l’ADNc dans un plasmide est ajouté et le mélange est déposé dans une cuvette d’électroporation 0,2cm (Bio-rad) sur glace. La cuvette est insérée dans un électroporateur de type GenePulser II (Bio-rad) à 25µF et 2,5kV. Après électroporation, la suspension bactérienne est récupérée en ajoutant 1ml de milieu LB et la culture est incubée pendant 1 heure à 37°C sous agitation à 250 rpm. Après quoi, 100µl et 800µl de culture sont étalés sur des boîtes de pétri de milieu LB solide contenant l’antibiotique de sélection puis incubés pendant une nuit à 37°C. Seules les bactéries ayant intégré le plasmide contenant le gène de sélection pourront pousser sur le milieu de sélection et former des colonies. Une colonie est repiquée à l’aide d’un cure-dent pour inoculer 5ml de milieu LB contenant l’antibiotique de sélection. La culture est incubée pendant 8 heures à 37°C. Un volume de 100µl permet d’inoculer une fiole de 100ml de milieu LB contenant l’antibiotique de sélection qui est incubé pendant une nuit à 37°C sous agitation. La culture est ensuite culottée par centrifugation à 4000 rpm pendant 20 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot peut être conservé à -20°C.

V.1.4.1.4 Préparation d’ADN plasmidique à partir d’une culture bactérienne

Pour préparer de l’ADNc plasmidique en quantité et qualité suffisantes pour effectuer nos expériences, nous utilisons les kit Miniprep^® et Midiprep® de Qiagen.

Une purification d'ADN dite "Miniprep TELT" est effectuée pour des manipulations contrôles comme le génotypage par PCR ou par digestion. Cette Miniprep TELT se fait à partir d'1ml de culture de bactéries issues d'une colonie repiquée la veille dans un volume de 3ml de solution LB et incubée toute une nuit sous agitation à 250 rpm à 37°C. Ce volume de 1ml est centrifugé à 13000 rpm pendant 1 minute. Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 100µl de solution TELT et 10µl de lysozyme (10mg/ml). Après quoi,on l'incube dans un bain-marie en ébulition pendant 1 minute, puis le surnageant est posé sur glace durant 5 minutes et enfin centrifugé à 4°C durant 7 minutes à 13000 rpm. Le culot formé par les débris membranaires est retiré à l'aide d'un cure-dent. On ajoute 200µl d'ethanol 100% au surnageant pour ensuite précipiter l'ADN à -80°C durant 15 minutes. Après quoi, il

est centrifugé à 13000 rpm à 4°C pendant 10 minutes ce qui forme un culot d'ADN. Ce- dernier est lavé dans 250µl d'ethanol 80% puis centrifugé 5 minutes à 13000 rpm et enfin séché et resuspendu dans 20µl d'H2O MilliQ.

V.1.4.1.5 Préparation d’ADN plasmidique à partir d’une culture de levure

La méthode utilisée pour préparer de l’ADNc plasmidique à partir d’une culture de levure provient d’une adaptation de la méthode de Hoffman (Hoffman, 1997). Une colonie de levure provenant d’une boîte fraîchement striée est repiquée à l’aide d’un cure-dent pour ensemencer 5ml de YPD ou de SC complété en fonction des besoins de l’expérience. La culture est incubée une nuit à 30°C sous agitation à 300 rpm puis centrifugée à 4000 rpm pendant 20 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 300µl de tampon de lyse, un volume de 200µl de billes de verre et 200µl d’une solution phénol chloroforme 50/50. Le mélange est vortexé pendant 1 minute puis centrifugé à 14000 rpm pendant 10 minutes. La phase supérieure aqueuse est récupérée et mélangée à un volume d’une solution de phénol chloroforme 50/50. Le mélange est vortexé puis centrifugé à 14000 rpm pendant 5 minutes. La phase supérieure aqueuse est récupérée et mélangée à un volume de chloroforme, le mélange est vortexé puis centrifugé à 14000 rpm pendant 5 minutes. La phase supérieure aqueuse est récupérée et mélangée à 2,5 volume d’éthanol 100% froid et 1/10 d’acétate de sodium 3M pH5.5 puis incubé pendant 30 minutes à -20°C. Le mélange est ensuite centrifugé à 14000 rpm pendant 20 minutes, le surnageant est éliminé et le culot obtenu est lavé avec de l’éthanol 70%. Le culot d’ADN est resuspendu dans 50µl d’H2O milliQ.

V.1.4.1.6 Analyse par électrophorèse sur gel d’agarose

Des gels d’agarose de 0,8% à 1,5% ont été utilisés pour analyser les fragments d'ADN. Pour préparer un gel, l’agarose est ajoutée à du tampon de migration TAE 0,5X. La solution est chauffée au micro-onde jusqu'à ébullition pour dissoudre l'agarose. Après refroidissement, du bromure d’éthidium (0,5µg/ml) est ajouté. La solution est déposée dans le moule jusqu’au durcissement du gel. Le TAE à 0,5X est utilisé comme tampon de migration. Le marqueur de taille moléculaire Hyperladder III (Bioline) ou SmartLadder (Eurogentec) est utilisé comme

référence pour repérer la taille des bandes d’ADN lors de la visualisation sous illumination UV.

V.1.4.1.7 Purification d'ADN/ARN par phénol/chloroforme

Une technique récurrente est utilisée dans le laboratoire pour purifier l’ADN ou l’ARN, la purification phénol/chloroforme. Un volume de phénol est ajouté à la solution contenant l’ADN ou l’ARN, le mélange est vortexé puis centrifugé à 14000 rpm pendant 1 minute. La phase supérieure aqueuse est récupérée et mélangée à un volume d’une solution de phénol chloroforme (50/50), le mélange est vortexé puis centrifugé à 14000 rpm pendant 1 minute.

La phase supérieure aqueuse est récupérée et mélangée à un volume de chloroforme, le mélange est vortexé puis centrifugé à 14000 rpm pendant 1 minute. La phase supérieure aqueuse est récupérée et mélangée à 2,5 volume d’éthanol 100% froid et 1/10 d’acétate de sodium 3M pH5,5 puis incubée pendant 30 minutes à -20°C. Le mélange est ensuite centrifugé à 14000 rpm pendant 20 minutes, le surnageant est éliminé et le culot obtenu est lavé avec de l’éthanol 70%. Pour un culot d’ADN, la resuspension se fait dans de l’H2O milliQ et pour un culot d’ARN, la resuspension se fait dans de l’H2O DEPC.

V.1.4.1.8 Séquençage

Les séquençages ont été effectués avec le kit BigDye Terminator par la firme Biovallée.

V.1.4.1.9 Oligos Morpholinos antisens

Les morpholinos (Gene Tools) sont des oligomères analogues synthétiques de l’ADN capables de bloquer spécifiquement l’épissage ou la traduction d’un ARNm cible. Afin d’inhiber la traduction, les séquences des morpholinos sont choisies au niveau du site d’initiation de la traduction ou dans la région 5’ non traduite située immédiatement en amont du site d’initiation de la traduction de l’ARNm. Les morpholinos, d’une longueur de 25 résidus, sont resuspendus dans de l’H2O à une concentration d’environ 1mM. L’absorbance de 5µl de la solution de morpholinos est lue à 265nm dans 995µl d’une solution 0,1M d’HCl.

La concentration de la solution de morpholinos est calculée selon la formule suivante : A265X200/ε où ε est l’absorbance d’une mole de morpholinos. Les stocks de morpholinos

dilués sont conservés à -80°C. Juste avant l’injection, les morpholinos sont dégelés et incubés 5 minutes à 65°C afin de permettre leur complète mise en solution. Après décongélation, les morpholinos sont conservés à 4°C (cf. Fig.35).

Les oligos Morpholinos antisens utilisés

Noms Séquences Rangement

XMyT1.1 TAACATTGTCTACATTCATCTTGGA Morpholinos 25

XMyT1.2 GACTGTTTATTCTTTGTGTCTCGCA Morpholinos 26

V.1.4.1.10 Synthèse d'une sonde ADN radioactive

Le fragment d'ADN est excisé du vecteur par digestion. Ce produit de digestion est transféré sur gel d'agarose afin d'isoler le fragment d'intérêt par électrophorèse. La bande est visualisée sous UV, identifiée à l'aide d'une marqueur de poids moléculaire, excisée du gel et purifiée via le kit QIAquick Extraction Gel. Par la suite, l’ADN modèle est dénaturé à 100°C, pendant 3 minutes avant d'être refroidi sur glace pendant 5 minutes. L'ADN est recopié en présence d'[γ-³²P] dATP, à l’aide du kit "Random Priming" (Invitrogen) suivant les recommandations de la firme. La sonde est purifiée sur colonnes à l’aide du kit QIAquick PCR Purification Kit.

1/600ème de la sonde est utilisé pour la quantification au compteur à scintillation. La quantité de sonde permettant d’obtenir 5.10⁵ à 10⁶cpm/ml de milieu d’hybridation, est dénaturée 5 minutes à 100°C avant utilisation.

V.1.4.2 Préparation, purification et analyse des ARN

V.1.4.2.1 Synthèse d’ARNm synthétique pour injection en embryons de xénope

L’ADNc plasmidique dont nous voulons transcrire la séquence en ARNm est linéarisé par digestion avec l’enzyme de restriction approprié. Le produit de digestion est vérifié par électrophorèse sur gel d’agarose et purifié par séparation phénol/chloroforme. La réaction de transcription de l’ARNm est réalisée à l’aide du kit mMESSAGE mMACHINE^® (Ambion) en utilisant l’ARN polymérase adaptée (T3, T7 ou Sp6). Le mélange de réaction est incubé à 37°C pendant 2 heures. L’ADNc plasmidique est ensuite éliminé par digestion avec 10U de

DNAse 1. L’ARNm synthétisé est purifié par séparation phénol/chloroforme puis après centrifugation, la phase aqueuse est récupérée et déposée sur une colonne de Sépharose G-50.

L’ARNm est élué puis précipité avec de l’éthanol 100% froid (2.5 volume) et de l’acétate de sodium 3M pH5,5 (1/10 volume) pendant 1 heure à -20°C. Le mélange est ensuite centrifugé à 4°C pendant 20 minutes, le culot d’ARNm est lavé à l’éthanol 80% et resuspendu dans de l’H2O DEPC. L’ARNm est analysé par électrophorèse sur gel d’agarose puis conservé à - 80°C.

V.1.4.2.2 Synthèse d’ARN antisens marqué à la digoxigénine pour hybridation in situ

L’ADNc plasmidique dont nous voulons transcrire la séquence en ARN antisens est linéarisé par digestion avec l’enzyme de restriction approprié. Le produit de digestion est vérifié par électrophorèse sur gel d’agarose et purifié par séparation phénol/chloroforme. La réaction de transcription d’ARN antisens est réalisée à l’aide du kit MEGAscript® (Ambion) en utilisant l’ARN polymérase adapté (T3, T7 ou Sp6) et de l’UTP-digoxigenin. Le mélange de réaction est incubé à 37°C pendant 4 heures. L’ADNc plasmidique est ensuite digéré par digestion avec 10U de DNAse 1 pendant 30 minutes. L’ARN synthétisé est ensuite purifié par séparation sur une colonne de Sépharose G-50. L’ARN est élué puis précipité avec de l’éthanol 100% (2,5 volume) et de l’acétate de sodium 3M pH5,5 (1/10 volume) pendant 1 heure à -20°C. Le mélange est ensuite centrifugé à 4°C pendant 20 minutes, le culot d’ARN est lavé à l’éthanol 80% et resuspendu dans de l’H2O DEPC. L’ARN est analysé par électrophorèse sur gel d’agarose puis dilué dans le tampon d'hybridation in situ à 1µg/ml puis conservé à -20°C.

V.1.4.3 Préparation, purification et analyse des protéines

V.1.4.3.1 Extraction de protéines et Immunoprécipitation (IP)

● A partir d’embryons de xénope

Dans un tube eppendorf de 1,5ml, 30 calottes animales sont lysées dans 300µl de tampon de

centrifugés à 14000 rpm pendant 5 minutes à 4°C, le surnageant est récupéré et une nouvelle centrifugation à 14000 rpm pendant 5 minutes à 4°C est effectuée de manière à récupérer un surnageant plus clair. En prévision de l’analyse par Western Blot, un volume de 30µl est prélevé et conservé à 4°C. Un volume de 30µl de protéinase A Sépharose 50%, prétraité durant 1 heure à 4°C avec de la BSA, est ajouté aux 270µl de l’échantillon. Celui-ci est incubé pendant 1 heure à 4°C sous agitation. L’échantillon est ensuite centrifugé pendant 5 minutes à 14000 rpm et le surnageant est transféré dans un autre tube auquel est ajouté l’anticorps de précipitation. L’échantillon est incubé pendant 1 heure à 4°C sous agitation. Un volume de 50µl de protéinase A Sépharose 50% prétraitée à la BSA est ajouté à l’échantillon.

Celui-ci est incubé 1 heure à 4°C sous agitation. L’échantillon est ensuite centrifugé pendant 5 minutes à 2000 rpm, les billes de Sépharose culottées sont ensuite lavées dans du tampon IP. Trois centrifugations identiques permettent de laver complètement les billes de Sépharose.

Le surnageant est éliminé et 30µl de tampon Laemmli est ajouté aux billes de Sépharose.

L’échantillon est chauffé dans l’eau bouillante pendant 5 minutes, centrifugé brièvement et stocké à -20°C.

● A partir de cellules Hela

Après deux jours de cultures, les cellules Hela sont prêtes à être traitées. Dans une boîte de pétri de 4cm de diamètre, il y a environ 4.10 ⁶ cellules. Elles sont lavées avec 2ml de PBS 1X froid puis détachées de la boîte au grattoir dans 1,5ml de PBS 1X. L’opération se fait sur glace. Les cellules sont récupérées dans un tube eppendorf 1,5ml et centrifugées à 2000 rpm pendant 5 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé, le culot est remis en suspension pour être lavé une deuxième fois dans 1ml de PBS 1X puis centrifugé à 2000 rpm pendant 5 minutes à 4°C. Le surnageant est ensuite éliminé et les cellules sont lysées dans 200µl de tampon de lyse IP pendant 30 minutes sur glace. Le lysat est ensuite centrifugé à 14000 rpm pendant 20 minutes à 4°C pour culotter les débris cellulaires. Le surnageant clarifié est récupéré dans un nouveau tube. En prévision de l’analyse par Western Blot, un volume de 20µl est prélevé et conservé à 4°C. Un volume de 30µl de protéinase A Sépharose 50%, prétraitée à la BSA durant 1 heure à 4°C, est ajouté aux 180µl de l’échantillon qui est ensuite incubé pendant 4 heures à 4°C sous agitation. Après quoi, l’anticorps de précipitation est ajouté à l’échantillon et est incubé durant la nuit à 4°C sous agitation. L’échantillon est ensuite centrifugé pendant 5 minutes à 3000 rpm. Les billes de Sépharose culottées sont ensuite lavées dans du tampon IP. Trois centrifugations identiques permettent de laver complètement les billes de Sépharose

dans du tampon IP. Le surnageant est éliminé et 30µl de tampon Laemmli est ajouté aux billes de Sépharose. L’échantillon est chauffé dans l’eau bouillante pendant 5 minutes, centrifugé brièvement et stocké à -20°C.

V.1.4.3.2 Synthèse de protéines in vitro

L'efficacité des oligos Morpholinos antisens à inhiber l'expression de XMyT1 a été testée par une manipulation contrôle de transcription/traduction in vitro. Pour cette expérience, nous utilisons 0,25µg d'ADN plasmidique de pCS2-XMyT1 (plasmides d'expression 98). Sa transcription est réalisée à l'aide de l'ARN polymérase Sp6, suivie d'une traduction de l'ARN générée à l'aide d'un lysat de réticulocytes de lapin. Les réactions ont été réalisées simultanément en présence de 0,5µl d'une solution de méthionine marquée à l'isope radioactif 35S (L-méthionine, 35S, d'activité spécifique 400Ci/mmol, 10mCie/ml) dans un volume réactionnel de 12µl, à l'aide des éléments et des indications du kit TNT Sp6 Coupled Reticulocyte Lysate System (Promega). Diverses réactions contenant différentes concentrations du Morpholinos, de 0,1μM à 1μM, ont été réalisées. L'efficacité de la réaction a été vérifiée par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10% d'un échantillon de 5µl du milieu réactionnel, suivie d'une autoradiographie de 15h du gel (Kodak).

V.1.4.3.3 Analyse par Western Blot

L’échantillon est décongelé puis analysé par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10%. La migration se fait à 100V pendant environ 1h30 à 2h30 après quoi les protéines sont transférées sur une membrane PVDF (Bio-rad) à l’aide de cuves de transfert de type Bio-rad.

Afin de bloquer les liaisons non spécifiques, la membrane est incubée dans du TBST complété avec 3% de lait en poudre pendant 1 heure à température ambiante ou pendant une nuit à 4°C sous agitation. La membrane est ensuite lavée 5 fois pendant 5 minutes au TBST puis incubée avec l’anticorps primaire dilué dans du TBST complété avec 3% de lait en poudre pendant 1 heure à température ambiante sous agitation. La membrane est de nouveau lavée 5 fois pendant 5 minutes avec du TBST puis incubée avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase dilué dans du TBST complété avec 3% de lait en poudre pendant 1 heure à température ambiante sous agitation. Enfin, la membrane est lavée 3 fois pendant 15 minutes

dans du TBST. Les protéines sont détectées par chemiluminescence à l’aide du kit Western Blot ECL+ (Amersham) sur film auto radiographique Hyperfilm (Kodak).

V.1.4.4 Manipulations sur levures

La souche de levure, utilisée dans ce travail, est la souche PJ69-4A (James et al, 1996). Ces levures ainsi que l’ensemble des protocoles expérimentaux nous ont été aimablement fournis par Dr. R. Van Wayenberg à l'IRIBHM. A noter que la souche PJ69-4A possède le gène rapporteur Histidine His3 sous la dépendance du promoteur Gal4. Il peut y avoir une fuite transcriptionnelle du gène Histidine (James et al, 1999). Pour contrer ce problème, nous avons ajouté au milieu une concentration de 1mM d’un inhibiteur compétitif pour la protéine HIS3 de la levure, le 3-AT (3-amino-1, 2, 4-triazole). La concentration en 3-AT utilisé provient des mises au point expérimentales des travaux de thèse de R. Van Wayenberg.

V.1.4.4.1 Cultures de levures en milieu solides ou liquides

Nous avons utilisé deux types de milieux de croissance. Le milieu YPD, c’est un milieu complet non sélectif permettant une culture extensive. Le milieu SD, milieu carencé en Adénine sulfate, en Histidine, en Leucine, en Tryptophane et complété suivant le besoin en Adénine sulfate à 40mg/ml, en Histidine à 20mg/ml, en Leucine à 30mg/ml ou en Tryptophane à 20mg/ml. Ces deux types de milieux de culture peuvent être liquides ou solides, dans le dernier cas nous ajoutons de l’Agar.

V.1.4.4.2 Transformation de levures par la méthode à l’acétate de lithium

La méthode utilisée pour effectuer une transformation de levures est la méthode à l’acétate de lithium (Becker and Lundblad, 1994 ; Gietz and Woods, 2002). Une colonie de levures provenant d’une boîte fraîchement striée est utilisée pour ensemencer 5 ml de YPD ou de SC complété en fonction des besoins de l’expérience. La culture est incubée une nuit à 30°C sous agitation à 300 rpm. Ensemencer 500ml de milieu YPD ou de SC complété suivant les besoins expérimentaux avec 2,5 10⁷ cellules et incuber pendant 6 heures à 30°C sous agitation jusqu’à obtention de 10⁹ cellules. La culture est centrifugée à 3000rpm pendant 10 minutes, le culot est resuspendu dans 25 ml d’H2O milliQ stérile et la suspension est

centrifugée à 3000rpm pendant 10 minutes. Le culot est alors resuspendu dans 1ml d’acétate de lithium à 100mM dans un tube eppendorf 1,5ml. La solution est centrifugée à 13000 rpm pendant 30 secondes puis resuspendue dans 500µl d’acétate de lithium à 100mM. Les cellules ainsi rendues chimio-compétentes sont mélangées au milieu de transformation : 50µl de cellules, 240µl de PEG 50%, 36µl d’acétate de lithium à 1M, 50µl d’ADN de sperme de saumon à 2mg/ml bouilli, 34 µl d’ADN à transformer (soit 0,1µg). Le mélange est ensuite incubé pendant 30 minutes à 30°C puis pendant 45 minutes à 42°C. Les cellules sont ensuite centrifugées à 3000rpm pendant 10 minutes, le culot est resuspendu dans 1ml d’H2O milliQ stérile et la suspension est centrifugée à 3000rpm pendant 10 minutes. Le culot est resuspendu dans 1ml d’H2O milliQ stérile et différentes dilutions sont étalées sur boîtes de pétri contenant du milieu SD complété en fonction des besoins de l’expérience. Les cultures sont incubées pendant 3 à 6 jours à 30°C. Seules les levures ayant intégrées le plasmide contenant les gènes de sélection pourront pousser sur le milieu et former des colonies.

V.1.4.4.3 Sélection par test colorimétrique X-gal

● Coloration X-gal sur levures issues de milieu solide

Le test colorimétrique X-gal, 5-bromo 4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside, permet de mettre en évidence l’activation du gène rapporteur LacZ codant pour la β–galactosidase. Les colonies de levures sont étalées sur boîtes de pétri contenant du milieu SC complété en fonction des besoins de l’expérience et incubées pendant 3 à 6 jours à 30°C. Une membrane de nitrocellulose Hybond (Bio-rad) de la taille de la boîte de pétri est appliquée au contact des levures et incubée pendant une nuit à 30°C. Les colonies adhèrent à la membrane qui est récupérée et plongée dans l’azote liquide puis déposée au contact du tampon X-gal pendant environ 2 heures à 30°C. Quand la coloration bleue apparaît, la membrane est incubée pendant 2 heures à 60°C pour stopper la réaction colorimétrique.

● Coloration β-galactosidase au CPRG sur levures issues de milieu liquide

Inoculer une colonie de levures co-transformées avec les plasmides pPC86 et pPC97 dans un milieu liquide SD sélectif carrencé en leucine et triptophane et incuber pour une nuit à 30°C sous agitation à 300 rpm dans un volume de 50ml. Le deuxième jour lorsque la densité

optique (DO) atteint 0,5 prélever un volume de 10 DO (ce qui équivaut dans ce cas-ci à 20ml). Centrifuger à 13000 rpm pendant 1 minute et resuspendre le culot dans 800μl de tampon Z. Ajouter 100μl de chloroforme et 50μl de SDS 0,1%. Vortexer vigoureusement pendant 30 secondes puis préchauffer les tubes à 30°C durant 5 minutes. Préparer fraîchement une solution de CPRG, chlorophenol red-β-D-galactopyranoside, à 4mg/ml dans du tampon Z. Ajouter 200μl de la solution CPRG aux levures et incuber à 30°C en notant le temps d'incubation. Lorsque la couleur du CPRG a viré au brun, stopper la réaction dans tous les tubes en ajoutant 500μl de Na2CO3 à 1M. Vortexer et centrifuger les tubes à 13000 rpm pendant 2 minutes pour culotter les débris cellulaires. Préléver le surnageant et mesurer la DO à 578nm. Le calcul de l'activité β-gal se fait par cette formule : DO578/DO600 (culture de levures) x Volume (de culture de levures prélevée) x temps d'incubation. La calibration du spectromètre se fait par un "blanc" constitué de 800μl de tampon Z, 100μl de chloroforme, 50μl de SDS 0,1% et 200μl de la solution CPRG.

V.1.4.4.4 Criblage de double hybride en levures

Le protocole de criblage de double hybride en levures que nous avons utilisé est l’application à grande échelle de la technique de transformation de levures par la méthode de l’acétate de lithium. Cela correspond à 250 transformations et 25µg de banque d’ADNc d’embryons de xénope au stade neurula tardif (la banque d’ADNc d’embryons de xénope au stade neurula tardif nous a été aimablement fournie par le Dr. R. Van Wayenberg à l'IRIBHM). Les levures contenant le vecteur appât sont transformées avec la banque d’ADNc et les transformants se développent sur les boîtes de pétri contenant du milieu SD complété en Adénine sulfate et Histidine . Les colonies apparaissant le plus rapidement sont repiquées et étalées sur du milieu SC sans acides aminés et contenant du 3-AT. Les colonies sélectionnées sont ensuite testées par test colorimétrique X-Gal et les colonies positives sont amplifiées pour permettre une préparation d’ADN plasmidique à partir de culture de levures. La préparation d’ADNc contient un mélange du vecteur appât et du vecteur proie. L’insert contenu dans le vecteur proie est amplifié par PCR à l’aide d’amorces spécifiques complémentaires de séquences contenues dans le vecteur proie puis purifié et séquencé partiellement pour être analysé.

V.1.4.5. Manipulations sur embryons de xénopes

V.1.4.5.1 Obtention d’embryons de xénopes

Les embryons, pigmentés ou albinos, sont obtenus en injectant dans le sac lymphatique d’une femelle, l’hormone gonadotrophine chorionique humaine (HCG; Sigma). La femelle doit être placée dans une solution de ponte et la ponte a lieu environ 10 heures après l’induction de l’ovulation et dure environ 8 heures. Les œufs ont été fécondés in vitro (Sive et al., 2000).

Pour cela, un mâle est anesthésié dans de l'eau contenant du MS222 (0,1%) pendant 30 minutes. Il est ensuite mis à mort par décapitation et disséqué pour prélever les testicules.

Les testicules débarrassés du tissu adipeux sont placés dans un volume réduit (environ 3ml) de solution de fécondation à 4°C. Les oeufs sont fécondés dans la solution de fécondation par contact avec un morceau de testicule tenu au bout d’une pince. Trois minutes après cette manipulation, les œufs sont placés dans la solution MBS 0,1X. Environ une heure après fécondation, pour éliminer la gangue protectrice, les embryons fécondés sont ensuite immergés dans une solution cystéine 2% pendant 10 minutes puis à nouveau placés dans une solution MBS 0,1X. Les embryons se développent dans cette solution plus ou moins rapidement suivant la température d’incubation (14°C, 18°C ou température ambiante). Les embryons sont récoltés au stade voulu suivant la table des stades de développement de Nieukoop et Faber (Nieuwkoop and Fabert, 1967).

V.1.4.5.2 Micro-injections d’ARNm synthétique en embryons de xénopes

Pour réaliser les micro-injections, nous utilisons une loupe binoculaire, un micromanipulateur MM3 (Märhauser Wetzlar) et un micro-injecteur (PicoSpritzer III). Les aiguilles en verre (Clark Electromedical Instrument) sont obtenues avec une étireuse horizontale (Sutter Instrument). Les embryons sont plongés dans la solution Ficoll d’injection et l’ARNm synthétique est injecté au stade 2 ou 4 cellules dans 1 ou 2 blastomères. La concentration d’ARNm synthétique utilisé varie de 0,01µg/µl à 0,1µg/µl permettant d’injecter de 50pg à 500pg dans un volume de 5nl. Ce volume est calibré sous la loupe binoculaire en ajustant le diamètre de la goutte obtenue au bout de l’aiguille par variation du temps d’injection. Afin de comparer chez l'embryon, par hybridation in situ, la partie injectée de la partie non injectée, il est nécessaire de déterminer le zone injectée. Pour cela, on rajoute de l'ARNm nuc-LacZ

(100pg/blastomère) au mélange d'ARN à injecter. Après l’injection, les embryons sont maintenus dans la solution Ficoll pendant 30 minutes puis dans une solution MBS à 0,1X où ils se développent jusqu’au stade voulu.

V.1.4.5.3 Préparation des calottes animales

Les embryons sont injectés au stade 4 cellules dans les 4 blastomères avec les ARNm synthétiques voulus. Au stade 9 de développement, les embryons sont plongés dans la solution de Steinberg 1X et les calottes animales sont excisées à l’aide d’une pince et d’une pipette pasteur en verre à l’extrémité de laquelle est fixé un cil. Les calottes sont cultivées pendant environ 6 heures dans la solution Steinberg 1X puis congelées dans un tube eppendorf plongé dans de l’azote liquide puis conservées à -70°C.

V.1.4.5.4 Fixation des embryons et coloration X-Gal

Les embryons sont placés dans des tubes en verre de 5ml et fixés dans du MEMFA pendant 45 minutes puis lavés deux fois dans du tampon phosphate pendant 15 minutes. Les embryons sont ensuite incubés à l’abri de la lumière dans le tampon X-Gal contenant 1/100 volume de X-gal 15%. Quand la coloration apparaît, la réaction est stoppée avec du MEMFA, les embryons sont lavés deux fois avec de l’éthanol 100% puis sont conservés à -20°C.

V.1.4.5.5 Hybridation in situ sur embryons de xénopes

La première étape consiste à réhydrater les embryons conservés dans l’éthanol 100%. Pour cela, les embryons sont successivement immergés à température ambiante dans une solution d’éthanol 75% et H2O 25% pendant 5 minutes puis dans une solution d’éthanol 50% et H2O 50% pendant 5 minutes puis dans une solution d’éthanol 25% et PTw 75% et enfin dans une solution de PTw 100%. Les embryons sont rincés 3 fois pendant 5 minutes dans la solution de PTw. La deuxième étape consiste à perméabiliser puis refixer les embryons. Pour cela, les embryons sont incubés dans 2ml de PTw contenant 10µg/ml de protéinase K pendant 5 minutes. Il est important de ne pas dépasser ce temps d'incubation car au-delà de 5 minutes en présence de protéinase K, les embryons se détériorent. Les embryons sont ensuite incubés 2 fois pendant 5 minutes dans 5ml de triéthanolamine (TEA) pour neutraliser les radicaux