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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Blero, D. (2006). Contribution à la caractérisation du rôle de SHIP2 comme modulateur de la voie de la PI 3-kinase (Unpublished doctoral dissertation).

Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté de Médecine

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire Directeur de thèse : Dr C. Erneux

Contribution à ia caractérisation du rôie de SHiP2 comme moduiateur de ia voie de ia PI 3-kinase

Daniel Blero

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences

Médicales (octobre-novembre 2006)

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté de Médecine

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire Directeur de thèse : Dr C. Erneux

Contribution à la caractérisation du rôle de SHIP2 comme modulateur de la voie de la PI 3-kinase

Daniel Blero

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences

Médicales (octobre-novembre 2006)

REMERCIEMENTS

A mes grands-parents.

Au début, il y eut des leçons de biochimie pathologique du cancer, le cours où nous prenions le temps de nous poser des questions fondamentales. Le professeur avait l’art de nous faire croire (à moi en tout cas) qu’à partir de principes biologiques simples, nous serions capables de raisonner sur des sujets aussi complexes que la cancérogenèse. Cette perspective me paraissait grisante et, lorsque ce professeur proposa aux étudiants de faire un stage de recherche, il ne m’a pas fallu longtemps pour prendre ma décision. Depuis lors, Jacques Emile Dumont a non seulement suivi mon parcours, mais a pu dans les moments les plus difficiles me motiver, me conseiller et me soutenir. Ce fut et c’est toujours pour moi un atout inestimable de pouvoir compter sur sa bienveillance quasi paternelle. Pour tout cela et pour tout ce que je n’ai pas exprimé je lui suis reconnaissant.

Il y eut aussi Christophe Erneux, capitaine de la galère « SHIP » (car malheureusement ça n’a pas été une croisière cinq étoiles). N’allez pas croire qu’il vous fouette ou qu’il vous maltraite ! Bien au contraire. Avec beaucoup de persévérance et d’empathie il vous fait traverser l’Atlantique à la rame et supporte vos ronflements car avec générosité il vous a fait partager sa couchette dans un port de Bruges. J’ai bien conscience de ne pas avoir été le galérien le plus facile à diriger (digérer ?), mais j’aimerais le remercier de m’avoir aiguillé jusqu’à bon port.

Parmi les galériens il y eut à bord : honneur aux dames ! Colette, intendante et rameuse pour quatre. Elle est endurante et surtout connaît très bien le capitaine, ce qui dans certaines circonstances peut s’avérer utile. Grâce à son expérience si vous l’écoutez, vous préviendrez certaines avaries et votre voyage en sera résolument moins rude. Elle est toujours prête à partager avec équité son énergie et son attention maternelle, quoi qu’en dise l’encart photocopié placardé au-dessus de l’évier. Jing Zhang, notre rameuse hors compétition. On se demande parfois ce qu’elle mange pour tenir la gageure. Il est sûr que ce n’est pas de la cuisine occidentale ! Travailleuse, vous l’aurez compris, Jing est aussi très motivée, déterminée, loyale et souriante. Elle vous aide à affronter les intempéries. Grâce à elle, nous avons repris la direction du grand large. Ulrike Krause aura été déterminante pour m’apprendre les deux qualités indispensables à tout bon marin : discipline et rigueur. J’ai apprécié la personnalité de cette femme quadrilingue totalement empreinte de cette insatiable curiosité que l’on trouve chez certains chercheurs. Tout est objet d’observations et d’analyses attentives. Et il en va de l’organisation du travail, du comportement des galériens, de la nourriture de la cantine et même de la psychologie animale (de son chat). Il y eut aussi « les filles », toujours plus organisées et constantes que moi.

Florence dite « Ferrari », Valérie dite la mégère non apprivoisable dont l’intégrité

et la franchise gagnent à être expérimentées, Nathalie qui n’est pas affublée de

sobriquet mais que je serais tenté d’appeler « les bons tuyaux » pour ses

connaissances des bonnes affaires, et Laurence le nouveau matelot du capitaine, à qui je souhaite le meilleur pour les années à venir.

Parmi les hommes, il y a bien sûr mon ami Jeannot, mon binôme, sans l’amitié duquel tout cela n’aurait pas eu la même saveur. C’est grâce à lui que j’ai pu vivre mes maladresses et mes bêtises avec humour et simplicité. Il m’a initié aux bases et à la pratique de la recherche fondamentale au quotidien. J’aurais aimé, même si cela paraît prétentieux, qu’on puisse parler de Pesesse et Blero comme on cite Hokin et Hokin, mais nous verrons bien où les vents nous mèneront. Mon ami Suske, visionnaire et grand curieux, tel une vigie, avec qui j’ai partagé déboires et engouements, a grandement contribué à mon équilibre par sa précieuse écoute et ses encouragements constants. C’est avec joie que je le retrouverai tant à la salle café que sur le bench. Il y a Alex, un galérien prometteur, courageux et inébranlable, que nous avons recruté pour les inositols et un de ces sports d’hommes auquel il s’adonne avec témérité. Enfin, il y eut Stéphane Schurmans, médecin accoucheur et réanimateur des souris, dont la présence m’a réconforté pendant ma dernière épreuve privée.

Notre chemin a croisé celui de quelques mercenaires, Sylvie de Toulouse charmante et accueillante, elle vous fera découvrir sa cité rose et ses restaurants (cela vaut le détour). Katrien d’Oostende, une courageuse rameuse avec qui j’ai agréablement partagé ma belgitude et notre paillasse (pour les non-averti(e)s et mauvaises langues, je précise que la paillasse, au labo, est bien notre table de travail). Dirk, l’Anversois, qui s’est impliqué dans la mise au point de l’HPLC.

Fafa, le petit Spirou, qui n’en a que l’aspect extérieur car ses idées sont bien tranchées. Son amitié « virile » m’a été d’un grand secours dans ce monde très féminisé, même si parfois je me dis que c’est lui qui aurait eu besoin de secours... Merci pour les séances de stretching, bon vent et bonne chance pour ta nouvelle expédition vers le nouveau monde.

Et puis, il y a toutes les personnes de l’IRIBHM toujours disposées à vous conseiller. Je songe ici plus singulièrement à Cathy, Joëlle, Christian et Joseph dont la disponibilité et l’aide sont précieuses. J’aimerais également exprimer ma gratitude à tous nos voisins de palier (Stéphane le professeur ès gravité appliquée, les filles de la culture et des « mycoses ») avec qui nous avons partagé l’étage et ces années.

Mon parcours n’a pu se passer de l’avis d’experts. Catherine Bruyns qui est

parvenue à m’initier à l’approche scientifique, à m’aider à faire le lien entre la

biochimie et la biologie. Bernard Payrastre et Lens Stephens, deux spécialistes

de la manipulation de ces insaisissables phospholipides. Tous deux anciens

joueurs de rugby ! Bernard est prêt à passer la nuit au labo avec vous, et Lens

n’hésite pas à vous accueillir à toute heure dans sa charmante maison de la

banlieue de Cambridge. J’aimerais remercier ici tous les membres du jury et en

particulier ceux dont ce n’était pas le domaine de prédilection pour leur

investissement et leurs critiques constructives du travail. J’aimerais également

remercier les professeurs Peter Parker et Louis Hue. Par leur reconnaissance et

leur intérêt, ils ont soulagé les frustrations essuyées lors de ces années de

recherche. Ce fut un honneur pour moi qu’ils aient accepté de faire partie de mon

jury. Je tiens à remercier le professeur Gilbert Vassart de m’avoir accueilli dans

son laboratoire et le professeur Jacques Devière d’être intervenu auprès de la Faculté et de m’avoir libéré de mes tâches cliniques, le temps nécessaire.

Bien évidemment, je n’aurais pu y arriver sans l’amour de mes proches et de ma famille (nombreuse) que je ne vais pas énumérer ici. Ils se reconnaîtront. Je pense en particulier à Anne la compagne de ma vie, Margaux et Barbara, ses enfants, qui ont partagé mon quotidien et m’ont permis de porter, aujourd’hui, un regard nostalgique sur ces belles années.

Durant ce travail, j’ai été financé par le FNRS et le Fonds Erasme.

COMPOSITION DU JURY

1. Michael Adler. Département de Gastroentérologie et d’hépatopancréatologie médicales, Hôpital Erasme, U.LB, Belgium

2. Christophe Erneux (Directeur de thèse). I.R.I.B.H.M., Faculté de Médecine (Erasme), U.L.B., Belgium

3. Louis Hue (Expert extérieur). I.C.P. Unité HORM., Faculté de Médecine (Bruxelles), U.C.L., Belgium

4. Peter Parker (Expert extérieur). Cancer Research UK London Research Institute (London), United Kingdom

5. Jeanne Rasschaert. Laboratoire de Medicine Expérimentale, Faculté de Médecine (Erasme), U.L.B., Belgium

6. Stéphane Schurmans (à titre privé). I.B.M.M., Faculté de Médecine (Gosselies), U.L.B., Belgium

7. Michal Svoboda. Département de Biochimie et de Nutrition, Faculté de Médecine (Bruxelles), U.L.B., Belgium

8. Magali Waelbroeck (Présidente du jury). Département de Biochimie et de Nutrition,

Faculté de Médecine (Bruxelles), U.L.B., Belgium

TITRE DE LA THESE ANNEXE

Rôle de l'acide phytique dans la prévention des hépatopathies éthyliques.

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES...i

ABREVIATIONS... vi

RESUME... 1

I. INTRODUCTION... 4

IA. LE METABOLISME DES PHOSPHOINOSITIDES ... 5

I.A.1. Généralités... 5

I.A.2. Métabolisme classique... 6

I.A.3. Le métabolisme du Ptdlns(5)P... 7

I.A.4. Métabolisme des D-3 phosphoinositides...8

I.A.4.1. Le Ptdlns(3)P... 8

I.A.4.2. Le Ptdlns(3,5)P2... 8

I.A.4.3. Le Ptdlns(3,4,5)P3...9

I.A.4.4. Le Ptdlns(3,4)P2... 10

I.A.5. Les domaines protéiques de reconnaissance des phosphoinositides... 11

I.A.5.1. Les domaines PH... 11

I.A.5.2. Les domaines PX...12

I.A.5.3. Les domaines PA/E... 12

I.A.5.4. Les domaines FERM... 12

I.A.5.5. Les domaines ENTH... 13

I.A.5.6. Les régions riches en résidus basiques...13

I.A.5.7. Le domaine C2...13

I.A.5.8. Le domaine Tubby... 14

I.A.5.9. Les domaines non caractérisés... 14

I.B. LES ENZYMES DU METABOLISME DES D-3 PHOSPHOINOSITIDES ... 15

I.B.1. La famille des phosphoinositides 3-kinases...15

I.B. 1.1. Les PI 3-kinases de classe 1... 15

I.B.1.1.1. PI 3-kinase de classe IA... 15

I.B1.1.2. PI 3-kinase de classe IB... 16

I.B.1.2. Les PI 3-kinases de classe II... 16

I.B.1.3. Les PI 3-kinases de classe III... 17

I.B.2. Les phosphatidylinositols 3-phosphatases...17

I.B.2.1. PTEN... :... 17

I.B.2.2. La famille des myotubularines... 18

I.B.3. Les phosphatidylinositols 4-phosphatases...19

I.B.4. Les inositols 5-phosphatases... 19

I.B.4.1. Généralités... 19

I.B.4.2. Les GIPs (GAP domain-containing inositol 5-phosphatases)... 19

I.B.4.2.1. La protéine INPP5P... 20

I.B.4.2.2. La protéine OCRL... 20

I.B.4.3. Les SCIPs (Sac-lp containig inositol 5-phosphatases)...20

I.B.4.3.1. La synaptojanine-1... 21

I.B.4.3.2. La synaptojanine-2... 21

I.B.4.4. SKIP (Skeletal muscle and kidney enriched 5-phosphatase)... 21

I.B.4.5. Les PIPs (Proline-rich containing 5-phosphatases)... 21

ii

I.B.4.5.1. La Phârbine, ou la 5-phosphatase de 72 kDa, ou l’inositol polyphosphate

5-phosphatase humaine de type IV...

I.B.4.5.2. PIPP (Prolin-rich inositol polyphosphate 5-phosphatase)...

I.B.4.6. Les SHIPs (SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatases)...

I.B.4.6.1. SHIP1...

I.B.4.6.1.a. Structure...

I.B.4.6.1.b. Expression...

I.B.4.6.I.C. Activité...

I.B.4.6.1.d. La signalisation négative dans les lymphocytes B...

I.B.4.6.1.e. Régulation...

I.B.4.6.1.f. Fonctions biologiques...

I.B.4.6.1.g. Mécanismes moléculaires d’action...

I.B.4.6.1.h. Application physiopathologique...

I.B.4.6.2. SHIP2...

I.B.4.6.2.a. Structure...

I.B.4.6.2.b. Expression...

I.B.4.6.2.C. Activité...

I.B.4.6.2.d. Régulation...

I.B.4.6.2.e. Fonctions biologiques...

I.C. LA SIGNALISATION DU RECEPTEUR A L’INSULINE ...

I.C.1. Généralités...

I.C.2. Mécanisme d’activation...

I.C.3. Recrutement de protéines adaptatrices par le récepteur à l’insuline...

I.C.4. Les voies de signalisations induites par le récepteur de l’insuline...

I.C.4.1. La voie de signalisation des des petites protéines G... ...

I.C.4.1.1. Ras et les MARK (« Mitogen activated-protein kinases »)...

I.C.4.1.2. Les autres petites protéines G...

I.C.4.2. La voie de signalisation passant par la PI 3-kinase...

I.C.4.2.1. la protéine kinase B (PKB)...

I.C.4.2.2. la P70 S6 kinase (p70®®'^)...

I.C.4.2.3. les proteines kinases C-Ç et -A (PKC-Ç et -A)...

I.C.4.3. les protéines phosphatases...

I.C.5. Les effets terminaux de l’insuline...

I. D. PHYSIOPA THOLOGIE HUMAINE DU METABOLISME DES PHOSPHOINOSITIDES.

I.D.1. La maladie de Cowden...

I.D.2. Le syndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba ou syndrome de Bannayan-Zonana...

I.D.3. La maladie de Lowe...

I.D.4. La myopathie myotubulaire liée à l’X (XLMTM)...

I.D.5. Les syndromes de Charcot Marie Tooth type 4B1 et 4B2...

I.D.6. L’agammaglobulinémie liée à l’X ou la maladie de Bruton...

I.D.7. La maladie granulomateuse chronique (MGC)...

I.D.8. Diabète de type 2...

I.D.9. Cancer...

II. BUTS ET STRATEGIES...

III. METHODOLOGIE...

IIIA. OUTILS D’ETUDES DES PHOSPHOINOSITIDES ...

22 22 22 22 22 23 23 23 24 25 26 27 27 .27 27 28 .28 28 .31 31 31 .32 .32 .32 .33 .34 35 .35 .36 .36 .37 .38 .39 .39 .39 .40 .41

.41 .42 42 .43 .44 .46 .48 .49

III.A.1 Production des D-3 phosphoinositides 49

III.A.1.1 Préparation de la PI 3-kinase... 49

III.A.1.2 Préparation du substrat radioactif...50

III.A.2 Dosage d’activité Rdlns(3,4,5)P3 5-phosphatase... 50

III.A.2 1.Dosage d’activité Ptdlns(3,4,5)P3 5-phosphatase : méthode radioactive...51

III.A.2 2.Dosage d’activité Ptdlns(3,4,5)P3 5-phosphatase : méthode des substrats fluorescents.51 III.A.2 3.Dosage d’activité Ptdlns(3,4,5)P3 5-phosphatase : méthode au vert de malachite... 51

III. A.3 Mesures des phosphoinositides en cellules intactes... 52

IV. RESULTATS EXPERIMENTAUX... 53

IV.A. SHIP2 DEPHOSPHORYLE IN VITRO LE PHOSPHATIDYLINOSITOL(3,4,5)P3 ET LE PHOSPHA TIDYLINOSITOL(4,5)Pz ...54

IV. A.1.: SHIP2 overexpression strongly reduces the prolifération rate of K562 erythroleukemia Cell line... 54

IV. B. SHIP2 PARTICIPE AU METABOLISME DU PHOSPHATIDYLINOSITOL(3,4,5)P3 EN CELLULES INTACTES ...61

IV.B.1 : The SH2 domain containing inositol 5-phosphatase SHIP2 Controls phosphatidylinsitol 3,4,5-fnsphosphate levels in CHO-IR cells stimulated by insulin... 61

IV. B.2 : Phosphatidylinositol 3,4,5-fr/sphosphate modulation in SHIP2-deficient mouse embryonic fibroblasts....!... 69

V. DISCUSSION... 82

V.A. SHIP2 EST UNE PHOSPHATIDYLINOSITOL(3,4,5)P3 5-PHOSPHATASE LIEE A LA VOIE DE SIGNALISATION DE L’INSULINE ... 83

V. A.1. L’activité Ptdlns(3,4,5)P3 5-phosphatase décrite par Guilherme (Guilherme et al, 1996) est attribuable à SHIP2...84

V.A.2. SHIP2 est phosphorylé sur tyrosine en réponse à différents stimuli extracellulaires, dont l’insuline... 84

V.A.2.a. La phosphorylation sur tyrosine de SHIP2 affecte-t-elle son activité enzymatique ?... 85

V.A.2.b. La phosphorylation sur tyrosine de SHIP2 affecte-t-elle ses interactions protéiques ?....86

V.A.3. Hypothèses sur la biochimie de SHIP2 dans la voie de signalisation de l’insuline...87

V. B. SPECIFICITE DE SUBS TRA T DE SHIP2 ... 87

V.C. SHIP2 CONTROLE LE PHOSPHATIDYLINOSITOL(3,4,5)P3 EN CELLULES INTACTES ET MODULE L’ACTIVITE PKB ... 88

V.C.1. Effets de la surexpression de SHIP2 sur la production de Ptdlns(3,4,5)P3 et l’activation de la PKB...89

V.C.2. Effets de la sous-expression de SHIP2 sur la production de Ptdlns(3,4,5)P3 et l’activation de la PKB... 91

V.C.3. Conclusions...93

V.C.3.a. SHIP2 et les phosphoinositides... 93

V.3.C.2. SHIP2 et la PKB... 93

V.D. LES EFFETS PHOSPHATIDYLINOSITOL(3,4,5)P3-INDEPENDANTS DE SHIP2 ... 94

VE. SPECIFICITE DE SHIP2 POUR LA VOIE DE L’INSULINE ... 95

IV

V. F. PROCESSUS BIOLOGIQUES MODULES PAR SHIP2 ... 97

V.F.1. Le point de vue du biochimiste...97

V.F.I.a. Le métabolisme des phosphoinositides et les protéines à domaine PH qui en dépendent...97

V.F.lb. Les MARK...99

V.F.1.C. Le cytosquelette... 99

V.F.ld. CAP/Cbl/TC10/C3G... 99

V.F.I.e. La signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase...100

V.F.2.Le point de vue du physiologiste... 101

V.F.2.a. Insuline... 101

V.F.2.b. Diabète sucré de type 2...102

V.F.2.C. Obésité... 103

V.F.2.C. Prolifération / Cancer / Métastase...104

V.F.2.d. Système hématopoïétique...104

VI. PERSPECTIVES... 106

VII. BIBLIOGRAPHIE...108

VIII. ANNEXES... 137

VIII.A. THE TWO-SH2_CONTAINING INOSITOL 5-PHOSPHATASES SHIP1 AND SHIP2 ARE COEXPRESSED IN HUMAN T LYMPHOCYTES ... 138

VIII.B. THE TERMINATION OF PI 3K SIGNALLING BY SHIP1 AND SHIP2 INOSITOL 5-PHOSPHA TASES ... 146

vue. SHIP2 INTERACTION WITH CYTOSKELETAL PROTEIN VINEXIN ... 162

ABREVIATIONS

ABREVIATIONS

ABREVIATIONS

aPKC : protéines kinases C atypiques BCR : « B cell receptor »

BLC : « B-lymphocyte chemoattractant » BMMC : « bone marrow-derived mast cells » Btk ; « Bruton’s tyrosine kinase »

BSA : « bovine sérum albumine »

CHO-IR ; lignée cellulaire d’ovaire d’hamster chinois transfectée de façon stable par le récepteur à l’insuline

Cpm : coup de désintégration par minute

COS-7 : lignée cellulaire de rein de singe vert d’Afrique DAG : sn 1,2-diacylglycérol

DAPP-1/2 : « dual adaptatorfor phosphotyrosine and 3-phosphoinositides-1/2 » DTT ; DL-Dithiothreitol

EEA-1 : « early endosomal antigen-1 » EGF : « epidermal growth factor » ENTH : « epsin NH2-terminal homology »

Erk-1/2: « extracellular signal regulated protein kinase-1/2 » F

RII : récepteur à la portion constante des IgG de type II F

RI : récepteur à la portion constante des IgE de type I FERM : « Four.one, Ezrin, Radixin, Moesin »

FGF : « fibroblast growth factor »

fMLP : « formyl methionyl leucyl phenylalanine » FYVE : « Fab-1p, YoTB, Vps27p and EEA-1 » Gab-1 : « Grb2 associated binder-1 »

GAP : « guanosine triphosphate phosphatase activating protein » GDI : « guanosine diphosphate dissociation inhibitor »

GDS : « guanosine diphosphate dissociation stimulator » GEF : « guanine nucléotide exchange factor »

GLUT-4 : transporteur du glucose de type 4

GM-CSF : « granulocyte/macrophage-colony stimulating factor » GPCR : récepteur couplé aux protéines G

Grb-2 : « growth factor receptor binding protein-2 »

vii

Grp-1 : réœptelir général aux phosphoinositides HGF : « hépatocyte growth factor »

ICAM : « intercellular adhesion molécules » IGF-1 : « insulin-like growth factor-1 »

IGF-1R : « insulin-like growth factor-1 receptor » InslP : inositol 1-phosphate

lns(1,4,5)P3 : inositol 1,4,5-fr/sphosphate

lns(1,3,4,5)P4 : inositol 1,3,4,5-fefra/c/sphosphate

IpgD : appareil de sécrétion de type III de Shigella flexneri IR : « insulin receptor »

IRS-1 : « insulin receptor substrate-1 »

ITAM : « immunotyrosine-based activation motif » ITIM : « immunotyrosine-based inhibitory motif » KO : knock-out

LPS : lipopolysaccharide

MCP-1 : « monocytes chemoattractant protein -1 » M-CSF : « macrophage-colony stimulating factor » MeOH : methanol

MTM : myotubularine

NADPH : forme réduite du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate OMP25 : « outer membrane protein of 25 kDa »

PA : acide phosphatidique

PBMC : « peripheral blood mononuclear cells » PDGF : « platelet derived growth factor »

PDK-1/2 : kinases dépendantes de D-3 phosphoinositides -1/2 PDZ : « PSD-95/D1g/ZO-1 »

PECAM : “platelet endothélial cell adhesion molécule”

PEST : riche en prolines, acides glutamiques, sérines et thréonines PH : « plekstrin homology »

PHOX : « phagocytic oxydase »

PI 3-kinase(PI 3K) : phosphoinositide 3-kinase

PI 4-kinase(PI 4K) : phosphoinositide 4-kinase

PI 5-kinase(PI 5K) : phosphoinositide 5-kinase

PITP : protéine transporteuse de phosphoinositides

.

PKB : protéine kinase B PKC : protéine kinase C PLC : phospholipase C PLD : phospholipase D

PTB ; « phosphotyrosine binding domain »

PTEN : phosphatase et homologue à la tensine délétée sur le chromosome 10 PtdChol : phosphatidylcholine

PtdSer : phosphatidylsérine Ptdins (PI) : phosphatidylinositol

Ptdlns(3)P (PI(3)P) : phosphatidylinositol 3-monophosphate Ptdlns(4)P (PI(4)P) : phosphatidylinositol 4-monophosphate Ptdlns(5)P (PI(5)P) : phosphatidylinositol 5-monophosphate Ptdlns(3,4)P2 (PI(3,4)P2) : phosphatidylinositol 3,4-b/sphosphate Ptdlns(3,5)P2 (PI(3,5)P2) : phosphatidylinositol 3,5-b/sphosphate Ptdlns(4,5)P2 (PI(4,5)P2) : phosphatidylinositol 4,5-b/sphosphate

Ptdlns(3,4,5)P3 (PtdInsPa ou encore PIP3) : phosphatidylinositol 3,4,5-fr/sphosphate PTK : protéine tyrosine kinase

PX : domaine d’homologie à PHOX RTK : récepteur à activité tyrosine kinase SCF : « stem cell factor »

SDF-1 : « stromal cell-derived factor-1 » SDS : dodécylsulfate de sodium

Shc : « Src homology and collagen-related » SH2 : « Src homology 2 domain »

SH3 : « Src homology 3 domain »

SHIP : « SH2 containing inositol phosphatase »

SHP-1/2: « SH2 containing protein tyrosin phosphatase -1/2 »

SopB/SigD : appareil de sécrétion de type III de Salmonella typhimurlum/enterica/dublln Sos : « Son of sevenless »

TAPP-1/2 ; « tandem PH-domain-containing protein -1/2 » TCR ; « T cell recptor »

TLC : « thin layer chromatography » Tris : tris (hydroxyméthyl) aminoéthane

IX

RESUME

RESUME

1

RESUME

Au-delà de leur rôle de constituant de la membrane plasmique, les phospholipides participent de façon dynamique à de nombreuses voies de signalisation.

Le phosphatidylinositol 4,5-b/sphosphate est un de ces phospholipides. Il est à la base de la voie de signalisation passant par une phosphoinositide 3-kinase qui phosphoryle le phosphatidylinositol 4,5-b/sphosphate en phosphatidylinositol 3,4,5-frisphosphate. Le Ptdlns(3,4,5)P3 est un second messager essentiel, notamment des récepteurs antigéniques des lymphocytes, des récepteurs aux facteurs de croissance et à l’insuline.

Les enzymes qui régulent les taux de ces phosphoinositides sont déterminantes au maintien de l’homéostasie. Les inositols et phosphatidylinositols 5-phosphatases constituent une famille d’isoenzymes capables de déphosphoryler en position D-5 le cycle inositol de l’inositol 1,4,5-fr/sphosphate, l’lns(1,3,4,5)P4 du Rdlns(4,5)P2 et du Ptdlns(3,4,5)P3. SHIP2 une nouvelle enzyme de cette famille, qui présente de nombreux domaines d’interaction protéique, a été clonée au laboratoire. Les souris invalidées pour le gène de SHIP2 présentent une sensibilité accrue à l’insuline in vivo.

Notre travail s’inscrit dans le cadre de la recherche des mécanismes moléculaires d’action de SHIP2 dans la signalisation de l’insuline. En effet, si SHIP2 est une 5-phosphatase, ses modules d’interaction laissent suspecter d’éventuels autres modes d’actions, comme sur celle de la voie des MAPK (« mitogen activated protein kinase »).

Dans une première phase du travail, nous avons pu montrer, in vitro, la spécificité de substrat de SHIP2 pour le Rdlns(3,4,5)P3 et, dans une moindre mesure, pour le Rdlns(4,5)P2. Ensuite, nous avons pu déterminer par des expériences de surexpression de SHIP2 dans un modèle de cellules transfectées de façon stable par le récepteur de l’insuline, les CHO-IR, que SHIP2 y contrôle de façon négative (en réponse à l’insuline), (1) les taux de Ptdlns(3,4,5)P3 produits en cellules intactes, (2) l’activité d’une protéine kinase dépendant des taux de Ptdlns(3,4,5)P3, la PKB et enfin (3) l’activation des MAPK. Ces résultats confirment le rôle de régulateur négatif de SHIP2 sur les deux grandes voies de signalisation induites par l’insuline, celle de la PI 3-kinase et de la PKB et celle des MAPK.

Nous avons alors étudié le métabolisme du Rdlns(3,4,5)P3 dans des cellules

issues des souris déficientes pour SHIP2 (SHIP2'), les fibroblastes embryonnaires

(MEF). Dans ce modèle, aucune modulation des taux de Rdlns(3,4,5)P3 n’a été

observée en réponse à de hautes doses d’insuline. Toutefois, la stimulation de ces

cellules par du sérum a permis de mettre en évidence une production significativement

accrue du second messager dans les MEF SHIP2'^' par rapport aux MEF SHIP2'^'^. Cette

modulation ne s’observe que lors des premières minutes de stimulation. En effet, après

trente minutes de stimulation des fibroblastes par le sérum, plus aucune différence n’est

mesurable. Cette modulation des taux de Rdlns(3,4,5)P3, en cellules intactes,

s’accompagne d’une régulation positive de l’activité de la PKB. De façon intéressante,

l’activité des MAPK en réponse au sérum n’est pas différente dans les MEF SHIP2^''^ et

SHIP2'^'. Nos données mettent en exergue le lien étroit entre SHIP2 et le contrôle aigu

des taux de Ptdlns(3,4,5)P3 et son rôle de régulateur négatif de l’activité PKB.

SUMMARY

Beyond their rôle as membrane components, phospholipids are essentiels forthe régulation of many intracellular signalling pathways. The phosphatidylinositol 4,5- b/sphosphate is one of these phospholipids leading to the formation of two second messangers: the soluble Inositol trisphosphate and the phosphatidylinositol trisphosphate. PI 3-kinase that produce Rdlns(3,4,5)P3 from Ptdlns(4,5)P2 plays a central in lymphocytes antigenic receptors (BCR and TCR), growth factors and insulin receptors signalling. Kinases, phosphatases and phospholipases, tightiy regulating the phosphoinositides levels are essentiels to maintain homeostasis. Among them, SHIP2 is a inositols and phosphatidylinositols 5-phosphatases belonging to a family of enzymes able to dephosphorylate in D-5 position of the inositol ring from inositol 1,4,5- fr/sphosphate, lns(1,3,4,5)P4, Rdlns(4,5)P2 and Ptdlns(3,4,5)P3. SHIP2 belongs to this family. The sequence of SHIP2 has been cloned in the laboratory and présents numerous proteic binding domains, presumed as regulatory domains. The SHIP2 gene knock-out mice has been shown to présent an increase of sensitivity to insulin in vivo.

The aim of our work was to study the action of SHIP2 in the insulin receptor signalling pathway. We will investigate the rôle of the catalytic activity of SHIP2 as a 5- phosphatase but aiso its ineraction modules suspected to be other potentiel mechanisms to modulate different signalling pathways, as the MARK (« mitogen activated protein kinase ») pathways.

In the first part of the work, we hâve demonstrated that substrate specificity of SHIP2 5-phosphatase activity is mainly directed, in vitro, against Rdlns(3,4,5)P3 and to a lesser extent against Rdlns(4,5)P2. We hâve next determined in a mode! of stably transfected cells with the insulin receptor (CHO-IR) that overexpression of SHIP2 Controls there (in response to insulin stimulation), (1) the Ptdlns(3,4,5)P3 levels produced in intact cells, (2) a Ptdlns(3,4,5)P3 levels dépendent kinase, PKB and finaly (3) the MARK activation. These results confirmed that SHIP2 plays a rôle of down regulator on the two main signalling pathways induced by the insulin receptor, namely the PI 3- kinase/PKB and the MARK pathways.

We then studied Ptdlns(3,4,5)P3 metabolism in SHIP2 déficient mouse embryonic fibroblasts, isolated from knock-out mice (MEF SHIP2 '' and SHIP2'''*). In this cell model, any modulation of the Rdlns(3,4,5)P3 levels haven’t been observed in response to high doses of insulin stimulation. Nevertheless, sérum stimulation of these cells, showed an increase in the production of PIP3 in SHIP2'^' cells in comparison to the SHIP2^'^ MEF cells. This modulation is only observed within the first minutes of stimulation. Indeed, afterthirty minutes of sérum stimulation, no more différence, in terms of Ptdlns(3,4,5)P3 levels, could be measured. We demonstrated that this Rdlns(3,4,5)P3 levels modulation in intact cells could be related with the PKB activity, which is aIso up regulated in the SHIP2 '- MEF cells stimulated by the sérum. Interestingly, the sérum stimulated MARK activity is not different between the two types of MEF cells. Thus our dataset highiight the link between SHIP2 and the acute control of the Rdlns(3,4,5)P3 production and its rôle of down regulator of the PKB activity.

3

I. INTRODUCTION

I. INTRODUCTION

j'—^Fattyadd

44. j|>-»Glycarol

ADP

PhosphabdyNnoailo)

= Pidins

Figure 1. Représentation simplifiée du Ptdins et du site d’action de la PI 3-kinase.

In vivo, l’acide gras qui occupe la position 1 est un acide stéarique et la position 2 un acide arachidonique.

MTM(R) Ptdlns(3)P ^ » PI 3K(III)

Ptdins .Q>

(0

<0

a a

PTEN

PI 5K (III)

Ptdlns(5)P 0 ⁾

(0

(0 a a

Ptdlns(3,4)P2 4 ► Ptdlns(4)P

PLIP

PI 5K

O O) a

Ptdlns(4,5)P2 PLC

DAG +

lns(1,4,5)P3 Figure 2. Le métabolisme général des phosphoinositides

Les différents phosphoinositides sont indiqués en noir. Les flèches noires indiquent le

sens de la réaction catalysée par l’enzyme juxtaposée (en rouge). Le chiffre romain mis

entre parenthèses à coté des kinases symbolise le type de kinase responsable de la

Nous avons voulu être complet dans l’introduction, ce qui permet au lecteur non averti de comprendre la suite mais, bien entendu, il n’est pas nécessaire pour le spécialiste de relire ces notions de base. Afin de mettre en relief nos travaux, cette revue de la littérature a volontairement été interrompue à l’année 2001, date du début de nos travaux.

LA. LE METABOLISME DES PHOSPHOINOSITIDES

I.A.I. Généralités

Le phosphatidylinositol (Rdins), pierre angulaire du métabolisme des inositols lipides en cellules eucaryotes, consiste en une molécule de D-myo-inositol 1-phosphate (InslP) et une autre de diacylglycérol (DAG) reliée par un lien phosphodiester (voir figure 1 ; Berridge et Irvine, 1989). La tête polaire de ce phospholipide, le cycle inositol, présente cinq groupes hydroxyls disponibles, dont seuls trois d’entre eux, en position D- 3, D-4 et D-5, peuvent être phosphorylés in vivo. Le Rdins et ses dérivés phosphorylés constituent les phosphoinositides. Sept phosphoinositides phosphorylés ont été identifiés en cellules eucaryotes. On distingue donc le Rdins (PI) i) des phosphatidylinositol monophosphates (RdInsP), soit le Rdlns(3)P, le Ptdlns(4)P et le Rdlns(5)P, ii) des phosphatidylinositol b/sphosphates (PtdlnsP2), soit le Ptdlns(3,4)P2, le Rdlns(3,5)P2 et le Ptdlns(4,5)P2, du phosphatidylinositol fr/sphosphate (Rdlns(3,4,5)P3) le Rdlns(3,4,5)P3- Si le Rdins, le Ptdlns(4)P et le Rdlns(4,5)P2 représentent respectivement 90%, 5% et 5% des phosphoinositides totaux dans la cellule au repos, ces derniers ne constituent que 10% de la masse phospholipidique totale de la membrane plasmique eucaryote (Rameh et Cantley, 1999).

Le métabolisme des phosphoinositides est à l’origine de la production de seconds messagers intracellulaires responsables d’une variété de réponses cellulaires suite à l’activation par différents stimuli, tels que des facteurs de croissance, des hormones ou encore des neurotransmetteurs (Carpenter et Cantley, 1996; Toker, 1998). Ce métabolisme, finement régulé par l’intervention de kinases, de phosphatases et de phospholipases, comprend deux voies majeures : celle du métabolisme dit

« classique » qui mène à la formation d’inositols polyphosphates solubles et de diacylglycérol (DAG) et l’autre, qui dépend de la phosphoinositide 3-kinase (PI 3-kinase) et mène au métabolisme des D-3 phosphoinositides (voir figure 2). Plus récemment, une troisième voie de signalisation a été mise en évidence, celle-ci est initiée par la phosphorylation en position D-5 du Ptdins via une phosphatidylinositol 5-kinase (Tolias et ai., 1998).

La plupart des phosphoinositides exercent leur effets biologiques par le recrutement et ou l’activation, sur le site de leur production, de protéines comportant en leur sein un domaine capable d’interagir avec le phospholipide. Plusieurs domaines protéiques d’interaction avec les phosphoinositides existent. Leur analyse structurale a permis la caractérisation de différents modules de liaison aux phosphoinositides présentant des spécificités et des affinités propres. Les domaines PH, FYVE, FERM, ENTH, C2, Tubby ou encore PX représentent les différents modules les mieux

5

Contexte (tissus, type cellulaire, état nutritionnel, agoniste, ...)

Enzyme(s) 4

PtdInsPx (localisation dans le temps et l’espace)

Protéine(s) cible(s) effectrice(s) (domaine de liaison aux Pis)

EFFET(S) BIOLOGIQUE(S)

Figure 3. Schéma d’action des phosphoinositides

MTM(Rj PI5K(II1)

Ptdlns(3)P ^ Ptdins ^ Ptdlns(5)P

lns(1,4,5)P3 Figure 4. Le métaboiisme ciassique des phosphoinositides

Les différents phosphoinositides sont indiqués en noir. Les flèches noires indiquent

le sens de la réaction catalysée par l’enzyme juxtaposée (en rouge). Le chiffre romain

mis entre parenthèses à coté des kinases symbolise le type de kinase responsable de

caractérisés. Ces domaines protéiques cibles des phosphoinositides sont discutés plus loin {cf. section I.A.5.). Le mode d’action général des phosphoinositides est schématisé sur la figure 3.

I.A.2. Métabolisme classique

Le métabolisme des phosphoinositides classiques (Rdins, Ptdlns(4)P et Ptdlns(4,5)P2) a été identifié dans les années 50 notamment par Hokin et Hokin. Cette voie de synthèse mène au Ptdlns(4,5)P2 qui lorsqu’il est hydrolysé par une phospholipase C (PLC) génère deux seconds messagers : rinositol(1,4,5)-fr/sphosphate et le diacylglycérol (DAG) qui permettent respectivement de libérer les réserves intracellulaires de calcium et d’activer des protéines kinases C (PKC) (Berridge et Irvine, 1984; figure 4). Il est communément admis que le Ptdins, le Ptdlns(4)P et le Rdlns(4,5)P2 sont gardés à l’équilibre par des réactions de phosphorylations et de déphosphorylations par des kinases et phosphatases spécifiques. Cette importante voie de synthèse de phosphoinositides constitue ce que l’on appelle « la voie canonique », où le Ptdlns(4)P sert de précurseur métabolique au Ptdlns(4,5)P2, pourvoyant de façon continue la membrane plasmique en substrat pour la phospholipase C (PLC).

Le Ptdins est formé dans le réticulum endoplasmique et transporté vers la membrane plasmique par une protéine transporteur de phosphoinositides (PITP). Si le Rdins est le plus abondant des phosphoinositides, il ne constitue que 10% de tous les glycérophospholipides cellulaires. Ses taux restent constants par le jeu de kinases et de phosphatases.

Le Ptdlns(4)P est obtenu par phosphorylation du Ptdins par un des membres de la famille des PI 4-kinases. Il peut également être produit par la déphosphorylation du Rdlns(3,4)P2 ou du Ptdlns(4,5)P2 respectivement par une phosphatidylinositol 3- phosphatase (Payrastre et al., 1994) et par une phosphatidylinositols 5-phosphatase {cf.

section I.B.4.). Le Ptdlns(4)P fait partie des phosphoinositides présents au repos et dont la concentration ne varie pas sous activation. Il sert de substrat soit à une PI 3-kinase de type II (ou I), soit et surtout à une PtdInsP-kinase de type I générant respectivement du Rdlns(3,4)P2 et du Rdlns(4,5)P2. Le Rdlns(4)P est principalement localisé dans les cellules de mammifères dans l’appareil de Goigi, où il ciblerait des protéines qui y sont également retrouvées (Wang étal., 2003 ; De Mattéis et al., 2004).

Trois voies différentes mènent à la synthèse de Ptdlns(4,5)P2. La voie principale et majoritaire consiste en la phosphorylation par une phosphatidylinositol(4)P 5-kinase du Ptdlns(4)P (Tolias et al., 1998), la deuxième voie consiste en la phosphorylation par une phosphatidylinositol(5)P 4-kinase du Ptdlns(5)P (Rameh et al., 1997) et la troisième est celle qui dépend de la déphosphorylation par une phosphatidylinositol fr/sphosphate 3-phosphatase, appelée PTEN, qui déphosphoryle en position D-3 le Ptdlns(3,4,5)P3 (U et al., 1997 ; Steck et al., 1997). Les taux du Rdlns(4,5)P2 ne varient pas de façon significative malgré des réactions constantes de phosphorylation/déphosphorylation du Ptdlns(4)P et du Rdlns(4,5)P2 par les kinases et phosphatases. Les enzymes de la

6

famille des phosphatidylinositols 5-phosphatases (décrites dans la section I.B.4.) participent activement au métabolisme de ce phosphoinositide. Il existe des phosphatidylinositols 4-phophatases bactériennes (IpgD et SigD/SopB) produites lors de l’invasion cellulaire respectivement par Shigella flexneri et Salmonella typhimurium, qui produisent du Rdlns(5)P à partir de Ptdlns(4,5)P2: par contre, aucune Ptdlns(4,5)P2 4- phosphatase n’a été décrite chez les eucaryotes. Outre son rôle de précurseur de trois seconds messagers différents (DAG, lns(1,4,5)P3 et le Rdlns(3,4,5)P3), le Ptdlns(4,5)P2 semble jouer un rôle dans l’organisation du cytosquelette et du trafic vésiculaire (Rhee et Bae, 1997 ; Corvera et al., 1999 ; Doughman et al., 2003 pour revues). Enfin, une chute rapide des taux de Rdlns(4,5)P2 à la membrane plasmique, peut être à l’origine de changement de localisation de certaines protéines. Ce mécanisme a été mis en évidence lors de l’activation du facteur de transcription Tubby, qui est transloqué vers le noyau lors de l’activation de la PLC (Santagata et al., 2001).

I.A.3. Le métabolisme du Ptdlns(5)P

En raison de sa plus faible quantité (cinquante fois moindre que celle du Rdlns(4)P) dans la cellule et des difficultés de l’isoler de son isomère majoritaire dans la cellule, le Ptdlns(5)P n’a été mis en évidence qu’en 1997 dans des cellules fibroblastiques de mammifères et chez Saccharomyces cerevislae (Rameh et al., 1997).

II est produit. In vitro et in vivo, par la phosphorylation du Ptdins par une phosphatidylinositol 5-kinase, appelée PYKfyve (Shisheva et al., 2001). Une autre voie de synthèse a été très récemment mise en évidence dans différentes lignées cellulaires de mammifères, par la déphosphorylation en position D-3 du Ptdlns(3,5)P2 par une enzyme appartenant à la famille des phosphoinositides 3-phosphatases, la myotubularine MTM-1 (Walker et al., 2001 ; Tronchere et al., 2004). Une phosphatase similaire à PTEN, PLIP, a pour substrat préférentiel, in vitro, le Rdlns(5)P (Pagliarini et al., 2004). La stimulation des plaquettes par la thrombine, une stimulation par un facteur de croissance, l’insuline ou par un stress hyperosmotique accroissent les taux de Ptdlns(5)P (Morris et al., 2000 ; Sbrissa et al., 2004 ; Meijer et al., 2001). Toutefois, à l’heure actuelle, c’est l’infection de cellules de mammifères par Shigella flexneri, via son facteur de virulence IpgD, qui est responsable de la plus forte augmentation intracellulaire de Ptdlns(5)P (Niebuhr et al., 2002). IpgD est une phosphatidylinositol 4- phosphatase qui déphosphoryle spécifiquement en position D-4 le Ptdlns(4,5)P2.

L’infection par Shigella flexneri ou la transfection de cellules par l’IpgD s’accompagne d’une chute dramatique des taux de Ptdlns(4,5)P2, d’une désorganisation du cytosquelette d’actine et d’une activation de la voie de la PI 3-kinase/PKB, par un mécanisme non élucidé à ce jour (décrite ci-dessous) (Niebuhr et al., 2002).

Inversement, la transfection par une phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase, réduit

les taux de Rdlns(5)P ainsi que l’activation de la voie de la PI 3-kinase/PKB en réponse

à l’insuline dans les CHO-IR (Carricaburu et al., 2003). De plus, en réponse à l’insuline

non seulement le Ptdlns(5)P est augmenté dans les CHO-IR et les 3T3-L1 différenciés

en adipocytes, mais sa micro-injection cellulaire induit un désassemblage de l’actine

similaire à celui observé par la stimulation insulinique (Sbrissa et al., 2004). Ces

résultats suggèrent pour ce nouveau phosphoinositide un rôle de second messager

potentiel.

MTM(R) Ptdlns(3)P ^ -»

PI 3K(III)

Ptdins PI 5K

0

C/5

CO

Q.

ex □Z

A PLIP

► Ptdlns(5)P 0 en O

Q.

Q en

Q.

PTEN Ptrilns(3,A)P„ 4 >

PI 5K (IJ 7

Ptdlns(4)P ^ Ptdlns(4,5)P2 PI 3K (1,11) 5-ppase(ll),

Ptdlns(3,4,5)P3

PLC

DAG +

■ns(1,4,5)P, Figure 5. Le métabolisme des D-3 phosphoinositides

Les différents phosphoinositides sont indiqués en noir. Les flèches noires indiquent

le sens de la réaction catalysée par l’enzyme juxtaposée (en rouge). Le chiffre

romain mis entre parenthèses à coté des kinases symbolise le type de kinase

responsable de la transformation enzymatique considérée.

I.A.4. Métabolisme des D-3 phosphoinositides

Nous exposerons ici, de façon succincte, les voies de synthèse et de métabolisme des différents D-3 phosphoinositides, ainsi que leurs cibles principales (voir figure 5). Les enzymes responsables de leur métabolisme seront exposées au chapitre I.B. Les D-3 phosphoinositides, découverts à la fin des années 80 (Whitman et al., 1988; Auger et al., 1989a), représentent moins de 1% des phosphoinositides totaux dans la cellule au repos et ont un métabolisme plus versatile que ceux du métabolisme classique, laissant penser qu’ils sont impliqués dans des phénomènes régulés plutôt que structurels (Rameh et Cantley, 1999). En fonction du type cellulaire et de la stimulation appliquée, plusieurs voies de synthèse peuvent être envisagées, toutefois on notera que les D-3 phosphoinositides ne sont hydrolysés par aucune isoforme connue de PLC.

I.A.4.1. Le Ptdlns(3)P

Constitutivement présent dans les cellules de mammifères, quoiqu’en faible quantité (5-15% de tous les RdInsP), ce phosphoinositlde est principalement produit. In vitro, par la phosphorylation du Rdlns par n’importe quelle PI 3-kinase. Sa voie de synthèse chez les mammifères implique principalement la PI 3-kinase de type III, homologue de la protéine vps34, responsable chez Saccharomyces cerevisiae de la synthèse des D-3 phosphoinositides (Auger et al., 1989b ). Le Rdlns(3)P pourrait aussi être obtenu par déphosphorylation du Ptdlns(3,4)P2 par une activité Ptdins 4- phosphatase (Morris et Majerus, 1994).

Dans la cellule le Rdlns(3)P peut être soumis à des réactions de phosphorylation par des kinases ou de déphosphorylation par des phosphatases.

Toutefois ses taux intracellulaires semblent ne pas varier de façon aiguë. Le Ptdlns(3)P peut être le substrat d’une activité PtdInsP 4-kinase potentielle, menant à la synthèse de Rdlns(3,4)P2 (Banfic et al., 1998a). Il a surtout été démontré que le Ptdlns(3)P était le substrat d’une PI 5-kinase appelée PIKfyve, générant de la sorte un nouveau second messager, le Ptdlns(3,5)P2 (Dove et al., 1997 ; Whiteford et al., 1997). Enfin le Rdlns(3)P peut être déphosphorylé par des phosphoinositides 3-phosphatases de la famille des myotubularines {cf. section I.B.2. ; Tronchère et al., 2003 pour revue).

Le concept de la fonction de régulateur du trafic vésiculaire du Ptdlns(3)P repose principalement sur les données obtenues chez la levure. En effet, chez Saccharomyces cerevisiae, la délétion de la kinase responsable de sa synthèse, vps34, engendre des perturbations du trafic vésiculaire de l’appareil de Goigi vers les vacuoles (Schu et al., 1993). De plus, il a été mis en évidence récemment l’existence d’un pool de Ptdlns(3)P au métabolisme plus rapide tel que, par exemple, celui qui apparaît dans les microdomaines plasmiques (rafts) de cellules stimulées par l’insuline (Maffucci et al., 2003).

I.A.4.2. Le Ptdlns(3,5)P2

Initialement isolé chez la levure et dans des fibroblastes de mammifères, le

Rdlns(3,5)P2 résulte de la phosphorylation en position D-5 du Ptdlns(3)P par un PtdInsP

5-kinase appelée Fab-1 chez la levure et PIKfyve chez les mammifères (Dove et al.,

1997 ; Whiteford et al., 1997). Il peut aussi être obtenu par phosphorylation du

Ptdlns(5)P en position D-3 par une PI 3-kinase de type I (Rameh et al., 1997). L’unique

Tableau 1. Fonctions des cibles classiques des D-3 PtdInsPx Phosphoinositides W ^ Ciblés protéiques Fonctions

Ptdlns(3)P EEA-1 Trafic membranaire

Ptdlns(3,5)P2 ^afic vésiculaire, « osmo-protecteur »

KM

. .

Ptdlns(3,4)P2, Ptdlns(3,4,5)P3 PDK, PKB, aPKC Survie, prolifération, métabolisme Gab-1 f ;; J ^ Prolifération

Vav/Rac ’ Mobilité cellulaire, cytosquelette Ptdlns(3,4,5)P3 ^ - Grp-1/Arno Effets Arf-dépendants

(Bourgeonnement vésiculaire)

Btk Maturation lymphocytes B

métabolisme caractérisé pour le Ptdlns(3,5)P2 consiste à être déphosphorylé par une des PI 3-phosphatases de la famille des myotubularines {cf. section I.B.2. ; Tronchére et al., 2003 pour revue)

Un stress hyperosmotique tant chez la levure que dans des fibroblastes 3T3 ou suite à l’exposition de cellules de mammifères aux rayonnements ultraviolets entraînent une production aiguë de Rdlns(3,5)P2 (Dove et al., 1997 ; Sbrissa et Shisheva, 2005 ; Toker et al., 2002). Ces données suggèrent pour ce phospholipide un rôle de second messager du stress cellulaire induit par le choc osmotique ou le rayonnement ultraviolet.

On notera que chez la levure, la mutation de l’unique kinase produisant du Rdlns(3,5)P2, Fab-1, provoque un agrandissement anormal des vacuoles intracytoplasmiques, laissant présager d’une fonction de régulation du trafic vésiculaire, chez la levure du moins (Yamamoto étal., 1995 ; Cooke et al., 1998).

I.A.4.3. Le Ptdlns(3,4,5)P3

Le Ptdlns(3,4,5)P3 est un second messager principalement localisé à la membrane cellulaire, qui joue un rôle capital dans la signalisation de nombreuses voies.

Sa concentration est finement régulée par l’action intégrée de kinases et de phosphatases (Rameh et Cantley, 1999).

La voie majeure de synthèse du Ptdlns(3,4,5)P3 repose sur la phosphorylation en position D-3 du Ptdlns(4,5)P2 par une PI 3-kinase, principalement de classe I (voir section I.B.1. ; Stephens et al., 1991). Une autre voie de synthèse a été décrite dans les plaquettes sanguines stimulées par la thrombine, dans des fibroblastes stimulés au PDGF et dans Saccharomyces pombe déficient en une phosphatidylinositol 3- phosphatase, homologue de PTEN, appelée Ptn-1 (Cunningham et al., 1990, Cunningham et Majerus, 1991, Mitra et al., 2004). Par l’étude de différents mutants chez la levure, cette autre voie implique l’action de Vps34p (une PI 3-kinase de classe III) et une phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase (Mitra et al., 2004). La concentration du Rdlns(3,4,5)P3 augmente très rapidement (endéans la minute) après stimulation de plaquettes à la thrombine, des neutrophiles au fMLP ou, de fibroblastes au PDGF (Augeref a/., 1989a ; Stephens étal., 1991 ; Auger et Cantley, 1991).

La métabolisation du Rdlns(3,4,5)P3 implique deux voies principales. La première est conditionnée par la déphosphorylation en position D-3 du phospholipide menant à la restauration, ad integrum, du Ptdlns(4,5)P2. Cette réaction est assurée par une Rdlns(3,4,5)P3 phosphatase, produit d’un gène suppresseur de tumeur, appelée PTEN, décrite plus longuement à la section I.B.2. (Li et al., 1997, Steck et al., 1997, Maehama et Dixon, 1998). D’autre part, le Ptdlns(3,4,5)P3 peut être déphosphorylé par des enzymes appartenant à la famille des phosphatidylinositols 5-phosphatases comme les synaptojanines et les protéines SHIP qui sont détaillées à la section I.B.4. (Erneux et al., 1998). Cette réaction de déphosphorylation produit un autre second messager le Ptdlns(3,4)P2, discuté au point I.A.4.4..

Le Ptdlns(3,4,5)P3, une fois produit à la membrane recrute différentes protéines

capables de le lier via un domaine particulier de liaison appelé domaine PH, du fait de

leur homologie avec la plekstrine. Il transloque et active de cette façon des

sérine/thréonine kinases, des phospholipases et des facteurs d’échanges pour

différentes petites protéines G responsables des effets biologiques dans lesquelles il

semble impliqué {cf. tableau 1). Ainsi il est engagé dans la régulation du métabolisme.

la croissance, la prolifération, l’apoptose ou encore des modifications du cytosquelette (Vanhaesebroeck et al., 2001 pour revue). Les cibles protéiques principales du Ptdlns(3,4,5)P3 sont exposées au chapitre I.A.5.. D’autres modes d’interaction on été décrits. Certaines protéines comme la neurogranine, la neuromoduline ou la centaurine a présentent des résidus polybasiques et hydrophobes, ne constituant pas de domaines PH, mais néanmoins capables d’interagir avec le Rdlns(3,4,5)P3 (Lu et Chen, 1997). Il a également été montré, in vitro, que les domaines SH2 des protéines Src, PLCy et p85 (sous-unité régulatrice de la PI 3-kinase de type IA, cf. section I.B.I.a.) lieraient le Rdlns(3,4,5)P3. Malgré la faible affinité de ces interactions, il a été proposé que ce phospholipide pourrait entrer en compétition avec les résidus phosphotyrosines de certaines protéines (Rameh et Cantley, 1999).

I.A.4.4. Le Ptdlns(3,4)P2

En régie générale, la production de Ptdlns(3,4)P2 est stimulée par les agonistes qui induisent la production de Ptdlns(3,4,5)P3. En raison de sa production retardée par rapport à celles du Rdlns(3,4,5)P3, il a longtemps été pensé que sa synthèse était secondaire à la déphosphorylation du Ptdlns(3,4,5)P3 par une 5-phosphatase (Stephens et al., 1993). Toutefois, certains suggèrent que le Rdlns(3,4)P2 puisse s’accumuler indépendamment du Ptdlns(3,4,5)P3. Ceci semble être le cas lors de l’induction du stress oxydatif par le peroxyde d’hydrogène (Gray et al., 1999 ; Van der Kaay et al., 1999) ou lors de l’activation des plaquettes intégrine-dépendante (Banfic et al., 1998a et b). Les voies envisagées consistent en la phosphorylation du Rdlns(3)P par une PI 4- kinase encore inconnue (Banfic et al., 1998a), soit la phopshorylation du Ptdlns(4)P par une PI 3-kinase de classe II voire même de classe I (Carter et al., 1994 ; Turner et al., 1998 ; Arcaro et al., 2000). Le Rdlns(3,4)P2 est potentiellement le substrat pour une RdInsP 5-kinase {cf. la synthèse du Ptdlns(3,4,5)P3), et substrat pour la PI 3- phosphatase PTEN ( Maehama et Dixon, 1998 ; Myers étal., 1998). Trois Ptdlns(3,4)P2 4-phosphatases ont été isolées, deux chez les mammifères les PI 4-phosphatases de type I et II et la troisième chez Salmonella dublin, SopB (Morris et al., 1995, 1997 et

1998). La PI 4-phosphatase de type I formerait un complexe protéique avec la PI 3- kinase lui permettant d’être localisée à proximité du site de production de son substrat préférentiel le Rdlns(3,4)P2 (Munday étal., 1999).

Certains domaines PH reconnaissent tant le Ptdlns(3,4,5)P3 que le Rdlns(3,4)P2, in vitro, comme ceux de la sérine/thréonine kinase PKB (Franck et al., 1997 : Vanhaesebroeck et Alessi, 2000) et de l’adaptateur DAPP-1 (Dowler et al., 1999).

Les protéines kinases C -5, -e et -Ç sont également capables de lier les deux phosphoinositides (Toker et al., 1994). L’hypothèse émise était qu’étant donné le délai de production du Rdlns(3,4)P2 par rapport au Ptdlns(3,4,5)P3, les protéines au domaine PH capable de reconnaître les deux phospholipides seraient recrutées à la membrane et/ou activées plus longtemps que celles qui ne reconnaissent que le Ptdlns(3,4,5)P3 (Vanhaesebroeck et al., 2001). Il a très récemment été montré que le domaine PX de liaison aux phosphoinositides de la sous-unité p47'’^™ de la NADPH oxydase présente une spécificité pour le Rdlns(3,4)P2 plutôt que pour le Ptdlns(3)P, suggérant un rôle régulateur spécifique du Ptdlns(3,4)P2 dans le contrôle de l’activité oxydative des phagosomes (Kanai et al., 2001). Enfin, la possibilité d’une signalisation spécifique du Rdlns(3,4)P2 est apparue avec la caractérisation de deux nouvelles protéines TAPP-1 et TAPP-2 , de fonction encore inconnue, dont les domaines PH lient préférentiellement le Ptdlns(3,4)P2 (Dowler et al., 2000).

10

Ptdlns(3)P

PX

_______ V

FYVE

p

40

EEA-1

SNX-2,-3 Fab-1

CISK PIKfyve

Ptdlns(3,4)P2

P BD

PH PDK-1 PKB DAPP-1 TAPP-1/-2

PX

p47phox

Ptdlns(4,5)P2

PH PLC PLD Dynamin

P BD

I I

Tubbv Tubby

ENTH AP-180 CALM Epsin

Figure 6. Exemples de domaines de liaison aux phosphoinositides.

Différents phosphoinositides (Ptdlns(3)P, Ptdlns(3,4)P2, Ptdlns(4,5)P2 et Ptdlns(3,4,5)P3) sont schématisés avec un domaine protéique de liaison potentiel (BD). Des exemples de protéines capables de reconnaître chaque PI sont donnés dans les encadrés; le domaine de ces protéines permettant la liaison se trouve en tête de liste souligné.

Ptdlns(3,4,5)P3

P BD

PH

PDK-1

PKB

Btk

PLCy

ARNO

GRP-1

Gab-1

DAPP-1

I.A.5. Les domaines protéiques de reconnaissance des phosphoinositides Les effets médiés par les phosphoinositides, produits dans les différents compartiments membranaires de la cellule, sont orchestrés par des protéines dont l’activité et ou la localisation sont modulées par l’environnement phospholipidique. Cette modulation des « effecteurs » des différents phosphoinositides est rendue possible par l’existence de domaines au sein des protéines capables de reconnaître les différents phosphoinositides. Ces domaines ont été classés en fonction de leur structure et de leur spécificité de liaison pour les différents phosphoinositides. Un nombre croissant de protéines, notamment impliquées dans la signalisation intracellulaire, possèdent des domaines de reconnaissance des phosphoinositides (Vanhaesebroeck et al., 2000 ; Hurley et al., 2001 ; Lemmon, 2003). Toutefois la spécificité et l’affinité avec lesquelles ces protéines lient les phosphoinositides requièrent d’être évaluées expérimentalement, car elles ne peuvent être prédites sur base de séquences protéiques seules (Lemmon, 2004). Les conséquences de la liaison de la protéine avec le phosphoinositide considéré consistent en une activation allostérique de l’enzyme (Btk, PDK-1 et Rac-1 par exemple) et souvent à une localisation de la protéine cible au niveau de structures membranaires où se trouvent son substrat (pour les PLC et les enzymes du métabolisme des PI) ou une kinase membranaire dont elle est le substrat (PKB). Quelques exemples de protéines capables de reconnaître certains D-3 phosphoinositides par ces domaines de liaison sont repris dans la figure 6.

I.A.5.1. Les domaines PH

Les domaines d’homologie à la plekstrine (PH) sont des modules protéiques d’environ 120 acides aminés, découverts il y 10 ans au sein de la plekstrine, le substrat protéique majeur de la PKC des plaquettes. On retrouve des domaines PH dans un grand nombre de protéines (plus de 250 domaines PH dans le protéome humain) telles que des phospholipases (PLCy et 5, PLD), des sérines/thréonines kinases (PKB, PDK- 1,...), des protéines adaptatrices (Gab-1), des régulateurs de petites protéines G (Vav une Rho-GEF, ARNO et GRP-1 des Arf-GEF,...), ou encore des protéines du cytosquelette (Cytohésine et la Dynamine) (Lemmon, 2003 ; Lemmon et Ferguson, 2000).

L’interaction avec les phosphoinositides est assurée par des boucles de résidus basiques (riches en lysine et arginine) retrouvés au sein de la structure en « sandwich » caractéristique de ces domaines PH. L’affinité et la diversité de spécificité des domaines PH dépend de la longueur et des séquences de ces boucles de résidus basiques (Dowler et al., 2000 ; Lemmon, 2003 ; Lemmon et Ferguson, 2000). La plupart des domaines PH lie les phosphoinositides avec une faible affinité et spécificité, probablement wa des interactions électrostatiques non spécifiques entre les charges positives des résidus basiques du domaine avec les phospholipides anioniques (Dowler et al., 2000 ; Kavran et al., 1998 ; Lemmon, 2003). Néanmoins, dans certains cas le domaine PH peut, du fait d’un arrangement singulier des charges et des groupements phosphates, présenter une spécificité élevée pour un phosphoinositide en particulier.

C’est le cas du domaine PH de la PLC5-1 et de GRP-1 (general receptor for phosphoinositides-1) qui présentent une forte spécificité respectivement pour le Rdlns(4,5)P2 et le Ptdlns(3,4,5)P3 (Kavran et al., 1998 ; Klarlund et al., 1997). Les domaines PH sont « en principe » les seuls domaines de liaison aux phosphoinositides à pouvoir reconnaître le Ptdlns(3,4,5)P3.

11

L’importance de ces domaines en pathologie humaine est soulignée par l’exemple de l’agammaglogbulinémie liée à l’X, ou maladie de Bruton, qui peut être secondaire à une mutation rendant non fonctionnel le domaine PH de la tyrosine kinase de Bruton, essentielle au développement des lymphocytes B (Salim et al., 1996). Ce point sera développé à la section I.D.6..

I.A.5.2. Les domaines PX

Le domaine PX (Phox Homology) est un large peptide de 100 à 140 acides aminés caractérisé à partir des sous-unités p40’^'’“ et p47 du complexe NADPH oxydase des phagosomes des polynucléaires (Ponting, 1996). Plus de 50 protéines humaines et 15 de levures contiennent un domaine PX. Outre les 2 sous-unités de la NADPH oxydase p40'’^“ et p47 on trouve parmi ces protéines, la PI 3-kinase de classe II, plusieurs protéines impliquées dans le trafic membranaire, les « sorting nexins » et la phospholipase D-1 (PLD-1) (Simonsen et Stenmark, 2001 ; Song et al., 2001 ).

Le Ptdlns(3)P est le ligand le plus décrit des domaines PX (Cheever étal., 2001 ; Ellson et al., 2001 ; Song et al., 2001 ; Xu et al., 2001). Chez la levure, il semble même qu’il soit l’unique phospholipide capable d’interagir avec ces domaines (Yu et Lemmon, 2001). Cette généralisation n’est certainement pas applicable aux mammifères, puisque si p40’^^°*‘ interagit bien avec le Ptdlns(3)P, p47'’^™ lie préférentiellement le Ptdlns(3,4)P2 (Kanai et al., 2001). Le domaine PX de la PLD-1 serait quant à lui capable de reconnaître le Ptdlns(5)P (Du étal., 2003).

I.A.5.3. Les domaines FYVE

Le nom de ces domaines est basé sur les initiales des quatre premières protéines au sein desquelles un tel domaine a été identifié (Fab-lp, ŸoTB, Vps27p et EEA-1). Ces domaines FYVE comprennent 60 à 80 acides aminés dont 8 cystéines qui forment deux régions de liaison au zinc, et un motif basique très conservé, impliqué dans la liaison au Ptdlns(3)P (Burd et Emr, 1998), qui est l’unique phosphoinositide reconnu par ces domaines. La plupart des protéines comportant un domaine FYVE régulent le trafic vésiculaire (Simonsen et Stenmark, 2001). A titre informatif, il semble que l’affinité de liaison du domaine FYVE, par exemple de EEA-1 (Early Endosome Antigen-1), pour le Ptdlns(3)P est mille fois moindre que celle du domaine PH de Grp-1 pour le Ptdlns(3,4,5)P3 (Lemmon, 2003). Ces considérations ont mis en exergue que les protéines à domaine FYVE devaient pallier à ce manque d’affinité par d’autre(s) mécanisme(s) permettant ici, à EEA-1 d’être efficacement ciblée au niveau des membranes endosomales où se trouve le Ptdlns(3)P. C’est ainsi qu’une boucle hydrophobe s’insérant dans la bicouche lipidique coopérant à l’interaction de faible affinité, mais spécifique du domaine FYVE a été mise en évidence (Kutateladze et Overduin, 2001).

I.A.5.4. Les domaines FERM

Les domaines FERM (4.1, Ezrin, Radixin, Moesin) sont localisés à l’extrémité

amino-terminale des protéines de la famille ERM (Ezrin, Radixin, Moesin), qui pontent le

cytosquelette d’actine et les protéines adhésives telles que le CD44 et certaines ICAMs

(Niggli et al., 1995). Ces domaines constitués d’environ 300 acides aminés ont été