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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
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DBM 00715
ui^iYE^RSITE LIBRE DE BRUXELLES
Laboratoire de Virologie Moléculaire, Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires, Faculté des Sciences, Université Libre de Bruxelles
Etude du rôle des sites de liaison AP-1 intragéniques dans la régulation de
l'expression du HIV-1
(Human Immunodeficiency Virus type-1)
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de docteur en sciences
Nathalie Vandenhoudt Promoteur : Pr. Carine Van Lint Année Académique 2008 - 2009
ACADÉMIE UNIVERSITAIRE WALLONIE-BRUXELLES
“I hâve nothing to offer but blood, toil, tears, and sweat.
We bave before us an ordeal of the most grievous kind.
We bave before us many, many months of struggle and suffering.
You ask, what is our policy? I say it is to wage war by land, sea, and air. War with ail our might and with ail the strength God bas given us, and to wage war against a monstrous tyranny never surpassed in the dark and lamentable catalogue of human crime. That is our policy.
You ask, what is our aim? I can answer in one word. It is victory. Victory at ail costs - Victory in spite of ail terrors - Victory, however long and hard the road may be, for without victory there is no survival.”
Sir Winston Churchill (The IS*** of may 1940)
Enfin la partie pour laquelle tout le monde s’accorde à dire qu’elle est certainement LA plus agréable à écrire lors de la rédaction d’une thèse : les remerciements ! L’occasion de rendre honneur aux personnes qui ont comptées pendant cette importante période de notre vie.
Tout d’abord, je tiens à remercier Carine Van Lint pour m’avoir accueillie chaleureusement dans son laboratoire depuis mon mémoire, il y a quatre ans déjà, et pour m ’avoir soutenue et encouragée tout au long de ma thèse à chaque instant dans les moments de joie comme dans les moments difficiles.
Ma pensée se dirige aussi vers Arsène Bumi venu régulièrement éclairer notre laboratoire par sa gentillesse et son légendaire sourire, sans compter les nombreuses anecdotes scientifiques parfois des plus étonnantes...
Je souhaite également remercier de tout cœur Stéphane de Walque et Valérie Martinelli qui m ’ont tous deux accompagnés au cours de mes premiers pas dans la recherche fondamentale. Leurs conseils, leur patience et leur savoir-faire ont été pour moi des atouts
précieux que je n ’oublierai pas.
Je tiens également à remercier très sincèrement les membres du laboratoire qui ont beaucoup comptés pour moi au cours de cette thèse : Vincent Quivy, Claire Calomme, Gaëlle Wijmeersch, Valérie Vierendeel, Jean-Stéphane Gatot (toujours zen), Miriam Calao (notre globetrotteur à qui je souhaite beaucoup de succès dans sa future carrière de chercheuse hors-paire qui démarrera par l’Australie, au soleil... mmmh, ça fait rêver !), Sophie Reuse (à qui je souhaite beaucoup de courage pour sa dernière ligne droite ! Et oui ! C’est bientôt ton tour So...), Vincent Michaux (à l’humour cru trop hilarant ; faites un cocktail entre Miche, Domi, Ann, Claire, Valérie, Gaëlle et Vincent et vous obtenez un mélange détonnant !!) et Marilyn Boutchon (une oreille attentive en plus d’une aide administrative de grande qualité.
Les petites pauses dans ton bureau en compagnie de Coco me manqueront certainement !).
Je souhaite également remercier Laurence Colin dont j’aimerais souligner les qualités à la fois scientifiques et humaines exceptionnelles. Voilà une personne dont vous entendrez encore beaucoup parler à l ’avenir car Laurence est une chercheuse née. Laurence, merci de tout cœur pour toutes ces fois où tu m’as aidée sans compter et sans revendications ; je ne te remercierai jamais assez ! J’espère que Thibaut et toi trouverez le bonheur dans votre petit nid douillet et que vos projets les plus fous se concrétiseront dans le futur.
Je remercie aussi Catherine Paquay, déjà Docteur en médecine, qui vient d’entamer
courageusement une thèse de doctorat en sciences. Catherine, nous nous sommes connues
tardivement, mais tu es une personne que j ’apprécie énormément et je te remercie pour tous
ces petits conseils qui m ’ont aidée à me préparer pour le grand saut dans le monde privé. Je
te souhaite beaucoup de succès dans cette thèse et beaucoup de joie dans ta vie « mondaine »
très chargée.
Ann Dekoninck et Domique Démonté... deux personnalités incroyables, un couple formidable ! J’ai toujours pu compter sur vous pour un avis direct, objectif et constructif.
Votre départ m ’a beaucoup peinée mais quand je vois vos magnifiques carrières respectives et vos projets, cela m'emplit de joie !
Merci aussi à Emmanuelle Veithen-Fort, Manou pour ceux qui la connaissent, Mc Giver selon certains tant Manou est polyvalente ! Il y a tellement de raisons de te remercier que j’ai du mal à savoir par où commencer... Tu as toujours été là pour moi, pour m’écouter, me conseiller, m’aider que ce soit professionnel ou plus privé ! Merci également de m’avoir fait voir ta/maintenant notre magnifique région de Nivelles où j’ai la chance d’habiter depuis bientôt trois ans déjà. C’est toujours un bonheur de vous revoir, toi et ta très sympathique famille. N’oublie pas, ma porte vous sera toujours grande ouverte !
Un merci tout particulier aussi à Valérie Pierard sur qui j’ai toujours pu compter dans les moments difficiles ! Et non, tu ne m ’as pas effrayée bien longtemps avec ta batte de baseball... ;-) Merci beaucoup pour ton soutien, tes conseils qui m’ont été d’une grande utilité, nos petites discussions littéraires (j’ai pas souvent l’occasion de partager ce passe- temps avec grand monde). A propos de littérature, as-tu pensé à mettre par écrit ces petites expressions tellement drôles qui te caractérisent si bien ?! Ta contribution dans ma réussite est loin d’être négligeable...
Je remercie également Marie-Jeanne, toujours discrète mais indispensable à la bonne conduite de nos recherches ! Milles merci Marie-Jeanne pour ton aide précieuse et pour les bons moments que nous avons passés ensemble (et les quelques pauses «fléchettes »...}.
Etant quasi voisine, j’espère que nous nous reverrons encore régulièrement...
Je tiens aussi à remercier Nathalie De Visch et Christelle Demesmaeker pour leur aide lors de mes recherches bibliographiques indispensables à la réalisation d’une thèse qu ’on veut la plus à jour possible.
Peut-être aurais-je plutôt du commencer par toi Anna, puisque quand on arrive à l’IBMM, tu es la première personne à éclairer notre journée par ta bonne humeur, ton sourire en toutes circonstances. Je n 'oublierai jamais les excellents moments passés dans ton bureau lors d’une petite pause, d’un évènement particulier et les fou-rires que nous avons partagés. Merci aussi de m'avoir fait bénéficier de tes talents de couturière hors-paire U
Bref, que serais-je sans Anna ?
Je remercie également mes meilleurs amis Céline, Olivier, Laetitia et Aline pour m’avoir soutenue depuis le début de mes études et supporter mes quelques sautes d’humeur, mes absences trop fréquentes. Merci d’être toujours là !
Et bien entendu, je n 'oublie pas mes parents sur qui j'ai toujours pu compter, 24h/24,
dans les moments de rires, de larmes, d’angoisses... Et je sais combien cela à pu être difficile
pour vous parfois de me supporter... Ma plus grande récompense aujourd’hui, c’est la fierté
et l'amour que je lis dans votre regard ; rien n 'est plus important et même si je ne vous le dis
pas assez souvent, je vous aime de tout mon cœur !
Quelle méchante je serais si j’oubliais de remercier mon petit chouchou, mon chat,
Salem alias le Roi de Baulers ou le Gros Fade, c’est selon... et sa petite sœur Miss. Leur
présence est apaisante, relaxante et les voir s’amuser ensemble est un vrai plaisir ! M-Chou,
j’ai adoré tes petits ronflements pendant la rédaction de l’article AP-1 et de ma thèse...
Abréviations
ADN: Acide DésoxyriboNucléique
ADRP: Adipose Differentiation-Related Protein AP-1 : Activator Protein 1
AP2: clathrin Adaptator Protein complex 2
APOBEC3G: Apolipoprotein B mRNA-editing enzymes catalytic polypeptide-like 3G APS: Ammonium persulfate
ARE: AU-Rich Elément ARN: Acide RiboNucléique
ASK1: Apoptosis-regulating Signal Kinase 1 ATF-3: Activating Transcription Factor 3 ATL: Adult T-cell Leukemia
ATP: Adénosine Triphosphate
B.
BMK: Big MAPK
BRE: TFIIB Récognition Elément BRG-1: Brahma Related Gene 1 BSA: Bovine sérum albumin
BST2: Bone marrow STromal cell antigen 2 B-ZIP: Basic leucine ZIPper
Ç,
C/EBP: CCAAT/Enhancer Binding Protein CAT: Chloramphénicol AcétylTransferase CCR5: chemokine CC motif Receptor 5 CD4: Cluster of Différentiation 4 CDK7: Cyclin-Dependent Kinase 7
ChIP: Chromatin Immunoprécipitation Assay CNC: Cap 'N Collar
CRE: cAMP responsive element
CREB: cAMP response element binding protein CREM: cAMP responsive element modulator CTD: Carboxy-Terminal Domain
CTF: CCAAT box-binding Transcription Factor CTIP2: COUP-TF Interacting Protein 2
CXCR4: chemokine CXC motif Receptor 4
DAG: DiAcylGlycérol
DCAF1 : DDB1 Cullin-Associated Factor 1 DCE: Downstream Core Element
DDB1: Damage DNA-specific Binding protein 1 DMEM: Dulbecco's modified eagle media DNMT: DNA MethylTransferase
DTT: DiThioThreitol
E.
EDTA: Ethylene diamine tetra-acetate EIAV : Equine Infectious Anémia Virus ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay EMSA: Electrophoretic mobility shift assays ERK: Extracellular signal-Regulated Kinase Ets: E26 Transformation-Specific
F,
FIV: Feline Immunodeficiency Virus
GR: Glucocorticoïd Receptor GTF: General Transcription Factor ü
HAART: Highiy Active AntiRetroviral Therapy HAPs: HIV-1 Anti-sens Proteins
HAT:Histone AcétylTransférase HBZ: HTLV-1 Basic Zip factors HCV: Hepatitis C Virus
HDAC: Flistone DésAcétylase Complex MIRE: HTLV-1 Internai Regulatory Elément HIV-1: Human Immunodeficiency Virus Type 1 HLA: Human Leukocyte Antigen
HPV: Human Papilloma Virus HS27: Heat Shock protein 27 HSV: Herpes Simplex Virus
hTERT: human Telomerase Reverse Transcriptase HTLV-1 : Human T-cell Leukemia Virus type 1 L
IgG: Immunoglobuline G IL-2: Interleukine 2
INI-1: INtergrase Interactor 1 Inr: Initiator
IP3: Inisitol triPhosphate
IRF: Interferon Regulatory Factors IST: Inducer of Short Transcripts ISWI: Imitation SWItch
iL
JNK: Jun N-terminal Kinase
K.
KSHV: Kaposi's Sarcoma-associated Herpes Virus
L.
LATs: Latency-Associated Transcripts LBP-1: Lipopolysaccharide-Binding Protein 1 LEF-1: Lymphoid Enhancer-binding Factor 1 LTR: Long Terminal Repeat
LUC: Luciferase WL
MAF: MusculoAponeurotic Fibrosarcoma oncogene MARK: Mitogen-Activated Protein Kinase
M-CSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor MEK: MAPK/ERK Kinase
MHC: Major Histocompatibility Complex MIP-1a: Macrophage Inflammatory Protein 1a MMTV: Mouse MammaryTumor Virus
MTE: Motif Ten Elément IL
Nef: Negativ Factor
NES: Nuclear Export Signal NF1 : Nuclear Factor 1
NF-AT: Nuclear Factor of Activated T cells NF- k B: Nuclear Factor-kappaB
NLS: Nuclear Localization Signal NRE: Négative Regulatory Elément O,
Oct: OCTamer-binding transcription factor OMS: Organisation Mondiale de la Santé
P,
PBMC: Peripherical Blood Mononucleic Cells PBS: Phosphate Buffer Saline
PCR: Polymerase Chain Reaction
PEST: rich in proline (P), glutamate (E), serine (S), and threonine (T) PKC: Protein Kinase C
PMA: phorbol 12-myristate 13-acétate
pTEFb: positive transcription élongation factor b PTX-B: Pertussis ToXin B-oligomer
El
5' RACE: Random Amplification of 5' Complementary DNA strands R: Repeat
RBF-2: Ras-responsive Binding Factor 2
RPMI: Roswell Park Memorial Institute
RRE: Rev Responsive Elément
RTC: Reverse Transcription Complex
s.
SAPK: Stress-Activated Protein Kinase = JNK SDS: Sodium Dodecyl Sulfate
SH: Site Hypersensible
SIDA: Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise SIV: Simian Immunodeficiency Virus
SNF: Sucrose Non-Fermenting
Sp1 : promoter-selective transcription factor 1
STAT3: Signal Transducer and Activator of Transcription 3 SWI: mating-type SWItching
TAK: Tat-Associated Kinase L
TAR: Trans-Activation Response Tat: Trans-Activator of Transcription TCF-1a: T-Cell Factor 1a
TCR: T-Cell Receptor
TEMED: N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine TFIIB: Transcription Factor for RNA polymerase IIB TK: Thymidine Kinase
TNF: Tumor Necrosis Factor
TRE: TPA = PMA Responsive Elément TRIS: hydroxymethyl-aminomethane
U3: Unique en 3' U5: Unique en 5'
UAS: Upstream Activating Sequence
UBP-1: UBiquitin-specific Processing Protease 1 UNG2: Uracil DNA Glycosylase 2
y.
Vif: Virion Infectivity Factor
Vpr: Viral Protein R
Vpu: Viral Protein U
_________________ Table des matières__________________
Introduction... p.l
I. Le rétrovirus HIV-1 : généralités...p.l
1. Pathogenèse du HIV-1...p.l 2. Structure de la particule virale...p.3 3. Le génome viral... p.3 4. Cycle réplicatif du HIV-1...p.8
II. Analyse de la structure chromatinienne du HIV-1... p.ll
1. Généralités... p.ll 2. La régulation transcriptionnelle chez les eucaryotes... p. 12 3. Les sites hypersensibles majeurs du HIV-1 - Régulation transcriptionnelle du HIV-1..p.14
III. La voie des MAPKs - Les facteurs de transcription AP-1... p.25
1. La voie des MAPKs (« Mitogen-Activated Protein Kinase »)... p.25 2. Les facteurs de transcription AP-1... p.26
But du travail... p.30 Résultats... p.32
I. Les sites AP-1 localisés dans le gène pol de la région régulatrice intragénique du HIV-1 sont importants pour l’infectivité du virus....p.32
1. Des facteurs de transcription AP-1 interagissent spécifiquement avec les sites AP-1
localisés dans le fragment 5103 du HIV-1... p.32
2. Identification de mutations ponctuelles permettant d’abolir la liaison des facteurs AP-1 à leurs sites respectifs... p.34 3. Les sites de liaison AP-1 localisés dans le gène pol sont entièrement responsables de
l’activité enhancer PMA-dépendante du fragment 5103... p.35 4. Des facteurs de transcription AP-1 sont impliqués dans l’activité enhancer
PMA-dépendante du fragment 5103... p.36 5. Les sites de liaison AP-1 du fragment 5103 sont critiques pour l’infectivité du HIV-L.p.38
II. Caractérisation de l’activité transcriptionnelle PM A-inductible du fragment 5105... p. 42
1. Cartographie de l’activité enhancer PMA-inductihle du fragment 5105... p.42 2. Le fragment 5105 présente une activité promotrice PMA-inductible ex vivo en cellules
HeLa... p.43 3. La partie 3’-terminale du fragment 5105 est critique pour son activité transcriptionnelle
PMA-inductible...p.43 4. Des facteurs de transcription AP-1 sont impliqués dans l’activité promotrice
PMA-inductible du fragment 5105... p.44 5. Des facteurs de transcription AP-1 interagissent spécifiquement in vitro avec le fragment
5105.3... p.44 6. Identification de mutations ponctuelles abolissant la liaison des facteurs AP-1 à leur site
du fragment 5105.3... p.45 7. Le site AP-1 localisé dans le fragment 5105.3 est partiellement responsable de l’activité
promotrice PMA-inductible du fragment 5105...p.46 8. Seul le site AP-1 du fragment 5105 confère une inductibilité par le PMA au fragment
1012... p.46 9. L’analyse bioinformatique de l’entièreté de la région intragénique du HIV-l a notamment
révélé la présence de 5 sites de liaison pour le facteur YY1 et 2 sites de liaison pour le facteur PU. 1...p.47
Conclusions - Discussion...p.50
1. Les sites AP-1 du fragment 5103... p.50
2. Le fragment 5105... p.52
3. Rôles potentiels de la région a\s-régulatrice intragénique du HIV-1... p.55 4. Rôle des facteurs de transcription AP-1 dans le cycle réplicatif du HIV-1 et d’autres virus... p.58
5. Les AP-1 : une cible potentielle pour combattre le
HIV-1 ?...p.60
Matériel et Méthodes...p.62
Bibliographie... p.73
Introduction
OrçMhatkn
mondufedebSantè (â)ONUSIDAt£-
AduKes et enfants vivant avec le VIH, estimsitions en 2007
Billion
Caii'aibes i 230 000
-Pttnio-27M
**** ■ " Moyen -Orien^ & Afriqu^ du Notd
—38(H»0 (Trim-SNOoq
ifVmérique latine 1,0 Billion
---,--- 1_--- vp---\ y —y-A
Asie du Sgd & ^u Sud-Est \ \ \
i4,0-jniilionsi-
Afrique subsaharienne ^Y-MlliaBi)
22,5 millions
{2019-24,3 MÜliaM]
Oceanie
75Ô0a {53m-12MM|
Total: 33,2 (30,6 - 36,1) millions
Fig. Il Estimation de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) des personnes infectées par le
virus HIV-1 dans le monde
Introduction
I. Le rétro virus HIV-1 : généralités
Le virus HIV-1 (« Human Immunodeficiency Virus Type 1 ») est un rétrovirus complexe appartenant au genre des lentivirus et responsable du Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise ou SIDA. Les premiers cas de la maladie, décrite alors comme un désordre immunitaire caractérisé par un déclin de la fonction immunitaire et des eellules T-lymphoïdes CD4^, furent identifiés aux Etats-Unis en 1981 (Gottlieb et al. 1981, revu dans Gallo 2006 et Wainberg and Jeang 2008). Quelques années plus tard, des scientifiques français et américains ont confirmé que l’agent responsable du SIDA est un rétrovirus : le HIV (Barre-Sinoussi et al. 1983, Popovic et al. 1984).
L’infection par le HIV-1 résulte, après une longue période asymptomatique, en un syndrome d’immunodéficience dû au mauvais fonctionnement de plusieurs compartiments effecteurs du système immunitaire et earaetérisé par des infections opportunistes, une incidence accrue de tumeurs et une profonde dégénérescence du système nerveux central (revu dans Weber 2001, Stevenson 2003, Boissé et al. 2008).
Sur base d’analyses phylogénétiques de séquences nucléotidiques, il a été proposé que le vims HIV-1 aurait été introduit dans la population humaine par transmission inter-espèces à partir du chimpanzé Pan troglodytes troglodytes infecté par un variant du virus simien SIVcpz (Gao et al. 1999, Santiago et al. 2002, Keele et al. 2006). Les modes connus de transmission entre humains sont: la voie sanguine [infection périnatale, transfusion, injections intraveineuses (personnes droguées p.ex.), injections de produits d’origine sanguine (lors d’hémophilie p.ex.)] et la voie sexuelle.
Selon les estimations de l’OMS (« Organisation Mondiale de la Santé ») de 2007, la pandémie de SIDA aurait déjà fait plus de 25 millions de morts de par le monde et 33 millions de personnes seraient infectées par le virus. Rien que pour l’année 2007, on a recensé 2,7 millions de nouveaux cas et 2 millions de morts. Comme nous pouvons le voir sur la carte ci-jointe (Fig. H), plus de 95% des personnes infectées le sont dans des pays du tiers-monde où les populations ont difficilement aecès aux thérapies anti-rétrovirales. La moitié des personnes infectées par le HIV-1 le sont avant 25 ans et mourront avant leur 35 ans.
1. Pathogenèse du HIV-1
Les principaux protagonistes lors d’une infection par le HIV-1 in vivo sont les cellules T-lymphoïdes CD4‘^, les monocytes/macrophages et les cellules dendritiques. H est largement admis que les macrophages constituent les premières cibles du HIV-1. Les macrophages sont des cellules présentatrices d’antigènes et contribuent grandement aux réponses innées contre les pathogènes et servent d’interface entre les réponses innées et adaptatives. Tandis que dans les cellules T CD4^ le cycle réplicatif du HIV-1 est généralement un cycle lytique caractérisé par un taux transitoirement élevé de production virale, les macrophages se caractérisent par une plus grande résistance aux effets cytopathiques du HIV-1 avec pour conséquence une production virale persistante sur de longues périodes (revu dans Herbein 2002, Aquaro et al.
2002, Verani et al. 2005 et Carter and Ehrlieh 2008). Les macrophages sont capables de
-
1
-B.
Fig. 12 Mécanismes de transmission via les cellules dendritiques
A. HIV-1 est internalisé dans les cellules dendritiques (DCs) où il s’accumule dans les compartiments intracellulaires (photo de gauche). Lors de la rencontre avec une cellule T CD4'*', HIV-1 est rapidement redistribué des compartiments intracellulaires vers la zone de contact entre la DC et la cellule T CD4'^: la synapse virologique (photo de droite). Les noyaux sont en bleu, le cytoplasme en vert et les particules virales en orange (tiré de Piguet and Sattentau 2004).
B. (a) Les DCs transfèrent les particules HIV-1 capturées aux cellules T CD4-I- via une jonction cellule-cellule appelée synapse virologique ou immunologique —> processus de /rani-infection.
(b) Les particules HIV-1 endocytées peuvent accéder à des corps multivésiculaires et être à nouveau libérées de la cellule par exocytose ^ processus de fra/ji-infection.
(c) HIV-1 infecte une DC et se réplique —> processus de cw-infection.
(Représentation schématique tirée de Wu and KewalRamani 2006).
transmettre l’infection au système nerveux central. Les cellules microgliales constituent les macrophages du système nerveux central et sont les principales cibles du HFV-l dans le cerveau. De par leur long temps de demi-vie et leur relative protection grâce à la barrière hémato-méningée, les cellules microgliales sont considérées comme des réservoirs du HIV-1 (Barber et al. 2006). De l’infection du système nerveux central peut résulter une neuropathie associée au HIV-1 (Kedzierska and Crowe 2002, Boissé et al. 2008). Les macrophages sécrètent des chémokines (MlP-la et MIP-IP) en réponse à l’expression de la protéine virale Nef. Ces chémokines vont attirer les lymphoc5des T CD4"^ dans leur environnement augmentant le risque d’infection (Swingler et al. 1999, Herbein 2002). La propagation du virus entre monocytes/macrophages et cellules T ou entre cellules T peut également se faire par l’intermédiaire de jonctions cellulaires spécialisées appelées synapses virologiques ou infectieuses (Gousset et al. 2008 et Chen et al. 2007 respectivement). Le groupe de Chen en 2007 estime que le transfert du HIV-1 entre cellules T CD4'^ est entre 92 et 18600 fois plus efficace que l’infection par des virus isolés. De plus, le transfert du HIV-1 via les synapses virologiques est résistant aux anticorps neutralisants dérivés du patient (Chen et al. 2007).
La principale voie de dissémination du HFV-l dans le monde est la transmission hétérosexuelle. De ce fait, beaucoup de scientifiques proposent aujourd’hui que les cellules dendritiques localisées au niveau des muqueuses et des tissus lymphoïdes pourraient compter parmi les premières cellules à rentrer en contact avec le virus lors de rapports sexuels. Comme les macrophages, les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigènes. Ces cellules joueraient un rôle important dans la dissémination du virus dans l’organisme selon deux processus possibles (Fig. 12): l’infection dite en îrans et l’infection dite en cis. Lors du processus de rran^-infection, les cellules dendritiques lient le virus qui va être internalisé puis soit dégradé ou relibéré par exocytose, soit être transféré à une cellule T CD4'^ par contact via des synapses virologiques. Le processus de cÏ5-infection est le processus par lequel la progénie virale d’une cellule dendritique est transférée à une cellule T CD4'^ ; ce processus implique l’infection productive des cellules dendritiques. Toutefois, en comparaison avec les cellules T CD4'^, la réplication dans les cellules dendritiques est généralement moins productive et la fréquence des cellules dendritiques infectées par le HFV-l in vivo est de 10 à 100 fois moins élevée. Les raisons d’une infection modérée des cellules dendritiques seraient une faible expression du récepteur CD4 et des co-récepteurs nécessaires à l’infection par le HFV, la dégradation rapide des virus internalisés dans des compartiments intracellulaires et l’expression de facteurs qui bloqueraient la réplication du virus. Lors de leur maturation, les cellules dendritiques migrent vers les ganglions lymphatiques et propagent l’infection (revu dans Stevenson 2003, Wu and KewalRamani 2006, Wu 2008, Cavrois 2008).
L'infection par HIV-1 est caractérisée par une phase initiale de virémie aigüe, qui coïncide avec un rapide déclin des cellules T CD4^ (Fig. 13). Cette phase d’infection aigüe est généralement contrôlée par des réponses spécifiques du système immunitaire de l'hôte, avec comme conséquences une diminution drastique de la charge virale et une restauration du taux de cellules T CD4‘^. La phase initiale, qui dure six à huit semaines, est caractérisée par des syndromes pseudo-grippaux tels que fatigue, fièvres, malaises, occasionnellement accompagnés d'éruptions cutanées ou d'encéphalopathies réversibles. Cependant, chez certains patients, elle est asymptomatique (revu dans Fauci and Desrosiers R.C., 1997, Vergis and Mellors 2000, Pope and Haase 2003). Ensuite, les patients entrent dans une phase asymptomatique, dite de latence clinique, caractérisée par relativement peu de manifestations cliniques, une diminution constante et progressive du nombre de lymphocytes T CD4+ et une augmentation graduelle de la charge virale. Bien que la vitesse de progression de la maladie soit influencée par des facteurs viraux et de l’hôte, le temps moyen entre l’infection initiale et
-
2
-mort
semaines années
temps après l’infection
10^
10
®10®
104
10®
102
Fig. 13: Evolution typique de l’infection par HIV-1 (Fauci et Desrosiers, 1997).
La courbe rouge indique l’évolution de la charge virale dans le plasma sanguin au cours de l’infection.
La courbe verte indique l’évolution des quantités de cellules T-CD4'’^ au cours de l’infection.
Cette figure est décrite de manière plus détaillée dans la section 1.1 de l’introduction.
A R N de H IV (c o p ie s / ml de pl as m a)
le développement du SIDA est compris entre 8 et 10 ans chez les patients non traités (Vergis and Mellors 2000). Des études ont démontré une réplication virale continue et hautement productrice durant cette période : l’infection par HFV-1 implique alors, par jour, la production et la destruction de milliards de cellules T CD4^ (Vergis and Mellors 2000, Pope and Haase 2003). La déplétion des cellules T CD4^ peut être directe des suites de l’infection du virus ou indirecte pour des cellules non infectées. HIV-1 serait responsable de dysfonctionnements cellulaires suite à une réponse aberrante du système immunitaire de l’hôte à l’infection (McCune 2001, Stevenson 2003). Malgré une vigoureuse réponse immune cellulaire et humorale, l’infection n’est pas éliminée et le système immunitaire va, inexorablement, à l’épuisement. La charge virale augmente à nouveau et atteint un taux comparable à celui observé pendant la phase initiale de l'infection avant le déclenchement de la réponse immunitaire. Cette reprise de la production virale est accompagnée par une diminution rapide du nombre de lymphocytes T CD4+. Le patient entre dans la phase SIDA caractérisée par des troubles du système nerveux central et par une profonde immunodépression qui rend la personne contaminée incapable de réagir aux agents pathogènes. La phase SIDA aboutit à la mort des individus infectés par HFV-l, due à des maladies opportunistes (dont des formes graves de pneumonie à Pneumocystis carinii, le muguet, la toxoplasmose ou des infections à cytomégalovirus) ou à des cancers (dont le sarcome de Kaposi, le cancer du col utérin, divers lymphomes et des carcinomes de la langue et du rectum) (revu dans Levy, 1998).
2. Structure de la particule virale
Le virion (ou particule virale) du HIV-1 a une structure icosaédrique complexe d'environ 110 nm de diamètre (Fig. 14). Il est constitué d'une enveloppe externe, d'une matrice et d'une capside. Les composants du virion sont encodés par les trois gènes de structure gag, pol et env caractéristiques de tous les rétrovirus. L’enveloppe virale est composée d’une bicouche lipidique d’origine cellulaire dans laquelle sont insérées des spiculés constituées d’un trimère de la glycoprotéine transmembranaire gp41, attachée de manière non covalente à la glycoprotéine de surface gpl20. Ces deux glycoprotéines sont produites à partir d’une glycoprotéine précurseur, la gplôO, codée par le gène env. Directement sous l’enveloppe, se trouve la matrice formée par la protéine pl7, l’un des produits du gène gag. Au centre de la particule est localisée la capside conique, constituée par la protéine p24, également produite à partir du gène gag. La capside contient le génome viral (deux molécules monocaténaires d'ARN existant sous forme d'un complexe ribonucléoprotéique contenant des protéines virales de structure, p7, liées à l'ARN), ainsi que plusieurs protéines jouant un rôle catalytique important durant le cycle réplicatif du HIV-l. Il s’agit de la protéase virale pli, responsable de la maturation des précurseurs polyprotéiques viraux, de la transcriptase inverse p66/p51 et de l'intégrase p32, toutes trois encodées par le gène viral pol. (revu dans Wang et al. 2000).
3. Le génome viral
Le génome du HIV-1 (Fig. 14) est constitué de deux molécules identiques d’ARN monocaténaire linéaire, de même polarité que les ARN messagers (polarité positive) et d’une longueur approximative de 9,7 kilobases. Dans chaque particule virale, ces deux molécules d’ARN génomique sont liées l’une à l’autre de manière non covalente et présentent les modifications post-transcriptionnelles classiques des ARNm cellulaires, à savoir une coiffe CAP à l’extrémité 5’ et une extrémité 3’ polyadénylée.
-
3
-0 8 9 kb
5
’LTR gag 1 \
A 1 pol
vpr
□ □ ---
--- rev—
□
LTR CE I_envZi 1[nëf|
vpu
p32 p66/p51 pli
INT RT PR gpl20
pl7 matrice p24
capside p7/p9
gp41
ARN
génomique
Fig. 14: Représentation schématique du génome et de la particule virale du HIV-1
Le gène env code pour les protéines d’enveloppe gpl20 et gp41. Le gène gag code pour les protéines de matrice (pi7),
de capside (p24) et les protéines virales de structure liées au génome viral p7 et p9. Le gène pol code pour les protéines
enzymatiques virales à savoir l’intégrase (INT), la transcriptase inverse (RT) et la protéase (PR) et qui sont enfermées
avec le génome viral dans la capside .
Le génome du HFV-1 présente les gènes de structure classiques de tous les rétro virus : gag, pol et env qui codent pour les pol5q)rotéines nécessaires à la formation de nouveau virions (section 1.4). Plusieurs cadres ouverts de lecture additionnels flanquent le gène env et encodent pour les protéines de régulation (Tat et Rev) et les protéines accessoires (Nef, Vpu, Vif et Vpr) dont les principales fonctions sont reprises ci-après. Les régions codantes de cet ARN génomique sont flanquées par des extrémités non codantes contenant une courte répétition R (Repeat) présente aux deux extrémités ainsi que les régions U5 (Unique en 5’) et U3 (Unique en 3’) présentes respectivement aux extrémités 5’ et 3’.
tat
Tat est une protéine d’environ 14-15 kD synthétisée à la fois dans les étapes précoces et tardives du cycle réplicatif viral. La protéine tran^-activatrice Tat intervient dans l’initiation et/ou l’élongation à partir du promoteur du HIV-1 en se liant à une boucle d’ARN appelée TAR (Un chapitre de la section II.3 est entièrement consacré à la structure de Tat et à son rôle dans la tra«5-activation de la transcription virale).
Outre son rôle dans l’activation de la transcription virale, Tat est également capable de moduler l’expression de gènes dans des cellules infectées par le HIV-1 ou non ; Tat peut stimuler l’expression de cytokines immunorégulatrices (TNF, IL-2, IL-6...) ou de diverses molécules d’adhésion (fibronectine, MHC...). Tat peut activer le cycle réplicatif d’autres virus dont les papillomavirus et les cytomégalovirus humains. Tat peut être sécrétée quand la mortalité cellulaire est encore basse et que l’expression de Tat est élevée. La protéine Tat extracellulaire contribue à la dissémination de l’infection par divers mécanismes dont l’activation du génome HIV-1 dans des cellules infectées de manière latente, l’augmentation des co-récepteurs CCR5 ou CXCR4 à la surface des cellules, la migration de certains types cellulaires ou encore l’immunosuppression de cellules non infectées notamment via un effet positif sur la production d’interféron alpha (revu dans Huigen et al. 2004). Il semblerait que Tat joue un rôle important dans certaines maladies associées au HIV-l. En effet, Tat a un effet neurotoxique direct ou indirect en stimulant la libération de substances neurotoxiques à partir des macrophages et des cellules microgliales. Cet effet interviendrait dans la démence associée au HIV-1 (revu dans Pugliese et al. 2005, Huigen et al. 2004).
rev
Rev est une petite phosphoprotéine d’environ 19 kD localisée principalement dans le noyau. Rev régule le processus post-transcriptionnel des ARN messagers (ARNm) viraux pour une réplication virale efficace (Fig. 15). Les ARNm viraux peuvent être séparés en 3 catégories ;
les ARNm complètement épissés d’environ 2 kb qui codent pour les protéines précoces Tat, Rev et Nef. Ces ARNm sont exportés vers le cytoplasme de manière Rev-indépendante.
les ARNm simplement épissés d’environ 4 kb qui codent pour les protéines accessoires Vif, Vpr et Vpu et pour la polyprotéine d’enveloppe,
les ARNm non épissés d’environ 9 kb qui codent pour les protéines Gag et Pol et qui serviront aussi d’ARN génomique viral.
-
4
-Noyau Cytoplasme
Fig. 15 Mécanisme d’action de la protéine régulatrice Rev du HIV-1
A. Seuls les ARNs totalement épissés (III) sont exportés dans le cytoplasme de manière Rev-indépendante. Ces ARNs messagers permettent la traduction des protéines Tat, Rev et Nef
B. Rev possède un signal de localisation nucléaire qui lui permet d’être à nouveau importée vers le noyau. Rev se lie à la
séquence RRE des ARNs non épissés ou simplement épissés et peut ainsi les exporter vers le cytoplasme grâce à un
signal d’exportation nucléaire.
Ces deux dernières catégories d’ARNm (simplement épissés et non épissés) possèdent une région de 240 pb, appelée RRE pour « Rev Response Elément » localisée dans env qui adoptent une structure secondaire complexe.
La protéine Rev peut être divisée en plusieurs domaines. Dans la partie N-terminale de la protéine se trouve un motif riche en arginines localisé entre les acides aminés 35 et 50.
Ce motif fonctionne comme un signal de localisation nucléaire (NLS ou « Nuclear Localization Signal ») et sert de domaine spécifique d’interaction avec la séquence RRE des ARNm simplement ou non épissés. La partie C-terminale de la protéine possède une région riche en leucines localisée entre les acides aminés 73 et 84 et responsable de la fonction effectrice de Rev in vivo. Cette région, aussi appelée domaine d’activation, sert de signal d’exportation nucléaire (NES ou « Nuclear Export Signal ») et interagit avec les protéines cellulaires impliquées dans l’exportation des ARNm viraux. Rev fait en permanence la navette entre le noyau et le cytoplasme grâce aux domaines NES et NLS qu’elle porte. Une fois dans le noyau, Rev interagit avec la séquence RRE des ARNm simplement ou non épissés ; cette liaison masque le signal de localisation nucléaire et les ARNm peuvent être exportés vers le cytoplasme et traduits (revu dans Suhasini and Reddy 2009, Cao et al. 2009).
nef
Nef est une protéine d’environ 27 kD myristylée qui s’associe au côté cytoplasmique de la membrane cellulaire. Comme Tat et Rev, Nef compte parmi les premières protéines synthétisées. Nef, nommé ainsi à l’origine pour « Negativ factor », intervient positivement dans la réplication virale et l’infectivité. Le fait que Nef joue un rôle prépondérant dans la pathogenèse du HIV-1 est illustré par une cohorte de patients infectés par une lignée contenant une délétion importante au niveau du cadre ouvert de lecture de nef et qui sont qualifiés de « long-term nonprogressors » c’est-à-dire qu’ils ne présentent pas les manifestations cliniques associées au SIDA même après plusieurs années (Dyer et al. 1997 ; revu dans Joseph et al. 2005, Roeth and Collins 2006).
Nef intervient dans la régulation de l’activité, la localisation et l’abondance des protéines membranaires de surface de manière à influencer la réplication, la dissémination et la persistance du HIV-l. Nef participe notamment à la régulation négative des récepteurs CD4 et MHC ou «Major Histocompatibility Complex » à la surface cellulaire. L’endoc5dose du récepteur CD4 à partir de la surface des cellules infectées se fait via l’interaction de Nef avec la partie cytoplasmique du récepteur, le recrutement d’AP2 ou « clathrin adaptor protein complex 2 », l’internalisation et le transport vers les endosomes puis vers les lysosomes où le récepteur CD4 est dégradé (revu dans Malim and Emerman 2008, Roeth and Collins 2006).
La dégradation du récepteur CD4 permet d’éviter la surinfection cellulaire et facilite le bourgeonnement des nouveaux virions. Dans le cas des MHC de classe I, Nef interagit avec la queue cytoplasmique des MHCI de t3q)e HLA-A et HLA-B, recrute des complexes AP-1 ou
« clatherin adaptor protein complex 1 » afin de les détourner vers les endosomes (revu dans Malim and Emerman 2008). De cette manière, le virus prévient l’exposition d’antigènes viraux à la surface cellulaire et échappe au système immunitaire.
Enfin, Nef interfère dans les voies de signalisation cellulaire en aval du TCR ou « T-Cell Receptor ». Cette interférence mène à une régulation positive du Pas ligand (FasL) à la surface cellulaire. La présence du FasL à la surface cellulaire protégerait la cellule infectée en induisant l’apoptose des cellules T lytiques voisines. Pour éviter la mort
-5
-prématurée de la cellule infectée, Nef interagirait avec la kinase AS Kl empêchant la transduction du signal apoptotique du FasL au récepteur du TNF ou « Tumor Necrosis Factor » (revu dans Roeth and Collins 2006).
Nef augmente l’infectivité du HIV-1 en facilitant l’entrée du virus via un réarrangement du réseau cortical d’actine et des interactions avec différentes protéines du cytosquelette (Pizzato et al. 2007, revu dans Malim and Emerman 2008, Joseph et al. 2005).
En conclusion. Nef module la composition de la surface des cellules infectées de différentes manières bénéfiques à la propagation virale.
vpu
Vpu ou « Viral Protein U » est une phosphoprotéine membranaire d’environ 16 kD localisée dans le réticulum endoplasmique et exprimée tardivement lors du cycle réplicatif viral. Comme Nef, Vpu participe à la régulation négative du récepteur CD4 et des MHC à la surface des cellules infectées. La protéine gpl60 (précurseur des protéines d’enveloppe gpl20 et gp41) est capable de bloquer les récepteurs CD4 nouvellement synthétisés au niveau du réticulum endoplasmique par la formation de complexes gpl60-CD4. La formation de tels complexes bloque également le transport et la maturation des protéines d’enveloppe elles- mêmes. Par conséquent, un rôle important de Vpu serait d’induire la dégradation des récepteurs CD4 au niveau du réticulum endoplasmique afin de libérer la gpl60 et lui permettre d’atteindre la surface cellulaire. La dégradation du récepteur CD4 suit la voie de l’ubiquitination suivie de la dégradation par le protéasome (revu dans Gramberg et al. 2009, Nomaguchi et al. 2008, Bour and Strebel 2003).
Vpu joue un rôle important dans la libération de nouvelles particules virales. Lorsque des cellules Vpu-dépendantes sont infectées avec un virus HIV-1 déficient pour Vpu, on observe l’accumulation de nouveaux virions à la surface cellulaire et dans les compartiments intracellulaires (revu dans Gramberg et al. 2009, Nomaguchi et al. 2008, Malim and Emerman 2008). La protéine cellulaire responsable de ce phénotype est BST2 ou « Bone marrow STromal cell antigen 2 » rebaptisée tetherine. Les tetherines sont des protéines membranaires ancrées dans la bicouche lipidique à la fois par leur extrémité N-terminale et C-terminale. Une extrémité pourrait être insérée dans la bicouche lipidique du virus tandis que l’autre extrémité serait insérée dans la membrane plasmique de la cellule. Les virus ainsi retenus dans la cellules peuvent être internalisés par endocytose puis dégradés. Vpu cible les tetherines qui sont ensuite dégradées par le protéasome (revu dans Gramberg et al. 2009).
vif
Vif ou « Virion Infectivity Factor » est une protéine cytoplasmique indispensable à la réplication du HIV-1 en cellules primaires. En absence de Vif, le gène humain APOBEC3G ou « Apolipoprotein B mRNA-editing enzymes catalytic polypeptide-like 3G » a été identifié comme étant suffisant pour prévenir l’infection par le HIV-1. Dans des cellules infectées par un virus déficient pour Vif, APOBEC3G est empaqueté dans les nouveaux virions au moment de l’assemblage. APOBEC3G va désaminer les cytosines en uraciles lors du processus de transcription inverse entrainant une hypermutation de guanine en adénine. Une telle perte dans l’intégrité du génome viral est suffisante pour stopper la dissémination du virus. Dans la
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6
-plupart des infections avec un virus sauvage, Vif contrecarre l’effet de APOBEC3G en recrutant un complexe multi protéique E3 ubiquitine-ligase. Une fois ubiquitiné, APOBEC3G est dévié vers le protéasome et dégradé (revu dans Gramberg et al. 2009, Malim and Emerman 2008).
vpr
Vpr ou « Viral Protein R » est une petite protéine nucléaire d’environ 14 kD exprimée tardivement lors du cycle réplicatif viral. Vpr est empaquetée dans les virions et recrutée dans le core viral où elle est étroitement associée à l’ARN génomique viral. Vpr peut donc intervenir dans les premières étapes du cycle réplicatif viral. Les rôles de Vpr sont multiples : modulation du taux de mutations du HIV-1, migration du complexe de pré-intégration vers le noyau, progression du cycle cellulaire et fran^-activation du LTR du HIV-1 ainsi que d’autres gènes cellulaires. Un rôle possible de Vpr dans l’apoptose est actuellement soumis à controverse (revu dans Le Rouzic and Benichou 2005, Gramberg et al. 2009, Malim and Emerman 2008).
La rétro-transcription se déroule dans le cytoplasme de la cellule au sein d’un large complexe nucléo-protéique appelé RTC pour « Reverse Transcription Complex ». Outre la retro-transcriptase, l’intégrase et d’autres protéines de la matrice, ce complexe contient Vpr.
Vpr module le taux de mutation du HIV-1 en influençant l’exactitude de la retro-transcription.
En effet, Vpr interagit avec UNG2 (« Uracil DNA Glycosylase 2 »), une enzyme impliquée dans les voies de réparation de l’ADN et qui enlève les bases uraciles de l’ADN (revu dan Le Rouzic and Benichou 2005).
Le rôle de Vpr dans la migration du complexe de pré-intégration vers le noyau est suggéré par sa présence dans le complexe et sa forte affinité pour des nucléoporines. Les nucléoporines sont les protéines qui font partie des pores nucléaires. Les pores nucléaires se définissent comme des canaux aqueux qui régulent le trafic des protéines entre le cytoplasme et le noyau (revu dans Le Rouzic and Benichou 2005).
Une caractéristique propre de Vpr est l’arrêt en phase G2 du cycle cellulaire des cellules infectées par HIV-l. L’accumulation de cellules exprimant Vpr en phase G2 est corrélée avec l’inactivation du complexe formé par la kinase cycline-dépendante p34/cdc2 et la cycline B1. Ce complexe permet la régulation de la transition de la phase G2 à la phase M du cycle cellulaire. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont mal connus à ce jour (revu dans Gramberg et al. 2009, Le Rouzic and Benichou 2005). Vpr affecte les voies cellulaires de réponse à un ADN endommagé sans induire des dommages à l’ADN. Il a été montré que Vpr est capable de s’associer deux protéines: DDBl ou «damage DNA-specific binding protein 1 » et DCAFl ou «DDBl Cullin-Associated Factor 1 ». Ces deux protéines font partie d’un complexe E3 ubiquitine-ligase similaire à celui capable de s’associer à Vif. Les protéines DCAFs servent d’adaptateurs qui ciblent les protéines cellulaires pour l’ubiquitination. Il a été montré que l’association de Vpr avec l’ubiquitine-ligase induit l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2 (revu dans Gramberg et al. 2009).
-
7
-Maturation ^ ô ^ '^^'O
Fig. 16 Cycle de réplication du HIV-1
L’interaction entre les protéines de l’enveloppe virale (gpl20, gp41), le récepteur cellulaire CD4 et les co-récepteurs
CCR5 ou CXCR4 entraine la fusion des membranes virale et cellulaire et la libération de la capside contenant l’ARN
génomique viral dans le cytoplasme de la cellule hôte. Après l’étape de transcription inverse, l’ADN proviral est intégré
au génome de la cellule hôte et acquiert le même statut qu’un gène cellulaire. Les ARNs transcrits par la machinerie
enzymatique de l’hôte vont permettre la synthèse des protéines nécessaires à la formation d’une nouvelle particule virale
qui va quitter la cellule par bourgeonnement. Une dernière étape dite de “maturation” est nécessaire pour rendre la
particule virale infectieuse. Cette figure est décrite de manière plus détaillée dans la section 1.4 de l’introduction.
4. Cycle réplicatif du HIV-1
Le cycle réplicatif du HIV-1 peut être divisé en deux phases majeures : la phase d’établissement comprenant les étapes de l’infection allant de la liaison à la cellule à l’intégration de l’ADNc dans le génome cellulaire et la phase plus tardive de l’expression des gènes viraux jusqu’à la maturation de nouveaux virions (Fig. 16) (revu dans Nisole and SaiL 2004, Nielsen et al. 2005, Verani et al. 2005, Carter and Ehrlich 2008).
Phase précoce d’établissement
L’infection par le HIV-1 est initiée par la liaison de la gpl20 du virion au récepteur CD4 présent à la surface des cellules T-lymphoc}4aires et monoc54aires/macrophagiques.
Cette liaison entraine un changement de conformation de la gpl20 qui expose ainsi ses sites de liaison au corécepteur CCR5 ou CXCR4. Cette double reconnaissance au récepteur/corécepteur libère le peptide de fusion N-terminal de la glycoprotéine transmembranaire gp41, induisant la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire et l’internalisation de la capside dans le cytoplasme de la cellule cible.
Jusqu’il y a peu, on considérait que le tropisme du HIV-1 pour les cellules T CD4+
ou les macrophages dépendait du choix du corécepteur : les récepteurs aux chimiokines CXCR4 ou CCR5 respectivement. Tandis que les lignées T CD4+ transformées n’expriment que CXCR4, les macrophages et les lymphocytes primaires qui sont les principales cibles du HIV in vivo expriment les deux récepteurs à leur surface (revu dans Carter and Ehrlich 2008).
n semblerait qu’en plus de l’interaction du virus avec le récepteur/corécepteur, d’autres interactions spécifiques avec la membrane des macrophages, telles que par exemples avec l’alpha-v-integrin (Bosch et al. 2006) ou l’annexin 2 faciliteraient l’entrée de la particule virale dans les macrophages (revu dans Wahl et al. 2003, Wahl et al. 2006).
Une fois internalisé dans le c5^oplasme, la capside virale migre jusqu’au noyau en utilisant un réseau de microtubules (McDonald et al. 2002). Pendant la migration vers le noyau, l’ARN génomique viral est rétrotranscrit en ADN bicaténaire par la transcriptase inverse du HIV-l. Ce processus de rétrotranscription permet de générer les longues répétitions terminales ou LTRs. Les LTRs sont divisés en trois régions appelées U3, R et U5 en fonction de leur origine respective dans TARN génomique virale (Unique en 3’, Répété aux deux extrémités et Unique en 5’ respectivement). Après la rétrotranscription, l’ADN génomique bicaténaire rétro viral migre vers le noyau où il est intégré au génome cellulaire par Tintégrase virale et est appelé provirus.
C’est également lors de la migration vers le noyau que le virus peut être soumis à divers mécanismes antiviraux intrinsèques à la cellule (revu dans Wainberg and Jeang 2008). Parmi ces mécanismes, citons APOBEC3G (Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G) qui possède une activité désaminase et mute les cytidines en uridines pendant le processus de rétrotranscription en l’absence de Vif (Goila-Gaur and Strebel 2008) (voir section 1.3) ou HS27 (« Heat Shock protein 27 ») qui possède une activité anti-Vpr (Liang et al. 2007).
-
8
-Phase tardive d’expression
Le provirus acquiert la même stabilité génétique et le même statut qu’un gène cellulaire. U peut dès lors être exprimé et répliqué grâce à la machinerie enzymatique de la cellule hôte.
Dans certains cas, le provirus peut être complètement silencieux suite à un blocage transcriptionnel ; on parle alors de latence post-intégrationnelle. L’ADN viral peut également rester de façon stable dans la cellule sous forme linéaire, cyclique à 1 LTR ou cyclique à 2 LTRs non intégrée. On parle alors de latence pré-intégrationnelle qui résulte d’une rétrotranscription incomplète et/ou d’une intégration inefficace. En 2008, Kelly et ses collaborateurs ont montré qu’en macrophages, l’ADN viral non intégré était particulièrement stable (au moins 30 jours) et reste biologiquement actif (Kelly et al. 2008).
Ces deux formes de latences par HIV-1 sont très probablement critiques pour la survie et la propagation du virus puisqu’elles lui permettent d’échapper à la réponse immunitaire de l’hôte (Pierson et al. 2002, Lassen et al. 2004, Siliciano 2005, Shen and Siliciano 2008).
La production de nouveaux virions n’a lieu que dans une petite portion des cellules infectées. En effet, l’expression des gènes viraux est déterminée au moins en partie par le site d’intégration, l’état de prolifération et d’activation cellulaire (section II, 3). Après stimulation des cellules infectées de manière latente par divers signaux d’activation tels que des cytokines, des facteurs de croissance, des radiations UV ou d’autres stimuli extérieurs, le provirus est transcrit par l’ARN polymérase II (RNA pol II) cellulaire en molécules d’ARN qui migrent vers le cytoplasme. La transcription est initiée à la jonction U3-R du LTR 5’ et se termine à Injonction R-U5 du LTR 3’. Par conséquent, malgré des séquences nucléotidiques identiques, les deux LTRs ont des rôles fonctionnels différents : le LTR 5’ se comporte comme un promoteur transcriptionnel tandis que le LTR 3’ se comporte comme un site de polyadénylation. A ce jour, une trentaine d’ARNm distincts ont été identifiés dans les cellules infectées par le HIV-l. Ces messagers sont générés à partir d’un transcrit primaire unique selon un processus complexe d’épissage alternatif. Ces transcrits servent soit d’ARNs messagers viraux traduits en protéines virales enzymatiques et de structure soit en ARNs génomiques emballés dans de nouveaux virions. La traduction des ARNm viraux en protéines se fait via l’utilisation de multiples cadres ouverts de lecture souvent chevauchant.
L’assemblage de la particule virale se fait au niveau de la membrane plasmique où les polyprotéines Gag et Gag-Pol s’accumulent au niveau de structures lipidiques appelés radeaux (revu dans Gomez and Hope 2005, Nielsen et al. 2005). Deux molécules d’ARN génomique s’associent à ces polyprotéines selon un processus impliquant le signal d’emballage (packaging signal) localisé dans la région leader de l’ARN génomique viral et le domaine protéique de la nucléocapside de la protéine Gag. Le virus peut bourgeonner à la surface cellulaire emportant avec lui une partie de la bicouche lipidique dans laquelle sont insérées des molécules de la protéine virale d’enveloppe.
Outre le modèle de bourgeonnement au niveau des radeaux lipidiques, un autre modèle complémentaire a été proposé pour les macrophages : Phypothèse de l’exosome de Troie.
Selon ce modèle, les particules virales s’accumuleraient au niveau d’endosomes tardifs et de corps multi-vésiculaires ce qui expliquerait la longévité des macrophages infectés par le virus en dépit d’une production virale constante. La libération des particules virales se ferait quand ces endosomes tardifs et ces corps multi-vésiculaires migrent à la surface, fusionnent avec la
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9
-membrane plasmique et libèrent leur contenu. Ce modèle est récemment soumis à controverse car l’accumulation de particules virales dans les endosomes tardifs et les corps multi-vésiculaires serait rare dans les macrophages in vivo. L’assemblage et le bourgeonnement se feraient donc essentiellement au niveau de la membrane plasmique tant dans les cellules T CD4+ que dans les macrophages (revu dans Carter and Erhlich 2008).
Lors de l’étape de maturation qui suit le bourgeonnement du virus à la surface cellulaire, les polyprotéines Gag et Gag-Pol sont clivées par le domaine protéase du précurseur Gag-Pol. Le clivage de Gag permet d’obtenir la matrice, la capside et la nucléocapside tandis que le clivage de Gag-Pol permet d’obtenir les protéines virales enzymatiques. Une fois le processus de maturation terminé, le nouveau virion est infectieux
(revu dans Nielsen et al. 2005)
-
10
-A B
H2A
Fig. 17 Organisation d’un nucléosome
A. Représentation schématique d’un nucléosome vu du dessus. Un tétramère constitué de deux histones H3 et de deux histones H4, est flanqué de deux dimères H2A/H2B. Le deuxième dimère se trouve en dessous du tétramère. L’histone H1 est localisée en dehors du nucléosome, associée à l’ADN linker.
B. Représentation schématique du même nucléosome vu de face. Les queues amino-terminales des histones du core
nucléosomal sont représentées.
II. Analyse de la structure chromatinienne du HIV-1
1. Généralités
Le génome des cellules eucaryotes est organisé en une structure appelée chromatine qui permet une condensation importante de l’information génétique dans le noyau et régule l’accès à l’ADN de divers complexes protéiques. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome qui consiste en 146 pb d’ADN enroulé 1,75 fois autour d’un octamère de protéines histones contenant deux fois chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4. Chaque octamère d’histones est arrangé de manière tripartite : un tétramère central (H3/H4)x2 flanqué de chaque côté par un dimère H2A/H2B (revu dans Kulaeva et al. 2007, Fischle et al. 2003, Pumfery et al. 2003, Wolffe et al. 1999). Une molécule unique d’histone H1 est associée à l’ADN (ADN « linker ») séparant deux nucléosomes (Fig. 17). L’histone H1 est responsable du maintien et de la stabilisation d’une structure chromatinienne hautement ordonnée (Raghuram et al. 2009). La résolution de la structure cristallographique à haute résolution d’un nucléosome (Luger et al. 1997) a permis de mettre en évidence que chaque histone possède deux domaines :
un domaine globulaire à l’extrémité C-terminale forme le « core » du nucléosome . Ce domaine est impliqué dans les interactions histones-histones et histones-ADN.
une queue N-terminale basique chargée positivement émerge du core du nucléosome et peut interagir avec des protéines non-histones et l’ADN chargé négativement.
La chromatine est hétérogène dans le noyau ; les gènes transcriptionnellement actifs sont caractérisés par une structure plus diffuse de la chromatine (« Veuchromatine ») tandis que les gènes inactifs sont empaquetés dans une configuration chromatinienne fortement condensée (« l’hétérochromatine »).
La chromatine active est moins compacte et donc définie par une sensibilité générale aux nucléases dix fois plus élevée que celle de la chromatine inactive. Cette sensibilité s’étend généralement sur plusieurs kilobases de part et d’autre d’un gène potentiellement actif ou activement transcrit. Les causes précises de cette sensibilité généralisée de l’euchromatine ne sont pas connues. Cependant, le contenu élevé en histones acétylées et en certaines protéines chromosomiques non-histones, ainsi que l’instabilité accrue des dimères H2A/H2B et l’hypométhylation relative de l’ADN dans les gènes actifs pourraient être impliqués dans ce processus.
De plus, certaines régions de la chromatine active peuvent présenter une hypersensibilité aux nucléases ; ces régions sont 100 fois plus sensibles à la digestion par les nucléases que la chromatine inactive. Ces sites hypersensibles (s’étendant sur 100 - 200 pb), localisés dans les régions de sensibilité généralisée, correspondent en général aux régions c/^-régulatrices des gènes actifs tels que des promoteurs, des enhancers, des UASs (« Upstream Activating Sequence » chez la levure), des silencers, des terminateurs, des loci de recombinaison, des télomères et des centromères. De tels sites hypersensibles aux nucléases in vivo sont probablement dus au déplacement ou à l’altération locale de la structure nucléosomale par des facteurs de transcription liés à l’ADN. Dans certains systèmes, des variations dans la sensibilité d’un site hypersensible particulier précèdent ou accompagnent l’activation ou la répression des gènes, ce qui renforce la corrélation entre ces sites et la régulation génique.
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-De nombreux proeessus eellulaires tels que la réplication, la recombinaison, la réparation de l’ADN et plus particulièrement la transcription, qui nous intéresse dans cette section, nécessitent des changements dans la structure chromatinienne de manière à rendre l’ADN accessible aux machineries enzymatiques et autres protéines indispensables au déroulement de ces processus. On distingue deux grandes classes de complexes capables de réguler l’accessibilité à l’ADN aux facteurs de liaison (revu dans Gangaraju and Bartholomew 2007, Li et al. 2007, Pumfery et al. 2003, Narlikar et al. 2002) :
les complexes ATP-dépendants qui nécessitent l’hydrolyse d’ATP et impliquent des mouvements des octamères d’histones sur l’ADN pour le rendre accessible.
Parmi ces complexes, les plus connus chez l’homme sont SWI/SNF (« mating-type SWItching/Sucrose Non-Fermenting ») et ISWI (« Imitation SWItch »).
les complexes qui vont modifier de manière covalente les queues N-terminales des histones par acétylation, phosphorylation, ubiquitination ou encore par méthylation.
Les diverses combinaisons des modifications post-traductionnelles des histones au niveau d’un seul histone, d’un seul nucléosome ou d’un domaine nucléosomal établissent des modifications locales ou globales de la chromatine qui peuvent être liés à certaines fonctions spécifiques. On en arrive ainsi à la notion de « code histone » (revu dans Escargueil et al.
2008, Li et al. 2007, Kouzarides 2007, Fischle 2003). Cette hypothèse prévoit :
1°) des modifications distinctes de la queue N-terminale d’un histone particulier peuvent être « lues » par d’autres protéines associées à la chromatine servant ainsi de plateforme pour le recrutement d’autres facteurs nucléaires.
2°) des modifications de la queue d’un même histone ou d’histones différents peuvent dépendre l’une de l’autre et générer des combinaisons variées de modifications distinctes sur des nucléosomes particuliers.
3°) plusieurs types de chromatine hautement ordonnée (tels que l’euchromatine ou l’hétérochromatine) dépendent largement de la concentration locale et de la combinaison de nucléosomes modifiés de manière différente.
Afin d’illustrer de quelle manière des modifications spécifiques des histones peuvent être traduites en changements au niveau du statut d’un gène ou de son activité, prenons l’exemple de l’acétylation. H a été montré que, dans la plupart des cas, l’acétylation altère la stmcture secondaire de la queue des histones, diminue les interactions entre la queue des histones et l’ADN et diminue les interactions inter-nucléosomales et le reploiement de la chromatine. Ces effets semblent directement liés à un changement de la charge nette des queues des histones suite à l’acétylation ; la neutralisation de la charge positive des queues des histones diminue l’interaction avec l’ADN chargé négativement (revu dans Fischle et al.
2003).
2. La régulation transcriptionnelle chez les eucaryotes
La régulation de la transcription des gènes codant pour les protéines chez les eucaryotes (ou gènes de classe II) dépend de plusieurs éléments : la structure chromatinienne (discutée ci-dessus), des séquences d’ADN agissant en cis (core promoteur, enhancers, silencers) et des facteurs de transcription agissant en trans.
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