per l’esame
del liquido seminale
QUINTA EDIZIONE
per l’esame
del liquido seminale
QUINTA EDIZIONE
Traduzione del WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, fifth edition,a cura della Società Italiana di Andrologia e Medicina della Sessualità (SIAMS)
© Organizzazione Mondiale della Sanità, 2010.
Il Direttore Generale dell’Organizzazione Mondiale della Sanità ha concesso i diritti di traduzione e pubblicazione per l’edizione italiana alla SIAMS che è la sola responsabile per l’edizione italiana.
Manuale di laboratorio WHO per l’esame del liquido seminale, quinta edizione.
© Società Italiana di Andrologia e Medicina della Sessualità (SIAMS), 2010.
Tutti i diritti sono riservati. Le pubblicazioni dell’Organizzazione Mondiale della Sanità possono essere ottenute da WHO Press, World Health Organization, 20 Avenue Appia, 1211 Ginevra 27, Svizzera (tel.: +41 22 791 3264; fax:
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Finito di stampare nel dicembre 2010 per i tipi della Eurolit, Roma.
Si ringrazia per il gentile contributo dato alla realizzazione di questo manuale il Centro Interuniversitario di Andrologia Sperimentale (CASPER).
INDICE
Ringraziamenti XII
Acronimi e abbreviazioni usati in questo manuale XIV
Capitolo 1 Stato dell’arte 1
1.1 Introduzione 1
1.2 La quinta edizione 1
1.3 Scopo del manuale 3
PARTE I. ANALISI DEL LIQUIDO SEMINALE
Capitolo 2 Procedure standard 7
2.1 Introduzione 7
2.2 Raccolta del campione seminale 10
2.2.1 Preparazione 10
2.2.2 Raccolta del campione a fini diagnostici o di ricerca 11 2.2.3 Raccolta in contenitore sterile per la riproduzione assistita 11 2.2.4 Raccolta in contenitore sterile per analisi microbiologica 12
2.2.5 Raccolta del campione a casa 12
2.2.6 Raccolta del campione con profilattico 12
2.2.7 Sicurezza nella manipolazione dei campioni 13
2.3 Valutazione macroscopica iniziale 13
2.3.1 Fluidificazione 14
2.3.2 Viscosità del liquido seminale 15
2.3.3 Aspetto dell’eiaculato 15
2.3.4 Volume del liquido seminale 16
2.3.5 pH del liquido seminale 17
2.4 Valutazione microscopica iniziale 18
2.4.1 Accurato miscelamento del campione e prelevamento di aliquote
rappresentative dell’intero campione seminale 18
2.4.2 Allestimento del preparato a fresco 19
2.4.3 Aggregazione nemaspermica 20
2.4.4 Agglutinazione nemaspermica 20
2.4.5 Componente cellulare non nemaspermica 22
2.5 Motilità nemaspermica 22
2.5.1 Categorie di movimento nemaspermico 23
2.5.2 Preparazione e valutazione di un campione per la motilità 23
2.5.3 Esempi 27
2.5.4 Limiti inferiori di riferimento 27
2.6 Vitalità nemaspermica 27
2.6.1 Test di vitalità mediante eosina-nigrosina 28
2.6.2 Test di vitalità con l’utilizzo della sola eosina 30
2.6.3 Test di vitalità mediante l’uso del rigonfiamento iposmotico 32
2.7 Concentrazione nemaspermica 34
2.7.1 Tipi di camere di conta 35
2.7.2 Emocitometro di Neubauer modificato 35
2.7.3 Utilizzo della griglia dell’emocitometro 36
2.7.4 Manutenzione della camera di conta 37
2.7.5 Fissativo per la diluizione del liquido seminale 37
2.7.6 Importanza di una conta sufficiente di spermatozoi 38
2.8 Procedura di conta di routine 39
2.8.1 Determinazione della diluizione richiesta 39
2.8.2 Preparazione delle diluizioni e caricamento delle camere emocitometriche 41 2.8.3 Valutazione del numero di spermatozoi nelle camere di conta 42 2.8.4 Calcolo della concentrazione degli spermatozoi nel liquido seminale 44
2.8.5 Esempi 45
2.8.6 Limiti di riferimento inferiori per la concentrazione degli spermatozoi 46 2.8.7 Calcolo del numero totale di spermatozoi nell’eiaculato 46 2.8.8 Limiti di riferimento inferiori per la concentrazione totale degli spermatozoi 46
2.9 Numero di spermatozoi basso: criptozoospermia e sospetto
di azoospermia 46
2.10 Quando non è necessaria una valutazione accurata del basso
numero di spermatozoi 47
2.10.1 Casi che non richiedono ulteriori valutazioni 47
2.10.2 Valutazione dei campioni centrifugati per identificare gli spermatozoi 47 2.10.3 Esame dei campioni non centrifugati per identificare spermatozoi mobili 48
2.11 Quando è richiesta una accurata valutazione di un basso
numero di spermatozoi 49
2.11.1 Valutazione di bassi numeri di spermatozoi nell’intera camera Neubauer
modificata (con microscopio a contrasto di fase) 50
2.11.2 Valutazione di bassi numeri di spermatozoi in vetrini monouso per grandi volumi
(microscopia a fluorescenza) 54
2.12 Conta delle cellule non nemaspermiche 57
2.12.1 Calcolo della concentrazione delle cellule rotonde nel liquido seminale 58
2.12.2 Sensibilità del metodo 58
2.12.3 Esempi 58
2.13 Morfologia nemaspermica 59
2.13.1 Il concetto di spermatozoi normali 59
2.13.2 Preparazione degli strisci seminali 60
2.14 Metodi di colorazione 64
2.14.1 Fissazione tradizionale e colorazione sequenziale 64
2.14.2 Procedimento di colorazione Papanicolaou per la morfologia nemaspermica 65 2.14.3 Procedura di colorazione Shorr per la morfologia nemaspermica 68 2.14.4 Procedura di colorazione rapida per la morfologia nemaspermica 69
2.15 Esame delle preparazioni colorate 70
2.15.1 Classificazione della normale morfologia nemaspermica 70 2.15.2 Classificazione della morfologia degli spermatozoi atipici 71
2.16 Tavole della morfologia 1-14 73
2.17 Analisi morfologica di uno striscio di liquido seminale 103 2.17.1 Valutazione della normale morfologia degli spermatozoi 103
2.17.2 Esempi pratici 104
2.17.3 Limite di riferimento inferiore 105
2.17.4 Valutazione della morfologia degli spermatozoi atipici 105
2.17.5 Esempi 105
2.17.6 Valutazione di particolari difetti degli spermatozoi 106
2.18 Valutazione dei leucociti nel liquido seminale 106 2.18.1 Colorazione della perossidasi cellulare mediante o-toluidina 107 2.19 Valutazione delle cellule germinali immature nel liquido seminale 112 2.20 Analisi degli antigeni di superficie degli spermatozoi 112
2.20.1 Mixed antiglobulin reaction test 113
2.20.2 L’IBT diretto 115
2.20.3 L’IBT indiretto 118
Capitolo 3 Procedure facoltative 120
3.1 Indici di difetti multipli degli spermatozoi 120
3.1.1 Calcolo degli indici di difetti morfologici multipli 120
3.1.2 Esempio 121
3.2 Colorazione immunocitochimica per i globuli bianchi (CD45) 122
3.2.1 Principi 122
3.2.2 Reagenti 123
3.2.3 Procedura 123
3.3 Interazione fra spermatozoi e muco cervicale 126
3.3.1 Test in vivo(post-coital test) 127
3.3.2 Test in vitro 130
3.3.3 Test in vitrosemplificato 131
3.3.4 Test del capillare 132
3.4 Saggi biochimici per la funzione delle ghiandole accessorie 135
3.4.1 Misurazione dello zinco nel plasma seminale 136
3.4.2 Dosaggio del fruttosio nel plasma seminale 137
3.4.3 Dosaggio dell’alfa-glucosidasi neutra nel plasma seminale 139
3.5 Analisi computerizzata del liquido seminale 142
3.5.1 Introduzione 142
3.5.2 Uso del CASA per valutare la motilità nemaspermica 143
3.5.3 Uso del CASA per valutare la concentrazione di spermatozoi 146 3.5.4 Valutazione morfometrica computerizzata dello spermatozoo 146
Capitolo 4 Procedure di ricerca 148
4.1 Specie reattive dell’ossigeno 148
4.1.1 Introduzione 148
4.1.2 Misurazione delle specie reattive dell’ossigeno generate da sospensione
di spermatozoi 149
4.2 Test di interazione fra spermatozoo e ovocita 152
4.3 Test di legame alla zona pellucida 153
4.4 Valutazione della reazione acrosomiale 153
4.4.1 Procedura mediante fluorescenza per la valutazione dello status acrosomiale 154
4.4.2 Test per la reazione acrosomiale indotta 156
4.5 Hamster test 158
4.5.1 Protocollo 159
4.6 Valutazione della cromatina nemaspermica 164
PARTE II. PREPARAZIONE DEGLI SPERMATOZOI
Capitolo 5 Tecniche di preparazione degli spermatozoi 167
5.1 Introduzione 167
5.1.1 Quando gli spermatozoi devono essere separati dal plasma seminale 167
5.1.2 Scelta del metodo 167
5.1.3 Efficienza di separazione degli spermatozoi dal plasma seminale
e da organismi infettivi 168
5.2 Principi generali 168
5.3 Lavaggio semplice 169
5.3.1 Reagenti 169
5.3.2 Procedura 169
5.4 Swim-up diretto 170
5.4.1 Reagenti 170
5.4.2 Procedura 171
5.5 Gradienti discontinui di densità 171
5.5.1 Reagenti 172
5.5.2 Procedure 172
5.6 Preparazione di campioni seminali con infezione da HIV 173 5.7 Preparazione di spermatozoi testicolari e dell’epididimo 173
5.7.1 Metodo enzimatico 174
5.7.2 Metodo meccanico 174
5.7.3 Preparazione delle sospensioni di spermatozoi per l’iniezione intracitoplasmatica 174 5.8 Preparazione di campioni da eiaculazione retrograda 174 5.9 Preparazione di campioni con eiaculazione stimolata 175
Capitolo 6 Crioconservazione di liquido seminale 176
6.1 Introduzione 176
6.2 Protocolli di crioconservazione del liquido seminale 179
6.2.1 Procedura standard 179
6.2.2 Protocolli di congelamento modificati per campioni oligozoospermici
e spermatozoi recuperati chirurgicamente 182
6.2.3 Codifica delle paillettes e registrazione 183
PARTE III. L’ASSICURAZIONE DI QUALITÀ
Capitolo 7 Assicurazione di qualità e controllo di qualità 187 7.1 Controllo di qualità nel laboratorio di andrologia 187 7.2 La natura degli errori nell’analisi del liquido seminale 187 7.3 Ridurre al minimo l’errore di campionamento statistico 188
7.4 Il programma di assicurazione di qualità 190
7.5 Il manuale delle procedure di laboratorio 191
7.6 Il controllo di qualità interno 191
7.6.1 Campioni per il QC acquistati 191
7.6.2 Campioni per il QC realizzati in laboratorio 192
7.6.3 Campioni conservati (acquistati o prodotti in laboratorio) 192 7.6.4 Campioni freschi per il QC (prodotti in laboratorio) 193
7.7 Procedure statistiche di analisi e registrazione degli errori sistematici
intra e inter seminologi 194
7.7.1 La carta Xbar 194
7.7.2 La carta S 197
7.8 QC per le percentuali 198
7.9 Valutazione delle carte Xbare S 198
7.9.1 Come riconoscere i valori fuori controllo 199
7.9.2 Cause di valori fuori controllo 200
7.9.3 Risposte ai valori fuori controllo 200
7.10 Procedure statistiche per l’analisi e la registrazione
della variabilità fra seminologi 201
7.10.1 Comparare i risultati tra due o più seminologi 201
7.10.2 Controllo mensile delle medie 203
7.11 Controllo e assicurazione di qualità esterni 204
7.11.1 Valutazione dei risultati EQC 206
7.11.2 Le risposte ai risultati “fuori del controllo” 207
7.12 Frequenza e priorità del controllo di qualità 207
7.13 Addestramento 208
7.13.1 Consigli pratici per quando si incontrano difficoltà nel valutare
la concentrazione degli spermatozoi 208
7.13.2 Consigli pratici quando si verificano difficoltà nel valutare la morfologia
degli spermatozoi 210
7.13.3 Consigli pratici in caso di difficoltà nella valutazione della motilità
degli spermatozoi 211
7.13.4 Consigli pratici quando si verificano difficoltà nel valutare la vitalità
degli spermatozoi 213
BIBLIOGRAFIA 217
APPENDICI
Appendice 1 Valori di riferimento e nomenclatura seminale 235
A1.1 Valori di riferimento 235
A1.2 Nomenclatura 237
Appendice 2 Attrezzature e sicurezza 239
A2.1 Forniture di base necessarie in un laboratorio di andrologia 239 A2.2 Possibili rischi biologici in un laboratorio di andrologia 242 A2.3 Procedure di sicurezza per il personale di laboratorio 242 A2.4 Procedure di sicurezza per le apparecchiature di laboratorio 244 A2.5 Procedure di sicurezza per la manipolazione dell’azoto liquido 245
Appendice 3 Microscopia 247
A3.1 Allestimento del campione 247
A3.2 Regolazione degli oculari 249
A3.3 Messa a fuoco dell’immagine 249
A3.4 Messa a fuoco degli oculari 250
A3.5 Messa a fuoco del condensatore di luce 250
A3.6 Centratura del condensatore 250
A3.7 Regolazione degli anelli di fase 251
A3.8 Microscopia a fluorescenza 251
Appendice 4 Soluzioni madre 252
A4.1 Biggers, Whitten e Whittingham 252
A4.2 Tampone fosfato salino Dulbecco 252
A4.3 Soluzione di Earle 253
A4.4 Soluzione di Ham F-10 253
A4.5 Soluzione salina bilanciata di Hanks 254
A4.6 Fluido tubarico umano 254
A4.7 Terreno Krebs-Ringer 255
A4.8 Soluzione salina Tris tamponata 255
A4.9 Soluzione di Tyrode 255
A4.10 Colorante Papanicolaou 255
Appendice 5 Muco cervicale 260
A5.1 Introduzione 260
A5.2 Raccolta e conservazione del muco cervicale 261
A5.3 Valutazione del muco cervicale 262
Appendice 6 Scheda di registrazione per l’analisi del liquido seminale
e del muco cervicale 266
A6.1 Modello di registrazione di analisi del liquido seminale 266
A6.2 Modello di registrazione del muco cervicale 268
Appendice 7 Errori di campionamento e controllo di qualità 269 A7.1 Errori nella misurazione della concentrazione di spermatozoi 269 A7.2 L’importanza di comprendere gli errori di campionamento 271
A7.3 Errori nella misurazione delle percentuali 272
A7.4 Produzione di campioni seminali per il controllo di qualità 276 A7.5 Preparazione di una video-registrazione per il controllo di qualità interno
dell’analisi della motilità spermatica 277
A7.6 Preparazione del seme diluito per il controllo di qualità interno e
determinazione della concentrazione di spermatozoi 281
A7.7 Preparazione dei vetrini per il controllo di qualità interno per la valutazione
della morfologia nemaspermica 285
A7.8 Taratura delle apparecchiature 287
Appendice 8 Programmi nazionali di controllo di qualità esterno per l’analisi
del liquido seminale 289
FIGURE
Fig. 2.1 Variazione nella concentrazione di spermatozoi per eiaculato e per ml
in un periodo di oltre un anno e mezzo 9
Fig. 2.2 Aggregazione non-specifica di spermatozoi nel liquido seminale 20 Fig. 2.3 Schema delle diverse localizzazioni delle agglutinazioni nemaspermiche 21
Fig. 2.4 Supporti alla valutazione della motilità 25
Fig. 2.5 Striscio con colorazione eosina–nigrosina osservato al microscopio
ottico in campo chiaro 29
Fig. 2.6 Rappresentazione schematica delle tipiche modificazioni morfologiche
in spermatozoi umani sottoposti a stress iposmotico 33
Fig. 2.7 Emocitometro di Neubauer modificato 36
Fig. 2.8 Quali spermatozoi contare nei quadrati della griglia 37
Fig. 2.9 Valutazione dell’intero vetrino coprioggetto per la presenza
di spermatozoi mobili 49
Fig. 2.10 Spermatozoi morfologicamente “normali” 60
Fig. 2.11 Metodi di striscio seminale per la morfologia nemaspermica 61 Fig. 2.12 Preparazione di uno striscio di un liquido seminale normale 62 Fig. 2.13 Disegni schematici di alcune forme atipiche di spermatozoi umani 73 Fig. 2.14 Cellule perossidasi-positive e negative in liquido seminale umano 109
Fig. 3.1 Leucociti in liquido seminale 125
Fig. 3.2 La scala di valutazione per il test di Kremer 133
Fig. 3.3 Terminologia standard per le variabili misurate dai sistemi CASA 145 Fig. 4.1 Chemioluminescenza generata in risposta a trattamento con zimosan
opsonizzato 151
Fig. 4.2 Rispettivi contributi delle sottopopolazioni di leucociti e spermatozoi alla capacità di generare specie reattive dell’ossigeno da parte
di sospensioni cellulari 152
Fig. 4.3 Colorazione degli spermatozoi umani mediante agglutinina fluorescente
Pisum sativum(PSA) 156
Fig. 4.4 Microfotografia a contrasto di fase di un ovocita di hamster contenente
spermatozoi umani 164
Fig. 7.1 Un diagramma Xbarper la concentrazione degli spermatozoi 196 Fig. 7.2 Un diagramma Sper la concentrazione degli spermatozoi 198 Fig. 7.3 Una carta Bland-Altman di stime manuali e col sistema CASA
della percentuale progressiva di motilità spermatica 201 Fig. 7.4 Un grafico di Youden per la stima delle concentrazioni degli spermatozoi 202 Fig. A2.1 Nomogramma per la determinazione della forza centrifuga relativa (RCF)
a partire dal raggio del rotore e dalla velocità di rotazione 243 Fig. A5.1 Esempi di cristallizzazione a foglia di felce nel muco cervicale essiccato
all’aria su vetrino 261
Fig. A7.1 Differenze accettabili tra due conte replicate in una funzione del numero
totale di spermatozoi valutati 270
Fig. A7.2 Le differenze accettabili tra le percentuali replicate sono funzione della
percentuale vera e del numero totale di spermatozoi valutati 274 Fig. A7.3 Supporto alla valutazione della motilità degli spermatozoi 280 Fig. A7.4 Vista attraverso un oculare con reticolo (reticolo rosso) 280 Fig. A7.5 Immagine video-registrata del micrometro sul monitor e la sovrapposizione
dei tratti 281
RIQUADRI
Riquadro 2.1 Conferma della qualità del contenitore in cui è stato raccolto il campione 11
Riquadro 2.2 Preparazione della bromelina 15
Riquadro 2.3 Accurato miscelamento del liquido seminale 19
Riquadro 2.4 Spessore del preparato a fresco 19
Riquadro 2.5 Errori nella valutazione delle percentuali 26
Riquadro 2.6 Confronto tra percentuali di replicati 26
Riquadro 2.7 Errori nella valutazione del numero 38
Riquadro 2.8 Ottenere una conta di 200 spermatozoi per replicati nelle tre griglie
centrali della camera Neubauer modificata 39
Riquadro 2.9 Volume osservato per pcv in una preparazione a fresco
con spessore di 20 μm 40
Riquadro 2.10 Confronto tra conte replicate 44 Riquadro 2.11 Ottenere 200 spermatozoi per replicato in tutte le 9 griglie
della camera Neubauer modificata 50
Riquadro 2.12 Ottenere 200 spermatozoi per replicato in una camera monouso
per volumi grandi di 100 μm di profondità. 54
Riquadro 2.13 Volume osservato per campo visivo in una camera monouso
a grande volume, 100 μm di profondità 56
Riquadro 2.14 Mezzi di montaggio 65
Riquadro 3.1 Preparazione della cera di vaselina 128
Riquadro 3.2 Volume osservato per campo visivo in una preparazione di muco cervicale
di profondità 100 μm 128
Riquadro 4.1 Induzione dell’ovulazione in hamster 161
Riquadro 4.2 Preparazione di pipette di vetro 162
Riquadro 6.1 Motivi per la crioconservazione degli spermatozoi 177 Riquadro 6.2 Valutazione del rischio della crioconservazione e dello stoccaggio
del liquido seminale umano 178
Riquadro 7.1 Terminologia nell’assicurazione e nel controllo di qualità 188 Riquadro 7.2 Determinazione dei valori per i limiti di controllo di azione e di allarme
di una carta Xbar 195
Riquadro 7.3 Metodo alternativo per il calcolo dei limiti di controllo Xbardall’insieme
delle deviazioni standard 196
Riquadro 7.4 Determinazione dei valori per i limiti di controllo di allarme
e di azione di una carta S 197
Riquadro 7.5 Regole di controllo di base per le carte QC 199
Riquadro 7.6 Valutazione delle differenze sistematiche tra seminologi 204
Riquadro 7.7 Principali caratteristiche delle procedure IQC 205
Riquadro 7.8 Calendario per il controllo di qualità 207
Riquadro 7.9 Sommario dei test QC 208
Riquadro A2.1 Calcolo forze centrifughe 242
Riquadro A3.1 L’obiettivo 248
Riquadro A5.1 Misurare il volume del muco raccolto 263
Riquadro A5.2 Volume di un preparato di muco profondo 100 μm osservato al microscopio
con un obiettivo a 40x 264
TABELLE
Tabella 2.1 Differenze accettabili tra due percentuali medie, determinate
da conte replicate di 200 spermatozoi (400 spermatozoi totali contati) 26 Tabella 2.2 Errori di conta arrotondati (%) secondo il numero totale di
spermatozoi contati 38
Tabella 2.3 Diluizioni necessarie del liquido seminale, modalità di preparazione,
camere da utilizzare, potenziali aree da valutare 40
Tabella 2.4 Differenze accettabili tra due conte replicate relative
ad una data somma 43
Tabella 2.5 Differenza accettabile tra due conte per una data somma:
basse concentrazioni 52
Tabella 2.6 Spiegazioni utilizzate nei commenti alle Tavole 1–14 75 Tabella 2.7 Quantità di liquido seminale da utilizzare per l’Immunobead test 116 Tabella 3.1 Calcolo degli indici dei difetti multipli degli spermatozoi 121
Tabella 3.2 Indici dei difetti nemaspermici da uomini di coppie fertili e infertili 122 Tabella 3.3 Grado di densità di penetrazione degli spermatozoi 134 Tabella 3.4 Classificazione dei risultati del test del capillare 135 Tabella 7.1 Fattori per la determinazione dei limiti di controllo per le carte Xbar
e Sbasati sulla deviazione standard media (Sbar) 195
Tabella 7.2 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della concentrazione
nemaspermica e soluzioni proposte 209
Tabella 7.3 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della morfologia degli
spermatozoi e soluzioni proposte 211
Tabella 7.4 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della motilità degli spermatozoi
e soluzioni proposte 212
Tabella 7.5 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della vitalità degli spermatozoi
e soluzioni proposte 213
Tabella A1.1 Valori di riferimento minimi delle caratteristiche seminali (5° percentile
e intervallo di confidenza del 95%) 236
Tabella A1.2 Distribuzione dei valori per i parametri seminali relativi a uomini le cui partner sono entrate in gravidanza entro 12 mesi dalla sospensione dell’uso di metodi
contraccettivi 237
Tabella A1.3 Nomenclatura seminale 238
Tabella A7.1 Differenze accettabili tra 2 conte replicate relative ad una data somma 271 Tabella A7.2 Differenze accettabili tra due percentuali medie, derivate da conte replicate
di 100 spermatozoi (200 contati) 275
Tabella A7.3 Differenze accettabili tra due percentuali medie, derivate da conte replicate
di 200 spermatozoi (400 contati) 275
Tabella A7.4 Differenze accettabili tra due percentuali medie, derivate da conte replicate
di 400 spermatozoi (800 contati) 276
Editor
Dr Trevor G Cooper
Centre of Reproductive Medicine and Andrology of the University,
Münster, Germany
(WHO Collaborating Centre
for Research in Male Reproduction)
Team editoriale Dr John Aitken Biological Sciences
School of Life and Environmental Sciences University Drive
Callaghan, New South Wales, Australia Dr Jacques Auger
Service de Biologie de la Réproduction Pavillon Cassini Hôpital Cochin
Paris, France
Dr HW Gordon Baker University of Melbourne
Department of Obstetrics and Gynaecology Royal Women’s Hospital Carlton, Victoria, Australia
Dr Chris LR Barratt
Division of Maternal and Child Health Sciences The Medical School
Ninewells Hospital Dundee, Scotland Dr Hermann M Behre
Centre for Reproductive Medicine and Andrology
Martin-Luther-University Halle, Germany
Dr Lars Björndahl Andrology Centre,
Karolinska University Hospital and Institute, Stockholm, Sweden
Ms Charlene Brazil
Center for Health and the Environment University of California Davis, CA, USA Dr Christopher De Jonge
University of Minnesota Reproductive Medicine Center
Minneapolis, MN, USA Dr Gustavo F Doncel CONRAD
Department of Obstetrics and Gynecology Eastern Virginia Medical School
Norfolk, VA, USA Dr Daniel Franken
Department of Obstetrics and Gynaecology Tygerberg Hospital
Tygerberg, South Africa Dr Trine B Haugen Faculty of Health Sciences Oslo University College Oslo, Norway
Dr Aucky Hinting Andrology Unit,
Department of Biomedicine School of Medicine
Airlangga University, Surabaya, Indonesia
Ringraziamenti
Questa pubblicazione è stata prodotta dalla UNDP / UNFPA / WHO / Programma Speciale di Ri- cerca, Sviluppo e Formazione in Riproduzione Umana (HRP) della Banca Mondiale, dall’OMS Di- partimento di Salute Riproduttiva e Ricerca (RHR). Per la partecipazione nella preparazione e redazione di questo manuale si ringraziano le seguenti persone:
Mr Godwin E Imade
Department of Obstetrics and Gynaecology Faculty of Medical Sciences
University of Jos Jos, Nigeria Dr Thinus F Kruger
Reproductive Biology Unit
Stellenbosch University Tygerberg, South Africa
Dr Hesbon O Odongo Department of Zoology University of Nairobi Nairobi, Kenya
Ms Elizabeth Noonan
Fred Hutchinson Cancer Research Center Statistical Center for HIV/AIDS Research and Prevention
Seattle, WA, USA Dr Steven M Schrader
National Institute for Occupational Safety and Health
Centers for Disease Control and Prevention Cincinnati, OH, USA
Dr Christina CL Wang Harbor-UCLA Medical Center Torrance, CA, USA
Dr William Shu-Biu Yeung
Department of Obstetrics and Gynaecology University of Hong Kong
Hong Kong SAR, China
Segreteria WHO, Dipartimento di Salute Riproduttiva e Ricerca
Dr Kirsten M Vogelsong Scientist Research Area Manager
Dr Sigrid von Eckardstein Former Acting Research Area Manager
Dr Michael T Mbizvo Direttore ad interim Ms Maud Keizer Segretario
Ulteriori ringraziamenti vanno a: Ms Cathy Treece, Ms Charlene Tollner e il Professor Jim Over- street (University of California, Davis, CA, USA) per la produzione di fotografie della morfologia e il controllo dei terreni di coltura; al Dr Rune Eliasson (Sophiahemmet Hospital, Stockholm, Swe- den) per l’aiuto nella definizione di cellule non nemaspermiche; al Dr Timothy Farley (World He- alth Organization, Geneva, Switzer land) per la revisione delle sezioni sul controllo di qualità; e al Dr Gary N Clarke (The Royal Women’s Hospital, Carlton, Australia), al Dr Roelof Menkveld (Tyger- berg Academic Hospital and University of Stellenbosch, Tygerberg, South Africa), e al Professor Pieter Wranz (University of Stellen bosch, Tygerberg, South Africa) per aver fornito ulteriori infor- mazioni utilizzate nella compilazione del manuale.
Si ringrazia la Società Internazionale di Andrologia per il sostegno finanziario.
Questa edizione del manuale è dedicata alla memoria del compianto Geoffrey Waites (1928–2005), ex direttore del WHO Task Force sui metodi di regolazione della fertilità maschile e coeditore della seconda, terza e quarta edizione di questo manuale di laboratorio. La devozione del comitato edi- toriale per la sua missione era guidata dall’apprezzamento per l’onestà, l’equità e l’impegno per i bisognosi di Geoff.
Acronimi e abbreviazioni usati in questo manuale
Ab anticorpo
AI inseminazione artificiale
AID inseminazione artificiale con seme di donatore AIH inseminazione artificiale con seme del partner ALH ampiezza dello spostamento laterale della testa ANOVA analisi della varianza
APAAP complesso fosfatasi alcalina – anti-fosfatasi alcalina
AR acrosoma reagito
ART tecniche di riproduzione assistita ASA anticorpo antispermatozoo BAEE N-benzoil-L-arginina etil estere BCF frequenza del battito laterale (Hz) BSA albumina sierica bovina
BWW Biggers, Whitten e Whittingham CASA computer – aided sperm analysis
CASMA computer – aided sperm morphometric assessment CBAVD assenza bilaterale congenita dei vasi deferenti
CD compact disk
CD goccia citoplasmatica
CD45 cluster di determinazione 45 (marker pan-leucocitario) CD46 cluster di determinazione 46 (antigene acrosomiale) CO2 diossido di carbonio
DMSO dimetil sulfossido DNA acido deossiribonucleico
DPBS tampone fosfato salino di Dulbecco DS deviazione standard
DVD digital versatile disc
EDTA acido etilendiaminotetracetico EQA garanzia di qualità esterna EQC controllo di qualità esterno ERC eccesso di residuo citoplasmatico
ES errore standard
FITC isotiocianato di fluoresceina FMLP formil-metionil-leucil-fenilalanina GIFT transfer gametico intratubarico GPC glicerofosfolcolina
H2O2 perossido di idrogeno
HBSS Hanks’ balanced salt solution HBV virus epatite B
hCG gonadotropina corionica umana HCV virus epatite C
HIV virus da immunodeficienza umana HOP penetrazione nell’ovocita di hamster HOS rigonfiamento iposmotico
HRP perossidasi di rafano HSA albumina serica umana HTF fluido tubarico umano
IB immunobead
IBT Immunobead test
IC intervallo di confidenza
ICSI iniezione intracitoplasmatica di spermatozoo
Ig immunoglobulina
IM assenza di motilità IQC controllo di qualità interno IR indice di rifrazione IUI inseminazione intrauterina IVF fecondazione in vitro
KRM Krebs–Ringer Medium
LC limiti di confidenza
LIN linearità
LLQ limite inferiore di quantificazione MAD spostamento angolare medio MAI indice di anomalie multiple MAR mixed antiglobulin reaction
NA apertura numerica
NP motilità non progressiva PBS tampone fosfato salino pcv campo visivo
PDCA pianificare, fare, controllare, agire PMA forbolo 12-miristato 13-acetato
PMSG gonadotropine di siero di cavalla gravida PNPG p-nitrofenolo glucopiranoside
PR motilità progressiva PSA agglutininaPisum sativum QA assicurazione di qualità QC controllo di qualità
RCF forza centrifuga relativa RNA acido ribonucleico
ROS specie reattive dell’ossigeno r.p.m. giri al minuto
SDI indice di alterazione spermatica SDS sodio dodecilsolfato
SOP procedura operativa standard STR rettilineità (VSL/VAP)
TBS Tris-buffered saline TGG Tyrode’s glucose glycerol TZI indice di teratozoospermia UI unità internazionale VAP velocità media di percorso VCL velocità curvilinea
VSL velocità in linea retta (rettilinea) WHO World Health Organization WOB oscillazione (VAP/VCL)
CAPITOLO 1 Stato dell’arte
1.1 Introduzione
Il Manuale di laboratorio per l’esame del liquido seminale e dell’interazione sperma- tozoi-muco cervicale è stato pubblicato la prima volta nel 1980 per rispondere alle crescenti esigenze di una standardizzazione delle procedure necessarie per l’esame del liquido seminale umano. Da allora è stato aggiornato tre volte e tra- dotto in numerose lingue. Negli ultimi trent’anni, il manuale ha fornito degli stan- dard globali ed è stato ampiamente impiegato nei laboratori di ricerca e clinici di tutto il mondo.
Nonostante questo successo, ci si è resi progressivamente conto che alcune delle raccomandazioni presenti nelle edizioni precedenti del manuale dovevano essere riviste alla luce delle nuove acquisizioni, e che alcuni concetti dovevano essere spiegati in maniera più approfondita e con maggiori prove a sostegno. Sulla base di queste considerazioni, il WHO ha istituito un comitato di redazione che rivedesse tutti i metodi descritti nel manuale, al fine di confermarli, modificarli o aggiornarli. In molti casi questo si è dimostrato estremamente difficile, in quanto con i metodi de- scritti nel manuale erano stati ottenuti dati insufficienti. In alcuni casi, i laboratori più accreditati sono stati in grado di ottenere risultati consistenti che, peraltro, non sono stati confermati da altri. Alla luce di tutto questo, il comitato di redazione ha messo a punto una consensus, dopo aver valutato la letteratura pertinente.
Ulteriori raccomandazioni sono state fatte ai seminologi e ai ricercatori, in partico- lare per quanto riguarda la necessità di maggiori dettagli per molti dei metodi de- scritti. La mancanza di dettagli nelle precedenti edizioni ha fatto sì che alcuni laboratori hanno utilizzato metodi descritti altrove, o hanno messo a punto perso- nali versioni di tali metodi, pur sostenendo di effettuare l’analisi del liquido seminale secondo i criteri del manuale del WHO. Per tale motivo, al fine di rendere più sem- plice il confronto fra i laboratori di tutto il mondo, questa edizione del manuale è molto più dettagliata, spiegando approfonditamente il razionale dell’impiego di una particolare tecnica nei casi in cui ci siano più metodi di analisi a disposizione per quel singolo parametro. Raccomandiamo pertanto ai laboratoristi che fanno riferi- mento a questo manuale, di riportare nella descrizione dei risultati pubblicati negli articoli scientifici il metodo specifico impiegato.
1.2 La quinta edizione
La quinta edizione consta di tre parti: l’analisi del liquido seminale (capitoli 2-4), la preparazione degli spermatozoi (capitoli 5 e 6) e il controllo di qualità (capitolo 7).
La Parte I, che riguarda l’analisi del liquido seminale, ricalca le edizioni precedenti, ma è stata divisa in tre capitoli: i metodi standard, rappresentati dalle procedure di routine universalmente accettate per la determinazione della qualità del liquido se- minale; i test opzionali, che possono essere utilizzati in determinate situazioni o per scelta del laboratorio; i test di ricerca, che non sono attualmente considerati di rou- tine. Dal momento che la spermiocoltura non viene eseguita routinariamente nel la- boratorio di seminologia, è stata menzionata solo nella sezione relativa alla raccolta sterile del liquido seminale. La sezione sulla preparazione degli spermatozoi com- prende, oltre agli spermatozoi eiaculati, anche gli spermatozoi ottenuti dal testicolo e dall’epididimo. Intercalati agli elenchi puntati delle istruzioni metodologiche, si
trovano Note (spiegazioni della metodologia), Commenti (interpretazione dei risul- tati) e Riquadri (contenenti ulteriore materiale esplicativo).
Le caratteristiche principali di questa quinta edizione sono le seguenti.
• I capitoli relativi all’analisi del liquido seminale includono dettagli su tutte le solu- zioni di lavoro, procedure, calcoli e interpretazioni, in modo che ogni metodologia sia quanto più possibile completa, con rimandi minimi ad altre parti del manuale.
• La sezione sulla preparazione del seme è stata ampliata, ed è stato aggiunto un nuovo capitolo sulla crioconservazione degli spermatozoi. Le procedure per l’analisi del muco cervicale sono state divise tra il capitolo sulle procedure op- zionali e un’appendice sulle caratteristiche del muco.
• Ci sono meno appendici rispetto alle edizioni precedenti, e sono limitate alle in- formazioni altamente specialistiche o raramente impiegate.
• Valutazione del numero degli spermatozoi. Le diluizioni del seme e le aree della camera di conta utilizzate per valutare il numero di spermatozoi nel liquido se- minale sono state modificate per consentire la conta di 200 spermatozoi per re- plicato. È stata ribadita l‘importanza sia degli errori di campionamento, che della certezza dei risultati numerici ottenuti. Il comitato di redazione ha ritenuto che il numero totale di spermatozoi per eiaculato fornisca una valutazione più accurata della funzionalità del testicolo rispetto alla concentrazione degli sper- matozoi, ma è imperativo che il volume del liquido seminale venga misurato con estrema precisione.
• Valutazione della azoospermia. Anche se apparentemente semplice, la diagnosi di azoospermia può essere resa difficile da vari fattori, fra cui grossi errori legati al conteggio di pochi spermatozoi, l’elevato numero di campi microscopici da analizzare e le difficoltà nell’esaminare il pellet post-centrifugazione in caso di campioni ricchi di detriti. Modifiche raccomandate includono la necessità di esaminare campioni fissati, non centrifugati, indicando la sensibilità dei metodi di conta utilizzati. Tuttavia, sono previsti anche metodi di centrifugazione per accumulare un numero sufficiente di cellule a fini terapeutici, e metodi per la valutazione di spermatozoi mobili in campioni non fissati di liquidi seminali post-vasectomia.
• Valutazione della motilità nemaspermica. Un cambiamento importante rispetto alle precedenti edizioni è la classificazione della motilità degli spermatozoi. Attual- mente viene consigliato di classificare gli spermatozoi come progressivamente mobili, non progressivamente mobili e immobili (invece dei gradi a, b, c, d).
• Valutazione della morfologia nemaspermica.Alcuni laboratori valutano solo le forme normali, mentre altri considerano più importanti il tipo, la localizzazione e l’estensione delle atipie. È ancora controverso se queste o altri tipi di valuta- zione o valutazioni semiquantitative rendano più attendibile l’analisi del liquido seminale. Prove a sostegno della relazione tra la percentuale di forme normali (definite dai criteri stretti o dalla valutazione computerizzata della morfologia) e tassi di fecondazione in vivogiustificano il tentativo di identificare, nel liquido seminale, una sottopopolazione di spermatozoi morfologicamente distinta. In questa edizione, abbiamo incluso un numero maggiore di fotografie di migliore
qualità di spermatozoi considerati normali e borderline, accompagnate da spie- gazioni del perché ogni spermatozoo è stato classificato in quel modo. Questo dovrebbe aiutare i seminologi a classificare gli spermatozoi in maniera uni- forme. Dati recenti, provenienti da una popolazione fertile, hanno permesso di fornire valori di riferimento per la percentuale di forme morfologicamente nor- mali.
• Controllo di qualità. Questo capitolo è stato completamente riscritto. Affinché i metodi analitici siano attendibili è necessario che ci sia un rigoroso controllo di qualità dell’analisi seminale. Vengono forniti consigli e suggerimenti su come migliorare le prestazioni di laboratorio nei casi in cui i risultati del controllo di qualità siano insoddisfacenti.
• Range e limiti di riferimento. I range di riferimento di questo manuale sono stati dedotti dai dati della qualità del liquido seminale di uomini fertili, la cui partner ha ottenuto una gravidanza entro i 12 mesi. Per i valori di riferimento, sono stati impiegati i dati grezzi di un numero variabile da 400 a 1.900 campioni di liquido seminale provenienti da uomini di otto paesi di tre continenti, che sono diven- tati padri di recente. Per convenzione statistica si considera il 2.5° percentile, di un intervallo di riferimento a due estremi, come soglia sotto la quale i valori possono essere considerati provenienti da una popolazione differente. Tuttavia, un intervallo di riferimento ad un solo estremo è stato ritenuto più opportuno per il liquido seminale, dal momento che elevati valori di qualunque parametro difficilmente sono pregiudizievoli per la fertilità. Il quinto percentile è dato come limite inferiore di riferimento, e la distribuzione completa per ogni parametro se- minale è riportata nell’Appendice 1.
1.3 Scopo del manuale
I metodi descritti in questo manuale hanno l’intento di linee guida per migliorare la qualità dell’analisi del liquido seminale e la comparabilità dei risultati. Non dovreb- bero essere necessariamente presi come obbligatori da strutture di accreditamento locale, nazionale o internazionale. L’analisi seminale può essere utile sia in campo clinico che di ricerca, per valutare lo stato della fertilità maschile così come per mo- nitorare la spermatogenesi nel follw-up della regolazione della fertilità maschile.
CAPITOLO 2 Procedure standard
2.1 Introduzione
Il liquido seminale è costituito da una sospensione concentrata di spermatozoi, im- magazzinata negli epididimi, che, al momento dell’eiaculazione, viene miscelata e diluita con le secrezioni delle ghiandole accessorie del tratto genitale. Tale fluido bio- logico viene emesso in diversi gettiti eiaculatori. Confrontando il volume del liquido seminale pre e post-vasectomia si rileva che il 90% è costituito dalle secrezioni delle ghiandole accessorie (Weiske,1994), principalmente dalla prostata e dalle vescicole seminali, mentre un minore contributo proviene dalle ghiandole bulbouretrali (ghian- dole di Cowper) e dagli epididimi.
Il liquido seminale ha due principali parametri quantizzabili:
• il numero totale di spermatozoi che riflette la produzione nemaspermica dei testi- coli e la pervietà dei dotti eiaculatori post-testicolari;
• il volume del campione, prodotto dalle ghiandole accessorie, che riflette l’attività secretoria delle ghiandole.
Altri parametri importanti per la funzione nemaspermica sono rappresentati da vita- lità, motilità, morfologia nonché dalla composizione del liquido seminale.
Durante un rapporto sessuale, la frazione iniziale dell’eiaculato, la prostatica, ricca di spermatozoi, viene a contatto con il muco cervicale che fuoriesce dalla vagina, men- tre il resto del fluido seminale rimane nella vagina (Sobrero, MacLeod, 1962). Al con- trario, nella pratica di laboratorio, quando l’intero eiaculato viene raccolto in un contenitore, gli spermatozoi vengono intrappolati in un coagulo prodotto dalle pro- teine derivanti dalle vescicole seminali. Successivamente, il coagulo fluidifica, me- diante l’azione di proteasi prostatiche, e l’osmolarità del liquido seminale aumenta (Björndahl, Kvist, 2003; Cooperet al., 2005).
È stato dimostrato che la qualità del liquido seminale varia a seconda della tipologia di raccolta del campione. L’eiaculato prodotto per masturbazione e raccolto in conteni- tori, in una stanza vicino al laboratorio, può essere di qualità inferiore rispetto a quello che viene recuperato dai profilattici senza spermicidi, utilizzati a casa durante un rap- porto (Zavos, Goodpasture, 1989). Questa differenza può indicare una diversa forma di eccitazione sessuale, in quanto il tempo necessario per produrre un campione per masturbazione – che riflette il protrarsi dell’emissione seminale, prima dell’eiacula- zione – influenza anche la qualità del liquido seminale (Poundet al., 2002).
In determinate condizioni di raccolta, la qualità del liquido seminale dipende da fat- tori che normalmente non possono essere modificati, quali la produzione testicolare di spermatozoi, la secrezione delle ghiandole accessorie, patologie recenti (in parti- colare quelle febbrili), e altri fattori quali i giorni di astinenza, che devono essere se- gnalati e considerati nell’interpretazione dei risultati.
I risultati della valutazione laboratoristica della qualità seminale dipendono, quindi, da:
• La raccolta completa del campione. Infatti, durante l’eiaculazione la prima fra-
zione del liquido seminale che viene emessa è la prostatica, ricca di spermatozoi, mentre le ultime frazioni sono vescicolari (Björndahl, Kvist, 2003). Per tale mo- tivo, la perdita della prima parte dell’eiaculato (ricca di spermatozoi) influenza maggiormente il risultato dell’analisi, rispetto alla perdita della porzione finale.
• L’attività delle ghiandole accessorie, cioè le secrezioni in cui vengono diluiti, al momento dell’eiaculazione, gli spermatozoi epididimari (Eliasson, 2003). La con- centrazione degli spermatozoi, infatti, non è una misura diretta della produzione testicolare, in quanto è influenzata dall’attività di altri organi riproduttivi. La pro- duzione testicolare è indicata, invece, dalla concentrazione totale di spermatozoi eiaculati (concentrazione di spermatozoi per ml moltiplicato il volume testicolare).
Per esempio, la concentrazione di spermatozoi per ml, nel liquido seminale di uomini giovani e anziani, può essere simile, ma la concentrazione per eiaculato può cambiare, in quanto, in alcuni casi, sia il volume del fluido seminale che la produzione totale di spermatozoi diminuiscono con l’età (Nget al., 2004).
• Il periodo di astinenza sessuale. In assenza di eiaculazione, infatti, gli spermato- zoi accumulati nell’epididimo, si versano nell’uretra e vengono espulsi nelle urine (Cooperet al., 1993; De Jongeet al., 2004). Una prolungata astinenza sessuale, peraltro, non influenza la vitalità e la cromatina degli spermatozoi (Tyleret al.,1982b; De Jongeet al., 2004), a meno che non venga alterata la funzione epi- didimaria (Correa-Perezet al., 2004).
• Penultima eiaculazione. Poiché gli epididimi non vengono completamente svuo- tati con una eiaculazione, possono rimanere alcuni spermatozoi della precedente eiaculazione (Cooperet al., 1993). Ciò influenza l’età e la qualità degli spermato- zoi nel liquido seminale (Tyleret al., 1982a). Comunque, il peso di tale fattore è difficile da stabilire e raramente viene preso in considerazione.
• Le dimensioni testicolari, che influiscono sulla concentrazione di spermatozoi totali per eiaculato (Handelsmanet al., 1984; WHO, 1987; Behreet al., 2000; Andersenet al., 2000). La dimensione del testicolo, infatti, è un indice dell’attività spermatogene- tica e influenza la morfologia degli spermatozoi (Holsteinet al., 2003).
Commento: La grande varietà biologica del liquido seminale (Castillaet al., 2006) è dovuta ai diversi fattori sopra riportati e richiede che tutte le valutazione sul campione seminale siano precise.
Tali fattori variabili, e in larga parte incontrollabili, spiegano le note differenze intrain- dividuali nella composizione del liquido seminale (Baker, Kovacs, 1985; Alvarezet al., 2003). La Fig. 2.1 mostra le variazioni, nel corso del tempo, nella composizione del liquido seminale, valutate con i metodi raccomandati dal WHO di cinque giovani volontari sani che hanno partecipato, nel braccio trattato con placebo, ad uno stu- dio sulla contraccezione ormonale maschile.
Tale variabilità ha conseguenze nell’interpretazione dell’analisi del liquido seminale:
• È impossibile definire i parametri seminali di un uomo basandosi sulla valuta- zione di un singolo campione seminale.
• È utile esaminare due o tre campioni per ottenere dati di riferimento (Polandet al., 1985; Bermanet al., 1996; Carlsenet al., 2004; Castillaet al., 2006; Keel, 2006).
L’esame del liquido seminale, comunque, fornisce informazioni essenziali sullo stato clinico di un individuo, anche se le indagini eseguite sull’intera popolazione di sperma- tozoi eiaculati non riescono a definire la capacità fecondante di quei pochi gameti che raggiungono l’ovocita.
Al fine di ottenere informazioni valide e utili, sia la raccolta che l’analisi del liquido seminale devono essere effettuate mediante appropriate procedure standardizzate. I test descritti in questo capitolo sono procedure approvate che costituiscono passaggi essenziali per la valutazione del liquido seminale.
Fig. 2.1Variazione nella concentrazione di spermatozoi per eiaculato e per ml in un periodo di oltre un anno e mezzo
Dati gentilmente concessi da Schering Plough e Bayer Schering Pharma AG.
0 50 100 150 200 250
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 250
0 50 100
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 0
50
Concentration(per ml)
Day
1
2
3
4
5 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540
0 100 200 0 100 2000 100 200 0 100 200 300
0 100 200 300 400 500 600
Total number(106)
Day
1
2
3
4
5
0 50 100 150 200 250
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 250
0 50 100
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 0
50
Concentration(106
Day
1
2
3
4
5 0
50 100 150 200 250
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 250
0 50 100
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 0
50
Concentration
Day
1
2
3
4
5 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540
0 100 200 0 100 2000 100 200 0 100 200 300
0 100 200 400 500 600
Total number
Day
1
2
3
4
5
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 0
100 200 0 100 2000 100 200 0 100 200 300
0 100 200 400 500 600
Total number
Day
1
2
3
4
5
Giorni Giorni
Concentrazione/EIAC (106) Concentrazione/HL (106 per ml)
L’esame del liquido seminale comprende i seguenti passaggi (descritti in dettaglio nella successiva sezione).
Nei primi 5 minuti:
• Porre il contenitore con il campione seminale sul bancone di lavoro o in un incu- batore (37°C) per la fluidificazione.
Tra 30 e 60 minuti:
• Valutare la fluidificazione e l’aspetto del campione seminale.
• Misurare il volume del campione seminale.
• Rilevare il pH (se richiesto).
• Valutare a fresco gli aspetti microscopici, la motilità e preparare una diluizione per la valutazione del numero di spermatozoi.
• Valutare la vitalità degli spermatozoi (nel caso in cui la percentuale di cellule mo- bili sia bassa).
• Allestire strisci del campione seminale per valutare la morfologia.
• Diluire il liquido seminale per valutare la concentrazione degli spermatozoi.
• Valutare il numero di spermatozoi.
• Eseguire il Mixed Antiglobulin Reaction test (MAR) (se richiesto).
• Valutare le cellule perossidasi-positive (se sono presenti cellule rotonde).
• Preparare gli spermatozoi per l’Immunobead test (se richiesto).
• Centrifugare il campione seminale (se devono essere valutati gli indici biochimici).
Entro 3 ore:
• Inviare i campioni al laboratorio di microbiologia (se richiesto).
Dopo 4 ore:
• Fissare, colorare e valutare gli strisci per la morfologia degli spermatozoi.
Più tardi nello stesso giorno (o un giorno successivo se i campioni vengono congelati):
• Dosare gli indici delle ghiandole accessorie (se richiesto).
• Eseguire l’Immunobead test indiretto (se richiesto).
2.2 Raccolta del campione seminale
2.2.1 Preparazione
• Il campione dovrebbe essere raccolto in una stanza riservata vicino al laborato- rio, per limitare l’esposizione del liquido seminale ad escursioni termiche e con- trollare il tempo che intercorre tra la raccolta del campione e l’esecuzione dell’analisi (vedi Sezioni 2.2.5 e 2.2.6 per le eccezioni).
• I campioni seminali dovrebbero essere raccolti dopo un minimo di 2 e un mas- simo di 7 giorni di astinenza sessuale. Se sono richiesti più campioni, il numero di giorni di astinenza, ad ogni analisi, dovrebbe essere il più possibile costante.
• Le istruzioni riguardanti la raccolta del liquido seminale dovrebbero essere co- municate al paziente, per iscritto e oralmente. Tali istruzioni dovrebbero sottoli- neare la necessità di una raccolta completa del campione e che non dovrebbe andare persa nessuna frazione dell’eiaculato.
• Le seguenti informazioni dovrebbero essere registrate su una scheda (vedi Ap- pendice 6, Sezione A6.1): nome del paziente, data di nascita e numero di codice personale, giorni di astinenza, data e ora di raccolta, raccolta completa del cam- pione, difficoltà nella raccolta del campione e tempo intercorso tra la produzione del campione e l’inizio dell’analisi del liquido seminale.
2.2.2 Raccolta del campione a fini diagnostici o di ricerca
• Il campione dovrebbe essere raccolto per masturbazione in un contenitore, pu- lito, dall’apertura larga, di vetro o plastica, proveniente da un lotto certificato come non tossico per gli spermatozoi (vedi Riquadro 2.1).
• Il campione, nel contenitore, dovrebbe essere mantenuto a temperatura am- biente, tra 20°C e 37°C, al fine di evitare escursioni termiche che possono influire negativamente sugli spermatozoi eiaculati. Il contenitore deve essere contrasse- gnato con il nome del paziente, numero di identificazione, data e ora della rac- colta.
• Il contenitore con il campione viene posto sul bancone o in un incubatore (37°C) durante il processo di fluidificazione.
• È necessario segnalare nella scheda se il campione non è stato raccolto interamente, in particolare se è stata persa la prima parte dell’eiaculato, frazione ricca di spermato- zoi. Se il campione seminale non è stato raccolto in maniera completa, deve essere eseguita una seconda raccolta dopo un periodo di astinenza di 2-7 giorni.
Riquadro 2.1 Conferma della qualità del contenitore in cui è stato raccolto il campione Selezionare vari campioni seminali con elevata concentrazione e buona motilità. Porre metà del campione seminale in un contenitore non tossico (contenitore di controllo) e l’al- tra metà nel contenitore che deve essere testato. Valutare la motilità nemaspermica, in replicati, a temperatura ambiente o a 37°C (vedi Sezione2.5), a intervalli di un’ora, per 4 ore. Se, ad ogni valutazione, non si rilevano differenze tra il controllo e il campione in esame (P>0.05 come indicato dal t-test), i contenitori analizzati possono essere conside- rati non tossici per gli spermatozoi e idonei per la raccolta del campione seminale.
2.2.3 Raccolta in contenitore sterile per la riproduzione assistita
Tale raccolta del campione seminale è a fini diagnostici (vedi Sezione 2.2.2), e i con- tenitori, le punte delle micropipette e le pipette utilizzate per miscelare il campione devono essere sterili.
2.2.4 Raccolta in contenitore sterile per analisi microbiologica
In questo caso, devono essere evitate le contaminazioni provenienti da fonti diverse dal liquido seminale (per es. organismi commensali dell’epidermide). I contenitori per la raccolta del liquido seminale, le punte delle micropipette e le pipette utilizzate per miscelare il campione devono essere sterili.
Il paziente dovrebbe:
• Urinare.
• Lavare accuratamente mani e genitali con sapone per ridurre il rischio di conta- minazione del campione biologico con organismi commensali dell’epidermide.
• Sciacquare accuratamente il sapone.
• Asciugare mani e genitali con un asciugamano monouso.
• Raccogliere il campione direttamente nel contenitore sterile.
Nota:Il tempo che intercorre tra la raccolta del campione e l’inizio dell’analisi micro- biologica non devesuperare le 3 ore.
2.2.5 Raccolta del campione a casa
• Il campione seminale può essere raccolto a casa, in circostanze eccezionali, quali l’impossibilità a produrre un campione per masturbazione in clinica o la mancanza di strutture adeguate vicino al laboratorio.
• Il paziente deve ricevere chiare istruzioni, sia scritte che orali, riguardanti la rac- colta e il trasporto del campione seminale. Le istruzioni devono sottolineare la necessità di raccogliere il liquido seminale in maniera completa, cioè deve es- sere raccolto tutto l’eiaculato, senza perdere alcuna parte, in particolare la prima porzione, ricca di spermatozoi. Se il campione non è stato raccolto completa- mente, ciò deve essere annotato nella scheda.
• Dovrebbe essere consegnato al paziente un contenitore precedentemente pe- sato, contrassegnato con il suo nome e codice identificativo.
• Il paziente dovrebbe annotare l’ora di produzione del campione seminale e con- segnarlo in laboratorio entro 1 ora dalla raccolta.
• Durante il trasporto in laboratorio, il campione seminale dovrebbe essere mante- nuto tra 20°C e 37°C.
• Nella scheda dovrebbe essere riportato se il campione è stato raccolto a casa o in altra sede fuori dal laboratorio.
2.2.6 Raccolta del campione con profilattico
• Un campione seminale può essere raccolto con profilattico durante un rapporto sessuale soltanto in casi eccezionali, come l’impossibilità a produrre un cam- pione per masturbazione.
• In questo caso, possono essere utilizzati solo speciali profilattici non tossici, prodotti per la raccolta di campioni seminali, disponibili in commercio.
• Il paziente dovrebbe ricevere informazioni relative alla casa produttrice e alla modalità d’uso del profilattico; il preservativo deve essere chiuso e trasportato al laboratorio.
• Il paziente dovrebbe annotare l’ora di produzione del campione seminale e con- segnarlo in laboratorio entro 1 ora dalla raccolta.
• Durante il trasporto in laboratorio, il campione seminale dovrebbe essere mante- nuto tra 20°C e 37°C.
• Nella scheda dovrebbe essere riportato se il campione è stato raccolto me- diante un particolare profilattico, durante un rapporto sessuale, a casa o in altra sede fuori dal laboratorio.
Nota:Il comune profilattico in lattice non deve essere utilizzato per la raccolta del li- quido seminale, in quanto contiene sostanze che interferiscono con la motilità degli spermatozoi (Joneset al., 1986).
Commento 1:Il coitus interruptusnon è una modalità di raccolta del campione semi- nale attendibile, in quanto può andare persa la prima parte dell’eiaculato, che con- tiene il maggiore numero di spermatozoi. Inoltre, con questa modalità di raccolta il campione seminale può essere sottoposto a contaminazioni cellulari e batteriche e il pH vaginale acido può influire negativamente sulla motilità nemasperrmica.
Commento 2:Se il paziente non riesce a raccogliere un campione seminale, il post- coital test (vedi Sezione 3.3.1) può fornire informazioni relative alla sua spermatogenesi.
2.2.7 Sicurezza nella manipolazione dei campioni
I campioni seminali possono contenere agenti infettivi pericolosi (per es. virus del- l’immunodeficienza umana - HIV, virus dell’epatite o herpesvirus simplex), per tale motivo, ogni campione biologico deve essere trattato come materiale a rischio bio- logico. Nei casi in cui il campione venga processato per inseminazione intrauterina (IUI), fecondazione in vitro(IVF), iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo (ICSI) oppure venga eseguita la spermicoltura (vedi Sezione 2.2.4), devono essere utilizzati materiali e procedure sterili.
È necessario seguire rigorosamente le linee guida relative alla sicurezza nel laborato- rio, come descritto in Appendice 2; la buona pratica di laboratorio è fondamentale per la sicurezza nel laboratorio (WHO, 2004).
2.3 Valutazione macroscopica iniziale
L’analisi del liquido seminale dovrebbe iniziare con una semplice valutazione, subito dopo la fluidificazione e preferibilmente dopo 30 minuti e non oltre 1 ora dall’eiacula- zione; ciò previene la disidratazione o i cambiamenti di temperatura che possono in- fluenzare la qualità seminale.
2.3.1 Fluidificazione
Immediatamente dopo l’eiaculazione, nel contenitore in cui è stato raccolto il cam- pione, il liquido seminale appare tipicamente come un coagulo semisolido. Entro pochi minuti a temperatura ambiente, ha inizio il processo di fluidificazione del seme, durante il quale il liquido seminale diventa più fluido e contemporaneamente si può osservare una miscela eterogenea di grumi. Con il procedere della fluidifica- zione, il liquido seminale diventa più omogeneo e piuttosto acquoso, mentre negli stadi finali del processo rimangono solo piccole zone con coaguli. L’intero campione seminale fluidifica solitamente entro 15 minuti, a temperatura ambiente, anche se ra- ramente può impiegare 60 minuti o più. Se la fluidificazione completa non avviene entro 60 minuti, deve essere segnalato. I campioni che vengono raccolti a casa o con profilattico, invece, quando arrivano in laboratorio saranno già fluidificati. Solita- mente i campioni seminali normali, alla fine della fluidificazione, possono contenere granuli simili a gelatina (corpi gelatinosi), che non fluidificano; questi granuli non sembrano avere un significato clinico. La presenza di filamenti di muco, comunque, può interferire con l’analisi seminale.
Nota 1:La fluidificazione può essere valutata macroscopicamente come sopra de- scritto, e microscopicamente. Infatti, gli spermatozoi immobili acquisiscono la capa- cità di movimento appena il seme fluidifica. Per tale motivo, se mediante un esame microscopico si osservano spermatozoi immobili, sarà necessario attendere un tempo maggiore affinché il processo di fluidificazione sia completato.
Nota 2:Durante la fluidificazione, per migliorare l’omogeneizzazione del campione se- minale, è consigliabile miscelare delicatamente e in modo costante il campione semi- nale o ruotare il contenitore, con il fluido biologico, mediante un agitatore
bidimensionale a temperatura ambiente o in un incubatore a 37°C.
Nota 3:Se il campione non fluidifica entro 30 minuti, non bisogna procedere con l’analisi del liquido seminale ma è consigliabile aspettare altri 30 minuti. Nel caso in cui la fluidificazione non si sia completata entro 60 minuti bisogna procedere come descritto in Sezione 2.3.1.1.
2.3.1.1 Fluidificazione ritardata
Alcune volte i fluidi seminali non fluidificano e ciò rende difficoltosa la valutazione del campione. In questi casi sono necessarie ulteriori procedure di miscelazione mecca- nica o digestione enzimatica.
1. Alcuni campioni possono essere indotti a fluidificare aggiungendo un eguale vo- lume di tampone fisiologico (per es. PBS Dulbecco vedi Appendice 4, Sezione A 4.2) e pipettando ripetutamente.
2. La disomogeneità può essere ridotta mediante delicati e ripetuti passaggi (6-10 volte) attraverso una siringa con ago smussato di diametro 18 (diametro interno 0.84 mm) o 19 (diametro interno 0.69 mm).
3. Per promuovere il processo di fluidificazione (vedi Riquadro 2.2) potrebbe essere di aiuto la digestione mediante bromelina, un enzima proteolitico ad ampia spe- cificità (EC 3.4.22.32).
Riquadro 2.2 Preparazione della bromelina
Preparare 10 UI/ml di bromelina in PBS Dulbecco (vedi Appendice 4, Sezione A4.2);
la bromelina non si scioglie facilmente, ma mediante miscelazione la maggior parte dell’enzima si dissolve in 15-20 minuti. Diluire il campione seminale 1:2 (1 + 1) con 10 UI/ml di bromelina, miscelare con una micropipetta e incubare a 37°C per 10 minuti.
Miscelare bene il campione prima di ogni analisi.
Commento:Questi trattamenti possono modificare la biochimica del plasma semi- nale, la motilità e la morfologia nemaspermica; per tale motivo si deve segnalare il loro utilizzo. Inoltre, ai fini della conta degli spermatozoi, per la valutazione della con- centrazione si deve considerare la diluizione 1:2 (1 + 1) del seme con la bromelina.
2.3.2 Viscosità del liquido seminale
Una volta completata la fluidificazione, la viscosità del campione seminale viene va- lutata aspirando delicatamente il fluido con una pipetta monouso di plastica, con apertura ampia (approssimativamente 1.5 mm di diametro) in modo da consentire al liquido seminale di gocciolare per gravità, osservando la lunghezza di ogni filamento ottenuto. Un campione seminale normale fuoriesce dalla pipetta formando piccole gocce separate. Se la viscosità è alterata, la goccia formerà un filamento lungo più di 2 cm. In alternativa, la viscosità può essere valutata introducendo una bacchetta di vetro nel campione ed esaminando la lunghezza del filamento che si forma al mo- mento dell’estrazione della bacchetta. La viscosità dovrebbe essere considerata anormale quando la lunghezza del filamento supera i 2 cm. Al contrario di un cam- pione parzialmente non fluidificato, un liquido seminale viscoso mostra una viscosità omogenea e una densità che non cambia nel tempo. Una elevata viscosità si identi- fica dalle proprietà di elasticità del campione, che si retrae fortemente quando si tenta di pipettarlo. I metodi per diminuire la viscosità sono gli stessi che vengono utilizzati in caso di fluidificazione ritardata (vedi Sezione 2.3.1.1).
Commento:Una elevata viscosità può interferire con la valutazione della motilità, della concentrazione nemaspermica, degli anticorpi antispermatozoo e del dosaggio degli indici biochimici.
2.3.3 Aspetto dell’eiaculato
L’aspetto fisiologico di un campione seminale fluidificato è omogeneo, grigio-opale- scente. Il liquido seminale può mostrare un aspetto meno opaco se la concentra- zione di spermatozoi è molto bassa; il colore potrebbe essere differente, per es.
rosso-bruno indicativo della presenza di emazie (emospermia), o giallo in pazienti con ittero o che assumono alcune vitamine o farmaci.
2.3.4 Volume del liquido seminale
Il volume dell’eiaculato è prodotto principalmente dalle secrezioni delle vescicole se- minali e dalla prostata e in minore misura dalle ghiandole bulbouretrali e dagli epidi- dimi. Una misura precisa del volume è essenziale in ogni valutazione dei campioni seminali, in quanto ciò permette il calcolo della concentrazione totale delle cellule nemaspermiche e non nemaspermiche nell’eiaculato.
Il modo migliore per misurare il volume è pesare il campione nel contenitore in cui è stato raccolto.
• Raccogliere il campione seminale in un contenitore pulito, monouso e preceden- temente pesato.
• Pesare il contenitore con il campione seminale.
• Sottrarre il peso del contenitore.
• Calcolare il volume del campione seminale utilizzando il peso del campione stesso, assumendo la densità del seme uguale a 1g/ml (Augeret al., 1995). La densità del seme varia tra 1.043 e 1.102 g/ml (Hugginset al., 1942; Brazilet al., 2004a; Cooperet al., 2007).
Nota:I contenitori vuoti possono avere pesi differenti, per tale motivo ogni conteni- tore dovrebbe essere pesato singolarmente, prima di ogni raccolta. Il peso deve es- sere annotato sul contenitore prima di essere dato al paziente. È consigliabile utilizzare un pennarello indelebile per scrivere sul contenitore o sulla etichetta. Se il peso viene annotato su una etichetta, quest’ultima deve essere incollata prima che il contenitore vuoto venga pesato.
Un altro modo per valutare il volume è la misura diretta.
• Raccogliere il campione direttamente in un cilindro di vetro graduato, ad ampia apertura. Tali contenitori sono disponibili in commercio.
• Leggere il volume direttamente mediante la scala graduata (accuratezza 0.1 ml).
Nota:I seguenti metodi di misura del volume del campione seminale non vengono raccomandati: trasferire il campione dal contenitore mediante una pipetta o siringa;
decantare il campione in un cilindro graduato. Questi metodi, infatti, non permettono di recuperare tutto il campione, determinando una sottostima del volume seminale, che può essere compresa tra 0.3 e 0.9 ml (Brazilet al., 2004a; Iwamotoet al., 2006;
Cooperet al., 2007).
Commento 1:Un volume seminale basso è indice di una patologia ostruttiva dei dotti eiaculatori o assenza bilaterale congenita dei vasi deferenti (CBAVD) (de la Tailleet al., 1998; Daudinet al., 2000; von Eckardsteinet al., 2000; Weiskeet al., 2000), una con- dizione in cui le vescicole seminali sono scarsamente sviluppate.
