L'interleukine-33, cytokine de la famille IL-1 : régulation par les protéases inflammatoires

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Université Toulouse III Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)

Biologie, Santé, Biotechnologies (BSB)

L'Interleukine-33, cytokine de la famille IL-1 : régulation par les protéases

inflammatoires

mardi 25 septembre 2012

Emma Lefrançais

Biologie Moléculaire et Cellulaire

Dr Véronique Witko-Sarsat et Dr Hans Yssel Dr Jean-Philippe Girard et Dr Corinne Cayrol

UMR 5089

Pr Denis Hudrisier, Professeur UPS, Toulouse, Président

Dr Véronique Witko-Sarsat, Directeur de Recherche INSERM, Paris, Rapportrice Dr Hans Yssel, Directeur de Recherche INSERM, Montpellier, Rapporteur Dr Corinne Cayrol, Chargée de Recherche CNRS, Toulouse, Directrice de thèse Dr Jean-Philippe Girard, Directeur de Recherche INSERM, Toulouse, Directeur de thèse

Remerciements

C’est fraichement diplômée que je souhaite adresser mes remerciements à toutes les personnes qui ont contribué à la réalisation de cette thèse. La thèse, certes une toute petite avancée dans les sciences et une toute petite part de vie, mais qui influence pourtant beaucoup la suite.

Je remercie d’abord mes rapporteurs, Véronique Witko-Sarsat et Hans Yssel, pour l’intérêt porté à mon manuscrit et pour leurs corrections pertinentes que vous y avez apportées. Merci à Natacha Bessis pour avoir également accepté d’évaluer ce travail et à Denis Hudrisier pour avoir présidé ce jury.

Merci à l’ARC et à la FRM pour avoir financé les deux dernières années de cette thèse.

L’équipe « Biologie Vasculaire » qui m’a formée

Jean-Philippe, j’ai eu la chance d’avoir été acceptée dans ton équipe et à l’IPBS que tu diriges, un atout

essentiel dans ce qui a pu faire l’aboutissement de cette thèse, autant sur un plan scientifique qu’humain. Merci donc de m’avoir accordé ta confiance à la fin de mon M2R car j’ai sans nul doute pu bénéficier de la qualité scientifique, des compétences de l’équipe et des moyens mis à ma disposition pour réaliser ces travaux. Cet environnement m’a en effet permis, au cours de ces quatre années avec vous, d’acquérir des connaissances fondamentales et techniques qui m’ont grandement fait évoluer. Je te remercie également pour m’avoir permis de présenter mes travaux dans de nombreux congrès, nationaux ou internationaux, des expériences qui ont aussi contribué à ma progression. Merci enfin pour avoir dirigé cette thèse au cours de laquelle tu m’as fait part de tes idées, réflexions et conseils éclairés, dans des entretiens toujours motivants.

Corinne, je te remercie de m’avoir autant apporté et de m’avoir délicatement portée. Tu as su tout

d’abord me transmettre ton savoir-faire et tu m’as appris minutieusement à manipuler. Mais c’est également la l’autonomie et la confiance que tu m’as accordée que j’ai pu apprécier. Merci pour avoir toujours répondu à mes questions et sollicitations par une présence discrète et par des discussions, conseils ou corrections d’une efficacité remarquable. Merci pour ton optimisme et tes encouragements à mon égard (même après des présentations préparées la veille !) ou pour tes mots touchants le jour de ma soutenance. On m’a demandé en entretien une qualité et un défaut perçus par mon directeur et j’aurais maintenant de quoi répondre… Je m’excuse aussi auprès de Maxime et Alexandre qui doivent connaitre les problèmes de l’IL-33 et de son clivage plus qu’il n’est nécessaire, étant donné le lien que tu as assuré entre moi et Jean-Philippe, entre midi et deux par exemple !

Stéphane, je crois que c’est avec toi que j’ai réalisé mes premières manips dans l’équipe ! Merci donc

pour m’avoir appris les rouages de la production et de la purification de protéines. Tout comme Maitre Renard, je fus par l’odeur alléchée, et celle de Coli m’est aujourd’hui bien plus chère que celle des souris ! Merci donc pour toutes les productions réalisées ayant servi à l’étude mais aussi pour toutes les autres qui n’ont malheureusement pas pu aboutir au Graal de pleine taille ! Merci enfin pour ta joyeuse et sensible présence, du café au thé en passant par les petits verres limpides et citronnés ! Merci aussi pour l’aide en plomberie, en désherbage et en réparation deux roues. Merci aussi pour ton vélo qui aura commencé mais malheureusement aussi fini son aventure avec moi dans le campus de l’IPBS…

Nathalie, merci tout d’abord pour m’avoir suivie dans mes premiers pas à l’animalerie de l’IPBS. Je

voudrais également te remercier pour t’être occupée de moi après mes erreurs basiques de cuisson (promis j’essaierai de faire mieux pour les macarons). Enfin, merci pour le partage de tes expériences du monde de l’université ou autres et qui sait, la nostalgie qui résonne de ton expérience postdoctorale a peut-être influencé le choix du mien… Rendez vous dans la baie !

Pour rester sur l’expérimentation animale, merci à Pascale pour la gestion de la transgénèse et de la lignée IL-33 KO sur laquelle j’ai pu travailler et à Arnaud pour les génotypages, pour m’avoir montré quelques gestes techniques et pour avoir un temps partagé ta paillasse (que j’ai annexé après ton départ !).

Merci aussi à toi Babeth pour avoir accueilli dans ta pièce et tes armoires ventilées mes SKOSAF (Souris KO Sans Animalerie Fixe) mais aussi pour ta disponibilité à n’importe quelle sollicitation, que celle-ci soit sportive (foot, squash, tennis, danse, jogging,…), culturelle ou gustative (je ne préciserai pas)!

Raoul, quatre ans que notre bureau est partagé par une frontière « Schengen » (qui est en fait bien

plus à mon avantage, je ne te le l’avoue que maintenant) ! Merci d’avoir égayé mon quotidien par ton enthousiasme et ta soif de découvertes dans tous les domaines ! Je te souhaite de retrouver quelqu’un à ma place d’aussi bon public à ton humour ! Je retiendrai aussi les (rares ?) fois ou Steph et toi m’avaient attendue en courant le long du canal.

Mélanie, toi aussi tu as fait partie de mon espace en partageant avec moi, et dès le début, le même

bureau et le même labo. Je te remercie pour les discussions de thésardes qui peuvent être scientifiques, techniques, musicales ou personnelles mais toujours naturelles. J’ai aussi apprécié, en dehors du labo, les congrès ou les concerts que nous avons partagés. Je te souhaite une bonne et belle fin de thèse et de trouver ton bonheur par la suite.

Emilie, merci pour ta serviabilité et pour ton humeur toujours aimable et souriante. Merci pour avoir

pris en charge les lignées et les génotypages qui ont pu me servir. Je te souhaite de toujours trouver une maison à rénover (tu risques autrement de t’ennuyer) et bien sûr de belles découvertes quant au rôle de cette fameuse cytokine.

Merci Mr le Professeur Emérite Gégé pour ta culture illimitée et si bien partagée grâce à ta grande hospitalité : merci donc pour toutes tes invitations qui rythment les saisons et la vie de ta maison.

Certaines personnes ont quitté l’équipe avant moi mais leur implication dans ma thèse n’en est pas pour autant moins grande. Merci tout d’abord à Christine. Je suis ravie que des conditions un peu particulières (tes révisions nocturnes de ton Nature et mes manips post journée de formation à l’école véto) aient pu favoriser notre rencontre. Si tu m’as aidée dans la thèse sur le plan des manips (injections, prélèvement, cytométrie,…), de la rédaction du manuscrit (ou comment rédiger en 1 mois) ou de la préparation de la soutenance (merci pour la visio conf en direct de Vienne !), c’est aussi d’un point de vue amical que je souhaite te remercier. Merci pour tous ces moments partagés, en tout lieu et en toute saison, qui malgré un bac + 14 à nous deux ont laissé transparaitre beaucoup d’indécision et assez peu de raison !

Merci également à Audrey, pour ta vivacité, ton écoute et tes conseils. Je te souhaite de tout cœur de réussir dans ta nouvelle voie. Merci à Ludovic, pour ta pédagogie en cytométrie en flux et le temps que tu m’as accordé pour l’aide dans la réalisation de ces manips.

Les collaborateurs avec qui ou grâce à qui j’ai travaillé

Afin d’identifier les fragments clivés de l’IL-33, j’ai eu l’opportunité de collaborer avec l’équipe de spectrométrie de masse de l’IPBS de Bernard Monsarrat. Merci donc à eux et en particulier à Violette et Anne qui ont persévéré malgré des quantités de protéines surement pas idéales. Nous avons finalement réussi à obtenir des résultats publiables et je vous en suis reconnaissante.

Merci à Azaaq Bellaaouaj pour nous avoir permis d’expérimenter sur ses souris KO, à Michel Arock, pour l’envoi des cellules HMC-1.

Merci à Malika, pour l’aide dans les démarches de valorisation dont le dépôt de brevet.

Merci à la plateforme Anexplo : Cédric, Magali et tout le personnel de l’animalerie et à la plateforme

TRI et en particulier à Christine Bordier pour la formation sur le Facscalibur.

Je tiens également à remercier l’administration : Annie, Brigitte, Mylène, Yvanne,… qui ont assuré l’intendance de mes déplacements ou de mes avenants.

Je remercie aussi Mr Bon choix pour sa bonne humeur légendaire du midi.

Ceux qui m’ont orientée

Je voudrais également profiter de ces lignes pour remercier les personnes qui ont été importantes dans mon choix de réaliser une thèse. Merci tout d’abord à Claude Maranges, responsable des études à l’INSA qui a toujours été d’une disponibilité hors du commun, pour vos conseils d’orientation et votre soutien.

Christel et Pierre Lutz, vous avez été mon premier contact avec la recherche, et pour cela surement décisifs,

puisque j’ai voulu renouveler l’expérience. Alexandra Carreau, si mon stage avec toi fut court il n’en a pas moins été très marquant pour moi et c’est toujours avec plaisir que je me le remémore. Michel Record et

Caroline Subra, merci de m’avoir formée et soutenue au cours de mon M2R. Ceux qui m’ont guidée et soutenue

Merci en premier lieu à ma famille : Papa, Maman, Marie et plus récemment Seb : vous qui m’avez toujours soutenue quel que soit le chemin choisi. Je vous remercie d’abord pour vos sacrifices, qui ont permis de sponsoriser ces longues années d’études, mais aussi pour votre soutien moral, votre présence et nos discussions qui, malgré les km (aussi bien avant, pendant … et après la thèse), ont fait et feront que vous serez toujours un appui solide et un réconfort pour moi.

Merci aussi à Marie et Jean pour votre accueil chaleureux dans la famille et votre présence dans les moments importants.

Merci enfin à toi Paul : qui de nous deux a incité l’autre à poursuivre vers le doctorat ? Tu diras que c’est moi, je dirais que c’est toi…peut-être alors une volonté individuelle … et une émulation commune ! Vouloir poursuivre en recherche n’est pas un objectif des plus faciles ni des plus reposants psychologiquement,

on se demande si ce n’est pas complètement irréaliste voire même inconscient ? J’ai laissé peu de personnes entendre mes doutes ou mes fluctuations de motivation (qui n’en a pas pendant la thèse ?) et je te remercie de toujours savoir y faire face et de me soutenir. En espérant que notre cadence soit parfaite et qu’un point d’orgue fasse résonner son accord encore pour longtemps.

Ceux qui m’ouvrent l’esprit et participe à un équilibre nécessaire

Sophie, mon amie de plus longue date (20 ans ça commence à faire !). Si nos rencontres se font plus

éparses, elles ne sont pas moins intenses et j’espère pouvoir encore longtemps conserver ce lien particulier d’histoire commune et d’amitié.

Nathalie, Marion et Pauline, merci pour votre amitié solide et reposante, malgré parfois mon manque

de disponibilité (surtout ces derniers temps). Votre compagnie et nos week-ends ont toujours été synonymes de bons moments, et plus curieusement de sérénité et d’apaisement. Si cette amitié a résisté à l’exode toulousain dans tout le territoire français, elle saura, j’en suis sûre, traverser l’Atlantique.

Jean-Philippe, tu es mon premier soutien landais à Toulouse et tu es, à en croire les tampons sur la

carte de chez moi, mon plus fidèle invité et je t’en remercie ! Charlotte, Elise, Christophe, Vincent, Mike,

Fafounet, j’ai été très heureuse d’avoir fait votre connaissance pendant cette thèse. Nous avons partagé de

nombreux moments mémorables et nos liens se sont resserrés en même temps que nos neurones se déconnectaient. J’espère qu’il y en aura encore beaucoup d’autres.

Merci enfin aux chœurs Eclats et Conférences Vocales et à ses membres qui m’ont permis maintes fois et depuis 7 ans de musicalement m’évader.

Les infiltrés, quand même associés à ma thèse

Merci à l’appareil utilisant des ondes électromagnétiques de très petites longueurs (the one who must not be named) pour m’avoir permis de renouveler ma monture et quelques-unes de mes cellules mais surtout pour m’avoir fait réaliser que l’équipe que je venais d’intégrer était d’une tolérance et d’un soutien inconditionnel !

En parlant de monture, merci également aux multiples voleurs de vélos, aux clous, trottoirs et autres bouts de verre qui m’ont sans cesse fait crever… et à mon Papa qui a chaque fois les a réparés ! Et oui la route vers l’Institut et le doctorat, bien que pouvant sembler très courte, n’est pas un chemin sans embuche…

« Droit devant soi, on ne peut pas aller bien loin » Le Petit Prince, A. de Saint-Exupéry

1 Sommaire

SOMMAIRE

SOMMAIRE ... 1

RESUME DES TRAVAUX DE THESE ... 3

LISTE DES ABREVIATIONS ... 7

INTRODUCTION ... 9

I-L’INFLAMMATION : SIGNAUX DE DANGER, CYTOKINES IL-1 ET PROTEASES INFLAMMATOIRES .... 11

1. LA RECONNAISSANCE DU DANGER ET LA MISE EN PLACE DES REPONSES IMMUNITAIRES ... 11

1.1. La réaction inflammatoire : clef de voute des réactions immunitaires ... 11

1.2. L’identification du danger ... 12

1.3. Les senseurs du danger et composants de l’immunité innée ... 18

1.4. Polarisation des réponses immunitaires et réponse adaptative ... 23

2. LES CYTOKINES DE LA FAMILLE IL-1, ACTEURS MAJEUR DE L’INFLAMMATION ... 27

2.1. Les membres de la famille IL-1 et leurs récepteurs ... 28

2.2. Fonctions biologiques des cytokines de la famille IL-1 ... 30

2.3. Mécanismes non conventionnels de sécrétion ... 34

3. LES PROTEASES EN TANT QUE REGULATEURS DE LA REPONSE IMMUNE ... 37

3.1. Les différentes classes de protéases ... 37

3.2. Protéases inflammatoires et régulation de l’inflammation ... 38

3.3. Régulation de l’activité des membres de la famille IL-1 par les protéases ... 41

II- L’IL-33 UN NOUVEAU REGULATEUR DE L’INFLAMMATION ... 47

1. L’INTERLEUKINE-33 ET SON RECEPTEUR ST2 ... 47

1.1. L’interleukine-33 : découverte, structure et expression ... 47

1.2. Le récepteur de l’IL-33, ST2, corécepteur et voies de signalisation ... 55

2. ROLE DE L’IL-33 SUR CES CELLULES CIBLES ... 59

2.1. Rôle extracellulaire de l’IL-33 ... 59

2.2. Cellules Lymphoïdes Innées de type 2 ou ILC2 ... 61

2.3. Autres cellules cibles du système immunitaire inné ... 66

2.4. Cellules cibles du système immunitaire adaptatif ... 68

2.5. Cellules immunosupressives : Tregs et cellules myéloïdes suppressives (MDSCs) ... 69

2.6. Cellules non hématopoïétiques ... 70

3. IMPLICATION DE L’IL-33 DANS LES PATHOLOGIES... 71

3.1. Maladies infectieuses ... 71

2 Sommaire

3.3. Maladies auto-immunes et inflammatoires ... 76

3.4. Maladies du système nerveux central ... 80

3.5. Obésité et maladies cardio-vasculaires ... 82

3.6. Tumorigenèse ... 84

3.7. Rejet de greffe et prééclampsie ... 85

4. MECANISMES DE SECRETION ET DE REGULATION DE LA VOIE D’ACTIVATION IL-33/ST2 ... 86

4.1. Régulation du récepteur ST2 ... 86

4.2. Régulation de l’IL-33 ... 88

RESULTATS ... 95

OBJECTIFS ET DESCRIPTION DU PROJET DE RECHERCHE ... 97

CHAPITRE I : ACTIVATION DE L’INTERLEUKINE-33 PAR LES PROTEASES DES NEUTROPHILES ... 101

1. AVANT-PROPOS ... 101

1.1. Les polynucléaires neutrophiles ... 101

1.2. Les protéases à sérine des neutrophiles : Cathepsine G, Elastase et Protéinase 3 ... 106

2. RESULTATS ... 113

2.1. Article I ... 113

2.2. Résultats complémentaires ... 127

CHAPITRE II : ACTIVATION DE L’INTERLEUKINE-33 PAR LES PROTEASES DES MASTOCYTES ... 135

1. AVANT-PROPOS ... 135

1.1. Les mastocytes ... 135

1.2. Les protéases des mastocytes chez l’Homme ... 139

1.3. Les protéases des mastocytes chez la souris ... 143

2. RESULTATS ... 145

DISCUSSION ET PERSPECTIVES ... 153

MATERIELS ET METHODES ... 165

ANNEXES... 171

  Résumé des travaux 3

RESUME DES TRAVAUX DE THESE 

L’interleukine‐33 (IL‐33) est le dernier membre identifié de la famille des cytokines IL‐

1.  L’intérêt qui lui est porté est grandissant, notamment depuis la découverte de ses cellules 

cibles  majeures,  les  cellules  lymphoïdes  innées  de  type  2  (ILC2),  impliquées  dans  la 

pathogénie des  infections  parasitaires  et  des maladies  allergiques  comme  l’asthme.  L’IL‐33 

se lie au récepteur ST2 via son domaine C‐terminal et induit des réponses inflammatoires et 

de  type  2,  caractérisées  par  la  sécrétion  de  l’IL‐6,  l’IL‐5,  et  l’IL‐13.  L’IL‐33  est  une  cytokine 

atypique  puisqu’on  la  retrouve  associée  à  la  chromatine  via  sa  partie  N‐terminale  dans  le 

noyau  des  cellules  endothéliales  et  épithéliales  de  tissus  exposés  à  l’environnement.  A 

l’inverse  des  autres  membres  de  la  famille  IL‐1,  comme  l’IL‐1β  ou  l’IL‐18,    l’IL‐33  n’a  pas 

besoin  d’être  clivée  par  la  caspase  1  pour  être  activée  et  libérée  dans  le  milieu 

extracellulaire.  Au  contraire,  l’IL‐33  est  inactivée  par  les  caspases  au  cours  d’une  mort 

cellulaire programmée par apoptose. En fait, l’IL‐33 est libérée sous sa forme de pleine taille 

et active, par les cellules nécrotiques lors de dommages cellulaires, agissant ainsi comme un 

signal d’alarme ou alarmine. Toutefois, il n’était pas exclu que d’autres protéases puissent la 

cliver et réguler son activité.  

En  effet,  nos  travaux  montrent  que  l’IL‐33  peut  être  clivée  et  suractivée  par  les 

protéases  du  microenvironnement  inflammatoire,  issues  des  neutrophiles  (la  cathepsine  G 

et  l’élastase)  ou  des  mastocytes (la  chymase,  la  tryptase  et  le  granzyme  B).  Nous  avons 

identifié  précisément  les  sites  de  clivage  par  ces  diverses  protéases  et  montré  que  les 

fragments  ainsi  générés,  contenant  le  domaine  C‐terminal  de  type  IL‐1,  ont  une  activité 

biologique  augmentée  d’un  facteur  10  par  rapport  à  la  forme  de  pleine  taille.  Enfin,  nous 

avons pu mettre en évidence l’existence de telles formes in vivo, dans un modèle murin de 

lésion  pulmonaire  aïgue.  Ces  nouvelles  formes  physiologiques  de  l’IL‐33  induisent  de 

profonds changements morphologiques in vivo, associés à une forte sécrétion de cytokines 

pro‐inflammatoires et de type 2. Cette découverte apporte de nouveaux éléments quant à 

l’importance  du  microenvironnement  inflammatoire  dans  la  régulation  de  l’activité  de  l’IL‐

33.  Le  recrutement  et  l’activation  de  neutrophiles  et/ou  de  mastocytes  sur  le  site  du 

dommage entraîneraient une amplification du signal d’alerte par la génération de fragments 

"super‐actifs"  de  l’IL‐33  et  pourraient  jouer  un  rôle  particulièrement  important  dans  les 

pathologies infectieuses et inflammatoires dans lesquelles la voie IL‐33/ST2 est impliquée. 

  4        _{Résumé des travaux} 

ABSTRACT 

Interleukin‐33  (IL‐33)  is  the  latest  member  of  the  IL‐1  family  which  has  attracted 

much attention since the recent discovery of its major target cells, the Innate lymphoid Cells 

type  2  (ILC2),  involved  in  the  initiation  of  inflammatory  and  type  2  immune  responses, 

characterised  by  secretion  of  IL‐6,  IL‐5  and  IL13,  during  parasitic  infection  and  allergic 

diseases  such  as  asthma.  IL‐33  is  a  chromatin  associated  cytokine  which  possesses  an  N‐

terminal chromatin binding motif and is constitutively expressed in the nuclei of endothelial 

and epithelial cells of tissues exposed to the environment. Extracellularly, IL‐33 binds to its 

receptor ST2 through the C‐terminal part of the protein to induce inflammatory and type 2 

responses. It has been shown that the full length form of IL‐33 is released upon cell injury, 

acting as an endogenous alarm signal or alarmin. It was initially believed that IL‐33, like IL‐1β 

and  IL‐18,  requires  processing  by  caspase‐1  for  biological  activity.  On  the  contrary,  it  has 

been  shown  that  full  length  IL‐33  is  biologically  active,  and  that  processing  by  apoptotic 

caspases  results  in  IL‐33  inactivation.  However,  it  was  as  yet  unclear  whether  other 

proteases could be involved in the regulation of IL‐33. 

We demonstrate here that the bioactivity of IL‐33 can be increased around 10 fold, 

due to the cleavage by inflammatory proteases secreted in the microenvironment. Immune 

cells  recruited  to  the  site  of  injury,  neutrophils  and  mastocytes,  can  regulate  IL‐33  by 

releasing elastase and cathepsin G, or chymase, tryptase and granzyme B, respectively. We 

precisely  mapped  the  different  cleavage  sites  and  we  show  that  each  of  these  proteases 

generate “superactive” forms of IL‐33, containing the IL‐1 domain. We also demonstrate that 

these forms do exist in vivo, using a murine model of acute lung injury. We speculate that 

resident  mastocytes  and/or  recruited  neutrophils  activated  on  the  site  of  tissue  injury  can 

amplify the IL‐33/ST2 pathway and the disease‐associated function of the alarmin IL‐33. 

  Résumé des travaux 5

PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES  

RELATIVES AUX TRAVAUX DE THESE 

Publication d’un article en premier auteur (Chapitre I) et préparation d’un deuxième article 

en cours (Chapitre II) 

Lefrançais  E.,  Roga  S.,  Gautier  V.,  Gonzalez‐de‐Peredo  A.,  Monsarrat  B.,  Girard  J‐P.+,  Cayrol  C+.  (+co‐derniers  auteurs)  « IL‐33 is processed into mature bioactive forms by neutrophil elastase and cathepsin G »   Proc Natl Acad Sci USA , 31 Jan 2012, vol. 109, num. 5, p. 1673‐1678, doi: 10.1073/pnas.1115884109   

Dépôt de Brevet  

Communications orales ou affichées dans des congrès nationaux et internationaux : 

Participation à d’autres études sur l’IL‐33 au sein du laboratoire : 

• Suivi  de  l’expression  de  l’IL‐33  murine  dans  un  modèle  de  souris  « IL‐33  lacZ  Gene  trap ».  (Annexe I) 

Pichery M.*, Mirey E.*, Mercier P, Lefrançais E., Dujardin A., Ortega N. +, Girard J‐P+. (*co‐premiers auteurs)  “Endogenous IL‐33 is highly expressed in mouse epithelial barrier tissues, lymphoid organs, brain, embryos and  inflamed tissues: in situ analysis using a novel Il‐33‐LacZ gene‐trap reporter strain"   The Journal of Immunology, 1er Avril 2012, vol. 188, num. 7, p. 3488‐3495, doi:10.4049/jimmunol.110197    • Analyse du rôle de l’IL‐33 dans un modèle de colite induite au DSS. (Annexe II)  Sedhom M.A.K.*, Pichery M.*, Murdoch J.*, Foligné B., Ortega N., Normand S., Mertz K., Butler M., Braoult L., 

Lefrançais E., Fallon P.G., Quesniaux V., Cathomas G., Junt T. +, Chamaillard M. +, Girard J‐P. +, Ryffel B+. 

“Neutralization  of  the  interleukin‐33/ST2  pathway  ameliorates  experimental  colitis  through  enhancement  of  mucosal healing in mice”  Gut  en révision   

Travaux de vulgarisation : 

•

7 Liste des abréviations

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ASC Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CARD

ATP Adenosine Tri Phosphate

CARD Caspase Recruitment Domain

CD Cluster of Differenciation

CG Cathepsin G

DAMP Danger Associated Molecular Pattern

DPPI Di Peptidyl Peptidase-I

DSS Dextran Sodium Sulfate

EAE Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale

ECM Extra-Cellular Matrix

FGF Fibroblast Growth Factor

GZM Granzyme

HMC Human Mast Cell

HMGB1 High Mobility Group Box 1

HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cell

ICAM Inter Cellular Adhesion Molecule

IFN Interferon

Ig Immunoglobuline

IL Interleukin

IL-1RAcP Interleukin-1 Receptor Accessory Protein

ILC Innate Lymphoid Cell

KO Knockout

LPS Lipopolysaccharide

LTB4/C4 Leucotriene B4/C4

MC-CPA Mast Cell Carboxy Peptidase A

MCP-1 Monocyte Chimioattractant Protein - 1

MDSC Myeloid Derived Suppressor Cell

MyD88 Myeloid Differenciention primary response gene 88

mMCP mouse Mast Cell Protease

8 _{Liste des abréviations}

NE Neutrophil Elastase

NET Neutrophil Extracellular Trap

NF-HEV Nuclear Factor of High Endothelial Venules

NF-ΚB Nuclear Factor – kappa B

NK Natural Killer

NLR Nod Like Receptor

NLRC Nod Like Receptor Card domain

NLRP Nod Like Receptor Pyrin domain

NOD Nucleotide-binding Oligomerisation Domain

OA Oleic Acid

OVA Ovalbulmin

PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern

PGD2/E2 Prostaglandine D2/E2

PMA Phorbol 12-Myristate Acetate

PR3 Proteinase 3

PRR Pattern Recognition Receptor

RRL Rabbit Reticulocyte Lysate

ROR Retinoic-related Orphan Receptor

ROS Reactive Oxygene Species

SIGIRR Single Immunoglobulin IL-1R- related molecule

sST2 soluble ST2

ST2 Suppressor of Tumorigenicity 2

STAT Signal Transducer and Activator of Transcription

TGF Transforming Growth Factor

Th Lymphocyte T helper

TIR Toll IL-1 Receptor

TLR Toll Like Receptor

TNF Tumor Necrosis Factor

TRAF Tumor necrosis factor Receptor Associated Factor

VCAM Vascular-Cell Adhesion Molecule

INT

TRO

ODUCTIO

ON

11 I.1) Reconnaissance du danger et mise en place des réponses immunes

I-

L’INFLAMMATION : SIGNAUX DE DANGER, CYTOKINES IL-1 ET

PROTEASES INFLAMMATOIRES

1. La reconnaissance du danger et la mise en place des réponses

immunitaires

1.1. La réaction inflammatoire : clef de voute des réactions immunitaires

Quotidiennement, l’organisme fait face à des agressions, qui peuvent être de nature étrangère (substance étrangère, infection par un virus, une bactérie, un champignon ou un parasite), ou non (blessure, modifications anormales de cellules ou de molécules). Ces diverses agressions peuvent affecter sa santé, voire sa survie et c’est pourquoi le règne animal a développé des mécanismes de défense pour maintenir l’intégrité de ses tissus (Medzhitov, 2008).

L’immunité est donc définie comme l’ensemble des mécanismes biologiques qui permettent à un organisme de réagir à tout évènement qui menace sa santé. Ces évènements peuvent être des substances étrangères, des agents infectieux, mais aussi ses propres constituants qui peuvent se trouver altérés (cellules endommagées par une blessure ou cellules tumorales).

L’immunité se compose de deux systèmes de défenses apparus successivement au cours de l’évolution. L’immunité innée est la première ligne de défense contre le danger. Elle est la plus rapidement mise en place (dans les heures qui suivent l’agression) mais la moins spécifique. Elle vise à empêcher la pénétration des microorganismes par des barrières physiques et par l’induction d’une inflammation aigüe. L’immunité adaptative, présente uniquement chez les vertébrés, est beaucoup plus lente à se mettre en place (plusieurs jours après l’infection) mais plus ciblée. Celle-ci dépend de la reconnaissance spécifique de la substance étrangère ; elle met en place des moyens ajustés à l’envahisseur et en gardera le souvenir.

Ces deux processus ne sont pourtant pas à opposer, au contraire ils sont étroitement liés. Ce sont les premiers événements de l’immunité innée qui vont induire et piloter l’immunité adaptative afin de s’adapter à chaque infection et d’y réagir plus efficacement. La réponse immunitaire peut ainsi se séparer en trois phases (Soehnlein and Lindbom, 2010):

1) La réponse innée immédiate (0 à 4 heures) : localement et dans les premières minutes suivant l’infection ou la blessure, les macrophages et les mastocytes reconnaissent l’incident et vont tenter de l’éliminer par phagocytose et/ou induire la réponse inflammatoire.

2) La réaction inflammatoire (4 heures à 4 jours) : dépendante de l’immunité innée, elle implique le recrutement sur le site de nouvelles cellules effectrices (neutrophiles, monocytes, ou cellules lymphoïdes innées comme les cellules tueuses NK).

3) La réponse adaptative (à partir du 4ème jour) : intervient si l’agression n’a pas été contrôlée durant les phases précédentes. Son développement dépend de la maturation des cellules dendritiques présentes lors de la réponse locale et de l’activation par ces cellules des lymphocytes spécifiques du pathogène dans les tissus lymphoïdes drainant l’infection. Les signaux échangés pendant les phases précédentes seront décisifs dans l’orientation de la réponse adaptative.

La réaction inflammatoire induite dans les premiers temps de la réponse immune innée est donc une étape essentielle dans la mise en place d’une immunité adaptative efficace.

12 _{Introduction. I - L’inflammation}

1.2. L’identification du danger

1.2.1. Les signaux de danger : les DAMPs (Danger Associated Molecular Patterns)

13 I.1) Reconnaissance du danger et mise en place des réponses immunes

La réponse immunitaire est souvent associée à une infection. Ainsi, la reconnaissance de structures microbiennes, les PAMPs ou motifs moléculaires associés aux pathogènes (Pathogen

Associated Molecular Patterns) a longtemps été considérée comme la principale cause de l’initiation

de la cascade inflammatoire et de l’activation d’une réponse immunitaire. Cependant la seule détection du « non soi » ne permet pas d’expliquer les cas d’activation du système immunitaire en l’absence d’agents étrangers, au cours des maladies auto-immunes par exemple ou au contraire la tolérance du système immunitaire à l’égard des bactéries de la flore intestinale.

C’est dans les années 1990 que Polly Matzinger conçoit la théorie du danger qui propose l’activation du système immunitaire non plus uniquement par des signaux microbiens mais par des signaux de dangers endogènes ou alarmines, libérés par des cellules endommagées, stressées ou nécrotiques. Ces signaux, par leur présence inhabituelle dans le milieu extracellulaire, vont alerter le système immunitaire, l’informant d’un risque ayant abouti au dommage cellulaire (Matzinger, 2002).

L’ensemble des PAMPs et alarmines forme les motifs moléculaires associés au danger ou DAMPs pour Danger Associated Molecular Patterns. Quels sont –ils ?

1.2.1.1. Les signaux exogènes : les PAMPs

Les signaux exogènes liés à une infection : les PAMPs

Les PAMPs sont des molécules exprimées spécifiquement par une même classe de microorganismes et non exprimées par les cellules de l’hôte. Ces motifs moléculaires sont conservés et sont souvent essentiels à la survie des pathogènes ou à leur pouvoir infectieux. Ce sont des molécules glycolipidiques composant l’enveloppe microbienne, des protéines ou des acides nucléiques (Takeuchi and Akira, 2010). Le Tableau 1 liste les molécules reconnues par le système immunitaire associées à une infection (signaux exogènes infectieux).

Les signaux exogènes liés à une agression chimique

Certains irritants chimiques provenant de l’environnement comme la silice, l’amiante, des irritants cutanés (dinitrofluorobenzene) ou les UVB, sont aussi capables d’activer directement les récepteurs de danger des cellules du système immunitaire (Tableau 1 : Signaux exogènes Chimiques ou environnementaux).

1.2.1.2. Les signaux endogènes : les alarmines

Dans des conditions stériles, des signaux endogènes ne provenant ni de pathogènes ni d’agents chimiques sont également capables d’engendrer une réponse immunitaire . Nous pouvons l’observer par exemple au cours de rejet de greffe, des maladies auto-immunes ou des réponses anti-tumorales où le système immunitaire est activé indépendamment d’une infection. C’est, dans ces conditions, une destruction tissulaire massive et non contrôlée qui va être la cause de la réponse inflammatoire. Des signaux endogènes, invisibles pour le système immunitaire au sein de la cellule dans des conditions physiologiques, vont être libérés à la suite de la nécrose des cellules. Différentes agressions peuvent être la cause d’un dommage tissulaire : des agressions microbiennes, chimiques, physiques, un stress métabolique,… Ces signaux, une fois libérés, activent les récepteurs de danger sur les cellules immunitaires (voir paragraphe suivant I-1.2.2), alertant l’organisme d’une mort cellulaire et par conséquent d’un danger (Figure 1). Le terme d’alarmine a été défini en 2007 par

14 _{Introduction. I - L’inflammation}

Joost Oppenhein pour nommer ces signaux de dangers (Oppenheim et al., 2007). Une alarmine possède les caractéristiques suivantes :

1) Une libération rapide au cours d’une mort cellulaire non programmée (nécrose) et non au cours de l’apoptose.

2) Elles peuvent parfois être produites et sécrétées par des cellules sans mort cellulaire mais si c’est le cas, la sécrétion ce fait par une voie de sécrétion non conventionnelle (les alarmines ne possèdent pas de peptide signal).

3) Purifiées, elles entraînent l’activation et le recrutement de cellules du système immunitaire inné dont les cellules dendritiques, promouvant directement ou non une réponse adaptative.

4) Elles induisent la reconstruction du tissu lésé.

Figure 1. Activation du système immunitaire par les alarmines – D’après (Martin et al., 2012). La mort cellulaire par

nécrose entraîne une réponse inflammatoire par la libération dans le milieu de signaux de danger endogènes (DAMPs). Ces DAMPs peuvent activer différentes populations de cellules immunes innées ou adaptatives (A) Au contraire la mort cellulaire programmée (apoptose) n’est pas inflammatoire. La membrane restant intacte, les DAMPs sont contenus dans les vésicules apoptotiques et ne sont pas libérés ou sont inactivés par les caspases. La cellule apoptotique sécrète, elle, des signaux afin d’être éliminée par les macrophages (B).

Ont été décrites pour le moment une vingtaine de signaux répondant à ces critères (Tableau 1 – Signaux endogènes libérés par nécrose) (Chen and Nunez, 2010).

HMGB1. Une des premières alarmines à avoir été décrite et qui a servi à l’établissement des

propriétés des alarmines est HMGB1 (High Mobility group box 1) (Lotze and Tracey, 2005). HMGB1 est une protéine présente dans le noyau de toutes les cellules. Elle se lie aux nucléosomes, permet le repliement de l’ADN et régule la transcription de certains gènes. Lors d’une mort par nécrose, HMGB1 est libérée dans le milieu extracellulaire où elle va agir comme une cytokine pro-inflammatoire (Scaffidi et al., 2002). Elle est par contre retenue sur la chromatine des cellules apoptotiques. HMGB1 peut également être sécrétée activement par des leucocytes activés. Elle active le récepteur RAGE entraînant une activité chimiotactique et la prolifération cellulaire. Des études récentes suggèrent que HMGB1 puisse former des complexes avec d’autres alarmines ou PAMPs, augmentant leur potentiel anti-inflammatoire. Des complexes avec du LPS, des histones, de

15 I.1) Reconnaissance du danger et mise en place des réponses immunes

l’ADN simple brin ou encore avec 1β amplifient l’activation des récepteurs TLR4, TLR2, TLR9 ou IL-1R respectivement (Bianchi, 2009).

Protéines de choc thermique HSPs. Les protéines de choc thermiques (HSP60, HSP90, GP96,…)

servent de chaperonnes intracellulaires en assurant le repliement correct des protéines. Sécrétées activement par les exosomes notamment, ou passivement par les cellules nécrotiques, elles sont reconnues par des récepteurs (CD91, TLRs, CD36, CD40 or CD14) sur les cellules immunitaires innées comme les cellules dendritiques induisant leur maturation et la production de cytokines proinflammatoires (Basu et al., 2001).

Protéines de la famille S100. La famille S100 se compose d’une vingtaine de membres se liant

au calcium intracellulaire jouant un rôle dans l’homéostasie cellulaire du calcium. Certains membres exprimés par des cellules myéloïdes (neutrophiles, monocytes), S100A8, S100A9 et S100A12, ont également un rôle extracellulaire d’alarmine lorsque ils sont libérés par ces cellules (Hofmann et al., 1999). Ils sont reconnus par le récepteur RAGE tout comme HMGB1.

Les acides nucléiques. Nous avons vu que les acides nucléiques (ARN ou ADN) étaient

d’importants signaux de pathogènes, notamment des virus qui présentent autrement peu de motifs caractéristiques. Ils diffèrent des acides nucléiques endogènes dans leur modification moléculaire (méthylation,…) mais également dans leur localisation. C’est dire que de l’ADN endogène trouvé hors du noyau ou de l’ARN extracellulaire peuvent également être reconnus comme des signaux de danger (Barbalat et al., 2011).

Cristaux d’acide urique. L’acide urique est le produit final de la dégradation des nucléotides.

Dans la cellule, l’acide urique est soluble. Lorsqu’il se retrouve dans le milieu extracellulaire riche en sodium, il précipite, formant des cristaux d’urate monosodique. Ce sont ces cristaux qui sont phagocytés par les cellules dendritiques. L’acide urique y active la caspase-1 par une voie dépendante de l’inflammasome NLRP3 (NLR family, pyrin domain containing 3) (Kono et al., 2010). Sa libération est notamment impliquée dans la maladie inflammatoire articulaire de la goutte (Martinon et al., 2006).

Adénosine extracellulaire L’ATP (Adénosine triphosphate) est la molécule fournissant

l’énergie nécessaire aux cellules par hydrolyse. Cytoplasmique, elle peut être libérée dans le milieu extracellulaire en cas de nécrose. Elle peut alors activer les récepteurs purinergiques dont P2X7R à la surface des cellules voisines. Comme l’acide urique, l’ATP extracellulaire stimule l’inflammasome, impliqué dans l’activation de la caspase-1 (Mariathasan et al., 2006). La caspase-1 est elle responsable de la maturation des cytokines IL-1β et IL-18 générées après stimulation bactérienne. L’ATP est donc ici une co-alarmine agissant avec les PAMPs.

Interleukines de la famille IL-1 : Les cellules nécrotiques peuvent aussi libérer des cytokines

inflammatoires préformées et stockées dans le noyau de ces cellules. C’est le cas de deux membres de la famille IL-1 : IL-1α et IL-33, localisées dans le noyau des cellules et sécrétées de manière non conventionnelle à la suite d’un dommage ou d’un stress cellulaire (Chen et al., 2007). Les membres de la famille IL-1 seront détaillés dans le paragraphe I- 2 (page 26).

La nécrose cellulaire entraîne donc la libération directe de signaux de danger mais va également permettre la génération indirecte de signaux de danger par la libération de protéases qui vont dégrader la matrice extracellulaire. Les produits de dégradation, comme le biglycane ou le hyaluronane agissent également comme des signaux de dangers endogènes en activant les récepteurs de danger TLRs.

16 _{Introduction. I - L’inflammation}

1.2.2. Les récepteurs des DAMPs : les Pattern Recognition Receptors

La perception du danger (pathogène ou alarmine) se fait grâce à la présence de récepteurs capables de reconnaitre les signaux de dangers précédemment décrits. Ce sont les PRRs pour Pattern

Recognition Receptors ou récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires en français (Tableau

1). Les PRRs, contrairement aux récepteurs d’antigènes de l’immunité adaptative des lymphocytes B et T, ne sont pas exprimés de manière clonale, c'est-à-dire qu’une même cellule peut exprimer plusieurs PRRs de spécificités différentes et plusieurs cellules différentes peuvent exprimer le même PRR (Takeuchi and Akira, 2010). Il en existe différents types que l’on peut classer selon leur fonction impliquant ou non un signal intracellulaire ou bien selon leur localisation qui peut être extracellulaire, membranaire ou intracellulaire.

Figure 2 La reconnaissance des DAMPs par les récepteurs de signalisation – D’après (Trinchieri and Sher, 2007). Les

signaux de danger sont reconnus par la cellule grâce aux récepteurs de la famille TIR, comprenant les TLRs qui reconnaissent des signaux de danger exogènes extracellulaires (TLR1, 2, 4, 5 et 6) ou intracellulaires (TLR3, 7, 8 et 9) et les IL-1R, les récepteurs des cytokines de la famille IL-1. Les récepteurs lectines de type C (CLRs) reconnaissent des motifs glucidiques et les récepteurs de type NOD (NLRs) reconnaissent des signaux cytoplasmiques. Ces PRRs activent les voies de transcription NF-κB, MAPK, IRF, ou l’activation de la caspase-1.

1.2.2.1. Les récepteurs sécrétés et endocytiques

Les récepteurs secrétés et endocytiques n’induisent pas de signal intracellulaire et ont pour fonction d’activer la voie du complément ou la phagocytose des bactéries. Ils sont donc plus spécifiques des PAMPs.

17 I.1) Reconnaissance du danger et mise en place des réponses immunes

La MBL (Mannane Binding Lectine) est une protéine sécrétée retrouvée dans le plasma de la

famille des collectines (lectines de type C contenant des séquences de type collagène) qui se lie à certains glucides de la surface des bactéries. Cette liaison va déclencher l’activation du complément.

Les récepteurs endocytiques sont des récepteurs membranaires des phagocytes. Ils vont

induire le processus d’endocytose/phagocytose à la suite de leur liaison avec leur ligand qui est souvent un motif glucidique. Beaucoup de ces récepteurs sont des lectines tel le récepteur au mannane des macrophages.

1.2.2.2. Les récepteurs de signalisation

Les TLRs (Toll Like Receptors). La famille des TLRs est la plus étudiée parmi les PRRs,

découverte en premier lieu chez la drosophile, elle comporte treize membres décrits chez l’Homme (Kawai and Akira, 2010). Les TLRs sont des récepteurs membranaires, composés d’un domaine de reconnaissance extracellulaire, formés par une succession de régions riches en leucines (LRR pour Leucine Rich Repeats) et d’un domaine effecteur intracellulaire TIR pour Toll-IL-1R car partagé avec les récepteurs de la famille IL-1. Les TLRs reconnaissent les motifs conservés de pathogènes (TLR1, 2, 4 et 6) ou des acides nucléiques de microorganismes (TLR3, 7, 8 et 9) aussi bien que des alarmines (les TLR-2 et -4 sont par exemple impliqués dans la reconnaissance d’ HMGB1, les protéines de choc thermique, le hyaluronane ou le biglycane) (Figure 2).

Les CLRs (C-type Lectin Receptors). Les lectines de types C sont des récepteurs membranaires

reconnaissant des structures glucidiques qui peuvent être caractéristiques de certains pathogènes. Certains membres sont impliqués dans la reconnaissance des alarmines (Dectine1 reconnait les βglucanes et Mincle reconnait la protéine SAP130).

Figure 3 Activation des NLRs par les DAMPs – D’après (Davis et al., 2011). Après la reconnaissance de divers ligands

associés à un pathogène ou non, les membres de la famille NLR s’assemblent avec l’adaptateur ASC. Ce dernier s’associe avec la caspase-1 qui devient active et permet la maturation de l’IL-1β et l’IL-18.

Les NLRs (Nod Like Receptors). Cette grande famille de protéines cytoplasmiques possède,

18 _{Introduction. I - L’inflammation}

sont caractérisés par un domaine central NOD (nucleotide binding oligomerization domain) (Fritz et al., 2006). Les NLRs possèdent également un domaine effecteur qui permet de recruter la caspase pour la sous-famille NOD ou la pyrine pour la sous famille NLRP. Les NLRs sont activés par des peptides exprimés par différentes bactéries, un stress oxydatif (ROS), des alarmines endogènes (ex : ATP, acide urique), ou exogènes (ex : silice, amiante, ARN bactérien ou viral) (Figure 3). L’activation de l’inflammasome et de la caspase-1 seront également discutée dans le paragraphe sur les caspases (I-3.2.2 page 39) et sur l’activation de l’IL-1β et l’IL-18 (I-3.3.1 page 41).

Les RLRs (RIG-I Like Receptors). Les RLRs sont une petite famille de protéines cytoplasmiques

permettant la reconnaissance d’ARN viral (Loo and Gale, 2011). Découvertes au début des années 2000, les protéines RIG-I et MDA5 en font partie. Le domaine effecteur des RLRs est un domaine d’interaction homophilique CARD.

1.2.3. Les voies de signalisation

Ces différents PRRs, s’ils reconnaissent des signaux de danger différents, ont un rôle commun : initier une réponse immédiate.

1) Induction de la phagocytose 2) Activation cellulaire

3) Chimiotactisme

4) Production et sécrétion de médiateurs de l’inflammation

La réponse des récepteurs de signalisation passe par les voies dépendantes des facteurs de transcription NF-κB, MAPK, IRF ou par la maturation de la caspase-1 (Figure 2).

Signalisation TLRs. Les TLRs activent la transcription de gènes proinflammatoires : (IL-1β,

TNFα,…) par les voies NF- κB ou MAPK. Ils possèdent un domaine intracellulaire identique à celui des récepteurs de la famille IL-1, le domaine TIR. Ils partagent ainsi les mêmes voies de signalisation qui seront détaillées dans le paragraphe I-2.1 (page 28).

Signalisation RLRs. Les récepteurs reconnaissant des motifs viraux (les RLRs mais également

les TLRs des endosomes) activent les facteurs régulateurs d’interféron (IRF). L’interféron-γ (IFN-γ) est en effet un médiateur majeur de la réponse contre un pathogène viral ou intracellulaire.

Signalisation NLRs. L’activation de certains NLRs, comme NLRP3, NLRC4 et NLRP1, induit la

formation des inflammasomes qui permettent le recrutement et l’auto-activation de la caspase-1. L’importance de l’activation de la caspase dans la régulation d’activité de médiateurs inflammatoires de la famille IL-1 sera détaillée au paragraphe I-3.3.1 (page 41).

L’organisme reconnait donc aussi bien un danger qu’il soit infectieux ou endogène et y répond de manière adapté. Nous allons maintenant voir quelles sont les cellules capables de reconnaitre ces signaux de danger et quelles sont celles qui vont pouvoir y faire face ?

1.3. Les senseurs du danger et composants de l’immunité innée

Pour empêcher la pénétration d’agents étrangers, l’immunité innée est d’abord constituée de barrières physiques formées par les épithéliums. Le contact avec les pathogènes se fait en effet au

19 I.1) Reconnaissance du danger et mise en place des réponses immunes

niveau des surfaces épithéliales externes (peau, conjonctive) ou des muqueuses internes (système respiratoire, digestif ou uro-génital). Ces premiers moyens de défenses sont :

1) Mécaniques : l’organisation en couches multiples de l’épithélium cutanée en fait une barrière très efficace. Les jonctions intercellulaires serrées (tight junctions) contribuent également à la pénétration difficile des epithélia. Le mucus enfin, sécrété par les cellules caliciformes au niveau des muqueuses empêche les pathogènes d’adhérer aux cellules épithéliales et permet leur élimination par des mouvements ciliaires (appareil respiratoire) ou péristaltiques (intestin). 2) Chimiques : les épithélia produisent un environnement antibactérien avec un pH acide dans

l’estomac, ou en libérant des substances antibactériennes (défensines, lysozymes dans la sueur, la salive ou les secrétions lacrymales, surfactants au niveau pulmonaire,…).

1.3.2. Les cellules tissulaires résidentes

Les microorganismes qui traversent les barrières épithéliales vont rencontrer des cellules immunitaires résidentes dans les tissus sains capables de reconnaitre les signaux de danger présentés précédemment. On trouve au sein des tissus sous-épithéliaux les macrophages, les mastocytes et les cellules dendritiques.

Figure 4 Les différentes populations de macrophages résidents ou activés - D'après (Galli et al., 2011). Présentation des

macrophages résidents dans les différents tissus (à gauche) et des phénotypes que peuvent acquérir les macrophages activés selon leur stimulation (à droite). Les macrophages résidents comprennent les macrophages alvéolaires (poumons), les histiocytes (tissue connectif interstitiel), les ostéoclastes (os), les cellules microgliales (cerveau) et les cellules de Kupffer (foie). Les macrophages recrutés, différenciés des monocytes, sont plus flexibles et présentent différents phénotypes et différentes fonctions caractéristiques selon les cytokines ou les facteurs qui les activent.

Les macrophages tissulaires (Figure 4) dérivent des monocytes circulants et colonisent les

20 _{Introduction. I - L’inflammation}

retrouve également au niveau du foie (cellules de Küpffer), de la rate, des ganglions lymphatiques, du thymus, des poumons (macrophages alvéolaires et interstitiels), des cavités séreuses (péritonéale et pleurale), du système nerveux (cellules microgliales), de la peau (histiocytes du derme) et du rein (cellules mesangliales). Ce sont eux qui vont reconnaitre immédiatement les DAMPs, entraînant la phagocytose de la bactérie et sa destruction.

Les mastocytes résident également dans les tissus et jouent un rôle important dans

l’initiation de la réaction inflammatoire grâce à la sécrétion de nombreux facteurs pro-inflammatoires (TNF-α, histamine, sérotonine, facteur activant les plaquettes, prostaglandine, leucotriène,…) suite à une activation directe par un pathogène ou indirecte par un signal inflammatoire. L’activation et les fonctions des mastocytes seront détaillées dans le chapitre II des Résultats (page 135).

Les cellules dendritiques sont présentes dans les tissus en tant que sentinelles immatures. Ce

n’est que lorsqu’elles vont rencontrer un danger qu’elles vont maturer, migrer vers un ganglion lymphatique et y activer les lymphocytes T naïfs. Ce sont elles qui assurent le lien cellulaire entre l’immunité innée et l’immunité adaptative.

1.3.3. Les cellules innées recrutées

L’activation des cellules résidentes va induire le recrutement depuis le sang de nouvelles cellules immunitaires sur le site (Tableau 2). Le recrutement dans les tissus lésés des cellules circulantes nécessitent plusieurs étapes. Premièrement, l’activation des cellules endothéliales et l’expression de molécules d’adhérence (P-Selectine, E-Selectine) qui permettent le ralentissement des leucocytes circulants dans le flux sanguin par roulement sur l’endothélium. Les leucocytes sont alors activés par les chimiokines attractantes sécrétées par l’endothélium, la matrice ou les cellules résidentes activées. Finalement les leucocytes s’arrêtent, adhèrent fortement aux cellules endothéliales et migrent à travers elles grâce aux intégrines du leucocyte qui se lient à des membres de la superfamille des immunoglobulines exprimés sur l’endothélium. Les chimiokines qui permettent l’activation et le recrutement sont spécifiques soit des cellules (récepteur exprimé seulement par un certain type cellulaire) soit du tissu (chimiokine exprimé par un certain type tissulaire).

21 I.1) Reconnaissance du danger et mise en place des réponses immunes

1.3.3.1. Les granulocytes

Les granulocytes se caractérisent par un noyau polylobé et la présence de granules dans leur cytoplasme. Le nom des 3 catégories de granulocytes vient des caractéristiques des différents colorants qui permettent de les différencier : ils sont respectivement marqués par des colorants neutres, à base d’éosine, ou basiques.

Les neutrophiles sont les cellules immunes les plus nombreuses dans le sang, représentants

60% de la population leucocytaire circulante et 99% des granulocytes. Leur durée de vie étant très courte, de l’ordre de quelques jours, ils sont constamment produits par la moelle osseuse. Ils sont recrutés très rapidement, dans l’heure qui suit la reconnaissance d’un danger. Ce sont donc les premières cellules à être recrutées sur le site de l’inflammation. Leur migration se fait entre autres grâce à l’IL-8, chimiokine attractante qui se lie aux récepteurs CXCR1 et CXCR2 et également à la reconnaissance de DAMPs comme les peptides dont la méthionine initiale est formylée (N-formyl peptides), une signature des bactéries et des mitochondries. Ils exercent leur fonction anti-infectieuse par différents mécanismes : la phagocytose, la production de réactifs dérivés de l’oxygène (ROS), la dégranulation qui permet la sécrétion de peptides inflammatoires, de protéases et la libération de son ADN formant des filets, les NETs (Neutrophil Extracellular Traps) limitant la propagation des bactéries et favorisant leur élimination. L’activation excessive des neutrophiles est cependant liée à des dommages tissulaires causés par les molécules toxiques qu’ils sécrètent. Les fonctions et mécanismes d’activation des neutrophiles seront détaillés dans le chapitre I des Résultats (page 101)

Les éosinophiles sont peu nombreux dans le sang (1-2 % des leucocytes circulants)

(Rothenberg and Hogan, 2006). Ils proviennent d’un progéniteur commun dans la moelle osseuse avec les basophiles et se différencient et prolifèrent grâce à l’IL-5. Ils sont recrutés grâce à l'éotaxine (CCL11) qui lie le récepteur CCR3. Comme les neutrophiles, les éosinophiles sont capables de produire des ROS mais en quantité plus importante et de libérer de nombreux médiateurs cytotoxiques qui participent à l’élimination des pathogènes. Parmi eux, les protéines basiques stockées dans les granules : la protéine basique majeure (MBP) qui perturbe l’intégrité des membranes, la peroxidase de l’éosinophile (EPO) qui catalyse la formation des radicaux libres et la protéine cationique des éosinophiles (ECP) qui, avec la neurotoxine dérivée de l’éosinophile (EDN), possèdent une activité ribonucléase antivirale. Une infection par des parasites est associée à une prolifération massive d’éosinophiles et ils sont en effet capables in vitro de les tuer grâce à la forte toxicité de leurs protéines granulaires. Elles sont également efficaces contre des bactéries, des champignons ou des virus bien que ce rôle soit moins souvent rapporté. Les éosinophiles sont aussi présents en conditions physiologiques dans l’intestin, la glande mammaire, l’utérus et le thymus où elles peuvent répondre directement à des signaux de danger ou jouer un rôle dans l’homéostasie de ces tissus.

Les basophiles sont les granulocytes les moins représentés (moins de 1% des leucocytes

sanguins). Ils sont caractérisés par l’expression du récepteur de forte affinité pour l’IgE (FcεRI) et par la sécrétion de médiateurs comme l’histamine ou leucotriène C4. Ces caractéristiques sont partagés avec les mastocytes ces derniers étant souvent considérés comme leurs homologues tissulaires bien qu’ayant des origines et des rôles distincts (Karasuyama et al., 2011). Ils auraient ainsi un rôle non redondant dans l’immunité innée contre les parasites et les tiques.

22 _{Introduction. I - L’inflammation}

Les granulocytes ont donc un rôle direct cytotoxique sur les pathogènes extracellulaires (bactéries ou parasites) par la sécrétion du contenu de leurs granules et vont favoriser, réguler et polariser la réponse immune par la production de cytokines (interleukines et chimiokines).

1.3.3.2. Les monocytes/macrophages

Les monocytes circulent dans le sang et expriment le récepteur CCR2 de la chimiokine CCL2

ou MCP-1 (Monocytic Chemokine Protein-1) qui permet leur recrutement dans les tissus, dans les heures qui suivent l’identification du danger. Ils se différencient alors en macrophages ou cellules dendritiques.

Les macrophages recrutés peuvent se différencier en différentes sous populations aux

fonctions différentes en fonctions des signaux qui leurs sont envoyés (Figure 4). On trouve ainsi les macrophages M1 ou classiquement activés par l’IFN-γ qui ont un rôle pro-inflammatoire et facilitent la mort des pathogènes microbiens notamment par phagocytose et production de ROS, les macrophages M2, activés alternativement par des cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13) qui ont un rôle dans la réparation et l’expulsion des parasites mais également l’homéostasie du tissu adipeux et la régulation du métabolisme du glucose (Murray and Wynn, 2011). On note également une troisième population de macrophage ayant des propriétés anti-inflammatoires.

Ces différentes populations sont plastiques et évoluent de l’une à l’autre en fonction du microenvironnement inflammatoire. Leur réponse va également guider la polarisation de la réponse adaptative.

1.3.3.3. Les cellules lymphoïdes innées

En plus des cellules myéloïdes décrites précédemment, le système inné comprend des cellules lymphoïdes programmées pour réagir rapidement et indépendamment de la reconnaissance d’un antigène : ce sont les cellules lymphoïdes innées ou ILCs pour Innate Lymphoïd cells (Figure 5). Elles se caractérisent par le partage des caractères morphologiques des lymphocytes mais n’expriment pas les récepteurs aux antigènes (Spits and Cupedo, 2012). Elles ont également en commun l’expression du facteur de transcription Id2 (Inhibitor of DNA binding) et elles requièrent pour leur développement la chaine γc commune aux récepteurs à l’IL-2, l’IL-4, l’IL-7, l’IL-9, l’IL-15 et l’IL-21. Il existe différentes populations réagissant différemment à divers stimuli.

ILC1 et NK. Les cellules NK (Natural Killer) furent les premières ILCs décrites. Cytotoxiques et

productrices d’IFN-γ, elles jouent un rôle dans l’immunité innée virale ou contre un pathogène intracellulaire, s’attaquant directement à la cellule infectée. Ces cellules sont stimulées par l’IL-18, l’IL-12 et l’IL-15.

RORγt ILCs : LTi, ILC17 et ILC22 : Plusieurs autres populations d’ILCs ont été découvertes par

la suite, notamment les cellules inductrices de tissus lymphoïdes (LTi), productrices d’IL-17 et nécessaires au développement des tissus lymphoïdes. Les LTi ont en commun avec les ILC17 et les ILC22 l’expression du facteur de transcription RORγt. Les ILC22 sont retrouvées dans l’intestin, expriment le marqueur NKp46, sont stimulées par l’IL-23 et renforcent la barrière épithéliale mucosale par la production d'IL-22 qui permet l'expression de peptides antimicrobiens par les cellules épithéliales. La production de l'IL-17 par les ILC17 peut agir en synergie avec l'IL-22 dans l'activation des cellules épithéliales et induit la production et le recrutement des neutrophiles. Elles ont un rôle dans l’immunité anti bactérienne.

23 I.1) Reconnaissance du danger et mise en place des réponses immunes

ILC2. Ce sont les dernières ILCs à avoir été découvertes. Elles produisent de grandes quantités

d’IL-5 et d’IL-13 en réponse à l’IL-33 et l’IL-25. Elles joueraient un rôle dans les infections parasitaires. Leurs caractéristiques et fonctions seront détaillées au paragraphe II- 2.2 (page 61).

Figure 5 Différenciation des populations de cellules lymphoïdes innées - D’après (Spits and Cupedo, 2012). Les ILCs

proviennent d’un progéniteur commun exprimant le facteur de transcription Id2. Elles sont ensuite différenciées en 3 sous populations. Les cellules dépendantes du facteur de transcription Rorγt comprennent les LTi (Lymphoid Tissu inducer cells) activées par l’IL-7 et impliquées dans la formation des organes lymphoïdes, les ILC17 et les ILC22 activées par l’IL-23 et impliquées dans l’immunité mucosale par la sécrétion respective de 17 ou 22. Les NKs ou ILC1 sont activées par l’IL-15 et l’IL-18 et impliquées dans les réponses cytotoxiques de type 1 alors que les ILC2 sont activées par les cytokines IL-33 et IL-25 et impliquées dans la réponse de type 2 antiparasitaires.

1.4. Polarisation des réponses immunitaires et réponse adaptative

Bien qu’efficace, la réponse immunitaire innée n’est pas toujours capable d’éliminer les pathogènes et la persistance d’agents infectieux au niveau de la lésion va conduire au développement d’une réponse immunitaire plus spécifique grâce au système immunitaire adaptatif qui va permettre le recrutement et l’activation des lymphocytes spécifiques de l’agent pathogène.

1.4.1. Les différents types de réponse

Les cellules dendritiques, sensibilisées par les DAMPs augmentent leur capacité à présenter l’antigène (Ag) et à migrer au niveau des organes lymphoïdes, entraînant l’activation des lymphocytes T. En réponse à une stimulation antigénique, les cellules T CD4 naïves prolifèrent et se différencient en cellules T effectrices qui se distinguent par leur production de cytokines et leurs fonctions. C’est en 1986 que Mosmann et al. proposèrent un modèle de différenciation des cellules T CD4 auxiliaires, ou T helper (Th), qui permettait de relier la fonction des effecteurs T CD4 et la nature de la réponse immunitaire induite, en fonction du profil des cytokines produites (Figure 6).

La réponse Th1. En réponse à l’IL-12 produite par les cellules dendritiques, les cellules T CD4

naïves se différencient en lymphocytes Th1, capables de sécréter de l’IFN-γ et de l’IL-12, induisant une réponse à médiation cellulaire. Les cellules Th1 activent les fonctions bactéricides des