CHAPITRE II : ACTIVATION DE L’INTERLEUKINE-33 PAR LES PROTEASES DES MASTOCYTES
1.3. Les protéases des mastocytes chez la souris
Les protéases des mastocytes sont plus nombreuses chez la souris (Tableau 4 page 139). Les mastocytes mucosaux (MMCs) expriment uniquement deux chymases : la mouse Mast Cell Protease (mMCP)-1 et mMCP-2. Dans l’utérus, une autre chymase a été identifiée : la mMCP-9. Les mastocytes de la peau (CTMCs) expriment également deux chymases, la mMCP-4 et la mMCP-5 bien que l’activité catalytique de cette dernière ait évoluée vers une activité de type élastase. En plus des chymases, les CTMCs expriment les tryptases mMCP-6 et mMCP-7 ainsi que la carboxypeptidase A murine. Comme chez l’homme les mastocytes murins expriment une forme membranaire de la tryptase appelée mTMT.
L’expression induite des différentes protéases des mastocytes a pu être caractérisée in vitro en étudiant la différenciation des cellules de la moelle osseuse cultivées avec différents cocktails de cytokines pendant plusieurs semaines (Bone Marrow-derived Mast Cells ou BMMCs). L’IL-3 et le Stem
Cell Factor (SCF) induisent l’expression de la chymase mMCP-5 et de la carboxypeptidase A, et le SCF
permet également l’expression de la chymase mMCP-4, qui témoigne de la maturité des mastocytes de la peau et du péritoine (CTMCs) (Gurish et al., 1992). Le TGF-β et l’IL-9, au contraire, favorisent l’expression des chymases mMCP-1 et mMCP-2 retrouvées dans les mastocytes des muqueuses (MMCs), mMCP-2 étant exprimée dans les cellules les plus différenciées (Miller et al., 1999).
1.4. Expression de la chymase et de la tryptase par d’autres types cellulaires
Bien que la très forte expression de ces protéases par les mastocytes soit souvent utilisée comme des marqueurs de ces cellules, la chymase et la tryptase peuvent être exprimées par d’autres types cellulaires, bien qu’en plus faible quantité. Les basophiles notamment expriment les tryptases α et β (Jogie-Brahim et al., 2004) ainsi que la chymase (Li et al., 1998).
145 Chapitre II- Activation de l’IL-33 par les protéases des mastocytes
2. Résultats
Nous avons vu dans l’article précédent que les protéases des neutrophiles, la cathepsine G et l’élastase, pouvaient cliver et générer des formes superactives de l’IL-33 en libérant le domaine C-terminal qui se lie au récepteur ST2. Nous avons également évoqué la possibilité que d’autres protéases puissent réguler l’activité de l’IL-33. Mais d’autres cellules sont présentes lors de la libération de l’IL-33 par les cellules endommagées. Les mastocytes sont des cellules résidentes dans les tissus où l’IL-33 est exprimée de manière constitutive (les muqueuses pulmonaire et intestinale, le derme et se trouvent à proximité des vaisseaux). En tant que cellules résidentes, ce sont les premières cellules à reconnaitre le danger et elles libèrent de très grandes quantités de protéases après stimulation. La chymase et la tryptase, deux protéases à sérine abondamment exprimées par les mastocytes sont donc de sérieuses candidates pour le clivage de l’IL-33. Une autre protéase produite par les mastocytes, potentiellement impliquée dans le clivage et l’activation de l’IL-33, est le granzyme B.
Les protéases des mastocytes augmentent l’activité biologique de l’IL-33 de pleine taille en générant des formes clivées.
Dans un premier temps, nous avons évalué l’effet des protéases des mastocytes sur l’activité de l’IL-33. L’IL-33 humaine de pleine taille IL-331-270, traduite in vitro, a tout d’abord été incubée avec la
chymase avant de stimuler la lignée de mastocytes MC/9. La sécrétion d’IL-6 par ces cellules triple lorsque l’IL-33 de pleine taille est incubée au préalable avec la chymase (Figure 1A). Nous avons ensuite déterminé si l’IL-33 pouvait être un substrat de la chymase. L’analyse par Western Blot indique que la chymase génère deux fragments de l’IL-33 de 18 kDa et de 20 kDa (Figure 1B et 1C), à partir de 5 minutes d’incubation et ces fragments semblent stables puisqu’ils sont encore détectés après 2 heures.
Figure 1. La chymase clive l’IL-33 de pleine taille et augmente son activité biologique. L’IL-331-270 produite in vitro et incubée 30 min avec la chymase recombinante montre une capacité accrue à stimuler la sécrétion d’IL-6 par les MC/9 (A). Une incubation de 5’, 15’, 30’, 1h ou 2h (B) ou par dose croissante de chymase (C) génère des fragments stables d’IL-33 clivée.
Nous avons ensuite étudié le rôle de la tryptase, l’autre protéase à sérine majeure des mastocytes. De la même manière, la tryptase permet de doubler l’activité de l’IL-33 de pleine taille (Figure 2A) et de générer des formes clivées. La tryptase produit trois fragments : un fragment principal de 18 kDa et deux autres plus longs de 26 kDa (Figure 2B et 2C). Ces fragments ne sont pas non plus dégradés après deux heures d’incubation avec la tryptase.
146 Résultats
Figure 2. La tryptase clive l’IL-33 de pleine taille et augmente son activité biologique. L’IL-331-270 produite in vitro et incubée 30 min avec la tryptase recombinante montre une capacité accrue à stimuler la sécrétion d’IL-6 par les MC/9 (A). Une incubation de 5’, 15’, 30’, 1h ou 2h (B) ou par dose croissante de tryptase (C) génère des fragments stables d’IL-33 clivée.
Si la tryptase et la chymase sont les protéases majeures des mastocytes avec la carboxypeptidase A, le granzyme B, décrite comme protéase cytotoxique des lymphocytes T CD8 et des cellules tueuses NKs, peut également être retrouvée dans les granules des mastocytes humains (Strik et al., 2007) et murins (Pardo et al., 2007). Nous avons ainsi testé son potentiel dans la régulation de l’IL-33. Le granzyme B est de manière intéressante lui aussi capable d’augmenter l’activité de l’IL-33 humaine de pleine taille (Figure 3A) et génère deux formes clivées toujours autour de 20kDa et 25kDa (Figure 3B).
Figure 3. Le granzyme B est aussi capable d’activer l’IL-33 générant des formes clivées. L’IL-331-270 produite in vitro est incubée 30 min avec le granzyme B recombinant et montre une capacité accrue à stimuler la sécrétion d’IL-6 par les MC/9 (A). Une incubation par dose croissante (B) ou de 5 min à 1h (B) génère des fragments stables d’IL-33 clivée.
147 Chapitre II- Activation de l’IL-33 par les protéases des mastocytes
Les protéases des mastocytes génèrent des fragments C-terminaux et clivent la protéine en amont du domaine IL-1.
Nous nous sommes demandé si les fragments produits étaient identiques à ceux générés par les protéases des neutrophiles et nous avons donc cherché les sites de clivage des différentes protéases. Pour cela, nous avons généré des mutants de délétion et des mutants ponctuels afin d’évaluer quels résidus sont importants pour le clivage par les protéases. La chymase, comme la cathepsine G a une activité chymotrypsine, c’est à dire qu’elle clive préférentiellement son substrat après un acide aminé aromatique : phénylalanine (F), tyrosine (Y), histidine (H) ou tryptophane (W). Ainsi, tout comme la cathepsine G, le clivage par la chymase est affecté par la mutation des résidus F94 et L108 ou H109. De plus, les formes clivées de la protéine sauvage comigrent avec les peptides IL-3395-270 et IL-33110-270 (Figures 4A et 4B) ce qui
conforte les résultats obtenus avec les mutants.
Figure 4. Identification des formes générées par la chymase : les fragments IL-3395-270 et IL-33110-270. Des mutants
ponctuels sont produits in vitro et analysés pour leur capacité à être clivés par la chymase. Les mutations F94G et H109G affectent le clivage par la chymase. (A). Représentation dans la séquence de l’IL-33 humaine des sites de clivage par la chymase (B).
La tryptase clive ses substrats après des acides aminés positivement chargés : Lysine (K) ou Arginine (R). Nous avons générés une série de mutants ponctuels d’IL-33, d’après cette spécificité de clivage, et d’après la taille des fragments générés par la tryptase (voir Figure 2). La mutation du résidu R106 affecte la génération du fragment le plus court qui comigre bien avec le fragment IL-33107-270. Dans la région du
clivage correspondant aux fragments plus longs 4 résidus peuvent être impliqués : R74, K75, K77 et R78. Tous ces sites étant proches, il est difficile de visualiser sur le gel les différences de migration entre les protéines recombinantes IL-3375-270, IL-3376-27, IL-3378-270 et IL-3379-270. La mutation double des résidus K77 et
R78 empêche la génération du fragment 75-270, tandis qu’un fragment comigrant avec une protéine recombinante IL-3379-270 est toujours présent (Figure 5A et 5B). Il est possible que la tryptase clive l’IL-33
encore plus en amont (K71) ou bien qu’elle clive au niveau d’un autre résidu dans ce domaine. Pour résoudre ce problème, il serait intéressant de générer un mutant de délétion de tout ce petit domaine (74- 79 voire 71-79) et/ou de générer un mutant ponctuel au niveau du résidu K71.
148 Résultats
Figure 5. Identification des formes générées par la tryptase : les fragments IL-3375-270,IL-3379-270 et IL-33110-270. Des
mutants ponctuels produits in vitro affectent le clivage par la tryptase recombinante (A). Représentation dans la séquence de l’IL-33 humaine des sites de clivage de la tryptase (B).
Le granzyme B clive ses subsrats après un résidu chargé négativement, préférentiellement l’acide aspartique (D) ou parfois l’acide glutamique (E) (Figure 6A). Nous avons donc muté les résidus hypothétiquement impliqués, d’après la spécificité de clivage du granzyme B (Figure 6A) et en accord avec les tailles des fragments obtenus après clivage (Figure 3). Nous montrons que la mutation de l’acide aminé D110 affecte la génération du second fragment (Figure 6B et 6C). Nous n’avons pas encore identifié le premier. Des expériences de mutagénèse dirigée sont prévues afin de l’identifier. L’ensemble des résultats obtenus montre que les protéases des mastocytes libèrent des fragments C-terminaux d’IL-33, proches des fragments générés par les neutrophiles à l’exception de plus longs fragments produits par la tryptase.
Figure 6. Le granzyme B génère la forme IL-33111-270 et une forme de plus grande taille.Site préférentiel de clivage du
granzyme B (A). Le mutant ponctuel D110G affecte le clivage (B) et le fragment généré est représenté dans la séquence de l’IL-33 humaine (B).
149 Chapitre II- Activation de l’IL-33 par les protéases des mastocytes
Les formes clivées d’IL-33 sont générées ex vivo par les mastocytes humains
Les clivages étant observés avec les protéases recombinantes, il était important de vérifier qu’ils puissent également avoir lieu dans des conditions plus physiologiques avec des mastocytes stimulés libérant le contenu de leurs granules. Nous avons donc stimulé la lignée de mastocytes humains HMC-1.1 avec du PMA et de la ionomycine pour induire leur dégranulation. L’incubation du surnageant des cellules avec l’IL-33 humaine de pleine taille produite in vitro entraîne la formation de fragments clivés qui comigrent avec les produits de clivage tryptase IL-3375-270, IL-3379-270 et IL-33107-270. Le produit caractéristique
de la chymase IL-3395-270 n’est par contre pas observé. Les mastocytes humains sont donc capables ex vivo
de générer des fragments clivés de l’IL-33 et dans ces conditions, le clivage par les HMC-1.1 semble être majoritairement réalisé par la tryptase (Figure 7). Toutefois, avant de conclure que l’IL-33 est un substrat majoritaire de la tryptase (par rapport à la chymase), il sera nécessaire de réaliser des tests d’activités enzymatiques sur les surnageants des cellules activées HMC1.1, et de vérifier la présence d’une activité chymase.
Figure 7. Clivage de l’IL-33 humaine ex vivo par le surnageant de mastocytes humains activés. L’IL-331-270 humaine est incubée avec le surnageant de mastocytes humains, la lignée HMC-1.1 stimulée PMA/Ionomycine et les fragments générés sont comigrés avec les mutants de délétion produits in vitro et analysés en Western Blot avec un anticorps anti IL-33 humain 305B.
L’IL-33 murine est également clivée par les protéases des mastocytes in vitro et ex vivo générant les fragments mIL-33102-266 et mIL-33106-266.
De la même manière, nous avons étudié le clivage de l’IL-331-266 de pleine taille murine. Les protéases
recombinantes chymase et tryptase clivent également la cytokine murine en générant un fragment principal de 20 kDa (Figure 8A et 8B) et un fragment plus long produit par la tryptase de 26 kDa (Figure 8B). Ces produits de clivage sont toujours observés après deux heures d’incubation avec les protéases.
Figure 8. L’IL-33 de pleine taille murine est clivée par les protéases des mastocytes. L’IL-331-266 murine est incubée avec les protéases recombinantes des mastocytes : la chymase (A) et la tryptase (B) avec des temps d’incubation de 5’ à 2 heures
150 Résultats
L’analyse de mutants ponctuels révèle des sites de clivage en amont du domaine cytokinique qui confère l’activité à l’IL-33 : après l’acide aminé F101 pour la chymase et après l’acide aminé V105 pour la tryptase (Figure 9A). Le fragment IL-33102-266 produit par la chymase est identique à celui résultant du clivage par la
cathepsine G ce qui en accord avec le fait que ces deux protéases ont des spécificités de clivage très similaires. Le clivage par la tryptase est proche mais génère un fragment différent IL-33106-266 (Figure 9B). La
cytokine murine est donc également susceptible au clivage par les protéases des neutrophiles et les produits des différents clivages contiennent également le domaine C-terminal.
Figure 9. Identification des formes murines générées par les protéases des mastocytes : mIL-33102-266 et mIL-33106-266.
Des mutants ponctuels murins sont produits et clivés par la chymase et la tryptase recombinantes (A). Les sites de clivage dans la séquence murine d’IL-33 sont représentés (B).
L’IL-33 murine est également clivée par le surnageant de mastocytes murins activés, aussi bien par la lignée de mastocytes MC/9 que par des mastocytes issus de moelle osseuse et différenciés en culture avec de l’IL- 3 et du SCF (Figure 10). Selon la littérature, les BMMCs différenciés dans ces conditions expriment les tryptases mMCP6 et mMCP7 et les chymases mMCP4 et mMCP5 (Gurish et al., 1992). L’IL-33 murine est clivée sous la forme d’un fragment principal migrant aux alentours de 20 kDa (Figure 10) qui peut correspondre aussi bien au fragment tryptase que chymase.
Figure 10. Clivage de l’IL-33 murine ex vivo par le surnageant de mastocytes murins activés. L’IL-331-266 murine est incubée avec des concentrations croissantes de surnageant de mastocytes murins, la lignée MC/9 ou avec des BMMCs différenciés pendant 6 semaines avec du milieu supplémenté en IL-3/SCF et stimulées PMA/Ionomycine.
151 Chapitre II- Activation de l’IL-33 par les protéases des mastocytes
Les formes d’IL-33 générées par la chymase et la tryptase sont plus actives que la forme de pleine taille.
Nous avons déjà vu que la cytokine de forme pleine taille était active mais que la libération du domaine IL-1 permettait d’augmenter de manière très significative l’activité biologique de l’IL-33. Les sites de clivage des protéases des mastocytes étant tous en amont de ce domaine, nous avons testé l’activité biologique de ces fragments. De façon intéressante, tous les fragments issus du clivage par la chymase ou la tryptase (même le fragment plus long généré par la tryptase) ont une activité biologique in vitro nettement supérieure à la forme de pleine taille. La sécrétion d’IL-6 par les mastocytes à une concentration donnée est en effet multipliée par 10 par rapport à la forme de pleine taille et la concentration de protéine pour obtenir un effet similaire est diminuée d’un log (Figure 11). Les produits générés par les protéases des mastocytes sont donc également des fragments superactifs de l’IL-33.
Figure 11. Les produits de clivage ont une activité biologique multipliée par 10 par rapport à la forme de pleine taille. La forme humaines pleine taille et matures sont produites in vitro et sont incubés en concentration croissante
avec la lignée de mastocytes MC/9 pendant 24 heures. Le surnageant est récupéré est la concentration en IL-6 est quantifiée par Elisa.
Conclusion
Les mastocytes sont, comme les neutrophiles, capables de réguler l’activité biologique de l’IL-33 humaine et murine. Nous montrons que la chymase, la tryptase et le granzyme B sont capables de cliver l’IL-33 de pleine taille. Nous avons identifié par mutagenèse dirigée ces produits de clivage : les formes IL- 3375-270, IL-3379-270, IL-3395-270, IL-33107-270, IL-33110-270 et IL-33111-270 pour la cytokine humaine et mIL-33102-266 et
mIL-33106-270 pour la cytokine murine. Il serait intéressant de cartographier les peptides générés, par
spectrométrie de masse, en utilisant la même technique que nous avions utilisée avec les protéases des neutrophiles. En effet, tandis que la technique de mutagenèse dirigée permet de prédire quel résidu est important pour le clivage, la méthode utilisant la spectrométrie de masse permet d’identifier avec précision quels sont les peptides générés. Cela nous permettrait par exemple d’identifier plus facilement les formes de haut poids moléculaires générées par la tryptase. Tous ces fragments identifiés sont actifs et possèdent une activité biologique supérieure à celle de l’IL-33 de pleine taille. Ces expériences ont été réalisées in vitro, et il sera très intéressant de reproduire ces résultats in vivo, dès que nous aurons suffisamment de protéine IL-33 de pleine taille recombinante (voir partie Discussion).
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155 Discussion et perspectives
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Conclusion générale
Les travaux que j’ai réalisés au cours de ma thèse ont permis de mettre en évidence,
pour la première fois, des mécanismes capables de réguler l’activité de l’IL-33. Cette
cytokine de la famille IL-1, exprimée dans le noyau des cellules endothéliales et épithéliales
des tissus exposés à l’environnement, agit comme une alarmine en étant libérée sous sa
forme pleine taille lors d’une mort cellulaire à la suite d’un traumatisme ou d’une infection.
Nous avons montré que cette forme de pleine taille peut être clivée et suractivée par les
protéases à sérine des neutrophiles (l’élastase et la cathepsine G) et des mastocytes (la
chymase et la tryptase) (voir figure ci-dessous). Nous avons identifié avec précision les
formes de l’IL-33 générées par ces protéases. Les formes IL-33
79-270, IL-33
95-270, IL-33
99-270, IL-
33
107-270, et IL-33
109-270chez l’homme et les formes mIL-33
102-266et mIL-33
106-266chez la souris
comprennent toutes le domaine IL-1, et ont une activité dix fois supérieure à la forme de
pleine taille. Ainsi, l’environnement inflammatoire pourrait, par le recrutement et
l’activation des cellules immunes sur le site du dommage, permettre de réguler l’activité de
l’alarmine IL-33.
Il est vraisemblable que le clivage de l’IL-33 par de multiples protéases en amont du
domaine IL-1, soit un mécanisme général d’activation de cette cytokine impliquée dans de
nombreuses pathologies.
Figure 1. Schéma récapitulatif des mécanismes d’activation de l’IL-33 par les protéases inflammatoires. L’IL-33, stockée dans le noyau des cellules des tissus exposés à l’environnement est libérée sous forme pleine taille en cas de dommage cellulaire en tant qu’alarmine. Dans le milieu extracellulaire, l’IL-33 est clivée par les protéases des mastocytes résidents et/ou des neutrophiles recrutés et activés sur le site de nécrose, résultant dans l’activation de la cytokine et l’exacerbation de la réponse inflammatoire et de type Th2.
156 Discussion et perspectives