Résultats complémentaires

Identification par mutagénèse dirigée des formes matures de l’IL-33 murine

Identification des formes matures de l’IL-33 murine

Nous avons vu dans l’article que les protéases recombinantes Elastase et Cathepsine G et les neutrophiles activés de souris généraient un fragment clivé d’environ 20 kDa comigrant avec la protéine mIL-33102-266 (Figure 6 A et B de l’article I). Afin de déterminer plus précisément les sites de

clivages de la protéine IL-33 murine, nous avons généré des mutants ponctuels. Nous avons ensuite analysé le clivage des protéines mutées pour les différents acides aminés susceptibles d’être impliqués dans la reconnaissance par les protéases des neutrophiles. La cathepsine G génère ainsi un fragment principal mIL-33102-266 de 20 kDa en clivant la protéine après l’acide aminé F101. En effet le

remplacement de ce résidu par une glycine ne permet plus de générer le fragment observé lors du clivage de la protéine WT (Figure complémentaire I-1 A et B). Comme dans le cas des mutants humains, nous observons le clivage de la protéine à des sites de clivage situés en amont dans la partie N-terminale de la protéine, lorsque le site de clivage principal est affecté. L’élastase génère elle deux fragments de 20 et 18 kDa. Le plus grand fragment, bien que comigrant avec le fragment généré par la cathepsine G (102-266) n’est pas affecté par la mutation de l’acide aminé F101 mais plutôt par la mutation de l’alanine A102 qui suit. Nous pensons donc que l’élastase génère le peptide mIL-33104-266. Le deuxième fragment est affecté par la mutation du résidu I110 et comigre avec le

peptide mIL-33111-266 (Figure complémentaire I-1 C et D).

Figure complémentaire I-1. Identification des formes matures de l’IL-33 murine générées par la cathepsine G et l’élastase. Traduite in vitro, la forme pleine taille mIL-331-266 sauvage ou mutée est incubée avec les protéases

recombinantes des neutrophiles Cathepsine G (A) ou Elastase (C). La mutation de l’acide aminé F101 abolit la génération par la cathepsine G du fragment mIL-33102-266 et les mutations A103 et I110 empêchent la génération par l’élastase des

fragments mIL-33104-266 et mIL-33111-266. Les sites de clivages murins de la Cathepsine G (B) et de l’élastase (D) sont

128 _Résultats

Les protéases murines n’étant pas commercialisées, nous avons réalisé les clivages in vitro avec les protéases humaines. La cathepsine G et l’élastase murines et humaines ont des spécificités de clivage comparables (Wiesner et al., 2005), laissant penser que les fragments d’IL-33 obtenus seraient identiques. Pour avoir une meilleure appréhension du clivage de l’IL-33 murine, nous avons également utilisé le surnageant de neutrophiles murins purifiés de moelle osseuse et stimulés avec la cytochalasine B et le peptide fMLP. L’incubation de la forme pleine taille mIL-331-266, traduite in vitro

avec le surnageant des neutrophiles activés entraîne la génération d’un fragment principal mIL-33102- 266 (voir Figure 6 de l’article I),qui n’est plus généré lorsque le résidu F101 est muté, confirmant que

la forme mIL-33102-266 peut être générée par les neutrophiles murins.

Activité des formes clivées de l’IL-33 murine par rapport à la forme de pleine taille

Nous avons comparé l’activité biologique des formes identifiées à la forme IL-33 murine de pleine taille. La sécrétion de l’IL-6 par des mastocytes murins stimulés avec la forme murine clivée mIL-33102-266 montre, comme avec la protéine humaine, que cette forme clivée a une activité

biologique supérieure (au moins un facteur 10) à la forme pleine taille mIL-331-266 (Figure

complémentaire I-2).

Figure complémentaire I-2. Les protéines murines IL-33 pleine taille mIL-331-266 et clivée mIL-33102-266 sont produites in vitro

et quantifiées par Western Blot à l’Odyssey avec un anticorps secondaire fluorescent (A) avant d’être incubées avec la lignée de mastocytes murins MC/9. L’IL-6 sécrétée par les cellules est quantifiée par Elisa au bout de 24 heures.

129 Chapitre I - Activation de l’IL-33 par les protéases des neutrophiles

Activité différentielle des formes matures de l’IL-33 et stabilité in vivo

Les formes C-terminales sont plus actives que la forme entière ; cependant, nous pouvons également nous demander si des différences d’activité sont observables entre les différentes formes matures de l’IL-33. Nous avons vu qu’in vitro, les formes IL-3395-270, IL-3399-270 et IL-33109-270 se

comportent de la même manière quant à l’activation des mastocytes et la sécrétion d’IL-6 par ces cellules (voir figure 4 de l’article I). In vivo pourtant, nous notons une augmentation significative de l’activité des formes IL-3395-270 (forme cathepsine G)et IL-3399-270 (forme élastase) par rapport à la

forme artificielle IL-33112-270 (augmentation des granulocytes sanguins 8 jours après injection

quotidienne d’IL-33) (Figure complémentaire I-5). Ces expériences ont été reproduites plusieurs fois de manière indépendante et avec des lots de protéines recombinantes différents (Figure complémentaire I-3).

Figure complémentaire I-3. Activité relative in vivo des formes C-terminales de l’IL-33. Après 7 jours de traitement avec

les protéines recombinantes (4µg en i.p, 12 souris Balb/c par groupe), nous remarquons que le nombre de granulocytes sanguins est significativement plus élevé avec les formes IL-3395-270 et IL-3399-270 qu’avec la forme de référence IL-33112-270.

Afin de comprendre les différences d’activité observées in vivo et de mieux caractériser ces formes, nous avons étudié leur stabilité. In vitro, les formes matures IL-3395-270 et IL-3399-270 incubées

dans du sérum de souris sont stables (toujours pas de dégradation observée au bout de 24 heures).

In vivo au contraire, la quantité d’IL-33 dans le sang injectée en i.v diminue très vite après l’injection

et seulement 10 % de la quantité d’IL-33 injectée est encore détectable en Elisa 10 minutes après l’injection. On observe ainsi deux phases dans la cinétique de diminution de la concentration en IL-33 sanguin : une première phase de distribution dans les tissus, très rapide, et une phase d’élimination d’IL-33 dans le sang où elle est détectable jusqu’à 6 heures après l’injection (Figure I-4). Les demi-vies de distribution et d’élimination calculées sont de l’ordre de 5 minutes et de 2 heures respectivement. Cependant nous n’avons pas obtenu de différence significative entre les différentes formes qui expliquerait les différences d’activité observées in vivo. Des différences d’activité pour des cytokines comportant quelques résidus de plus ou de moins ont déjà été décrites pour l’IL-36, un autre

130 _Résultats

membre de la famille IL-1. En effet, l’ajout ou la suppression de quelques acides aminés à la forme possédant l’activité optimale réduit l’activité de l’IL-36, in vitro. Cette différence a été expliquée par une diminution de la liaison de l’IL-36 avec son récepteur (Towne et al., 2011). Un tel mécanisme pourrait aussi expliquer la différence d’activité des différentes formes de l’IL-33.

Figure complémentaire I-4. Stabilité des formes matures d’IL-33 in vivo. Les formes IL-3395-270, IL-3399-270 ou IL-33112-270 (4

µg par souris) ou un volume équivalent de PBS ont été injectées en rétro-orbital à des souris. Le sang a été prélevé dans la queue à intervalle régulier après l’injection, et la concentration en IL-33 a été déterminée par Elisa (R&D).

131 Chapitre I - Activation de l’IL-33 par les protéases des neutrophiles

Activité des nouvelles formes sur l’expansion des ILC2 in vivo

Compte tenu des nouvelles données quant au rôle de l’IL-33 dans l’activation des Innate

lymphoid cells type 2 (ILC2) (voir paragraphe II-2.2 page 61), nous avons voulu savoir si les nouvelles

formes d’IL-33 générées par les protéases des neutrophiles étaient capables d’agir sur cette population cellulaire. Nous avons donc suivi, in vivo, dans différents organes, la présence des ILC2 en conditions normales ou après injection de la forme IL-3395-270 recombinante (la première forme

générée par la cathepsine G). Au 5ème jour, les cellules de différents organes sont analysées. Les ILC2 sont définies par l’absence d’expression des marqueurs des lymphocytes (CD3, B220), des granulocytes (Gr1), des monocytes (Cd11b), des globules rouges (TER119), des cellules dendritiques (Cd11c), NK (NK1.1), et des mastocytes (FCεRIα), et par l’expression du récepteur à l’IL-33 (ST2), du récepteur à l’IL-7 (IL7Ra/CD127), à l’IL-2 (CD25) et les marqueurs ckit et Sca1. C’est dans le mésentère et les poumons que nous retrouvons cette population en plus grand nombre comptant respectivement pour 0,4% et 0,1% des lymphocytes dans des conditions physiologiques. Nous observons ainsi une multiplication par un facteur deux ou plus dans les mésentères, les ganglions mésentériques, les poumons, la rate et le lavage péritonéal (Figure complémentaire I-5). La forme IL- 3395-270 est donc capable d’entraîner la prolifération ou le recrutement des ILC2 in vivo.

Figure complémentaire I-5. Activité in vivo de la forme mature IL-3395-270 dans l’expansion des ILC2. Des souris C57Bl/6

sont traitées i.p avec 0,5 µg d’IL-3395-270 ou un volume équivalent de PBS pendant 4 jours. Le 5 ème

jour, le mésentère, le ganglion mésentérique, les poumons, la rate et le lavage péritonéal sont récupérés, broyés et les cellules sont analysées en cytométrie de flux.

132 _Résultats

Autres modèles in vivo dans lesquels le clivage de l’IL-33 est observé

Nous avons observé in vivo l’existence de formes clivées d’IL-33 dans un modèle de lésion pulmonaire induit par l’injection en intraveineux d’acide oléique (Figure 6 Article I). Dans ce modèle, nous pouvons récupérer le lavage bronchoalvéolaire, ce qui permet de n’analyser que les protéines du milieu extracellulaire. L’IL-33, exprimée constitutivement dans les pneumocytes va être libérée à la suite des dommages membranaires induits par l’acide oléique. Nous pensons que l’IL-33 est libérée sous sa forme entière et qu’elle est ensuite clivée par les protéases inflammatoires.

Afin de déterminer si ce clivage in vivo peut avoir lieu dans d’autres conditions et dans d’autres organes, nous avons analysé les formes d’IL-33 retrouvées dans un modèle de colite induite par la consommation de DSS (Dextran Sulfate Sodium) à 3% dans l’eau de boisson pendant 8 jours. Les souris traitées au DSS montrent une inflammation du colon qui se traduit par une perte de poids et une diminution de la longueur du colon (Figure complémentaire I-6 A et B). Les colons sont prélevés au 8ème jour et les extraits protéiques totaux montrent que l’expression de l’IL-33 de pleine taille est augmentée à la suite du traitement. D’autre part, nous notons la présence de formes clivées de l’IL-33 de taille similaire (autour de 20kDa) à celles obtenues avec les protéases des neutrophiles (Figure complémentaire I-6 C). L’IL-33 peut donc être clivée in vivo au cours d’un modèle d’inflammation du colon. Il est connu que les neutrophiles sont fortement recrutés au cours de ce modèle de colite (Wirtz et al., 2007), et les protéases des neutrophiles pourraient donc être responsables des clivages observés. Nous ne pouvons cependant pas savoir si ce clivage a lieu extracellulairement et si la protéine est libérée puisque nous analysons ici les extraits protéiques totaux.

Figure complémentaire I-6 Clivage de l’IL-33 in vivo dans un modèle de colite induite au DSS. Des souris C57Bl/6 sont

traitées avec du DSS à 3% dans l’eau de boisson pendant 8 jours. Les souris sont pesées tous les jours (A) et les colons sont prélevés le dernier jour. Leur longueur est mesurée (B) et la présence de différentes formes de l’IL-33 dans les extraits protéiques est analysée en Western Blot (Goat anti-mouse IL-33 R&D) (C). Les pistes notées d’un astérisque (*) sont les extraits protéiques de souris traitées avec un inhibiteur de sérines protéases AEBSF (i.p).

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135 Chapitre II- Activation de l’IL-33 par les protéases des mastocytes

CHAPITRE II : ACTIVATION DE L’INTERLEUKINE-33 PAR LES