IDENTIFICATION DE Staphylococcus aureus :

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REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE D’ETAT CHARGE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE OPTION : ANALYSES BIOMEDICALES

Rapport de stage de fin de formation pour l'obtention du diplôme de licence Professionnelle

THEME :

Président du jury : Professeur BANKOLE Honoré, Maitre de conférences des universités (CAMES), Enseignant de Bactériologie à l’EPAC

Superviseur de stage : Docteur AHOYO Théodora Angèle, Maitre-assistant des universités (CAMES), Hygiéniste, Enseignant de microbiologie à l’EPAC

Examinateur : Docteur DOUGNON Victorien, Assistant de recherche et d’enseignement (Microbiologie) à l’EPAC

Année académique 2013 - 2014 7^ème promotion

IDENTIFICATION DE Staphylococcus aureus : PROBLEMATIQUE DE LA RECHERCHE DE LA STAPHYLOCOAGULASE LIBRE AVEC DU PLASMA HUMAIN

Réalisé et présenté par : Ghislain DENAKPO

Devant le jury suivant le 07 Novembre 2014 :

(2)

7^ème Promotion de Licence Professionnelle REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE D’ETAT CHARGE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

DIRECTEUR : Pr Félicien AVLESSI

DIRECTEUR-ADJOINT : Pr Clément BONOU

CHEF DEPARTEMENT/GBH : Dr Julien A. G. SEGBO

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LISTE DES ENSEIGNANTS

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Réalisé par Ghislain DENAKPO Page ii

LISTE DES ENSEIGNANTS DU DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)

I- ENSEIGNANTS PERMANENTS

N° NOM et Prénoms Matières enseignées 01 ADISSODA Cyrille Anglais

02 AHOYO Théodora Angèle

Microbiologie Générale et Médicale 03 AIKOU Nicolas Biochimie

04 AKPOVI Casimir Physiologie cellulaire

05 ALITONOU Guy Chimie Générale et Organique 06 ANAGO Eugénie Biochimie Structurale

07 ANAGONOU Sylvère Education Physique et Sportive 08 ATCHADE Pascal Parasitologie

09 AVLESSI Félicien Chimie Générale et Organique 10 BANKOLE Honoré Bactériologie Générale et Appliquée 11 DOSSOU Cyriaque Techniques d’Expression et Méthodes de

Communication

12 HOUNSOSSOU Hubert Biométrie et Anatomie Générale 13 LOKO S. Frédéric Biochimie Clinique

14 LOZES Evelyne Immunologie Générale

15 SECLONDE Hospice Immuno-Hématologie et Transfusion Sanguine, Esprit de Leadership

16 SEGBO A. G. Julien Biologie Cellulaire, Biochimie Métabolique et Biologie Moléculaire

17 TOPANOU Adolphe Hématologie Générale

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Identification de Staphylococcus aureus : Problématique de la recherche de la Staphylocoagulase libre avec du plasma humain

2013-2014

Réalisé par Ghislain DENAKPO Page iii

18 YANDJOU Gabriel Techniques d’Expression et Méthodes de Communication

19 YOVO K. S. Paulin Physiologie Humaine, Pharmacologie et Toxicologie

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Réalisé par Ghislain DENAKPO Page iv

II- ENSEIGNANTS VACATAIRES

N° Nom et Prénoms Matières enseignées 01 ABLEY Sylvestre Déontologie Médicale

02 ADOMOU Alain Physique

03 AGBANGLA Clément Génétique Moléculaire

04 AGOSSOU Gilles Législation et Droit du Travail 05 AKOGBETO Martin Entomologie Médicale

06 BINAZON Claude César Soins Infirmiers et Phlébotomie 07 DARBOUX Raphaël Histologie Spéciale

08 DESSOUASSI Noël Biophysique

09 DOSSEVI Lordson Techniques Instrumentales 10 FOURN Léonard Santé Publique

11 HOUNNON Hyppolite Mathématiques 12 MASLOKONON Vincent Histologie Générale 13 SENOU Maximin Histologie Spéciale

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2013-2014

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DEDICACE

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A Dieu le père Tout Puissant^…

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2013-2014

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REMERCIEMENTS

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Nos sincères remerciements :

 au Docteur AHOYO Angèle notre superviseur, votre sens du travail bien fait et votre rigueur ont permis la réalisation de ce travail. Malgré vos multiples occupations, vous avez été toujours présente et disponible durant ce travail.

Par vos conseils et votre sens de la discipline, vous avez été, pour nous, une mère. Puisse l’Eternel vous accorder longévité et prospérité afin que les générations futures bénéficient aussi de vos connaissances ;

 à Mr DEHOUMON François, plus qu’un tuteur vous avez été pour nous un père de par votre soutien, vos analyses, vos sages conseils et votre attention à notre égard. Vous avez su nous faire bénéficier de vos expériences et de votre savoir-faire. Que le Seigneur vous comble de sa grâce ;

 à Mr FANOU Brice pour m’avoir donné le plus beau cadeau que l’on puisse offrir à quelqu’un : votre temps, votre attention et votre amour. Pour la confiance que vous me redonnez à chaque moment où je vacille. Merci à vous, pour le grand frère et l’ami que vous êtes pour moi ;

 à tout le personnel du laboratoire du Centre Hospitalier Départemental de l’Ouémé-Plateau, pour votre disponibilité, votre soutien, vos multiples conseils ;

 à Mme HOUNANOU Agnès, pour l’aide précieuse que vous nous avez apportée dans la réalisation de ce travail ;

 à tous nos camarades de promotion, en souvenir des moments de joies et de peines que nous avons vécus. Courage et persévérance ;

 aux enseignants de l’EPAC, en particulier ceux du département de Génie de Biologie Humaine, recevez ici le témoignage de notre profonde gratitude.

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2013-2014

Réalisé par Ghislain DENAKPO Page ix

Merci à Dieu Tout Puissant pour tous tes bienfaits et pour les êtres merveilleux que tu m’as permis de rencontrer. Mes sincères remerciements :

 à ma mère TIKADA Josiane, pour ton soutien permanent et indéfectible et les marques d’affections dont vous nous faites grâce tous les jours. Que Dieu te protège.

 à mon père DENAKPO Enock, pour ton soutien permanent et indéfectible et l’exemple parfait de travail bien fait que vous nous démontrez chaque jour.

Puisse le Seigneur vous combler encore davantage ;

 à mes grandes sœurs et grand frères, pour l’exemple parfait de sagesse que vous incarnez. Pour l’esprit d’entente et d’harmonie que vous avez su inculquer à vos enfants. Merci ;

 à LIGAN Gloria, ton amour, ta présence et ton soutien me donnent la force et le courage d’aller de l’avant. Merci et que Dieu te protège ;

 à Mr KLOTOE Jean Robert, Mr FAH Lauris, Mr DOUGNON Victorien, pour la famille que vous m’avez donnée à l’EPAC. Puisse le Seigneur vous le rendre au centuple ;

 à Mr. KOUDOKPON Hornel, pour ta présence, ton amour et ton soutien indéfectible. Merci ;

 à IBRAHIM Boussari, DJOSSOU Rock et HOUNTON Sylvestre pour m’avoir redéfini l’amitié. Sincères remerciements ;

 à tous mes autres amis, merci à vous.

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Réalisé par Ghislain DENAKPO Page x

HOMMAGES

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2013-2014

Réalisé par Ghislain DENAKPO Page xi

 A son excellence, Monsieur le Président du Jury, c’est un honneur que vous nous faites en acceptant de présider notre jury de soutenance de rapport de stage. Veuillez recevoir l’expression de nos respectueux hommages ;

 aux Honorables Membres du Jury, nous vous sommes reconnaissants de l’honneur que vous nous faites en acceptant de siéger dans ce jury et de juger notre travail. Nous vous prions de reconnaître l’expression de nos sincères considérations.

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Réalisé par Ghislain DENAKPO Page xii

LISTE DES ABREVIATIONS,

SIGLES ET SYMBOLES

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ADN : Acide désoxyribonucléique ARN : Acide ribonucléique

BCC : Bouillon Cœur-Cervel NaCl : Chlorure de sodium

CHD-OP : Centre Hospitalier Départemental de l’Ouémé-Plateau

OC : Degré celsius Cm : Centimètre

DNase : Désoxyribonucléase

EMB : Eosine Bleu de Méthylène

G : Gramme

L : Litre

Meti-R : méticillino- résistant

µ : Micron

Mm : Millimètre Ml : Millilitre

PLL : Plasma Lyophilisé de Lapin PFH : Plasma Frais Humain

PFL : Plasma Frais de Lapin

 : Pourcentage

pH : Potentiel Hydrogène Qsp : Quantité suffisante pour

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LISTE DES TABLEAUX& FIGURES

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1- Liste des tableaux

Tableau 1 : Fréquence de dissémination de Staphylococcus aureus au sein de la flore commensale de la peau et des muqueuses de l’homme………

06 Tableau 2 : Répartition des souches bactériennes en fonction des

résultats de la DNAse……….

32 Tableau 3 : Répartition des souches bactériennes en fonction des

résultats de la recherche de la staphylocoagulase libre avec du plasma lyophilisé de lapin……….…

32 Tableau 4 : Répartition des résultats obtenus avec du bouillon de

24 heures (PFH non traité) ………..

33 Tableau 5 : Répartition des résultats obtenus avec les colonies de

24 heures (PFH non traité) ………

33 Tableau 6 : Répartition des résultats obtenus avec du bouillon de

24 heures (PFH traité) ………

35 Tableau 7 : Répartition des résultats obtenus avec les colonies de

24 heures (PFH traité) ………

35 Tableau 8 : Etude comparatif des plasmas contenant de

l’antibiotique ………..

36

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2- Liste des figures

Figure 1 : Aspect de S. aureus après coloration de Gram (obj. X100) 14 Figure 2 : Résultat de la recherche de la DNase ………. 26 Figure 3 : Résultat de la recherche de la staphylocoagulase libre…… 27 Figure 4 : Aspect des coagulums obtenus avec les plasmas humains

(A) et du plasma lyophilisé de lapin (B)………..

34

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2013-2014

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RESUME

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Réalisé par Ghislain DENAKPO Page xviii

La cherté, l’inaccessibilité et les contraintes de conservation du plasma lyophilisé de lapin utilisé pour la recherche de la staphylocoagulase libre, enzyme importante pour l’identification de Staphylococcus aureus constituent l’une des raisons qui amène les techniciens de laboratoire à avoir recours à des méthodes d’identification moins performantes.

La présente étude a eu pour objectif d’évaluer l’utilisation du plasma humain pour la recherche de la staphylocoagulase libre. Pour ce faire, 45 souches de Staphylococcus aureus possédant une staphylocoagulase libre ont été utilisées. Ces souches ont été soumises à la recherche de l’enzyme par deux techniques avec deux types de plasmas humains, recueillis sur deux différents anticoagulants.

Les tests effectués avec les bouillons des souches et les différents plasmas ont montré que 80% des souches coagulaient le plasma humain de sujets non traités prélevé sur tube-Fluoré contre seulement 55,55% pour le plasma humain de sujets traité prélevé dans les mêmes conditions. Par ailleurs, pour les plasmas humains prélevés sur EDTA K3, 60% et 53,33% des souches ont coagulé respectivement le plasma de sujets non traités et le plasma de sujets traités.

Quant aux tests réalisés avec les colonies et les différents plasmas, 68,88% et 37,77% des souches ont coagulé respectivement les plasmas humains de sujets non traités prélevé sur Fluorure de Na et sur EDTA K3 et seulement, 17,77% et 11,11% des souches ont coagulé respectivement les plasmas humains traités prélevés sur Fluorure de Na et sur EDTA K3. En outre, les coagulums formés dans les cas de positivité avec les plasmas humains n’avaient pas les mêmes consistances que ceux obtenus avec le plasma lyophilisé de lapin (méthode de référence).

Au total, le plasma humain entier ne peut donc pas être utilisé pour une mise en évidence certaine de la staphylocoagulase libre.

Mots clés : staphylocoagulase libre, plasma humain, colonies et bouillon de 24h

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ABSTRACT

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The dearness, the inaccessibility and the constraints of plasma conservation freeze-dried of rabbit used for the research of the free staphylocoagulase, important enzyme for the identification of Staphylococcus aureus constitutes one of the reasons that brings the technicians of laboratory to have resort to less effective methods of identification.

The present survey had for objective to value the use of the human plasma for the research of the free staphylocoagulase. For that to make, 45 stumps of Staphylococcus aureus possessing a free staphylocoagulase have been used.

These stumps have been submitted in search of the enzyme by two techniques with two types of human plasmas, introverted on two different anticoagulant.

The tests done with the soups of the stumps and the different plasmas showed that 80% of the stumps coagulated the plasma human of topics non appropriated on tube-Fluoré against only 55,55% for the plasma human of topics treaty appropriated in the same conditions. Otherwise, for the human plasmas appropriated on EDTA K3, 60% and 53,33% of the stumps coagulated respectively the unprocessed topic plasma and the plasma of topics treaties. As for the tests achieved with the colonies and the different plasmas, 68,88% and 37,77% of the stumps coagulated respectively the plasmas human of topics non appropriated on Fluoride of Na and on EDTA K3 and only, 17,77% and 11,11%

of the stumps coagulated respectively the treated human plasmas appropriated on Fluoride of Na and on EDTA K3. Besides, the coagulums formed in the cases of positivity with the human plasmas didn't have the same consistences that those gotten with plasma freeze-dried of rabbit (method of reference).

To the total, the whole human plasma cannot be used not therefore for a setting in evidence certain of the free staphylocoagulase.

Key words: free staphylocoagulase, human plasma, colonies and soup of 24h

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SOMMAIRE

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Introduction ………... 1

1- Synthèse bibliographique………... 4

2- Matériel et méthodes……… 17

3- Résultats et commentaire……….. 30

Conclusion et suggestions……… 40

Conclusion……… 41

Suggestions……… 43 Références bibliographiques……… 45 Table des matières………. 56

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INTRODUCTION

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Parmi les micro-organismes les plus incriminés dans les infections bactériennes, Staphylococcus aureus occupe une place privilégiée en médecine humaine et vétérinaire [1,2]. Son pouvoir pathogène, son caractère ubiquiste et l’absence d’exigences nutritionnelles font de cette bactérie un exemple d’adaptation et de dissémination [3]. La prise en charge efficiente des infections dues à S. aureus passe obligatoirement par son identification. Chaque étape, chaque manipulation dans le cours d’un traitement peut être déterminante dans le succès de celui-ci et il importe de bien connaitre les techniques appropriées [4]. L’identification de S. aureus au laboratoire repose sur un certain nombre de caractères dont la plus importante est la mise en évidence de la staphylocoagulase libre [5], une enzyme dont la présence est marquée par la formation d’un coagulum suite au mélange d’un bouillon cœur-cervelle ensemencé de la bactérie étudiée et du plasma lyophilisé de lapin à volume égal [6]. Mais force est de constater que dans la plupart de nos laboratoires, différentes techniques sont utilisées. En effet, la cherté, l’inaccessibilité et les contraintes de conservation du plasma lyophilisé de lapin d’une part, pousse des laboratoires à utiliser le plasma humain indépendamment de sa provenance [7]

et d’autre part, l’empressement de certains techniciens les amène à utiliser à la place du bouillon ensemencé de la bactérie étudiée, des colonies prises directement sur les milieux d’isolement. En effet, au Centre Hospitalier Départemental de l’Ouémé-Plateau où nous avons effectués nos stages, la mise en évidence de la staphylocoagulase libre se fait avec des colonies émulsionnées directement dans du plasma humain

Le présent travail s’est donné alors comme objectif, d’évaluer l’utilisation du plasma humain dans la recherche de la staphylocoagulase libre. Il s’est agi spécifiquement de :

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1- collecter des souches de Staphylococcus aureus identifiées sur la base de la présence de la staphylocoagulase libre

2- tester l’efficacité du plasma humain dans la réalisation de la staphylocoagulase libre,

3- comparer l’efficacité du bouillon de 24h et de colonies de 24h dans la recherche de la staphylocoagulase libre.

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1- SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE

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1.1- Définition et historique

Staphylococcus aureus est, comme les autres staphylocoques, un coccus à Gram positif d’un diamètre d’un micromètre (1µm) environ apparaissant en amas à l’examen microscopique. Il est immobile, non sporulé et présente une capsule in vivo mais qui n’est pas visible au microscope optique (in vitro) [8].

Ils sont des germes de la famille des Micrococcaceae. Cette famille compte trois genres dont seuls les genres Staphylococcus et Micrococcus sont d’intérêt médical.

Staphylococcus aureus est une bactérie impliquée dans de nombreuses pathologies qui ont fait l’objet de plusieurs recherches par d’importants chercheurs au nombres desquels nous pouvons citer Louis Pasteur, Robert Koch, Ogston, Rosenbach.

En effet, Koch, en 1878, souligne le rôle pathogène de bactéries en forme de grains isolés puis identifiés dans le pus d’un furoncle puis dans le pus d’une ostéomyélite par Louis Pasteur en 1880. Pour décrire ces grains groupés en amas, Ogston les nomma « staphylocoques » en 1883, nom dérivé du latin

« Staphylle » ou grappe et « coccus » ou grain se présentant sous forme de cocci Gram positif [9]. Les premières cultures pures de cette bactérie ont été obtenues par Rosenbach en 1884 [10].

1.2- Habitat

Les Staphylocoques sont des bactéries pyogènes par excellence responsables d’infections nosocomiales. Ce sont des bactéries ubiquitaires. Elles constituent l'essentiel de la flore résidente de la peau de l'homme et des animaux à sang chaud. Ils peuvent également survivre sur des surfaces inanimées telles que la literie, les vêtements, et les poignées de portes [11]. Chez l’homme, S.

aureus est présent sur plusieurs sites corporels. On le repère sur la surface de la peau et des muqueuses, mais il colonise principalement les fosses nasales, les glandes de la peau, le cuir chevelu, les mains, la bouche, les dents et le périnée

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[12, 13, 14]. La fréquence du portage sain chez les humains est approximativement de 30 %. Cette fréquence diffère suivant le site que colonise le germe (Tableau 1) ou l’âge (jusqu’à 64 % chez les enfants) [15].

Tableau 1 :

Sites Fréquences en (%) d’individus porteurs

Références

Peau 5 à 25 Mounier et Denis [16]

Nez 20 à 85 Mounier et Denis, Amir et al. ; Sina et al. [16, 17, 2]

Bouche 26 à 36

75 à 100

Smith et al [14]

Mounier et Denis [16]

Oropharynx 35 à 40 Mounier et Denis [16]

Selles 30 à 50 Mounier et Denis [16]

1.3- Colonisation et infection

La base de la colonisation de S. aureus est complexe et mal connue mais semble impliquée dans le contact de la bactérie avec son hôte ainsi que dans son aptitude d’adhésion et d’évasion aux défenses immunitaires. Les patients porteurs de S. aureus ont plus de risque de développer une infection que les autres [18].

Après l’introduction du germe dans l’organisme, le plus souvent après rupture de la barrière cutanée (blessures, cathéters, chirurgie, brûlures…) ou au niveau d’un follicule pileux, l’infection peut évoluer différemment en fonction de nombreux paramètres liés à l’agent infectieux lui-même et/ou à l’état de l’organisme infecté [19]. La maladie causée par l’agent infectieux peut rester limitée au point de l’introduction du germe (abcès), ou bien atteindre les parties locorégionales, en empruntant les relais lymphatiques, ou enfin, il y a diffusion Fréquence de dissémination de Staphylococcus aureus au sein de la flore commensale de la peau et des muqueuses de l’homme.

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de l’agent infectieux dans tout l’organisme provoquant une infection généralisée [20].

1.4- Epidémiologie et prévention

En pathologie humaine, l’espèce la plus fréquemment isolée est Staphylococcus aureus. Il est retrouvé chez 30 à 50% des sujets sains au niveau des zones de colonisation habituelle [21] (cf. Tableau 1). La principale transmission interhumaine est manu portée expliquant la diffusion sous forme épidémique dans les collectivités (hôpital, crèche, école maternelle) [22].

Le germe est responsable d’infections cutanées (impétigo, furoncle…), d’infections de la sphère ORL (sinusites, otites…), d’infections diverses et d’infections septicémiques redoutables, d’infections nosocomiales, d’intoxinations alimentaires individuelles ou collectives [2, 23]. La grande résistance de Staphylococcus aureus dans le milieu extérieur est à la base de son mode de contamination indirecte, notamment à l’Hôpital (vêtements, literie, matériel médical, air et poussière) [24].

La prophylaxie des infections à S. aureus repose sur les mesures d’antisepsie et d’hygiène au niveau individuel et collectif à savoir : lavage des portes d’entrées cutanées potentielles, lavage des mains, lavage des outils destinés à pénétrer la peau, règles d’isolement d’un patient contaminé par un staphylocoque méti-R à l’hôpital. La détection de la colonisation à S. aureus associée à une décolonisation est de plus en plus préconisée en plus de l’antibioprophylaxie chez les patients devant subir une chirurgie orthopédique ou cardiaque. Par ailleurs, la vaccination staphylococcique anti S. aureus est proposée chez les patients hémodialysés [25].

1.5- Toxines et enzymes 1.5.1- Toxines [2, 24]

S. aureus produit plusieurs toxines ayant pour cible les membranes cellulaires. Ces toxines se fixent à des cellules cibles et provoquent la formation

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de canaux membranaires laissant passer les ions (pore-forming toxins). Elles entraînent des troubles physiologiques à distance du foyer infectieux, par leur activité super antigénique. Ces toxines entraînent une activation polyclonale des lymphocytes T indépendamment de leur spécificité antigénique. La libération massive de cytokines, la sensibilisation des monocytes aux endotoxines et les lésions de l’endothélium sont à l’origine des chocs staphylococciques (fièvre, hémorragie, hypotension).

1.5.1.1- Hémolysines ou staphylolysines Elles sont au nombre de quatre (04) :

 Alpha-hémolysine ou alpha toxine staphylococcique

C’est une exotoxine protéique thermostable et antigénique induisant la formation d’anticorps neutralisants. Elle est inactivée à 60°C et réactivée à 100°C. Synthétisée par 80 à 90% des souches pathogènes, elle est cytotoxique et cytolytique pour une grande variété de types cellulaires et agit sur de nombreuses membranes cellulaires telles que celles des érythrocytes, des leucocytes, des plaquettes et des fibroblastes. Elle est dotée d'un pouvoir nécrotique important sur le derme lorsqu'elle est injectée par voie sous cutanée [10].

 Bêta-hémolysine

Elle est thermolabile synthétisée par 54% de souches humaines. Elle agit comme une sphingomyélinase de type C et donne une hémolyse accrue en présence de souches de Streptococcus agalactiae sur un grand nombre de cellules [26].

 Gamma-hémolysine

Elle est antigénique et le cholestérol inhibe son action. Elle comporte deux facteurs I et II agissant en synergie [21].

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2013-2014

 Delta-hémolysine

Elle contient beaucoup d’aminoacides thermostables et hydrophobes. Elle est faiblement antigénique. Elle agit comme un détergent sur les membranes biologiques et inhibe l'absorption de l'eau, la respiration mitochondriale, la phosphorylation et la production d'acide adénosine mono phosphorique cyclique (AMPc). Elle semble ainsi jouer un rôle dans les diarrhées aiguës des infections à Staphylococcus aureus. Elle est active notamment sur les érythrocytes de l’homme et de certains animaux, les macrophages et les granulocytes [27].

1.5.1.2- Leucocidines

Les leucocidines sont très spécifiques des polynucléaires neutrophiles et des macrophages de l’homme et du lapin. On distingue plusieurs leucocidines dont la plus importante est la leucocidine de Panton et Valentine (LPV). En effet, la LPV est la plus retrouvée dans les cas de furoncles. Elle semblerait être un facteur de gravité des infections de la peau et des muqueuses et impliquée dans des affections telles que les abcès cutanés ou les fascistes nécrosantes. Son rôle a été mis en évidence dans des infections ostéo-articulaires sévères et dans de graves pneumonies nécrosantes mortelles [2]. La LPV crée un pore dans les membranes des cellules. Ce pore conduit à des fuites d’ions, à des relargages de cytokines et au final à la mort de la cellule [26]. Elle est produite à partir du matériel génétique d'un bactériophage [21, 23].

1.5.1.3. Exfoliatine ou épidermolysine

Les exfoliatines sont des métalloprotéines à l’action épidermolytique qui regroupent deux types: A et B [28]. Le gène codant pour l’épidermolysine A est porté par un bactériophage, tandis que celui de l’épidermolysine B est à transmission plasmidique [29]. Elles sont également responsables d’un décollement intra-épidermique entre le startum granulosum et le stratum spinosum qui se traduit cliniquement par des lésions bulleuses [30]. De plus,

(34)

elles sont surtout responsables du syndrome d’exfoliation généralisée (syndrome de peau ébouillantée chez l’enfant ou syndrome de Ritter chez le nouveau-né).

Une forme mineure d’expression de ces exfoliatines est l’impétigo bulleux localisé [31].

1.5.1.4- Entérotoxines.

Ce sont des protéines thermostables et résistantes aux protéases intestinales qui comportent plusieurs types antigéniques (A à E et G à R). Elles sont impliquées dans les intoxications alimentaires : le choc toxique staphylococcique et la scarlatine staphylococcique [2, 10]

1.5.1.5- Toxine du Syndrome du Choc Toxique Staphylococcique (SCTS) Cette toxine fortement protéolytique est peu ou pas hémolytique, pyrogène et létale [9]. Cette toxine est impliquée dans le choc toxique staphylococcique, la scarlatine staphylococcique et le NTED (Neonatal toxic shock syndrome- like exanthematous disease). C’est un super antigène qui entraîne l'activation simultanée de plusieurs sous-populations lymphocytaires, ce qui entraîne la libération de plusieurs médiateurs responsables du choc staphylococcique [21].

1.5.2- Enzymes

1.5.2.1- Staphylocoagulase libre ou coagulase libre

La staphylocoagulase libre est le produit d’un gène (Coa). Ce gène induit la production d’une protéine extracellulaire et non d’une enzyme. Elle fait partie des SERAM (Secretable Expanded Repertoire Adhesive Molecules) qui sont des nouvelles adhésines [27]. La coagulase est une protéine de 60kDa qui se fixe avec la prothrombine sur un site de liaison situé en N-terminal. Elle forme avec la prothrombine un complexe nommé staphylothrombine. Le complexe ainsi formé amène alors à la polymérisation du fibrinogène en fibrine et au final à la formation d’un caillot qui protège les cocci de la phagocytose [10, 31].

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2013-2014

L’identification de S. aureus au laboratoire repose le plus souvent sur la mise en évidence de cette enzyme [5].

1.5.2.2- Staphylokinase (SAK)

La staphylokinase (SAK) est une glycoprotéine de 136 acides aminés sécrétés par certaines souches de S. aureus [32]. Elle facilite l’activation des plasminogènes, les précurseurs de la protéase fibrinolytique plasmine [33]. Elle forme avec le plasminogène un complexe qui converti ainsi en plasmine active d’autres molécules de plasminogène. Dans le plasma, cette enzyme peut dissoudre des amas de fibrine sans pour autant y associer une dégradation du fibrinogène [34]. Cette substance thermolabile est antigénique et joue un rôle dans la formation d’embolies septiques [9]. Elle joue aussi le rôle de la neutralisation des IgG et du fragment C3b du complément évitant ainsi la phagocytose [35] ou elle se fixe aux peptides bactéricides (α-defensines) des neutrophiles pour empêcher leurs propriétés défensives [36].

1.5.2.3- Catalase

C’est une enzyme qui inhibe la bactéricidie intra leucocytaire en empêchant la formation, par les globules blancs, de radicaux oxygénés toxiques pour la bactérie. Elle dégrade le peroxyde d’hydrogène et peut protéger le microorganisme de la phagocytose [8].

1.5.2.4- Lipases

L’une des façons par laquelle l’organisme répond à une infection est la production des acides gras et des lipides, qui forment des petits trous dans la membrane bactérienne, alors que S. aureus produit des enzymes appelées lipases qui détruisent ces acides gras avant de causer des dommages au niveau de la membrane bactérienne [37].

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1.5.2.5- Hyaluronidase

Cette enzyme dépolymérise la substance fondamentale, l’acide hyaluronique, du tissu conjonctif favorisant ainsi la dissémination bactérienne dans les tissus [38]. Cette enzyme est produite uniquement dans la phase exponentielle de croissance [39].

1.5.2.6- Désoxyribonucléase ou DNAse

La DNAse est une enzyme de catalyse des acides désoxyribonucléiques en polynucléotides et nucléotides. Elle est un facteur de destruction des noyaux cellulaires. La mise en évidence chez Staphylococcus d’une DNAse thermostable suffit à l’identification de l’espèce aureus[40].

1.5.2.7- Lysozymes

Staphylococcus aureus produit un lysozyme capable de lyser la paroi de cellules bactériennes [10].

1.5.2.8- Bêta-lactamase

La β-lactamase est une enzyme inductible codée par le gène bla Z porté par un plasmide [41]. Elle est une enzyme inactivant l’antibiotique par ouverture du cycle bêtalactame. La bêtalactamase du staphylocoque est une pénicillinase qui induit une résistance aux pénicillines G et A (Ampicilline, Amoxicilline), aux carboxypénicillines (Ticarcilline) et aux acyluréidopénicillines (Mezlocilline, Azlocilline et Pipéracilline) [4].

1.6- Infections staphylococciques 1.6.1- Infections suppuratives localisées

Elles regroupent les infections atteignant les muqueuses, la peau ou les régions sous-cutanées. Les principales staphylococcies cutanées focales sont la folliculite, l’anthrax, le furoncle, le sycosis, le panaris, l’impétigo, l’abcès, les cellulites, les lymphangites. Toutes les atteintes cutanées comme une plaie

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2013-2014

traumatique ou chirurgicale, une brûlure, une ulcération sont des facteurs favorisants ces types d’infection. Certaines formes superficielles peuvent se compliquer de lésions bulleuses graves lorsque la souche de staphylocoque est productrice d’exfoliatine. Par ailleurs comme infections de la sphère ORL nous pouvons citer les sinusites, les otites et les mastoïdites [21].

D’autres types d’infections atteignant les nouveau-nés ont été répertoriés. Il s’agit du pemphigus épidermique qui est une dermatose bulleuse, très contagieuse, auto-innoculable, évoluant en petites épidémies et de la panniculite aigüe nécrosante qui n’est rien d’autre qu’une nécrose cutanée extensive sous forme d’un placard rouge et induré, débutant souvent au niveau du tronc et d’évolution sévère [21, 42].

1.6.2- Infections profondes

L’origine des infections profondes est soit une extension directe d’une infection superficielle, soit une diffusion sanguine du germe avec septicémie. On trouve comme infections profondes : les ostéomyélites, les arthrites, les méningites, les abcès cérébraux, les endocardites infectieuses, les staphylococcies pleuropulmonaires et les staphylococcies maligne de la face [25].

1.6.3- Toxi-infections

1.6.3.1- Entérocolites staphylococciques

Elles surviennent après l’ingestion d’aliments contaminés par des staphylocoques dorés ayant sécrété des entérotoxines thermostables. En général l’incubation est d’environ 3 heures après le repas. Le malade est apyrétique et présente d’abord des vomissements, des douleurs abdominales, des diarrhées, avec parfois une défaillance cardio-vasculaire pouvant aller jusqu’au collapsus [3, 10].

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1.6.3.2- Syndrome de choc toxique staphylococcique (TSS : Toxic Shock Syndrome)

Ce syndrome est dû à l’entérotoxine TSST-1. On retrouve notamment une fièvre en plateau supérieure à 39°C, une hypotension, une érythrodermie scarlatiforme généralisée ou palmoplantaire et des atteintes viscérales comme une atteinte rénale, hépatique, digestive ou encore neurologique.

Il existe sous une forme dite complète, sous une forme dite incomplète et sous une forme dite syndromes scarlatins staphylococciques. Cette dernière forme constitue une forme mineure du TSS [10].

1.7- Caractères d’identification bactériologique 1.7.1- Caractères morphologiques

Les staphylocoques sont des cocci à Gram positif de taille variable : 0,5 à 1,5 micromètre. Ils sont très souvent groupés en amas, mais on les rencontre également sous forme de diplocoques, de tétrades ou de courtes chaînettes. Ils sont immobiles, non sporulés, ne possèdent pas de capsule visible au microscope optique [10, 16].

Figure 1: Aspect de S. aureus après coloration de Gram [43]

(39)

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1.7.2- Caractères culturaux

Staphylococcus aureus est une bactérie non exigeante. Il se cultive facilement sur les milieux ordinaires en aérobie comme en anaérobie en formant, sur milieux solides, des colonies lisses, luisantes et bombées, plus ou moins pigmentées en jaune or d’où l’appellation Staphylococcus aureus ou staphylocoque doré. En milieu liquide, il produit, dans le bouillon, un trouble homogène. Si les conditions idéales de croissance sont une température de 37°C et un pH de 7,5, de grandes variations sont tolérées. Il est même capable de se multiplier dans des conditions hostiles par exemple en présence de 7g pour cent de NaCl. Ce caractère est mis à profit dans le milieu de culture sélectif hypersalé de Chapman pour isoler le staphylocoque d’un prélèvement polymicrobien [21]. Ce milieu favorise une pousse abondante de S. aureus en 24 heures à 48 heures. Les colonies sont souvent pigmentées entourées d’une auréole jaune car le germe fermente le mannitol. La pousse sur milieu de Chapman ne constitue qu’une indication. D’autres germes (entérocoques, Proteus) peuvent y cultiver. Sur milieu gélosé additionné de 5% de sang de mouton, le germe peut être hémolytique [6, 16].

1.7.3. Caractères biochimiques

Staphylococcus aureus est une bactérie aéro-anaérobie facultatif. Il possède une catalase et est capable de fermenter le glucose. Il fermente habituellement le mannitol utilisé dans le milieu Chapman. Cette fermentation se traduit par le virage au jaune du milieu de culture. Ce caractère est souvent, mais pas obligatoirement, associé à la pathogénicité de la souche [4] étant donné que d’autre souche comme S. saprophyticus et autres fermentent bien le mannitol. L’espèce S. aureus doit alors être différenciée des staphylocoques fermentant ce sucre. Contrairement aux autres Staphylocoques, S. aureus en plus d’être sensible à la novobiocine 5µg, produit presque toujours à la fois une

(40)

catalase, une staphylocoagulase libre, une thermonucléase. Les deux dernières sont le plus souvent utilisées en association ou non pour son identification.

1.8- Traitement

La mise en route du traitement d’une infection par S. aureus doit être fonction de la (ou les) localisation(s) de l’infection, de sa gravité avérée ou potentielle et surtout de l’antibiogramme [25]. En effet, le caractère ubiquiste et pathogène de S. aureus, et de sa résistance de plus en plus étendue à plusieurs antibiotiques dont la pénicilline, l’oxacilline, le triméthoprim + sulfaméthoxazol et la vancomycine [2] font de lui un germe dont la surveillance devra être rigoureuse.

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2- MATERIEL & METHODES

(42)

2.1- Cadre d’étude

Nos travaux de recherche se sont déroulés du 02 juin au 11 Septembre 2014 et ont eu pour principaux cadres :

 le Centre Hospitalier Départemental de l’Ouémé-Plateau (CHD-OP) et,

 le laboratoire de bactériologie de l’option Analyse Biomédicales (ABM) du département des Analyses Biomédicales de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC), ex-Collège Polytechnique d’Abomey-Calavi (CPU).

2.1.1- Ecole Polytechnique d’Abomey-calavi (EPAC)

L’EPAC, ex-CPU est créée en 1977 grâce à la coopération bénino- canadienne. Sur le plan pédagogique, l’EPAC comporte deux secteurs de formation :

 le secteur biologique qui regroupe cinq départements que sont :

 Analyses Biomédicales

 Imagerie Médicale

 Production et Santé Animales

 Génie de l’Environnement

 Génie de la Technologie Alimentaire

 le secteur industriel qui est constitué des départements tels que :

 Génie Civil

 Génie Electrique

 Génie Informatique et Télécommunication

 Génie Industriel

 Génie Mécanique et Energétique.

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L’EPAC, en sa qualité de grande école, est une institution de marque pour la formation en technologie en République du Bénin. Elle a aussi pour mission essentielle d’assurer les formations conduisant au diplôme d’ingénieur d’Etat ou ingénieur de conception en cinq années de formation, à la formation professionnelle après trois années d’étude.

Le laboratoire de bactériologie de la filière Analyses Biomédicales qui nous a servi de cadre d’étude est situé au ré-de chaussée du bâtiment C (C- 1395).

2.1.2- Centre Hospitalier Départemental de l’Ouéme-Plateau (CHD-OP) Il se dresse à la fin de la rue qui passe devant le siège de l’Assemblée Nationale, la place Bayol et la Maison Internationale de la Culture.

2.1.2.1- Organisation du CHD-OP

Ce centre comporte plusieurs services à savoir :

 le service des affaires administratives et financières ;

 le service des affaires économiques ;

 le service de la maternité ;

 le service de la pédiatrie ;

 le service de la néonatologie ;

 le service de chirurgie et des urgences ;

 le service de Stomatologie ;

 le service d’Oto-Rhino-Laryngologie (ORL) et d’Ophtalmologie ;

 le service d’anesthésie-réanimation ;

 le service de pharmacie ;

 le service de rééducation fonctionnelle ;

 le service social ;

 le bloc opératoire ;

(44)

 le service de radiologie ;

 la morgue ;

 la cantine ;

 le service de laboratoire d’analyses biomédicales.

2.1.2.2- Organisation du laboratoire du CHD-OP Ce service comporte les sections suivantes : 2.1.2.2.1- Biochimie

Dans cette section, les examens sont réalisés sur le plasma ou sur le sérum et visent à doser les différents paramètres du sang. On assiste ainsi, dans cette section, aux examens suivants:

 la glycémie ;

 l’urémie ou azotémie ;

 la créatininémie ;

 l’uricémie ;

 le dosage des transaminases ;

 le dosage du cholestérol total, HDL (high density lipoprotein) et LDL (low density lipoprotein) ;

 le dosage de la bilirubine (total et conjuguée) ;

 la calcémie ;

 la magnésémie ;

 le dosage des triglycérides ;

 le dosage de gamma-GT (glutamyl transferase) ;

 le dosage de la phosphatase alcaline ;

 le dosage de l’alpha amylase ;

 la protidémie ;

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2013-2014

 l’ionogramme ;

 l’électrophorèse de l’hémoglobine.

2.1.2.2.2- Hématologie

Dans cette section, les examens sont réalisés sur le sang total et sur le sérum. Les examens suivants y sont pratiqués :

 la numération formule sanguine ;

 la vitesse de sédimentation ;

 la numération des réticulocytes ;

 le temps de saignement ;

 le temps de coagulation ;

 le test d’Emmel 2.1.2.2.3- Sérologie

Dans cette section sont réalisés, le contrôle et la surveillance des maladies à potentiel épidémique ainsi que les examens de routine à savoir :

 sérodiagnostic de Widal et Félix ;

 sérodiagnostic de la syphilis ;

 l’électrophorèse de l’hémoglobine ;

 dosage de l’anticorps antistreptolysine O ;

 recherche de l’antigène du virus de l’hépatite B ;

 recherche de l’anticorps du virus de l’hépatite C.

2.1.2.2.4- Bactériologie

C’est dans cette section que notre travail s’est déroulé. Comme la section de la sérologie, elle a pour rôle d’assurer le contrôle et la surveillance des

(46)

maladies à potentiel épidémique. En outre, les examens de routine suivants y sont réalisés :

 examen cytobactériologique des urines avec antibiogramme ;

 examen cytobactériologique des sécrétions cervico-vaginales avec antibiogramme ;

 examen cytobactériologique des sécrétions urétrales avec antibiogramme ;

 examen bactériologique des pus et sérosités avec antibiogramme ;

 spermoculture avec antibiogramme ;

 coproculture avec antibiogramme ;

 spermogramme.

Les activités au laboratoire débutent par les prélèvements qui se font de 8heures à 10heures pour la permanence. Les analyses commencent à 10heures et se poursuivent jusqu’à 15heures. Après 10heures, le laboratoire continue à recevoir les prélèvements d’urgence des personnes hospitalisées. A partir de 15heures jusqu’au lendemain à 8heures, la garde est assurée par un technicien ayant pour tâche essentielle d’effectuer les travaux d’urgences. Le laboratoire travaille donc 24heures sur 24.

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2.2- Matériel

Il regroupe le matériel de laboratoire et le matériel biologique.

2.2.1- Matériel de laboratoire 2.2.1.1- Equipement

Nous avons utilisé :

 Etuve à 37°C (Memmert model 100): pour mettre nos souches à une température de croissance

 Poupinel (Gallenkamp) : pour stériliser nos tubes a hémolyse pour les manipulations

 Réfrigérateur (Westpoint PR133) : pour conserver les réactifs et milieux de culture

 Balance (Kern ALJ 220-4) : pour peser les milieux de culture avant préparation.

 Autoclave : pour stériliser les milieux de culture

 Gaz + Bec bunsen : pour créer un environnement de manipulation sain

 Anse de platine : pour ensemencer les milieux de culture

2.2.1.2- Milieux de culture, réactifs et consommables

 Gélose Chapman : pour isoler les staphylocoques

 Gélose DNA : pour évaluer l’activité thermonucléase des souches

 Bouillon Cœur Cervelle : pour ensemencer les souches afin de disposer de bouillon pour la recherche de la staphylocoagulase libre

 Bleu de toluidine 1% : pour la mise en évidence de la production de DNAse

 Plasma lyophilisé de lapin + diluant du plasma lyophilisé (oxalate de sodium) : pour la recherche de la staphylocoagulase libre

(48)

 Plasma humain frais : pour la recherche de la staphylocoagulase libre

 Eau oxygénée: pour le test de la catalase

 Réactif pour la coloration de Gram (Violet de gentiane, lugol, Alcool, Fuchsine)

Nous avons enfin utilisés quelques consommables. Il s’agit de :

 Boîtes de Pétri

 Lames : pour les différents examens directs (état frais et état coloré)

 Seringues stériles : pour prélever les différents liquides stériles

 Tubes à hémolyses : pour les différents tests en tube

2.2.2- Matériel biologique Le travail a porté sur :

- Quarante-cinq (45) souches bactériennes provenant de divers laboratoires (Laboratoire National, laboratoire du CHD-OP, Laboratoire de l’HOMEL) et d’écouvillonnage des narines d’étudiants ;

- une (01) souche de référence Stapylococcus aureus ATCC 25923 fournie par le Laboratoire national pour le contrôle ;

- plasma de lapin lyophilisé commercialisé (Rabbit plasma 56352, BIO- RAD) ;

- plasma humain de sujets non soumis à un traitement antibiotique, prélevé par ponction veineuse en tubes (EDTA K3, fluorure de Na) et ;

- plasma humain de sujets soumis à un traitement d’antibiotique (Ciprofloxacine et Azithromycine 500) prélevé également dans les mêmes conditions.

- plasma frais de lapin (PFL) traité pour la circonstance par les mêmes antibiotiques que l’homme.

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Nota Bene : les échantillons humains utilisés ont été préalablement analysés (HIV et AgHBs négatifs) avant leur implication dans les tests et les lapins prélevés ont été acclimatés sept jours à l’animalerie du LARBA avant d’être prélevés.

2.3- Méthodes

2.3.1- Phase pré-analytique

2.3.1.1- Préparation des milieux de culture

Nous avons préparé les géloses Chapman, DNAse et les bouillons Cœur- cervelle (BCC) suivant les consignes des fabricants (Annexe 1).

2.3.1.2- Confirmation des souches

Chacune des souches bactériennes reçues et les prélèvements de fosses nasales effectués chez les étudiants ont été ensemencés sur la gélose Chapman et incubée à 37^oC pendant 24 heures afin de disposer de souches jeunes. Sur les colonies mannitol positif obtenues après 24 heures, nous avons faire un étalement mince, coloré suivant la technique de Gram (Annexe 2) et recherché la catalase. Nous avons enfin recherché pour chacune des souches, la production de la DNAse suivant la méthode décrite par Allay et al. [44] et de la staphylocoagulase libre suivant la méthode de Bankolé et al. [22].

- Recherche de la DNAse

Nous avons ensemencé la gélose DNAse par spot à l’aide d’une anse de platine chargée d’une fraction de colonie prélevée de la gélose Chapman. Après 24 heures de culture, nous avons recouvert la gélose d’une solution de bleu de Toluidine à 1%. Après 3 à 5 minutes, on note :

o Autour des souches DNAse positive un halo rosâtre alors que le reste du milieu est bleu et

o Pour les souches DNAse négative, il n’y a pas d’halo rose.

(50)

Figure n°1 : Résultat de la recherche de la DNAse - Recherche de la staphylocoagulase libre

Dans un tube en verre stérile, nous avons mélangé 0,5 ml de BCC ensemencé de chacune des souches de Staphylocoque à tester à 0,2 mL de plasma de lapin reconstitué suivant les prescriptions du fabricant.

- dans les tubes contenant des souches productrices de la coagulase libre (coagulase positive) il se forme un coagulum visible après 24 heures à 37°C à l’étuve et,

- dans les tubes ne contenant pas de Staphylococcus aureus, il n’y a pas de coagulum visible.

NB : Un caillot moins compact, visible avant la 24^éme heure doit être considéré comme positif ; car il peut être suivi de redissolution provoquée par la fibrinolysine entraînant une fausse réaction négative [22].

DNAse

positive DNAse

négative

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Test positif (Présence de coagulum)

Test négatif (Pas de coagulum)

Figure n°2 : Résultats de la recherche de la staphylocoagulase libre 2.3.2- Phase analytique

2.3.2.1- Recherche de la staphylocoagulase libre avec du plasma humain de sujet non traité prélevé sur tube EDTA. K₃ et tube Fluorure de Na

Nous avons recherché la staphylocoagulase libre par deux (02) techniques différentes avec le plasma humain de sujet non traité : la technique normale et celle utilisant des colonies de 24heures utilisée dans la plupart des laboratoires.

Coagulum

(52)

2.3.2.1.1- Technique normale [6, 16]

Nous avons mélangé dans un tube sec stérile 0,5 mL de BCC ensemencé de Staphylococcus aureus et 0,5 mL de plasma humain de sujet non traité prélevé sur tube EDTA. K3 et tube Fluorure de Na.

2.3.2.1.2- Technique utilisant les colonies jeunes de 24 heures

Nous avons émulsionné à l’aide d’une anse de platine deux colonies de Staphylococcus aureus prélevées d’une culture jeune de 24 heures à 0,5 mL de plasma humain sans antibiotique prélevé sur EDTA K3 et tube Fluorure de Na contenu dans un tube à hémolyse. Le mélange obtenu a été incubé à l’étuve à 37°C.

Nous avons effectué la lecture des réactions toutes les deux (02) heures pendant les 6 premières heures et 24 heures après. La réaction positive se traduit par la prise en masse du mélange au point que le tube peut être retourné. Un caillot moins compact, visible avant la 24^éme heure doit être considéré comme positif.

2.3.2.2- Recherche de la staphylocoagulase libre avec du plasma humain de sujet traité avec antibiotique prélevé sur tube EDTA et tube Fluorure de Na

Ici, nous avons utilisé du plasma humain de malade sous traitement antibiotique. Nous avons recherché dans les mêmes conditions que pour le plasma humain de sujet non traité, la staphylocoagulase.

Dans un but comparatif, le test avec du plasma frais de lapin traité dans les mêmes conditions que le plasma humain a été réalisé.

Notons que pour chaque expérimentation, les résultats ont été notés pour chaque souche testée et les proportions de positives et de négatives aux tests ont été calculées par la formule :

(53)

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a) % Coag (+) = et,

b) % Coag (-) = 100% - % Coag (+) 2.4- Traitement des données

Les résultats ont été saisis dans le tableur Excel 2010. Les différentes proportions de résultats positifs et négatifs ont été calculées et les rapports entre les différents tests ont été comparés entre eux.

Total (Tests positifs à la Coagulase) Total (Tests positifs effectués)

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3- RESULTATS ET COMMENTAIRE

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3.1- RESULTATS

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3.1.1- Résultat d’identification des souches de Staphylococcus aureus à testées

3.1.1.1- Résultats de la DNAse

Tableau II : Répartition des souches bactériennes en fonction des résultats de la DNAse.

Résultats

Souches

Effectif Pourcentage (%) ATCC 25923

Positif 39 75 1

Négatif 13 25 0

Total 52 100 1

Le tableau II présente les résultats de la recherche de la production de la thermonucléase par les souches cocci Gram positif et Catalase positif. Il en ressort que trente-neuf (39) sur les cinquante-deux (52) souches testées soit 75%

produisent une thermonucléase.

3.1.1.2- Résultats de la recherche de la Staphylocoagulase

Tableau III : Répartition des souches bactériennes en fonction des résultats de la recherche de la staphylocoagulase libre avec du plasma lyophilisé de lapin

Résultats

Souches

Effectif Pourcentage (%) ATCC 25923

Positif 45 86,53 1

Négatif 07 13,47 0

Total 52 100 1

Le tableau III montre que sur les cinquante-deux souches testées, nous avons quarante-cinq (45) soit 86,53% qui sont Staphylococcus aureus.

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3.1.2- Résultats des tests avec du plasma frais de sujets non traité prélevés sur EDTA. K3 et du Fluorure de Na

3.1.2.1- Résultats des tests effectués avec du bouillon de 24 heures

Tableau IV : Répartition des résultats obtenus avec du bouillon de 24 heures Effectifs (Pourcentages)

Tube EDTA K₃ Tube Fluorure de Na

ATCC 25923

Positifs 27 (60%) 36 (80%) 1

Négatifs 18 (40%) 9 (20%) 0

Total 45 (100%) 45 (100%) 1

Nous avons constaté d’une part que sur les 45 souches ayant donné un résultat positif avec du plasma lyophylisé de lapin (PLL), seulement vingt-sept (soit 60% pour le plasma humain – EDTA.K3) et 36 (soit 80% pour le plasma humain- Fluorure de Na) environs ont coagulé le plasma humain et d’autre part que le plasma humain- Fluorure de Na est plus sensible à la staphylocoagulase que le plasma humain- EDTA.K₃.

3.1.2.2- Résultats des tests effectués avec les colonies de 24 heures Tableau V : Répartition des résultats obtenus avec les colonies de 24 heures

Effectifs (Pourcentages) Tube EDTA K₃ Tube Fluorure

de Na

ATCC 25923

Positifs 17 (37,77%) 31 (68,88%) 1

Négatifs 28 (62,23%) 14 (31,12%) 0

Total 45 (100%) 45 (100%) 1

(58)

Nous avons remarqué que seulement le tiers soit 17/45 des souches de Staphylococcus aureus ont donné un test positif avec le plasma humain prélevé sur tube EDTA. K3 alors qu’avec le plasma humain prélevé sur tube fluoré, nous avons obtenu près du double de la proportion obtenue avec le plasma EDTA. K3

(31/45).

Le plasma humain obtenu du sang prélevé sur du fluorure de Na est donc plus sensible (environs 1,33 fois avec le bouillon de 24h contre 1,82 fois avec les colonies) à la staphylocoagulase que le plasma obtenu d’un prélèvement fait sur l’EDTA.K₃. De plus, le résultat des tests est optimal (1,58 fois environs avec EDTA.K3 et 1,16 fois environs avec Fluorure de Na) lorsque le test est réalisé avec le bouillon de 24 qu’avec les colonies. Enfin, les coagulums obtenus (Figure 3) en utilisant le plasma humain prélevé sur EDTA.K3 et celui prélevé sur fluorure de Na n’ont pas les mêmes consistances.

Figure 3 : Aspect des coagulums obtenus avec les plasmas humains (A) et du plasma lyophilisé de lapin (B)

Tube Fluorure de Na

Tube EDTA. K₃ A

B

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2013-2014

3.1.3- Résultats des tests avec du plasma frais de sujets traité prélevés sur EDTA. K3 et du Fluorure de Na

3.1.3.1- Résultats des tests effectués avec du bouillon de 24 heures

Tableau VI : Répartition des résultats obtenus avec du bouillon de 24 heures Effectifs (Pourcentages)

Tube EDTA K₃ Tube Fluorure de Na

ATCC 25923

Positifs 24 (53,33%) 25 (55,55%) 1

Négatifs 21 (46,67%) 20 (44,45%) 0

Total 45 (100%) 45 (100%) 1

De l’analyse du tableau IV, il ressort que les souches de S. aureus en bouillon réagissent de la même manière (24/25) avec le plasma humain de sujet traité prélevé dans les deux types de tubes utilisés.

3.1.3.2- Résultats des tests effectués avec des colonies de 24 heures Tableau VII : Répartition des résultats obtenus avec colonies de 24 heures

Effectifs (Pourcentages) Tube EDTA. K₃ Tube Fluorure

de Na

ATCC 25923

Positifs 05 (11,11%) 08 (17,77%) 1

Négatifs 40 (88,89%) 37 (82,23%) 0

Total 45 (100%) 45 (100%) 1

Nous avons obtenu les plus faibles proportions de résultats positifs (5/45 pour le plasma- EDTA.K3 et 8/45 pour le plasma- Fluorure de Na) avec les tests sur les colonies de 24h (Tableau VII). Aussi, avons-nous remarqué que les colonies de 24h de S. aureus ont exprimé par rapport aux réactions lues au