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2.1- Cadre d’étude
Nos travaux de recherche se sont déroulés du 02 juin au 11 Septembre 2014 et ont eu pour principaux cadres :
le Centre Hospitalier Départemental de l’Ouémé-Plateau (CHD-OP) et,
le laboratoire de bactériologie de l’option Analyse Biomédicales (ABM) du département des Analyses Biomédicales de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC), ex-Collège Polytechnique d’Abomey-Calavi (CPU).
2.1.1- Ecole Polytechnique d’Abomey-calavi (EPAC)
L’EPAC, ex-CPU est créée en 1977 grâce à la coopération bénino-canadienne. Sur le plan pédagogique, l’EPAC comporte deux secteurs de formation :
le secteur biologique qui regroupe cinq départements que sont :
Analyses Biomédicales
Imagerie Médicale
Production et Santé Animales
Génie de l’Environnement
Génie de la Technologie Alimentaire
le secteur industriel qui est constitué des départements tels que :
Génie Civil
Génie Electrique
Génie Informatique et Télécommunication
Génie Industriel
Génie Mécanique et Energétique.
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L’EPAC, en sa qualité de grande école, est une institution de marque pour la formation en technologie en République du Bénin. Elle a aussi pour mission essentielle d’assurer les formations conduisant au diplôme d’ingénieur d’Etat ou ingénieur de conception en cinq années de formation, à la formation professionnelle après trois années d’étude.
Le laboratoire de bactériologie de la filière Analyses Biomédicales qui nous a servi de cadre d’étude est situé au ré-de chaussée du bâtiment C (C-1395).
2.1.2- Centre Hospitalier Départemental de l’Ouéme-Plateau (CHD-OP) Il se dresse à la fin de la rue qui passe devant le siège de l’Assemblée Nationale, la place Bayol et la Maison Internationale de la Culture.
2.1.2.1- Organisation du CHD-OP
Ce centre comporte plusieurs services à savoir :
le service des affaires administratives et financières ;
le service des affaires économiques ;
le service de la maternité ;
le service de la pédiatrie ;
le service de la néonatologie ;
le service de chirurgie et des urgences ;
le service de Stomatologie ;
le service d’Oto-Rhino-Laryngologie (ORL) et d’Ophtalmologie ;
le service d’anesthésie-réanimation ;
le service de pharmacie ;
le service de rééducation fonctionnelle ;
le service social ;
le bloc opératoire ;
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le service de radiologie ;
la morgue ;
la cantine ;
le service de laboratoire d’analyses biomédicales.
2.1.2.2- Organisation du laboratoire du CHD-OP Ce service comporte les sections suivantes : 2.1.2.2.1- Biochimie
Dans cette section, les examens sont réalisés sur le plasma ou sur le sérum et visent à doser les différents paramètres du sang. On assiste ainsi, dans cette
le dosage des transaminases ;
le dosage du cholestérol total, HDL (high density lipoprotein) et LDL (low density lipoprotein) ;
le dosage de la bilirubine (total et conjuguée) ;
la calcémie ;
la magnésémie ;
le dosage des triglycérides ;
le dosage de gamma-GT (glutamyl transferase) ;
le dosage de la phosphatase alcaline ;
le dosage de l’alpha amylase ;
la protidémie ;
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l’ionogramme ;
l’électrophorèse de l’hémoglobine.
2.1.2.2.2- Hématologie
Dans cette section, les examens sont réalisés sur le sang total et sur le sérum. Les examens suivants y sont pratiqués :
la numération formule sanguine ;
la vitesse de sédimentation ;
Dans cette section sont réalisés, le contrôle et la surveillance des maladies à potentiel épidémique ainsi que les examens de routine à savoir :
sérodiagnostic de Widal et Félix ;
sérodiagnostic de la syphilis ;
l’électrophorèse de l’hémoglobine ;
dosage de l’anticorps antistreptolysine O ;
recherche de l’antigène du virus de l’hépatite B ;
recherche de l’anticorps du virus de l’hépatite C.
2.1.2.2.4- Bactériologie
C’est dans cette section que notre travail s’est déroulé. Comme la section de la sérologie, elle a pour rôle d’assurer le contrôle et la surveillance des
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maladies à potentiel épidémique. En outre, les examens de routine suivants y sont réalisés :
examen cytobactériologique des urines avec antibiogramme ;
examen cytobactériologique des sécrétions cervico-vaginales avec antibiogramme ;
examen cytobactériologique des sécrétions urétrales avec antibiogramme ;
examen bactériologique des pus et sérosités avec antibiogramme ;
spermoculture avec antibiogramme ;
coproculture avec antibiogramme ;
spermogramme.
Les activités au laboratoire débutent par les prélèvements qui se font de 8heures à 10heures pour la permanence. Les analyses commencent à 10heures et se poursuivent jusqu’à 15heures. Après 10heures, le laboratoire continue à recevoir les prélèvements d’urgence des personnes hospitalisées. A partir de 15heures jusqu’au lendemain à 8heures, la garde est assurée par un technicien ayant pour tâche essentielle d’effectuer les travaux d’urgences. Le laboratoire travaille donc 24heures sur 24.
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2.2- Matériel
Il regroupe le matériel de laboratoire et le matériel biologique.
2.2.1- Matériel de laboratoire
Réfrigérateur (Westpoint PR133) : pour conserver les réactifs et milieux de culture
Balance (Kern ALJ 220-4) : pour peser les milieux de culture avant préparation.
Autoclave : pour stériliser les milieux de culture
Gaz + Bec bunsen : pour créer un environnement de manipulation sain
Anse de platine : pour ensemencer les milieux de culture
2.2.1.2- Milieux de culture, réactifs et consommables
Gélose Chapman : pour isoler les staphylocoques
Gélose DNA : pour évaluer l’activité thermonucléase des souches
Bouillon Cœur Cervelle : pour ensemencer les souches afin de disposer de bouillon pour la recherche de la staphylocoagulase libre
Bleu de toluidine 1% : pour la mise en évidence de la production de DNAse
Plasma lyophilisé de lapin + diluant du plasma lyophilisé (oxalate de sodium) : pour la recherche de la staphylocoagulase libre
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Plasma humain frais : pour la recherche de la staphylocoagulase libre
Eau oxygénée: pour le test de la catalase
Réactif pour la coloration de Gram (Violet de gentiane, lugol, Alcool, Fuchsine)
Nous avons enfin utilisés quelques consommables. Il s’agit de :
Boîtes de Pétri
Lames : pour les différents examens directs (état frais et état coloré)
Seringues stériles : pour prélever les différents liquides stériles
Tubes à hémolyses : pour les différents tests en tube
2.2.2- Matériel biologique Le travail a porté sur :
- Quarante-cinq (45) souches bactériennes provenant de divers laboratoires (Laboratoire National, laboratoire du CHD-OP, Laboratoire de l’HOMEL) et d’écouvillonnage des narines d’étudiants ;
- une (01) souche de référence Stapylococcus aureus ATCC 25923 fournie par le Laboratoire national pour le contrôle ;
- plasma de lapin lyophilisé commercialisé (Rabbit plasma 56352, BIO-RAD) ;
- plasma humain de sujets non soumis à un traitement antibiotique, prélevé par ponction veineuse en tubes (EDTA K3, fluorure de Na) et ;
- plasma humain de sujets soumis à un traitement d’antibiotique (Ciprofloxacine et Azithromycine 500) prélevé également dans les mêmes conditions.
- plasma frais de lapin (PFL) traité pour la circonstance par les mêmes antibiotiques que l’homme.
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Nota Bene : les échantillons humains utilisés ont été préalablement analysés
2.3.1.1- Préparation des milieux de culture
Nous avons préparé les géloses Chapman, DNAse et les bouillons Cœur- cervelle (BCC) suivant les consignes des fabricants (Annexe 1).
2.3.1.2- Confirmation des souches
Chacune des souches bactériennes reçues et les prélèvements de fosses nasales effectués chez les étudiants ont été ensemencés sur la gélose Chapman et incubée à 37oC pendant 24 heures afin de disposer de souches jeunes. Sur les colonies mannitol positif obtenues après 24 heures, nous avons faire un étalement mince, coloré suivant la technique de Gram (Annexe 2) et recherché la catalase. Nous avons enfin recherché pour chacune des souches, la production de la DNAse suivant la méthode décrite par Allay et al. [44] et de la staphylocoagulase libre suivant la méthode de Bankolé et al. [22].
- Recherche de la DNAse
Nous avons ensemencé la gélose DNAse par spot à l’aide d’une anse de platine chargée d’une fraction de colonie prélevée de la gélose Chapman. Après 24 heures de culture, nous avons recouvert la gélose d’une solution de bleu de Toluidine à 1%. Après 3 à 5 minutes, on note :
o Autour des souches DNAse positive un halo rosâtre alors que le reste du milieu est bleu et
o Pour les souches DNAse négative, il n’y a pas d’halo rose.
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Figure n°1 : Résultat de la recherche de la DNAse - Recherche de la staphylocoagulase libre
Dans un tube en verre stérile, nous avons mélangé 0,5 ml de BCC ensemencé de chacune des souches de Staphylocoque à tester à 0,2 mL de plasma de lapin reconstitué suivant les prescriptions du fabricant.
- dans les tubes contenant des souches productrices de la coagulase libre (coagulase positive) il se forme un coagulum visible après 24 heures à 37°C à l’étuve et,
- dans les tubes ne contenant pas de Staphylococcus aureus, il n’y a pas de coagulum visible.
NB : Un caillot moins compact, visible avant la 24éme heure doit être considéré comme positif ; car il peut être suivi de redissolution provoquée par la fibrinolysine entraînant une fausse réaction négative [22].
DNAse
positive DNAse
négative
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Test positif (Présence de coagulum)
Test négatif (Pas de coagulum)
Figure n°2 : Résultats de la recherche de la staphylocoagulase libre 2.3.2- Phase analytique
2.3.2.1- Recherche de la staphylocoagulase libre avec du plasma humain de sujet non traité prélevé sur tube EDTA. K3 et tube Fluorure de Na
Nous avons recherché la staphylocoagulase libre par deux (02) techniques différentes avec le plasma humain de sujet non traité : la technique normale et celle utilisant des colonies de 24heures utilisée dans la plupart des laboratoires.
Coagulum
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2.3.2.1.1- Technique normale [6, 16]
Nous avons mélangé dans un tube sec stérile 0,5 mL de BCC ensemencé de Staphylococcus aureus et 0,5 mL de plasma humain de sujet non traité prélevé sur tube EDTA. K3 et tube Fluorure de Na.
2.3.2.1.2- Technique utilisant les colonies jeunes de 24 heures
Nous avons émulsionné à l’aide d’une anse de platine deux colonies de Staphylococcus aureus prélevées d’une culture jeune de 24 heures à 0,5 mL de plasma humain sans antibiotique prélevé sur EDTA K3 et tube Fluorure de Na contenu dans un tube à hémolyse. Le mélange obtenu a été incubé à l’étuve à 37°C.
Nous avons effectué la lecture des réactions toutes les deux (02) heures pendant les 6 premières heures et 24 heures après. La réaction positive se traduit par la prise en masse du mélange au point que le tube peut être retourné. Un caillot moins compact, visible avant la 24éme heure doit être considéré comme positif.
2.3.2.2- Recherche de la staphylocoagulase libre avec du plasma humain de sujet traité avec antibiotique prélevé sur tube EDTA et tube Fluorure de Na
Ici, nous avons utilisé du plasma humain de malade sous traitement antibiotique. Nous avons recherché dans les mêmes conditions que pour le plasma humain de sujet non traité, la staphylocoagulase.
Dans un but comparatif, le test avec du plasma frais de lapin traité dans les mêmes conditions que le plasma humain a été réalisé.
Notons que pour chaque expérimentation, les résultats ont été notés pour chaque souche testée et les proportions de positives et de négatives aux tests ont été calculées par la formule :
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a) % Coag (+) = et,
b) % Coag (-) = 100% - % Coag (+) 2.4- Traitement des données
Les résultats ont été saisis dans le tableur Excel 2010. Les différentes proportions de résultats positifs et négatifs ont été calculées et les rapports entre les différents tests ont été comparés entre eux.
Total (Tests positifs à la Coagulase) Total (Tests positifs effectués)
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