ACTA ENDOSCOPICA
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E d i t o r i a l
Nouvelles techniques en histopathologie : qu'entend-on par diagnostic pr6coce
de cancer et diagnostic
de 16sion n6oplasique au d6but ?
L a carcinogen6se ou la n6oplasie constitue un processus ~ 6tapes multiples ass0ci6 des ddficiences de g6nes contr61ant la prolifdration et la mort cellulaire. Au cours de ce processus, il existe de multiples ~tapes de d6veloppement entre les cellules normales et les cellules pr6malignes, le cancer in situ et les mdtastases. Le passage d'une 6tape h l'autre ne parait pas progressif mais d6pend de l'apparition de d6fections gdn6tiques subsdquentes et de la sdlection de clones anormaux. Comme la carcinogen~se implique une prolif6ration anormale, il est 6vident que les d6fections gdn6tiques comprenant la prolif6ration cellulaire et la mort des cellules rev~tent une importance majeure mais s'ajoutent au ddveloppement parall~le d'autres ph6nom~nes. Les cellules provenant d'une activit6 mitotique normale vont croitre, mfirir et au cours du processus de matu- ration, elles vont acqu~rir des caract~res stricts fonctionnels et structurels qui leur per- mettent de fonctionner correctement et de se distinguer d'autres types cellulaires. Ce processus est appel6 la ~< diff6renciation ,,. La carcinogen~se est aussi caractdris6e par des pertes variables de la capacit6 de diff6renciation. Cette derni~re peut progresser vers diffdrentes 6tapes du processus ndoplasique. Le ddveloppement du n6oplasme peut
~tre 6valu6 et diagnostiqu6 par diff~rentes techniques. Au niveau du tractus gastro- intestinal, elles consistent principalement en techniques morphologiques. Celles-ci incluent, au niveau macroscopique, les techniques radiologiques et endoscopiques et, au niveau microscopique, l'utilisation d'6chantillons tissulaires ou de biopsies.
Comme le cancer et spdcialement les cancers du tractus gastro-intestinal constituent une cause importante de ddc~s, de multiples efforts ont 6t6 consacr6s ~ la pr6vention et la thdrapie. La prdvention primaire a pour but l'identification et l'61imination des agents responsables mais ce but n'a pas 6t6 obtenu pour les cancers du tractus digestif. D~s lots, la pr6vention secondaire, c'est-h-dire le diagnostic prdcoce se pr6sente comme l'approche technique la mieux appropri6e.
La prdvention secondaire a pour but l'identification des n6oplasies d6butantes et des cancers au stade pr6coce. La m6thode la plus appropride jusqu'~ pr6sent est l'examen d'@hantillons de tissus obtenus chez les patients ~ risque ou au niveau de l~sions sus- pectes d6couvertes en endoscopic quelle qu'en ait 6t6 l'indication. Les projets de d6pis- tage systdmatique avec des biopsies systdmatiques ne paraissent pas pr6senter actuelle- ment un rapport cofit/b6n6fice acceptable mais l'examen d'6chantillons tissulaires prdlevds chez les patients ~ risque ou non h risque, subissant une endoscopic est certai- nement une approche acceptable.
DIA GNOSTIC PRI~COCE D U CANCER
Le diagnostic prdcoce signifie la mise en 6vidence de 16sions 5 leur d6but, ce qui signifie en d'autres termes h une des ~tapes pr6coces de la carcinogen~se.
L'examen macroscopique, spit radiologique, spit endoscopique, est ~ ce stade une approche diagnostique inad6quate de ces 16sions. L'examen microscopique est actuelle- ment la meilleure technique disponible. Elle est utilis6e dans la d6tection des dysplasies.
La dysplasie constitue une 6tape pr6coce d6tectable par des m6thodes morphologiques grace au microscope optique avec une simple coloration de routine ~ l'hdmatoxyline-
~osine. La dysplasie a 6td d6finie comme une << transformation n6oplasique indiscutable mais non invasive de l'6pith61ium,~. Ceci signifie que les cellules 6pith61iales rdsultent d'une prolifdration ddficiente sans alt6ration de la membrane basale et avec une struc- ture tissulaire encore prdserv6e. L'6tape suivante est le d6passement des limites entre l'6pith61ium et le tissu conjonctif envahi. Cette 6tape est intitul6e <~ transformation maligne ~. L'6tape prd-invasive dolt ~tre consid6rde comme une n6oplasie b6nigne (non invasive et par cons6quent non encore maligne mais avec risque potentiel).
Certaines affections, comme l'cesophage de Barrett et la colite ulc6reuse, sont recon- nues comme des affections ~ risque n~oplasique et peuvent s'exprimer par des 16sions reconnaissables par l'endoscopie. Celle-ci peut observer une muqueuse granuleuse ou des 16sions ldg6rement sur6lev6es, parfois appeldes <~ masses ldsionnelles assocides ~i la dysplasie ,, (MALD) mais celles-ci sont gdn6ralement indicatrices d'un stade plus avanc6 de la dysplasie (dysplasie de haut degr6). En outre, elles exposent ~ un risque accru de cancer invasif concomitant.
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in its medical and surgical applications ; - - experimental studies of endoscopic ins-
trumentations ; - - bibliographical analysis.
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La dysplasie au stade de 16sion pr6coce ne doit pas 6tre confondue avec le cancer pr6coce. Parmi ceux-ci figurent <, le cancer gastrique pr6coce ~ et le <~ cancer pr6coce de l'cesophage ~. Les cancers pr6coces de l'estomac et de l'oesophage sont encore appel6s ,, cancers superficiels ~,. I1 s'agit d6jh de 16sions invasives bien que l'invasion soit limit6e aux couches sup6rieures de la paroi intestinale et sont encore de bon pronostic. Ces cancers pr6coces ne doivent pas ~tre confondus avec le ~ cancer in situ ~ ou le ~ cancer intra-6pith61ial ~, une 16sion qui est une forme extr6me de la dysplasie montrant d'im- portantes anomalies qui sont encore confin6es dans les limites de la membrane basale.
En somme, la dysplasie est l'expression morphologique d'une des 6tapes pr6coce de la carcinogen~se. N6anmoins cette derni~re reste le r6sultat d'une d6fection g6n6tique vraisemblablement ant6rieure. Les d6fections g6n6tiques r6sultent probablement de lacunes dans les produits des g6nes et la plupart du temps il s'agit de structures pro- t6iques.
Dans la mesure o/a l'on d6sire diagnostiquer la transformation n6oplasique h u n stade ant6rieur ~t la dysplasie, il faut s'orienter vers l'identification de la d6fection g6n6- tique elle-m~me ou des r6sultats de celle-ci au niveau des synth6ses prot6iques.
Les nouveaux moyens diagnostiques et modalit6s techniques d6velopp6s ~ cette fin sont h pr6sent devenus applicables en pratique quotidienne. Ces techniques compor- tent l'immunohistochimie, l'hybridation in situ, et la RPC. L'immunohistochimie est destin6e ~ la d6tection d'antig~nes ou de prot6ines. Des anticorps marqu6s sont appli- qu6s sur une coupe tissulaire et se lient h l'antig~ne. Ensuite leur localisation peut ~tre d6cel6e grace aux marqueurs lids h l'anticorps. Cette technique implique une grande vari6t6 d'antig6nes ou de protdines, de constituants cellulaires associ6s/t la diff6rencia- tion ou ~ la perte de diff6renciation. Par exemple ce sont 1'~, antig6ne carcinoembryon- naire ~, dans le cancer colorectal ou d'autres addnocarcinomes et les cytok6ratines.
~ L'hybridation in situ ~ comporte en outre des sondes marqudes in vitro ~ I'ADN ou I'ARN, ensuite hybrid6es in situ ~ un g6ne sp6cifique ou ~ u n mARN versus le chro- mosome correspondant ou un mARN cellulaire dans des sections de tissu. Cette tech- nique permet par cons6quent la d6tection des anomalies 6ventuellement avant la syn- th~se des prot6ines anormales. Ndanmoins, plusieurs d6fections g6n6tiques diff6rentes sont associ6es ~ la carcinogen6se et aux diff6rentes 6tapes du processus. I1 est important de regarder aux 6v6nements prdcoces qui surviennent avant la dysplasie et peuvent ~tre visualis6s en routine afin d'amdliorer une ddtection pr6coce. Ceci est 6galement vrai en immunohistochimie.
Toutefois un probl6me demeure car la carcinogen6se est pr6cis6ment un proces- sus ~t 6tapes multiples et comportant diff6rentes d6fections g6ndtiques. L'ordre de leurs successions n'est pas connu avec pr6cision et n'est certainement pas constant.
Par exemple il semble exister certaines diff6rences dans la s6quence observ6e d'une part dans la carcinogen~se colique de la polyad6nomatose familiale et d'autre part celle observ6e dans la colite ulc6reuse.
Les colorations de routine ?a l'h6matoxyline-6osine, l'immunohistochimie et l'hybri- dation in situ constituent des techniques qui peuvent 6tre et sont couramment utilis6es dans la d6tection des drapes prdcoces de la carcinogen6se, c'est-fi-dire la transformation n6oplasique des cellules 6pith61iales.
En ce qui concerne la transformation maligne des cellules lymphoides et l'6difica- tion prdcoce du lymphome, les techniques de routine et l'immunohistochimie sont compldt6es par la RCP, une technique dont le but est la d6tection pr6coce intertissu- laire de l'existence d'une population monoclonale. La technique de RPC (r6action de polym6risation en cha]ne) comporte trois 6tapes principales. La premi6re 6tape est la d6naturation d'un double brin d'ADN afin de sdparer ses deux bras, ensuite on intro- duit des petits fragments synth6tiques d'ADN, appel6s primaires. Ceux-ci sont fix6s dans certaines positions de I'ADN original. A l'aide d'acides nucl6iques pr6sents dans l'environnement exp6rimental, on peut induire la formation de doublets. Ceux-ci constituent une copie de I'ADN original porteur de deux nouvelles h61ices, chacune d'elles ayant pour moiti6 une composition artificielle. Ce proc6d6 peut ~tre r6p6t6 plu- sieurs fois.
En proc6dant ainsi, m6me de petites quantit6s d'ADN peuvent ~tre d6tect6es dans les tissus. Cette technique est fort sensible. La contamination du tissu par de petits fragments d'ADN exog~ne peut ~tre responsable de rdsultats faussement n6gatifs ou positifs.
C O N C L U S I O N
En conclusion, diff6rentes techniques sont actuellement disponibles et applicables sur des sections de tissu en vue de contribuer au diagnostic pr6coce du cancer. Ces tech- niques sont souvent utilis6es de mani~re combin6e. Elles constituent des moyens adju- vants plut6t que des techniques remplaqant les m6thodes de routine. Leur combinaison e s t certainement indiqu6e dans la d6tection de 16sions tr~s pr6coces, lesquelles sont pathognomoniques et par cons6quent plus difficiles h diagnostiquer.
K. GEBOES Department o f Pathology, K.U.Leuven, Belgium
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Editorial
New techniques in Pathology: what do they mean for the early diagnosis of neoplasia and the diagnosis
of early neoplasia ?
Carcinogenesis or neoplasia is a multistage process associated with defects in genes controlling cell proliferation and cell death.
During this multistep process a transition from normal cells into premalignant cells, in situ cancer, invasive cancer, and metastasis occurs.
The transition from one step to another is apparently not gradual but depends on the occurrence o f subsequent genetic defects, and selection o f abnormal clones. As carcinogenesis implies abnormal proliferation, it is obvious that defects o f genes controlling cell proliferation and death are o f major importance but in addition other phenomena occur in parallel Cells resulting from normal mitotic activity will grow and mature and during this process o f maturation they acquire functional and structural characteristics which enable the cell to function properly and which allow to distinguish between different types o f cells. This process is called ~ differentiation ~.
Carcinogenesis is also characterized by variable loss o f differentiation. The latter may progress with different steps o f the neoplastic process. The development o f neoplasia can be evaluated and diagnosed by different techniques. For the GI tract these are mainly morphologic techniques. They include for the macroscopic level radiological techniques and endoscopy and at the microscopic level the use o f tissue samples or biopsies.
As cancer, and especially cancer o f the gastrointestinal tract is an important cause o f death multiple efforts are devoted towards prevention and curation. Primary prevention aims at the identification and elimination o f the causative agent but this goal is not yet achieved for GI cancer. Hence secundary prevention, by which early diagnosis is meant is the most appropriate technique to be used.
Secundary prevention aims at the identification o f early neoplasia or early cancer. The most appopriate technique available for this purpose is at present the examination o f tissue samples obtained either from patients at risk or from suspect lesions found during endoscopy for whatever indication. Systematic screening projects with systematic biopsies seem at present not cost-effective but examination o f tissue samples taken from patients at risk or not, undergoing endoscopy is certainly feasible.
Early diagnosis o f cancer
Early diagnosis means diagnosis o f early lesions or in other words o f one o f the earlier steps o f carcinogenesis.
Macroscopic examination, either radiology or endoscopy, remains at this stage ineffective for the appropriate diagnosis o f these lesions.
Microscopy is the best technique nowadays available. It is used for the detection o f dysplasia. Dysplasia is the earliest step which is detectable by morphology, with the use o f light microscopy and routine haematoxylin and eosin staining o f routinely processed tissue samples. Dysplasia is defined as an ~ unequivocal, but noninvasive, neoplastic transformation o f the epithelium ~. This means that the epithelial cells are the result o f a deficient proliferation but the basement membrane is still intact and hence the tissular relationship is still preserved. The next step will be invasion when the boundaries between the epithelium and the connective tissue are no longer preserved.
This step is called ,~ malignant transformation ,,. The preinvasive state can be considered as a benign (noninvasive and hence not yet malignant but potentially malignant) neoplasia.
Some diseases such as Barrett's oesophagus and Ulcerative colitis, known to be premalignant conditions may show endoscopically recognizable lesions. These can be a granular mucosa or sligthly elevated raised lesions, sometimes called Dysplasia associated mass lesions (DALM) but these usually show a more advanced stage o f dysplasia (high-grade dysplasia). Furthermore, they have a greater probability o f associated invasive cancer already being present.
Dysplasia as an early neoplastic lesion should not be confused with early cancer. Examples o f the latter are ~ Early gastric cancer ~ and ~ Early oesophageal cancer ~. Early gastric and oesophageal cancer are sometimes also called ~ Superficial cancer ~. These are already in vasive lesions although invasion is limited to the upper layers o f the intestinal wall and hence the prognosis is still good. These early cancers should not be confused with ~ in situ cancer ~ or ~ intraepithelial cancer ~, a lesion which is at the extreme o f dysplasia, showing important abnormalities but being still confined within the boundaries o f the basement membrane.
Dysplasia is thus the morphological expression o f one o f the earliest steps o f carcinogenesis. The latter is however the result o f a genetic defect. So this is likely to occur before. Defects in genes will result in defect o f products o f genes and most o f these products o f genes are proteins.
In order to make a diagnosis o f neoplastic transformation even at an earlier stage than dysplasia it is thus appropriate to look either for the genetic defect itself or for the results o f the genetic defects which are the proteins synthesized.
New diagnostic and technical modalities have been developed for this purpose and can nowadays be applied in daily practice. These techniques include immunohistochemistry, in situ hibrydisation and PCR. Immunohistochemistry is designed to detect antigens or proteins. Labelled antibodies are applied on the tissue section and will bind to the antigen. Subsequently their location can be detected through the label attached to the antibody. This technique is well studied for a variety o f antigens or proteins, cell constituents associated
Acta Endoscopica Volume 27- N ~ 2 - 1997 I I I
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with differentiation or loss o f differentiation. Examples o f these are the 'Carcinoembryonic antigen'for colorectal and other adenocarcinomas and the cytokeratins.
In 'in situ hybridisation' in vitro labelled DNA or RNA probes complementary to a specific gene or mRNA are hybridised ~ in situ ~ to the corresponding chromosome or cellular mRNA in cells or tissue sections. This technique allows thus the detection of abnormalities even before the synthesis o f abnormal proteins. However, as there arc different genetic defects associated with carcinogenesis and with the different steps of the process, it is important to look for the early events occurring even before dysplasia can be visualized routinely in order to improve early detection. The same is true for immunohistochemistry.
This is at present however still a problem as carcinogenesis is a precisely a multistep process involving different genetic defects. The order in which these occur is not yet precisely known and certainly not constant. There seem to be some differences for instance between the sequence observed in colonic carcinogenesis in familial adenomatous polyposis coli and that observed in ulcerative colitis.
Routine H & E staining, immunohistochemistry and in situ hybridisation are techniques which can, and are currently used for the detection o f early steps of carcinogenesis, i.e. neoplastic transformation of epithelial cells.
For malignant transformation of lymphoid cells and the early recognition of lymphoma, routine stainings and immunohistochemistry are completed by PCR, a technique aiming at the early detection of the existence of a monoclonal population in tissue. PCR (polymerase chain reaction) is a technique composed of three major steps. The first step is the denaturation o f the double stranded DNA in order to separate the two strands. Subsequently small synthetic DNA fragments, called primers, are applied. These will fix to certain positions o f the original DNA. With the use o f nucleic acids, present in the experimental environment they will induce the formation of duplicates.
The result is the formation o f copies of the original DNA and two new helices, each one being articifial for half of its composition. This process can be repeated several times.
By doing so, even very small quantities of DNA can be detected in the tissue. The technique is thus highly sensitive but contamination o f the tissue by small fragments of exogenous DNA can be responsible for false negative or positive results.
CONCLUSION
In conclusion it appears that different new techniques are available for application on tissue sections which help for an early diagnosis of cancer. These techniques will often be used in combination with each other. They are adjuvant techniques, rather than techniques replacing older approaches. A combined use is certainly indicated for very early lesions (as these arc the least pathognomonic and hence more difficult to diagnose.
K. GEBOES Department of Pathology, K.U.Leuven, Belgium
IV Volume 27 - N ~ 2 - 1997 Acta Endoscopica
