L’incertitude est un paramètre associé au résultat d’une mesure qui caractérise la dispersion des valeurs pouvant être raisonnablement attribuées au mesurande. Son estimation est donc essentielle dans le cadre de l’interprétation des résultats et, en particulier, de leur comparaison par rapport à des seuils de toxicité ou de pathologie, ou encore par rapport à des limites réglementaires de conformité. C’est pourquoi la norme ISO 17025 impose depuis 2001 aux laboratoires d’essai et notamment à tous les prestataires des services dans le domaine de la santé d’appliquer des procédures pour l’estimation de l’incertitude et de pouvoir, le cas échéant, l’associer aux résultats rendus.
Or à ce jour, la plupart d’entre-eux sont encore incapables de répondre valablement à cette exigence normative. Cette situation résulte à nos yeux de la complexité des approches métrologiques préconisées, de leur mise en œuvre lourdes et fastidieuse dans le cadre d’analyses impliquant de nombreuses sources d’erreurs, des coûts additionnels qu’elles engendrent pour ces laboratoires dans un marché hautement concurrentiel, de la mauvaise connaissance des approches alternatives par ces mêmes laboratoires et, enfin, de l’absence de recommandations claires quant à ces dernières approches.
C’est pourquoi l’objectif principal de notre travail était de réaliser une étude comparative de différentes approches alternatives permettant d’estimer l’incertitude des mesures analytiques sans avoir recours à une étude conventionnelle de type métrologique.
Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux approches basées sur des études inter- laboratoires, de robustesse et sur la validation. Pour ce faire, nous avons sélectionné deux techniques analytiques largement répandues dans le domaine pharmaceutique, à savoir la chromatographie liquide et l’électrophorèse capillaire et nous les avons appliquées à une situation analytique relativement complexe, la détermination d’une impureté chirale.
La première étape de notre travail a donc tout naturellement consisté en la mise au
L’optimisation des conditions de séparation de la méthode de chromatographie liquide a été faite selon une approche multivariée. Un plan expérimental de Box-Behnken a été utilisé pour fixer les points expérimentaux. Il a été construit avec trois facteurs quantitatifs, à savoir les proportions de 2-propanol et de diéthylamine dans la phase mobile et la température de la colonne. Trois temps de rétention différents associés aux pics des cinq composés à séparer (S- timolol, le R-timolol, l’isotimolol, le dimère de timolol et le dimorpholinothiadiazole) ont été sélectionnés comme réponses. Puisque dans la stratégie d’optimisation indirecte qui a été suivie nous avons tenu compte de quatre réponses d’intérêt, la désirabilité globale, qui dans le cas présent est la moyenne géométrique des désirabilités individuelles des réponses d’intérêt sélectionnées, a été utilisée pour déduire les conditions optimales de la CLHP. Les conditions chromatographiques ainsi optimisées nous ont permis non seulement d’obtenir une très bonne séparation des cinq composés (Rs de la paire critique R-timolol / isotimolol > 1,7) mais aussi de quantifier simultanément les autres impuretés présentes dans les échantillons de maléate de S-timolol alors que la monographie de la Pharmacopée européenne requiert l’utilisation de deux techniques séparatives.
En ce qui concerne la méthode d’électrophorèse capillaire, notre choix s’est délibérément orienté vers la technique en milieu non aqueux basée sur l’utilisation de l’heptakis(2,3-di-O-méthyl-6-O-sulfo)-β-cyclodextrine comme sélecteur chiral associée au camphosulfonate au sein d’une solution méthanolique acidifiée. En effet, des résultats très prometteurs avaient été obtenus antérieurement pour les substances médicamenteuses basiques. Lors de l’optimisation, nous nous sommes focalisé sur la sélection de l’étalon interne adéquat, l’évaluation du temps d’injection et le niveau de concentration de l’échantillon permettant de déterminer 0,1 % de R-timolol dans le maléate de S-timolol. Dans les conditions opératoires sélectionnées, nous avons obtenu une énantiorésolution très élevée (Rs = 8,5) ainsi qu’une excellente résolution (Rs = 9,2) entre le S-timolol et la pyridoxine, choisie comme étalon interne.
Les conditions optimales d’analyse pour les deux techniques étant obtenues, nous nous sommes attaché à la validation de leur aptitude à quantifier l’impureté R-timolol dans du maléate de S-timolol. Pour ce faire, nous avons appliqué le concept novateur du profil d’exactitude. Nous avons construit plusieurs profils en tenant compte des niveaux de risques de 5 % ou de 10 % tout en testant différents modèles de régression. A partir de ces profils, le modèle le plus adéquat a été sélectionné. Pour les deux méthodes, le modèle de régression linéaire passant par zéro et utilisant un seul standard de calibration a été trouvé approprié. A partir de ce dernier, les différents critères de validation ont ensuite été estimés. Les performances mesurées sont en parfait accord avec les objectifs des deux méthodes (± 10%) ainsi que l’illustre les intervalles de tolérance obtenus, de -1,5% à 1,5% pour la chromatographie liquide et de -0,45 à 3,2% pour l’électrophorèse capillaire. Signalons encore que le modèle de régression sélectionné est aussi facilement applicable en routine.
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Dans la foulée de la validation, le profil de risque a été investigué pour la première fois comme outil de gestion du risque lié à l’utilisation en routine des procédures analytiques et ce, en vue d’estimer la probabilité d’obtenir des futurs résultats en dehors des limites d’acceptation fixées a priori (10%). Nous avons ainsi pu démontrer que, pour les deux méthodes développées, ce risque était nettement inférieur à 1% au seuil d’impureté fixé par la Pharmacopée européenne (1,0% en R-timolol)
Signalons encore que les deux méthodes ont été appliquées avec succès pour déterminer l’impureté R-timolol ainsi que les autres impuretés dans différents lots de maléate de S-timolol. Aucun lot n’a présenté des impuretés à des teneurs supérieures aux valeurs tolérées par la monographie pour ces impuretés (1,0 % pour le R-timolol et 0,4 % pour les autres impuretés). De plus, les teneurs en R-timolol obtenues au moyen des deux méthodes ont été trouvées significativement non différentes, démontrant ainsi l’équivalence des deux méthodes développées.
Par ailleurs, en utilisant les résultats de la validation, nous avons calculé à partir des profils d’exactitude obtenus pour les deux méthodes l’incertitude associée à chaque niveau de concentration évalué. Nous avons constaté que dans l’intervalle de dosage validé l’incertitude dépend de la concentration en R-timolol.
La troisième partie de notre travail consistait en l’étude de la robustesse des méthodes développées. Nous avons ainsi évalué l’influence des paramètres opératoires de chaque méthode sur les réponses qualitatives et quantitatives. Le choix de ces facteurs a été fait en fonction de l’étude inter-laboratoires qui était envisagée ultérieurement. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux réponses quantitatives qui sont relativement peu abordées dans le cadre de la robustesse. Un plan expérimental de Plackett-Burman a été construit avec 7 facteurs, ce qui a généré 8 conditions expérimentales. Cette étude a tout d’abord été menée sur la méthode de CLHP. Bien que quelques effets significatifs des facteurs opératoires aient été observés sur les critères de performances chromatographiques, nous avons constaté que ces facteurs n’avaient aucune influence significative sur la quantification du R-timolol, démontrant ainsi la robustesse de cette méthode.
En ce qui concerne la méthode d’EC, nous avons observé que les réponses qualitatives, notamment la résolution et le temps de migration, dépendaient fortement du lot d’échantillon de HDMS-β-CD utilisé. Par ailleurs, l’utilisation d’un étalon interne a montré une nette amélioration de la variabilité des temps de migration dans les différentes conditions expérimentales testées, démontrant ainsi l’adéquation de la pyridoxine en tant qu’étalon interne. Malgré les effets de ces facteurs sur les réponses qualitatives, les paires des pics des énantiomères et de S-timolol/pyridoxine restaient toujours suffisamment résolues dans les différentes conditions expérimentales, autorisant toujours la quantification du R-timolol dans les quatre échantillons examinés et démontrant par la même occasion la robustesse de la méthode EC.
Enfin, en utilisant les résultats quantitatifs (teneurs en R-timolol) issus des études de robustesse et en appliquant le guide ISO 5725-2, nous avons estimé l’incertitude de mesure.
Tout comme dans l’approche basée sur la validation, nous avons trouvé qu’elle augmentait avec la concentration en R-timolol et ce, quelque soit la technique analytique concernée. Par ailleurs, les informations recueillies dans la phase de robustesse nous ont été d’une grande utilité pour la préparation de l’étape suivante, c’est-à-dire l’étude inter-laboratoires.
Dans cette dernière partie expérimentale de notre travail, nous nous sommes efforcés d’éprouver les méthodes de chromatographie liquide et d’électrophorèse capillaire dans le cadre d’une plus large échelle d’utilisation. Auparavant, un test préliminaire a été effectué en vue d’examiner la mise en œuvre de ces deux méthodes par les laboratoires participants ainsi que l’adéquation du protocole. Sur la base de ce test préliminaire, nous avons mené les études collaboratives en chromatographie liquide et en électrophorèse capillaire, en suivant le guide ISO 5725-2. Pour chaque méthode, 8 laboratoires ont pu fournir des résultats qui ont été exploités pour déterminer la reproductibilité. L’incertitude de résultats a aussi été estimée.
Comme pour la validation et la robustesse, nous avons trouvé que l’incertitude augmentait avec la concentration en R-timolol quelle que soit la technique analytique utilisée. Il convient de souligner que c’est la première fois qu’une telle étude est menée avec succès en électrophorèse capillaire.
Au terme de ces trois études, validation, robustesse et inter-laboratoires, nous avons entrepris la comparaison des incertitudes obtenues pour chacune d’elles et ce, pour les deux méthodes. Ces trois études pouvaient être comparées puisque les mêmes échantillons de S- timolol contenant du R-timolol avaient été analysés avec chaque procédure analytique. Dans les trois études, les principales composantes de la variance ont été estimées, notamment la fidélité intermédiaire obtenue en validation, en robustesse et en inter-laboratoire ainsi que la
Que ce soit en chromatographie liquide ou en électrophorèse capillaire, il apparaît que l’incertitude obtenue lors de l’évaluation de la robustesse prédit très bien celle obtenue lors de l’étude inter-laboratoires. Cette prédiction est néanmoins moins bonne lorsque la variabilité intrinsèque à la technique est plus grande comme cela a été observé avec la méthode d’EC. Il n’en reste pas moins que l’étude de robustesse constitue une alternative intéressante à l’étude inter-laboratoires. En revanche, l’incertitude associée à la validation est significativement différente de celle des deux autres approches évaluées. Signalons toutefois que dans le cadre des études de validation, seul l’effet « jour » a été investigué. L’absence des autres sources de variation raisonnablement attendues en routine, tels que les effets « opérateur » et
« équipement » peut vraisemblablement expliquer en partie la différence observée. Quoiqu’il en soit, il nous paraît néanmoins raisonnable d’affirmer que l’approche basée sur la validation reste parfaitement valable pour estimer l’incertitude associée à un résultat et ce, pour autant que le protocole de validation soit en accord avec la routine et que la méthode ne quitte pas le laboratoire qui l’a validée.
Par ailleurs, étant donné que dans les deux techniques analytiques (chromatographie liquide et électrophorèse capillaire) le même composé a été quantifié, nous avons envisagé de comparer les performances obtenues par ces deux techniques. Il ressort clairement que l’EC présente une variabilité plus importante des résultats par rapport à la CLHP démontrant ainsi que l’incertitude n’est pas et ne peut pas être la même dans toutes les situations.
En guise de recommandations, nous pensons pouvoir dire que le choix de l’approche alternative pour l’estimation de l’incertitude associée à un résultat dépendra essentiellement du contexte d’utilisation de la méthode analytique.
C’est ainsi que si un laboratoire a développé et validé en interne la méthode avec
recommandation s’inscrit parfaitement dans la démarche actuelle de l’accréditation qui différencie les laboratoires en fonction de leur aptitude à développer et donc à valider ou non de nouvelles procédures analytiques.
En revanche, lorsque les résultats émis par deux laboratoires ou plus sur un même type d’échantillon doivent être comparés entre-eux (ou si on sait qu’ils le seront), l’approche basée sur une étude inter-laboratoires est manifestement plus appropriée. Toutefois, dans ce contexte, l’estimation de l’incertitude à partir d’une étude de robustesse sur des réponses quantitatives nous paraît plus réaliste tant d’un point de vue pratique qu’économique. En effet, nous avons démontré que l’incertitude obtenue lors de l’étude de robustesse prédisait très bien celle obtenue lors d’une étude inter-laboratoires. Elle constitue donc notre recommandation pour ce cas de figure pour autant que le protocole utilisé soit suffisamment représentatif d’une étude inter-laboratoires (par exemple : deux équipements avec différents paramètres de réglage, différents lots de colonnes ou de cyclodextrines, etc.).
Pour terminer, notre travail s’est essentiellement focalisé sur la comparaison de différentes approches alternatives pour l’estimation de l’incertitude mais nous pensons qu’il serait intéressant à l’avenir de modéliser sur la base des expériences de validation la relation entre l’incertitude et la concentration afin d’obtenir une équation prédictive de l’incertitude associée à tous les futurs résultats compris dans l’intervalle de dosage validé. Par ailleurs, nous sommes convaincus qu’il serait particulièrement intéressant d’appliquer le concept du profil d’exactitude à tous les contrôles de qualité obtenus en routine. Cette approche offrant toutes les garanties requises en termes de sources de variation inhérentes à l’utilisation de la méthode en routine mériterait certainement aussi d’être comparée à celles utilisant les études de robustesse et inter-laboratoires.
