Sommaire
I
Avant-propos,
par B. BAUDIN, B.Haruque
et Ph. LnrnevRE. Méthodes générales
l. Unités, instrumentation
etmétrologie,
par B. BAUoItrl, P.Kavroun
et N.Manro Unités.
Unitésdebase...
Unités dérivées
Unités d' électricité usuelles.
Utilisatondesgaz. ...r,
Commercialisation des gaz Utilisation des gaz
n de
vide
de
chaleur.
Combustiond'wgaz ...:
C,hauffage d'une résistance électrique
Autresmodes de
chauffagre ...r.
tion
defroid
etlyophilisation.
Réfrigérateurs et congélateurs
..
.Neige carbonique et azote liquide .
Lyophilisation
et
matériel courant
delaboratoire
. . . . .Matériel de volumétrie
Matériel courantaulaboratoire . . .
..
.i.
. .des balances et différents types. . . . .
bosages gravimétriques
2. Préparation
desréactifs,
par B.Beuoru,
P.Knvroux
et N.Manro.
tion
del'eau.
.de ville.
différents types d'eau purifiée . . . . . .
et utilisation des eaux purifiées . . .
du
pH
etsolutions tampons dupH.
et solutions d'étalonnage.
ftrmpons.
et réactifs
chimiques
chimiquesdes solutions.
XVII
3 3 3 3 5 5 5 5
I
B B
I
11
II II
L2
I
9 11
ll
15 16 II
L7 L7
t7 t2 I4
15
t7
1B
IB
18 20
2t
24 24 24 d'une solution tampon 26
-4
Bioréactifs.
Principes de marquage et méthodes quantitatives Méthodes qualitatives et amplificaton du signal.
Chapitre 3 Préparation
deséchantillons biologiques,
par B.BeuoIN
et N.ManIo Sang..
Modes deprélèvement. . . . .
Conditions de prélèvement. . . . .
Utilisation du prélèvement Anticoagulants
...
Conservation Interférences
Urines
Autres
liquides biologiques
Tissus.Chapitre 4. Méthodes d'extraction
et defractionnement,
par B.BeulIN,
D. BoNNEFoNT-RoussELor, P.Keuoul etD.
STERNBERG . . .Précipitations
etextractions
sélectives Précipitation des protéinesExtraction des protéines membranaires. . . . . .
Extraction des acides nucléiques
Dialyse.
Membranes de dialyse Facteurs influençant la dialyse Méthodes de dialyse
Applications de la dialyse.
Filtraton
Principes.
Procédés de
filtration
Différents types de filtres . . . .
Ultrafiltration
Centrifu
gation
etultracentrifugation.
Déflnitions
Principes de la centrifugation. .
Appareillages
Ultracentrifugation préparative . . .
Applicatons de la centrifugation en biochimie et biologie moléculaire
Chapitre 5. Bonnes pratiques
delaboratoire,
par N.Manro Notions
générales.Définition de la qualité Réglementation
....
Procédures.
Phase
pré-analytique.
Prélèvementdes
échantillons...
. . .Conservation et transport des échantillons. . . . . .
Récepton et enregistrement des échantillons . . .
Phase
analytique.
. .Instnrmentation et réactifs
TItr
SO}L\IAIRE27 27 28
30 30 30 30 30 31 31 31 32 32 32
34 34 34 35 35 40 40 40
4I
42
45 45 45 46 47 i+s 50 50
5U 50 51 42 42 +J 43 44
51 51 51 52 52 52
Validation d'une méthode d'analyse quantitative (dosage) Contrôle de qualité
Phase
post-analltique
Méthodes d'identification
et de dosage desbiomolécules
Chapitre 6. Méthodes spectroscopiques,
par D.FoMpsvnrn
et Ph. LepEevRE ..
59Propriétés de la
lumière,
par Ph.LBppsvnE
59Nature de la
lumière
59Différents domaines des ondes électromagnétiques
.
60Diffraction de la
lumière.
60Réflexion et réfraction de la
lumière
61Diffusion de la
lumière
62Spectrophotométrie d'absorption moléculaire,
par Ph.LEpEevnE
62Émissionderayonnements...
62.\bsorption de la
lumière
63Appareillage
64Spectrophotométrie
dérivée, par D.FoltpevorE.
78Principe de la
méthode
78-\spect des
courbes
7BConséquences...
78-\ppareillage
79Intérêtdeladérivation...
79Applications.
B0Photométrie des
milieuxtroubles
:turbidimétrie
etnéphélométrie,
par D. Fonæsvnrn et Ph. Lepse\Rn . .. 8l
Principe
Bl-\ppareillage
Bl-\pplications.
BlChapitre 7. Spectroscopie moléculaire par luminescence,
par N.AuzsIL
et A.RscezzErrl
..
83Généralités.
Principes
de lafluorescence.
83Lxcitation de la molécule par absorption d'un photon. . . . .
.
84Devenir d'une molécule
excitée
84Signal de
fluorescence
85Grandeurs caractéristiques du processus de fluorescence .
.
86Disparition de la fluorescence . .
.
90Phénomènesliésàlafluorescence....
93-{nisotropie et polarisation de fluorescence . . .
.
93Fluorescence par transfert d'énergie par résonance
(FRET).
95Spectrofluorimétrie
96Specnofluorimètres.
..
97Recommandations pour les analyses effectuées par
spectrofluorimétrie
98\lcléculesfluorescentes...
99Généralités.
99Fluorophoresintrinsèques. ..
99Fluorophoresextrinsèques '.
100Quelques
applications
de lafluorescence .
109-\pplications biochimiques de la polarisation de fluorescence
.
109Détection et dosage par CLHP couplée à une détection par fluorescence. .
.
111Chimiluminescence etbioluminescence
111Chimiluminescence
.
111Bioluminescence... ll4
-{pplications.
11552 55 5t)
SOMMAIRE IX
Chapitre 8. Spectrométries d'absorption
etd'émission atomiques,
par f.Poueon Principe
généralAspects
théoriques
etappareillage.
. . .Atome et théorie quantique.
Specûométrie d'absorption atomique en flamme (SAAF).
Spectrométrie d'absorption atomique électrothermique (SAAET) Spectrométrie d'émission atomique en flamme (photométrie de flamme)
Spectrométrie d'émission atomique en plasma couplé induit haute fréquence (ICP-OES) Couplages et spéciation
Chapitre 9. Spectrométrie
de masseIntroduction
générale etdéfinitions,
parM.-C.
MENEI Spectromètre de masse.Spectre de masse Masse .
Exactitude de masse Résolution
Sensibilité.
Limite de masse .
Ions
Analyse des
molécules organiques
:biomolécules
simples etmacromolécules,
parM.-C. Mnlver.
. . . .Principes etappareillages
....
Couplage des méthodes séparatives avec la spectrométrie de masse.
Applications.
Analyse des
molécules inorganiques
et des élémentsminérauxpar spectrométrie
de masse en plasmainduit,
par|. PoupoN.
Principes et appareillages . .
..
Interférences en ICP-MS et systèmes de correction des interférences. . . .
Applications.
Chapitre 10. Méthodes électrochimiques
etpotentiométriques,
par A.Ducey Méthodes électrochimiques.
.Voltamétrie ou voltampérométrie
Potentiométrie, ampérométrie et coulométrie. . .
Applications des méthodes électrochimiques . . .
Méthodes potentiométriques
Électrodes indicatrices métalliques.Électrodes indicatrices à membrane sélective ou électrodes spécifiques Méthodes de calcul de la concentration. .
Applications de la potentiométrie en biochimie clinique . . . . . .
Chapitre ll. Méthodes isotopiques,
par P.Kemoux
et J.-M.Vrrr,nrrs.
Structure
del'atome.
Radioactivité ...
Émission alpha (o).
Émissionbêta(p)....
Émission gamma (T) .
Lois de la radioactivité
Détection et mesure de la radioactivité . .
Chapitre 12. Méthodes enzymatiques,
par B.Beuurt Définition
des en4rmes etspécifïcité.
Spécificité.
I20 r20
130 130
r20
r20 r22 r23 I27 r27 r29r30 131
l3t t32 t32 t32 t32 t32 r32
r32 r44t44
153 r53 r54
156
r58 158 158
t6t
163
166 I66 168 176 t77
l80i
lBl lBl
tB2 180 180 180 180
r87
r87 IB7 Site actif\Iécanismes de la catalyse.
I
so\Dr{rREIB7 tB7
\spects cinétiques
Relation de Michaelis-Menten et inhibiteurs en4.'rnatiques En4..rnes allostériques
Classification des enzl'mes et principales coenz!'mes Détermination des activités enzJ'matiques
Dosage de substrats par des méthodes en4rrnatiques . . .
En-4rnes-réactifs de
laboratoire
\Iarquage des en4.'rnes pour immunodosage . Biocapteurs enzymatiques
Autres emplois des enz].rynes. . . . . .
Purifi cation des enzgnes
Chapitre 13. Méthodes immunologiques,
par J.-M.Broanr
et L. LACRoIX Principesgénérarx.
-{nticorps et antigène
Réaction antigène- anticorps . .
Production
desanticorps
. . . . .Production et caractéristiques des anticorps polyclonaux Production et caractéristiques des anticorps monoclonaux.
Ingénierie des anticorps
Principales
méthodes immunologiques
. .\léthodes fondées sur la précipitation ou l'agglutination . . .
\Iéthodes fondées sur l'utilisation de réactifs marqués
\-ers des
méthodes immunologiques
sansanticorps.
\Iéthodes multiplex.
De la sensibilité des immunodosages.
De la modification des anticorps à leur substituton par des aptamères
Gapitre 14. Méthodes chromatographiques
:généralités,
par Ph.Lsrssvnn
Difrérents types dechromatographies.
.Chromatographie planaire
Chromatographie en phase gazeuse Chromatographie en phase liquide.
ki-ncipaux
mécanismes deséparation chromatographique
Clromatographie d'adsorption . . .Clromatographie departage .
...
.Càromatographie d'échange d'ions Cbromatographie d'exclusion stérique Cbromatographie d' affinité .
kincipales
donnéesthéoriques
C,:efficient de partageGrandeurs de rétention
;frcacité
de la colonne.û;alité
dela séparation . . . . .(bpitre 15. Chromatographie planaire,
par Ph. LnpBevnn. . . . .Gromatographie
surpapier
. .fl;omatographie
sur couchesminces
-:cipe
}lecanismes de séparation C.:oduite d'une CCM
Grandeurs caractéristiques . . . . .
188 189 191
r92 194 196 198 198 199 199 199
201
20r
201 202 202 202 203 204 205 205 206 212 212
2r3
2142t6
216 216 216 216
2t6 2r6
2L7 2L7 217 2t7
2t7
2t7 2tB 2TB 2L9 22122r
221 221 22r 222 224xl
SOMMAIRE
r Chapitre 16. Chromatographie en phase gazeuse, par J.-P. GneuoNo
et Ph. LnrnevnE.
226
Principes
de laséparation.
. ..
226Interactions moléculaires
dispersives.
226Interactions moléculaires
polaires.
226Appareillage
226Gazvecteur ..
226Colonne
227Modes
d'injection
229Détection
235Préparationdel'échantillon...
237Extraction.
237Dérivation
237Optimisation
deI'analyse
237Choixdu
gazvecteur.
237Température
d'analyse.
238Anomalies rencontrées lors de l'acquisition d'un
chromatogramme.
238Quantification: méthode de l'étalonnage
interne.
238Chapitre 17. Chromatographie liquide
àhaute perform{rnce
. . . . . 240Interactions moléculaires,
parM.-C. Mat'{er.
24OMomentdipolaire..
24LInteractions
241Évaluation de la polarité d'une molécule
organique.
241Évaluation de l'hydrophobie d'une molécule
organique.
242Couples phase
stationnaire/phase mobile.
Mécanismes derétention,
parM.-C. Mrxer
242Chromatographied'adsorption...
242Chromatographiedepartage...
243Chromatographie d'échange
d'ions
245Chromatographie d'exclusion
stérique
247Séparation des molécules
chirales.
249Optimisation
enchromatographie
en phaseliquide,
parM.-C. MnNEr 25I
Augmentation de la résolution par modification du facteur de rétention
k' 25I
Augmentation de la résolution par augmentation de la sélectivité o. . . .
.
252Augmentation de la résolution par augmentation de l'efficacité
N.
252Appareillage
enchromatographie liquide,
par P. LEFEBVRE etM.-C. MENsr
. . . ..
254Pompes.
254Systèmes
d'injection
257Colonnes
257Détecteurs
258Chapitre 18. Dérivation
enchromatographie,
par Ph.Lnresvne
262Dérivation
enchromatographie
en phasegazeuse
262Réactions de
silylation
262Réactions
d'acylation
264Réactions
d'alkylation.
266Dérivation
enchromatographie liquide
à hauteperformance
266Dérivation pour
l'extraction
266Dérivationpourlaséparation...
267Dérivation pour la
détection
270Dérivation pré- ou
post-colonne
27IChapitre 19. Méthodes électrophorétiques,
par B.BeulIN
. . ' 'Principes
généraux de l'électrophorèse
\Iobilité
électrophorétique et facteurs influants Courants électro-osmotiques et effet Joule274 274
aaA 275
Itr
so\L\r{rREde
zone.
ffinition
et ionisaton des macromolécules biologiques. . . . . .enélectrophorèse de zone
..
de révélaton
preparauve
préparative sur gel .
préparative sur colonne
à écoulement libre oufreeflow electrophoresis . . . . .
en veine
liquide
etélectrophorèse capillaire
. . . . .et avantages de l'élqctrophorèse capillaire . . . .
méthodes utilisées en électrophorèse capillaire.
Méthodes d'étude
desmacromolécules
m. Purilïcation
desmacromolécules par chromatographie liquide, pflr
B.Bauoru
desfractionsettraitementdusignal
. ...:
''..
quantitatifs
d'exclusion stérique.
d'exclusion stérique et tampons de travail
préparativesauxmacromolécules.
''....;
phie
d'échanged'ions.
général
aux protèines
auxacidesnucléiques
etautresmoléculesbiologiques.... '...
tamponsdetravail '.
! !i...
d'adsorptionetdepartage ...
surhydroxyapatite...
:...
sur colorants chimiques.
surchélatesmétalliquesouimmobiIizedmetataffinitychrornatography d'interactions hydrophobes
en phases inversées.
d'affinité
Méthodes d'étude structurale
desmacromolécules, par
B. BAUDIN,D.SrnnNsnnc...
et dosage des
protéines,
par B.BRuoru
. . . ..:
.des protéines
de
I'ADN
et I'ARN, par D. SrnnNeenc "desacidesnucléiques. ...
hDNetdeI'ARN
275 275 276 276 277 282 284 284 284 285 285 285 286 288
291
29r 29r
292 292 292 293 293 293 293 294 296 296 296 297 297 298 298 298 298.
299lsoo rl
r300 300 301
303 303 303 304 306 306 306
I
XIH
SOMMAIRE
Étude de la
structure primaire,
par B'BeuuN'
avecD' SrrnNssnc
' ' ' ' Composition chimique des protéines et peptidesQuantification
dunombre
de copiesd'une
séquenced'acide nucléique par - oirporitifs
moléculaires d'émission de fluorescence utilisésDétermination de la séquence
Détermination
de la masse, de lataille
et de laforme,
par B'BeuoIN' .' " " .' -
Notions de masse moléculaire, de forme et de taille 'Méthodes d'étude directes et méthodes biochimiques Analyses de sédimentation par ultracentrifugation' ' ' Méthodes utilisant la diffusion de la lumière
Méthodes
d'analyse desstructures
secondaire ettertiaire' ',' ' - -;' ;^.::;-'
' 'ilniËil ;;aiftZi"",'
niveatxstruc':'l"* d"::1:'"i:tï*::*.i:
u'u"""'*
ilit*;;;;Àtuir"
appliqué à l'étude des protéines' par B' Beuoru' ÉtuO", par radiocristallographie et RMN-2D' par F'Danoel
Méthodes d'étude
enbiologie moléculaire
chapitre 22. Principes, méthodes
etoutils
enbiologie moléculaire'
parD' SrnnNssnc
'L'hybridation, propriété fondamental" q:t Î:19:' nucléiques.
rlr."t t
f'o.igine â" t'uppatiement en double hélice ' ' ' ' ':;
Facteursdetransitionentreétatappariéetétatnonapparle
NoUon
a. t"-pérature
de fusion (Tm) et de courbeOt.tttot';l :;.^^'^..:;: -^^^;;";.""
ilr?iiffi: :i:ï:iËi,il'i"" u"
génome o., a,,t ur,r.rpto..
fondées sur la reconnaissance par hvbridation ' 'outilsenz]rmatiquesdemodificationetdesl'rrthèsedesacidesnucléiques.
Introduction et revue générale
Endonucléases de restriction de I'ADN double
brin
' ' ' ' ' 'prô-tiÀZt
à"s ADN polymérases utilisant des matrices ADN et ARNMéthodes d'étude
deI,ARNutilisant
laslnthèse d'ADN
àpartir d'ARN (transcription inverse)
Introduction généraleTyÀ;;"Ëage
pour la RT (synthèse des brins antisens)'
'Tiànscriptases inverses utilisables pour la RT
, , ' : ' ' ' ' ' rntàittoaË,
"tilisées pour la synthèsà du second
brin{si
nécessait"]'.-';- ;',^ ;;;.;;',::rr-;;;
[:tffiii#'iffi.ffiffiï;],lriliJâq""",ii"t""
du produit final de Rr éventuellement amplirié'Méthodes
de po\'Tnérisation
en chaîne deI'ADN
(PCR) 'Présentation générale de la réaction ' Historique de la PCR
Cinétiques théorique et réelle d-e la sVntlrès3
d'T,f
11"-"::t
de la PCRVariétés des réactifs et des conditions réactionnelles en PCR
Échantillons d'ADN ou d'ARN introduits dans le mélange réactionnel de la PCR ' ' ' ' Utilisation de standards dans une PCR' ' '
Les conditions thermiques de la réaction de PCR et leur contrôle Optimisation d'une PCR'
(RT-)PCR en temPs réel
Normalisation par rapport à un fluorochrome passif
'''''''
Modes d'exPression des mesures'
308 308 309 314 314 314 315 317 317 3L7 318 3r9
325 330 330 330 330 332 334 334 335 335 336 336 337 338 338 339 339 339 340 JtI
341 343 344 344 345
Gamme dlmamique et efficacité'
(RT-)PCR quantiiative avec standard endogène et méthode des AACt
Iféthodes
dedétection
demutations ponctuelles
deI'ADN
\téthode fondée sur la détection des polymorphismes de restriction (RFLP) Étude des poll'rnorphismes conformàtionnels des simples brins par SSCP ' '
\téthodesfondéessurladétectiondeshétéroduplexoudesmésappariements' Electrophorèse sur gel en gradient de dénaturation (DGGE) ' ' ' ' ' ' : Cbromarographie liquide
"à
haute performance en cànditions de dénaturation (DHPLC) '
In-
so\L\L\IRE345 346 348 348 344 349 350 350 351 353 353 358
A. Alrerçus sur
leclonage
deI'ADN,
par D.SrnnNssnc
étapes du clonage.desfragments d'ADN: étape 1
péparation
duvecteur, et jonction de I'ADN d'intérêtà I'ADNvecteur: étape 2. . . . . . de I'ADN vecteur greffé dans les cellules hôtes : étape 3 . ! ! . . : .des cellules hôtes ayant incorporé le vecteur greffé : étape 4 Yecteurs de
clonage.
concernant I'ADN insérable .
bactérienssauvages.
.r...'..
hybrides
24.
Puces àADN. Méthodes d'étude
dugénome
et dutranscriptome, Bmanretl.. Lecnox
général
typesdepucesàADN i...
de détection.
séquences utilisées comme sondes
despucesàADN.
deséchantillons,amplification,marquageethybridationdescibles...'.:.:
des échantillons d'acides nucléiques.
et marquage des cibles.
et lavage
bio-informatique
etbiostatistique
des images.
filtrage et représentation des données. . . . .
biostatistique des données d'expression génique .
d'application
Méthodes d'étude
desinteractions moléculaires
25. Interactions ligands-récepteurs,
par B.Beuorx
et B. HAINQUEdesinteractionsmoléculaires.. ....;...
de
caractérisation
desliaisons ligand-site récepteur
. . . .expérimentales... .:...
ne modifiant pas l'équilibre.
susceptibles
demodifierl'équilibre. .. !. !..
des interactons en temps réel. . . .
en évidence de résidus
fonctionnels
et de zonesd'interactions
. . . . .362 362 362 362 362 364 365 365 366 367 369
37r
372 373 375 375 3V5 376 377 378 378 378 378 378 379 379 379 380 382 383
387
I
387387 389 389 389 389 390 390 392 394 395 395 406
I
xv
physiques chimiques.
biologiques.
des complexes
protéiques
lféthodes d'étude des interactions protéine-protéine in vivo Héthodes d'étude des interactions protéine-protéine in
vitro.
. . . . .SOMMAIRE
Chapitre 26. Interactions
acidesnucléiques-protéines,
par B.HarnquE.
. ..
408Diversité
desobjectifs
et des approchesméthodologiques
408Place des méthodes de purification dans l'étude des interactions acides
nucléiques-protéines.
409Place des méthodes de clonage dans l'étude des interactions acides nucléiques-protéines . .
.
410Détermination des caractéristiques des interactions acides
nucléiques-protéines 4lI
Méthodes d'étude
desinteractions ADN-protéines.
Filtration sur membrane de nitrocellulose . . .
Retardement sur gel.
Balises moléculaires et FRET ou BRET
Empreinteinvitro
(protectiondeI'ADNvis-à-vis deréactifs de clivage, en4/rnatiquesouchimiques)...
Interférence par modification de nucléotides. . . . .
Formation de liaisons covalentes ADN-protéines par irradiation
IfV
Empreinte in vivo par méthylation des purines
Identification des protéines de liaison à I'ADN par le système simple hybride . . . . . .
Identification des motifs nucléotidiques par sélection itérative et amplification par PCR des sites de liaison
à partir d'un pool d'oligonucléotides de séquence variable .
Exploration de la localisation génomique des protéines associées in vivo à Ia chromatine par immunoprécipitation. . .
Méthodes d'étude
desinteractions ARN-protéines
.Retardement sur gel. .
Empreinte in vitro (protection de I'ARN vis-à-vis de réactifs de clivage chimiques) Formation de liaisons covalentes ARN-protéines par irradiation
W.
. . .Reconstitution in vitro et purilication des complexes ARN-protéines . . . . .
Identification des protéines de liaison aux ARN par le système triple hybride Sélection in vitro des ARN fonctionnels
L'essor de
nouvelles méthodes Liste
desabréviations
4t2
4r2 4r2 414 4r541,9 420 421 422 424 425 427 427 427 428 429 429 431 431 433
Index
437III
so\f\L{rREPrix France : 75
€
tsBN, 978-2-257 1-6545-9
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il||lllllll llllllll
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1782257n165459nwww.medecine.f lammarion.com