Diversité et traits d’histoire de vie des Botryosphaeriaceae et évaluation du potentiel de défense de différents cultivars de Vitis

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Botryosphaeriaceae et évaluation du potentiel de défense

de différents cultivars de Vitis

Aurelia Nivault

To cite this version:

Aurelia Nivault. Diversité et traits d’histoire de vie des Botryosphaeriaceae et évaluation du potentiel de défense de différents cultivars de Vitis. Agronomie. Université de Bordeaux, 2017. Français. �NNT : 2017BORD0811�. �tel-01941397�

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POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES ET ENVIRONNEMENTS

SPÉCIALITÉ ÉCOLOGIE ÉVOLUTIVE, FONCTIONNELLE ET DES COMMUNAUTÉS Unité de recherche

[SAVE, INRA, UMR1065]

Par Aurélia NIVAULT

Diversité et traits d’histoire de vie des Botryosphaeriaceae et

évaluation du potentiel de défense de différents cultivars de Vitis

Sous la direction de : Mme Marie-France CORIO-COSTET (co-encadrante : Mme Stéphanie CLUZET)

Soutenue le 30 novembre 2017

Membres du jury : Composition du jury

Mme Florence FONTAINE Professeur à l'Université de Reims Rapporteur

M Marc-Henri LEBRUN Directeur de Recherche, INRA Rapporteur

M Philippe REIGNAULT Professeur à l’Université du Littoral Côte d’Opale Rapporteur Mme Sylvie GERMAN RETANA Chargé de recherche, INRA de Bordeaux Examinateur

M Michel HERNOULD Professeur, Université de Bordeaux Président du Jury

M Philippe LARIGNON Ingénieur, Institut français de la Vigne et du Vin Examinateur

M Serge DELROT Professeur, Université de Bordeaux Invité

Mme Marie-France

CORIO-COSTET Directeur de recherche, INRA

Directrice de thèse Mme Stéphanie CLUZET Maître de Conférences, HDR Université de

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soumise à de nombreuses contraintes environnementales pouvant favoriser l’émergence des maladies de dépérissement du bois (MDB). La famille des Botryosphaeriaceae est responsable du Botryosphaeria dieback, provoquant des chancres et des nécroses qui conduisent à une dépréciation de la qualité du vin, voire à la mort des ceps. Les méthodes de lutte sont peu efficaces. Sept espèces sont retrouvées dans le vignoble français dont B.

dothidea, D. intermedia, D. mutila, D. seriata, Do. viticola, N. parvum et L. viticola. Nous avons étudié

différents traits d’histoire de vie de ces agents pathogènes : (i) leur agressivité in planta, (ii) leur adaptation à des contraintes environnementales (e.g. température, fongicides), (iii) la présence de mycovirus, pour acquérir des connaissances sur leur pouvoir adaptatif face aux contraintes environnementales et expliquer la variabilité de leur agressivité. En complément, l’évaluation de la sensibilité de cultivars de Vitis face à une infection par N.

parvum et D. seriata a été réalisée, et le potentiel de défenses de différents cépages (Ugni Blanc,

Cabernet-Sauvignon et Merlot) a été étudié. L’ensemble des travaux menés ont permis de révéler des espèces très agressives telles que N. parvum et L. viticola par rapport à D. seriata, lors d’inoculations en serre sur des boutures. Les températures optimales de croissance déterminées montrent que certaines espèces (ex.

Lasidiplodia spp.) sont mieux adaptées à des températures élevées (33°C). Par ailleurs, la sensibilité de 65

souches et génotypes a été testée pour 9 fongicides avec des modes d’action différents (inhibiteurs de la respiration mitochondriale, de la biosynthèse des stérols, du cytosquelette, muti-sites, etc.). De nombreuses espèces sont peu ou pas sensibles à certains de ces fongicides et des souches résistantes ont été trouvées avec un facteur de résistance pouvant atteindre plus de 1000. D’autre part, la détection de mycovirus au sein des 65 isolats a permis d’identifier la présence de 6 mycovirus, dont Neofusicoccum luteum mitovirus 1 et

Neofusicoccum luteum fusavirus 1. L’évaluation du potentiel de défense des trois cultivars Vitis face à une

infection par N. parvum et D. seriata a montré des réponses différentes entre cépages et en fonction de l’agent pathogène. In fine, des analyses croisant les différents traits d’histoire de vie et les interactions plante-pathogènes ont été faites, et l’ensemble des résultats nous a fourni de nouvelles pistes d’étude pour lutter contre ces agents pathogènes.

Mots clés : [Botryosphaeriaceae, traits d’histoire de vie, Vitis vinifera, Maladies de dépérissement, Diversité,

Potentiel de défense]

Title: Grapevine Trunk Diseases (GTD): plant defence responses and diversity of Botryosphaeriaceae

Vitis vinifera L. is largely cultivated in countries producing wine but an increase in grapevine trunk diseases

(GTDs) have been observed due to the attack of several fungal pathogens including those belonging to the Botryosphaeriaceae family (Botryosphaeria dieback). Seven species were isolated in the French vineyards B.

dothidea, D. intermedia, D. mutila, D. seriata, Do. viticola, N. parvum and L. viticola. Nowadays, no efficient

products are available to control these diseases. Studying, different life traits of 65 strains of different genotypes of the Botryosphaeriaceae’s family, known to have members displaying different aggressiveness, would lead to a better understanding of these wood pathogens. Their in planta aggressiveness, their adaptation towards environmental pressures (temperature, fungicides), and the detection of mycoviruses were carried out. In order to have a better comprehension of the interaction within the plant, the expression analysis of genes involved in the plant defense were assayed upon 3 cultivars (Cabernet Sauvignon, Merlot, and Ugni-Blanc) but also on two species (N. parvum and D. seriata). L. viticola, and N. parvum, were shown to be more aggressive than D.

seriata and. L. viticola is more adapted to higher temperature (33°C). Moreover, the strains tested with 9

different fungicides (mitochondrial respiratory, sterol biosynthesis, cytoskeleton or multisite inhibitors, etc.) showed lower sensitivity within some species, (with a resistance factor reaching a 1000). In addition, at least 6 mycoviruses were characterized. Amongst them, two mycoviruses were isolated from a N. luteum strain and were fully sequenced (Neofusicoccum luteum mitovirus 1 and Neofusicoccum luteum fusavirus 1). The three cultivars infected with either N. parvum or D. seriata showed different gene responses between themselves but also between the different strains inoculated. These different studies are giving us more information upon these Botryospheriaceae fungi, to find out new efficient or complementary methods in order to control GTDs.

Keywords: [Botryosphaeriaceae, Life traits,Vitis vinifera, Grapevine Trunk Disease, Diversity, Plant defense]

Unité de recherche

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Je tiens à remercier chaleureusement les membres de mon jury, Florence Fontaine, Marc-Henri Lebrun, Philippe Reignault, Sylvie German-Retana, Michel Hernould et Philippe Larignon, d’avoir accepté d’évaluer mon travail.

Je remercie également le CNIV et le Casdar d’avoir financé ce projet qui m’a permise de réaliser ma thèse.

Merci à Marie-France Corio-Costet de m’avoir encadrée et dirigée pendant ces trois années de thèse. Merci aussi, à Stéphanie Cluzet de m’avoir co-encadrée pendant ce projet.

Un grand merci à tous ceux qui ont de près ou de loin contribué à ce travail, Marie-Cécile, Gwen, Gilles, Chantal; et merci aussi à tous ceux que j’ai connusvia SAVE, vous êtes si nombreux!

Ceux qui me connaissent, vous savez qu’il est difficile pour moi de m’exprimer, surtout lorsqu’il s’agit de parler sentiments. Alors je vais essayer et de plus en français.

Les filles Juju et Lulu, merci de votre soutien et de votre bonne humeur. J’aurais appris beaucoup de choses sur les frelons et le pouvoir aux filles…. Ramsès, merci pour ta chaleur et ton aide. Arthur, bon que dire, si ce n’est merci et hakuna matata! Jonathan, je te remercie pour tout et si tu hésites un jour, sache que tu es un vrai soutien et pour sûr on se refera des apéros improvisés!

Marie Momo, merci pour ton soutien, ton aide, ta bonne humeur et ta présence, c’était toujours agréable de travailler avec toi. Tu n’imagines pas à quel point tu m’as aidée.

Non je ne vous ai pas oublié Delphine, David, Marie et toute la team « soirée Bordo », et à tous ceux que j’ai oubliés de citer mais qui ont été présents au cours de ces trois ans, merci à vous aussi.

Les filles vous vous reconnaitrez très bien, pas besoin de dire plus et après 10 ans, je vous adore toujours!

Shan thanks for having being there the whole way long. You’ve been a real support and I wouldn’t even imagine having another bestie sis anyway. Now, that’s over and that I’ll get a sock, we can rock together! Mam, well, you know how bad I am at expressing myself. No matter what, you know how grateful I am. Papa, même topo que maman, merci d’avoir été là. Je ne vous le dis pas souvent mais je vous aime fort. Corinne et Christophe merci pour toutes ces dernières années et que le champagne coule à flot! Yann, oui, t’y es aussi, merci d’être là…. Et en plus tu clos les remerciements, pas de chance pour toi!

“We're all mad here.” ― Lewis Carroll, Alice in Wonderland

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Introduction générale

Introduction bibliographique

1. La culture de la vigne (Vitis vinifera) 5

2. Les bio-agresseurs de la vigne 7

3. Les mécanismes de défense chez les plantes 9

3.1. Qu’en est-il des réactions de défense mises en place par la vigne en réponse à des Botryosphaeriaceae?

13

4. Les méthodes de protection et de lutte au vignoble 14

4.1. Des méthodes de luttes prophylactiques 14

4.2. La lutte chimique (Produits de Protection des Plantes) 15

4.3. Des produits de lutte dit de « biocontrôle » 16

4.4. Les produits stimulateurs des défenses des plantes (SDP ou SDN) 18

4.5. Amélioration variétale 18

5. Les Maladies du Bois et les dépérissements dus aux Botryosphaeriaceae 19

5.1. Les méthodes de luttes 19

5.2. Les Botryosphaeriaceae, une famille d’agents pathogènes complexes 22

5.2.1. Taxonomie et distribution 22

5.2.2. Cycle biologique des Botryosphaeriaceae et symptômes observés sur vigne 26

5.2.3. Des champignons pathogènes à l’agressivité variable 28

5.2.4. Influence de la température sur la répartition géographique des espèces 34

5.2.5. Sécrétion de toxines pathotoxiques 36

5.2.6. Exigence nutritionnelle, un arsenal enzymatique pour la dégradation du bois 40

5.2.7. Sensibilité des Botryosphaeriaceae aux fongicides 42

5.2.8. Présence de mycovirus chez les Botryosphaeriaceae ? 48

6. Objectifs de la thèse 51

Matériel et Méthodes

1. Matériel végétal 52

1.1. Matériel fongique 57

1.2. Fongicides 57

1.2.1. Les fongicides uni-sites 57

1.2.2. Fongicides multi-sites 60

2. Méthodes 61

2.1. Multiplication et conservation des souches 61

2.1.1. Production de matériel fongique pour l’extraction d’ARN double brin 61

2.1.2. Mesure de la croissance des Botryosphaeriaceae à différentes températures 61

2.1.3. Test in vitro de la sensibilité aux fongicides 62

2.2. Expériences in planta 63

2.2.1. Mesure de l’agressivité in planta des différentes souches de

Bortyosphaeriaceae

63

2.2.2. Test de sensibilité de différents cultivars suite à leur infection 64

2.2.3. Extraction des ARN totaux des feuilles et du bois de vigne 65

2.3. Extraction et caractérisation de mycovirus chez les Botryosphaeriaceae 72

2.3.1. Extraction des ARNds par chromatographie sur cellulose CF11 72

2.3.2. Synthèse des ADN complémentaires et amplification par PCR 73

2.3.3. Détection de virus dans la collection 74

(7)

1.1. Taille des chancres et des nécroses pour le cépage Cabernet-Sauvignon 77

1.1.1. Comparaison des chancres en fonction des espèces 79

1.1.2. Comparaison des nécroses en fonction des espèce 81

1.2. Variabilité de l’agressivité globale in plant 83

1.2.1. Variabilité au sein du genre Diplodia spp 83

1.2.2. Variabilité de l’agressivité au sein du genre Neofusicoccum spp 86

1.2.3. Variabilité de l’agressivité de l’espèce B. dothidea 88

1.2.4. Variabilité de l’agressivité dans le genre Lasiodiplodia spp 88

1.3. Discussion sur l’agressivité des Botryosphaeriaceae du vignoble français 90

1.3.1. Un lien existe-t-il entre la taille des chancres et des nécroses ? 90

1.3.2. L’origine régionale de la souche est-elle en relation avec son agressivité ? 92

1.3.3. Comment s’intègrent ces nouvelles données avec celles de la littérature ? 96

2. Rôle de la température sur la croissance des Botryosphaeriaceae 101

2.1. Effet de la température sur la croissance des différentes espèces à différentes températures (15, 22, 25, 28, 33 et 36°C) 101 2.1.1. Croissance à 15°C 101 2.1.2. Croissance à 22°C 107 2.1.3. Croissance à 25°C 108 2.1.4. Croissance à 28°C 114 2.1.5. Croissance à 33°C 118 2.1.6. Croissance à 26°C 122 2.2. Conclusion-Discussion 125

2.2.1. Les espèces françaises se comportent-elles comme celles décrites dans la littérature ?

125

2.2.2. Existe-t-il des différences de croissance selon la région viticole française ? 127

2.2.3. Existe-t-il une différence de croissance selon la région viticole française entre

D. seriata et N. parvum ?

129

2.2.4. Existe-t-il une corrélation entre l’agressivité in planta des espèces et leur aptitude à se développer à des températures élevées ?

130

3. Caractérisation et identification de mycovirus présents dans les souches de Botryosphaeriaceae

131

3.1. Sélection de souches de Botryosphaeriaceae 132

3.2. Identification et caractérisation des mycovirus présents dans les souches de Botryosphaeriaceae sélectionnée

134

3.2.1. Extraction d’ARNds 134

3.2.2. Identification des mycovirus 135

3.3. Distribution des mycovirus au sein de la mycothèque 147

3.4. Influence des mycovirus sur la croissance mycélienne 150

3.4.1. Impact sur l’agressivité in planta 150

3.4.2. Influence des mycovirus sur la croissance mycélienne 151

3.5. Discussion et Conclusion 152

4. Sensibilité des Botryosphaeriaceae à différents fongicides 155

4.1. Les inhibiteurs de la respiration 155

4.1.1. Les inhibiteurs du cytochrome b : l’azoxystrobine (quinone outside inhibitor, QoI)

155

4.1.2. Les inhibiteurs du cytochrome b : la cyazofamide (quinone inside inhibitor, QiI)

163

4.1.3. Les inhibiteurs de la succinate déshydrogénase : le fluopyram (SDHI) 168

4.2. Les inhibiteurs de la voie de biosynthèse des stérols 172

4.2.1. Les inhibiteurs de la C14α-déméthylase ou DMI : le tébuconazole 172

4.2.2. Les inhibiteurs de classe II, les IBS : la spiroxamine 177

4.3. Les inhibiteurs de microfilaments 182

(8)

4.4.2. Le phosphonate de potassium 197

4.5. Discussion 202

Etude de l’interaction plante – pathogène : V. vinifera vs

Botryosphaeriaceae

210

5. Effet du stress mécanique lié à la perforation au niveau foliaire et du bois chez trois cépages

213

5.1. Effet du stress mécanique dans les feuilles de Merlot, Cabernet-Sauvignon et Ugni Blanc

213

5.2. Comparaison de l’expression des gènes exprimés dans le bois et dans les feuilles des trois cépages

217

6. Etat des défenses de trois cépages de Vitis (Merlot, Cabernet-Sauvignon et Ugni blanc) après inoculation avec une souche de N. parvum

221

6.1. Effet de N. parvum sur la taille des chancres et des nécroses 221

6.2. Profils d’expression des gènes de défense dans les feuilles des 3 cépages après inoculation par N. parvum

222

6.3. Profil d’expression des gènes de défense dans le bois après infection par N. parvum 225

6.4. Comparaison de l’expression des gènes dans le bois et les feuilles de plants inoculés avec PER20 (N. parvum)

230

7. Effet de la diversité des agents pathogènes sur la réponse du Cabernet Sauvignon 231

7.1. Effets des champignons sur la taille des chancres et des nécroses 231

7.2. Profil d’expression des gènes de défense au niveau des feuilles de Cabernet Sauvignon à 2 et 7 jours après perforation

233

7.3. Profil d’expression des gènes de défense au niveau des feuilles de Cabernet Sauvignon 2 et 7 jours après inoculation par des souches de Botryosphaeriaceae

233

8. Réponses de trois différents cépages de Vitis vinifera et de deux hybrides à quatre espèces de Botryosphaeriaceae

236

9. Discussion et conclusions 237

(9)

Planche photographique 1 : Exemple de cépages français étudiés au cours de ce projet de thèse ... 5

Planche photographique 2: Symptômes d’oïdium par Erysiphe necator : ... 10

Planche photographique 3 : Symptômes de pourriture grise sur grappes par Botrytis cinerea ... 10

Planche photographique 4 : Symptômes du mildiou par Plasmopara viticola ... 10

Planche photographique 5 : Symptômes d’eutypiose par Eutypa lata ... 12

Planche photographique 6 : Symptômes d’Esca ... 12

Planche photographique 7: Symptômes de dépérissements dus aux Botryosphaeriaceae ... 12

Planche photographique 8 : Diversité des souches de différentes espèces de Botryosphaeriaceae étudiées, provenant de France.. ... 23

Planche photographique 9: Chancres et nécroses sur boutures de Cabernet Sauvignon 4 mois après inoculation ... 31

Planche photographique 10 : Mesure de la taille des chancres et des nécroses sur boutures de Cabernet Sauvignon 4 mois après inoculation ... 64

Planche photographique 11 : Exemple de réisolement de l’agent pathogène au niveau de boutures de Merlot sacrifiées, 4 mois après inoculation. ... 64

(10)

Figure 1 : Principaux cépages cultivés en France ... 5

Figure 2 : Schéma simplifié de la taxonomie de Vitis vinifera L. ... 6

Figure 3 : Cycle biologique non détaillé de Vitis vinifera L. ... 6

Figure 3.1: Évolution des quantités de produits phytosanitaires vendues en France de 1996 à 2013 ... 17

Figure 4: Cycle biologique commun aux différents champignons appartenant aux Botryosphaeriaceae en fonction du cycle de la vigne ... 27

Figure 5: Complexes de la chaîne respiratoire ... 45

Figure 6: Voie de biosynthèse des stérols chez les champignons ... 46

Figure 7: Mode de transmission d’une souche infectée par un mycovirus à une souche dite saine ... 50

Figure 8 : Formules des molécules potentiellement élicitrices testées. ... 57

Figure 9 : Schéma modifié représentant les cibles des différentes molécules fongicides utilisées ... 60

Figure 10 : Schéma du protocole d’inoculation et des prélèvements réalisés sur les différents cultivars de vigne ; hpi=heures post inoculation, jpi= jours post inoculation... 65

Figure 11 : Schéma représentant les gènes de la puce NeoViGen-96 et les voies de biosynthèse ... 68

Figure 12 : Localisation des 44 souches étudiées provenant du vignoble français. ... 75

Figure 13 : Taille des chancres 4 mois après inoculation avec les souches dans des boutures de Cabernet-Sauvignon ... 80

Figure 14 : Taille des nécroses sur bouture de Cabernet Sauvigno 4 mois après inoculation ... 82

Figure 15 : Taille moyennes des chancres et des nécroses des souches du genre Diplodia ... 84

Figure 16 : Corrélation entre la taille des chancres et des nécroses avec les souches françaises appartenant à l’espèce D. mutila. ... 85

Figure 17 : Corrélation entre la taille des chancres et des nécroses des souches françaises de D. seriata ... 86

Figure 18 : Taille moyenne des chancres et des nécroses des souches appartenant au genre Neofusicoccum spp. (N. luteum, N. parvum et N. ribis). ... 87

Figure 19 : Corrélation entre la taille des chancres et des nécroses des souches françaises appartenant à l’espèce N. parvum ... 88

Figure 20 : Corrélation entre la taille des chancres et des nécroses des souches appartenant aux Lasiodiplodia spp ... 91

Figure 21 : Corrélation entre la taille des chancres et des nécroses, de l’ensemble des souches étudiées, ... 91

Figure 22 : Corrélation entre la taille des chancres et des nécroses pour les souches isolées dans le vignoble français ... 91

Figure 23 : Distribution des souches selon huit groupes, basés sur le lien existant entre leur taille de chancre et de nécrose 93 Figure 1 : Taille des chancres et des nécroses toute espèce confondue, selon la région française ... 94

Figure 25 : Taille des chancres et des nécroses par les souches de l’espèce D. mutila en fonction de l’origine géographique 94 Figure 26 : Taille des chancres et des nécroses par des souches de l’espèce D. seriata en fonction de l’origine géographique ... 95

Figure 27 : Taille des chancres et des nécroses par des souches de l’espèce N. parvum en fonction de l’origine géographique ... 95

Figure 28 : Croissance mycélienne en AUDPC sur 3 jours, des 65 souches de Botryosphaeriaceae à 15°C ... 103

Figure 29 : Croissance mycélienne en AUDPC sur 3 jours à 15°C des 15 espèces étudiées ... 104

Figure 30 : Croissance mycélienne à 22°C des souches de Botryosphaeriaceae. ... 106

Figure31 : Croissance mycélienne à 22°C des 15 espèces étudiées (AUDPC). ... 107

Figure 33 : Croissance mycélienne en AUDPC sur 3 jours à 25°C des 15 espèces étudiées. ... 111

Figure 36 : Croissance mycélienne en AUDPC sur 3 jours des 65 souches de Botryosphaeriaceae à 33°C ... 117

Figure 39 : Croissance mycélienne en AUDPC sur 3 jours à 36°C des 15 espèces étudiées ... 122

Figure 40 : Croissance mycélienne, en AUDPC, des 15 espèces étudiées ... 123

Figure 41 : Analyse en composantes principales de la répartition des souches de Botryosphaeriaceae selon les valeurs d’agressivité (dimension 1), et de croissance mycélienne (dimension 2) ... 128

Figure 42 : Morphologie de quelques souches sélectionnées pour le séquençage. ... 133

Figure 43 : Profils électrophorétiques (gel d’agarose 0,8%) des ARNds extraits de L. viticola (LAG05), N. parvum (VIE35 et PER20), D. seriata (BoF98-1), D. mutila (BEI36 et BRA08) et de N. luteum (CAP037). ... 134

Figure 44 : Profil électrophorétique (gel d’agarose 1%) des produits d’amplification obtenus avec les ADNc des souches N. parvum et D. mutila. dsPER20 : N. parvum ; dsBRA08 : D. mutila. ... 135

Figure 45 : Répartition des différents virus au sein des souches virosées détectées, exprimée en pourcentage relatif au nombre de détection (23). Bleu foncé = NLFV1, bleu clair = (-) ssRNA, jaune= endornavirus, orange = partitivirus, rouge= diplodia scrobiculata virus 1 et blanc =NLMV1. ... 149

(11)

Figure 48 : Analyse en composantes principales de la taille moyenne des chancres et des nécroses sur boutures de

Cabernet-Sauvignon.. ... 151

Figure 49 : Détermination des CI50 moyennes à l’azoxystrobine (mg/l), des différentes espèces de Botryosphaeriaceae .... 156

Figure 50 : Distribution des CI50 moyennes à l’azoxystrobine (mg/l), au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 160

Figure 51 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité à l’azoxystrobine ... 162

Figure 52 : Détermination des CI50 moyennes de cyazofamide (mg/l), des différentes espèces de Botryosphaeriaceae. ... 165

Figure 53 : Distribution des CI50 moyennes de cyazofamide (mg/l), au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 166

Figure 54 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité à la cyazofamide ... 167

Figure 55 : Détermination des CI50 moyennes de fluopyram, en mg/l, sur les différentes espèces de Botryosphaeriaceae . 168 Figure 56 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité au fluopyram ... 170

Figure 57 : Distribution des CI50 moyennes de fluopyram (mg/l), au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 171

Figure 58 : Détermination des CI50 moyennes de tébuconazole, (mg/l) au sein des espèces de Botryosphaeriaceae ... 173

Figure 59 : Distribution des CI50 moyennes de tébuconazole (mg/l), au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 175

Figure 60 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité au tébuconazole ... 176

Figure 61 : Détermination des CI50 moyennes de spiroxamine, (mg/l) au sein des espèces de Botryosphaeriaceae. ... 179

Figure 62 : Distribution des CI50 moyennes de spiroxamine, au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 180

Figure 63 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité à la spiroxamine ... 181

Figure 64 : Détermination des CI50 moyennes de thiophanate-méthyle, (mg/l) au sein des espèces de Botryosphaeriaceae. ... 184

Figure 65 : Distribution des CI50 moyennes de thiophanate-méthyle (mg/l), au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 185

Figure 66 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité au thiophanate-méthyle ... 186

Figure 67 Distribution des CI50 moyennes de métrafénone (mg/l), au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 189

Figure 68 : Détermination des CI50 moyennes de métrafénone, (mg/l) au sein des espèces de Botryosphaeriaceae. ... 190

Figure 69 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité au métrafénone... 191

Figure 70 : Détermination des CI50 moyennes de cuivre, en mg/l, au sein des différentes espèces de Botryosphaeriaceae .. 194

Figure 71 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité au cuivre ... 194

Figure 72 : Distribution des CI50 moyennes de cuivre (mg/l), au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 195

Figure 73 : Observation d’une inhibition négative chez trois souches françaises de Botryosphaeriaceae, ... 197

Figure 74 Détermination des CI50 moyennes de phosphonate de potassium, en g/l, au sein des différentes espèces de Botryosphaeriaceae. ... 198

Figure 75 : Distribution des effectifs selon leur degré de sensibilité au phosphonate de potassium (LBG) ... 198

Figure 76 : Distribution des CI50 moyennes de phosphonate de potassium (g/l), au sein des espèces, (a) D. mutila, (b) D. seriata et (c) N. parvum. ... 200

Figure 77 : Sensibilité des souches françaises aux différents fongicides (QoI, QiI, SDHI, DMI, IBS.II, β-tubuline, Métrafénone, Cuivre et phosphonate de potassium ) basée sur la CI50. ... 203

Figure 78 : Corrélations entre la sensibilité des espèces N parvum et D. mutila à différents fongicides ... 206

Figure 79 : Corrélation négative entre la résistance au fongicide QoI (mg/l) et la taille des chancres et des nécroses ... 208

Figure 80 : Corrélation négative entre la résistance aux multi-sites (mg/l) et la taille des chancres et des nécroses ... 208

Figure 81 : Evolution temporelle des gènes réprimés ou surexprimés dans les feuilles des trois cépages, Cabernet-Sauvignon, Merlot et Ugni Blanc ... 212

Figure 82 : Clusters hiérarchiques de l’expression relative des gènes de défense, dans les feuilles de boutures de Cabernet-Sauvignon (A), Merlot (B) et Ugni Blanc (C) après perforation à 6 hpp, 2, 6, 15 jpp ... 214

Figure 83 : Analyse en composantes principales de l’expression des gènes de défense exprimés dans les feuilles des boutures de Cabernet Sauvignon, Merlot et Ugni Blanc à 6 hpp, 2 jpp, et 6 jpp après perforation ... 216

Figure 84 : Clustering hiérarchique de l’expression relative (ER) des gènes de défense dans les feuilles (F) et le bois (B) de boutures de Cabernet Sauvignon (A), Merlot (B) et Ugni Blanc (C) à 6 et 48 ... 218

Figure 85 : Analyse en composantes principales de l’expression des gènes de défense exprimés dans les feuilles (F) et dans le bois (B) de boutures de Cabernet Sauvignon (CS), Merlot (Me) et Ugni Blanc (UB), 6 et 48 h après perforation (hpp). .... 219

Figure 86 : Diagramme de Venn représentant les expressions significatives communes entre les trois cépages à 6 et 48 hpp ... 219

(12)

Blanc à 6 hpi, 2, 6 et 15 jpi avec la souche PER20 (N. parvum). ... 223 Figure 89 : Analyse en composantes principales de l’expression des gènes exprimés dans les feuilles de boutures de Cabernet Sauvignon, Merlot et Ugni Blanc à 6 hpi, 2, 6 et 15 jpi après inoculation avec la souche PER20 (N. parvum) ... 224 Figure 90 : Modulations des gènes exprimés dans les différents cépages après inoculation dans le bois (A) et dans les feuilles (B), 6 et 48h après inoculation. ... 225 Figure 91 : Expression relative des gènes de défense dans le bois de boutures de Cabernet Sauvignon, Merlot et Ugni Blanc à 6 hpi et 2 jpi, inoculé avec PER20 (N. parvum). ... 227 Figure 92 : Analyse en composantes principales de l’expression des gènes exprimés dans le bois de boutures de Cabernet Sauvignon, Merlot et Ugni Blanc à 6 hpi ou 2 jpi, après inoculation avec la souche PER20 (N. parvum). ... 228 Figure 93 : Analyse en composantes principales de l’expression des gènes de défense exprimés dans le bois et les feuilles de boutures de Cabernet Sauvignon, Merlot et Ugni Blanc à 6 hpi (A), 48hpi (B), après inoculation avec la souche PER20 (N. parvum) avec leur ellipse de confidence. ... 228 Figure 94 : Cluster hiérarchique des gènes de défense exprimés dans le bois (A et B) ou dans les feuilles (C et D) de Cabernet Sauvignon (CS), Merlot (Me) et Ugni Blanc (UB) en fonction de la référence « Cabernet Sauvignon percé non inoculé » à 6 et 48 hpi ... 229 Figure 95 : Taille des chancres et des nécroses 4 mois après inoculation de boutures de Cabernet Sauvignon avec les souches PER20 et BdF00-3 (N. parvum) et LAT16 (D. seriata ... 232 Figure 96 : Diagramme de Venn représentant les expressions significatives communes ou pas (A), et le pourcentage de gènes modulés (B) ; dans les feuilles de boutures perforées à 2 et 7 jpp après perforation, ... 232 Figure 97 : Cluster hiérarchique de l’expression relative des gènes de défense dans les feuilles de boutures de Cabernet Sauvignon, 48 hpi (A) et 7 jpi (B), après leur inoculation par les souches PER20, BdF00-3 (N. parvum) ou LAT16 (D. seriata) en référence à du Cabernet Sauvignon non inoculé. ... 234 Figure 98 : Diagramme de Venn représentant en rouge les gènes surexprimés et en bleu les gènes réprimés, des PR protéines, des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes et des stilbènes, dans la voie des indoles, des glutathione S-transférases, des oxylipines, du renforcement des structures pariétales et des voies de signalisation ; à 48 hpi (A) et 7 jpi (B). ... 235 Figure 99 : Analyse en composantes principales de l’expression des gènes de défense exprimés dans les feuilles de boutures de Cabernet Sauvignon après 2 jours ou 7 jours d’inoculation avec PER20, BdF00-3 (N. parvum) et LAT16 (D. seriata) par rapport au témoin percé non inoculé. ... 236 Figure 100 : Répartition des souches selon les espèces étudiées du vignoble français ... 240 Figure 101 : Répartition des souches françaises toutes espèces confondues selon la région viticole ... 241

(13)

Tableau 1 : Exemples de maladies parasitaires et de ravageurs de la vigne ... 9

Tableau 2 : Exemple de produits de la liste NODU vert biocontrôle autorisés en France en 2015 . ... 17

Tableau 3 : Caractéristiques et formes anamorphes et téléomorphes des genres étudiés ... 24

Tableau 4 : Quelques exemples de Botryosphaeriaceae identifiés dans les vignobles mondiaux ... 26

Tableau 5 : Modes de dissémination des Botryosphaeriaceae décrits selon la région géographique et le climat. ... 29

Tableau 6 : Tailles des nécroses (en mm) après inoculation des Botryosphaeriaceae spp. ... 32

Tableau 7 : Potentiel de croissance mycélienne des espèces étudiées ... 35

Tableau 8 : Toxines identifiées dans différents hôtes attaqués par Botryosphaeriaceae ... 38

Tableau 9 : Liste des produits fongicides utilisés sur des espèces de Botryosphaeriaceae spp. ... 41

Tableau 10 : Répartition des types de mycovirus selon leur génome ... 48

Tableau 11: Famille de mycovirus de type ARN double brin ... 49

Tableau 12: Amorces utilisées pour la détermination du génotype des souches de Botryosphaeriaceae ... 52

Tableau 12 : Caractéristiques des souches de Botryosphaeriaceae utilisées. ... 53

Tableau 14 : Génotypes des souches de Botryosphaeriaceae étudiées ... 56

Tableau 15 : Détail des produits fongicides utilisés selon le Fungicide Resistance Action Comittee ... 58

Tableau 16 : Liste des milieux utilisés pour la culture des souches ... 61

Tableau 17 : Concentration de matière active des fongicides utilisés ... 63

Tableau 18 : Gènes présents sur la puce « NeoVigen96 » ... 69

Tableau 19 : Caractéristiques des fragments des virus amplifiés ... 74

Tableau 19 : Taille moyenne des chancres et des nécroses dans les boutures de Cabernet-Sauvignon ... 78

Tableau 20 : Taille moyenne des chancres et des nécroses provoquées par les espèces de Botryosphaeriaceae. ... 79

Tableau 21 : Classement des agressivités des 10 souches françaises de N. parvum, ... 87

Tableau 22 : Répartition des 63 isolats en fonction de la présence ou absence de chancre et/ou nécrose et de leur taille au niveau du bois des Cabernet Sauvignon ... 93

Tableau 231 : Croissance mycélienne à 15°C, des souches exprimées en AUDPC ... 102

Tableau 2 : Croissance à 15°C des espèces prélevées dans le vignoble français à 15°C ... 104

Tableau 3 : Croissance mycélienne à 22°C, des souches exprimées en AUDPC ... 105

Tableau 4 : Croissance mycélienne des espèces provenant du vignoble français, à 22°C ... 108

Tableau 5 : Croissance mycélienne des 65 souches exprimées en AUDPC, à 25°C ... 109

Tableau 6 : Croissance mycélienne des espèces provenant du vignoble français à 25°C ... 111

Tableau 7 : Croissance mycélienne des 65 souches exprimées en AUDPC à 28°C ... 112

Tableau 34: Croissance mycélienne des espèces provenant du vignoble français à 36°C ... 123

Tableau 35 : Significativité des croissances mycéliennes des 15 espèces étudiées aux 6 températures testées ... 124

Tableau 36 : Croissance mycélienne de quatre espèces présentes dans le vignoble français selon la région d’origine aux différentes températures ... 126

Tableau 37: Croissance mycélienne de D. seriata et N. parvum présentes dans trois régions viticoles françaises (Aquitaine, Bourgogne, Champagne), aux différentes températures étudiées ... 129

Tableau 38 : Liste et caractéristiques des souches de Botryosphaeriaceae dans lesquelles ont été recherchés les mycovirus et soumises à l’analyse NGS ... 133

Tableau 39 : Homologies des séquences virales trouvées dans les différentes souches (analyses Blastx des lectures et contigs) ... 147

Tableau 40 : Caractéristiques des amorces utilisées pour la détection des six virus identifiés par l’approche NGS ... 147

Tableau 41 : Identification des souches infectées par des mycovirus ... 148

Tableau 42 : Taille des chancres et de nécroses entre des souches infectées ou non provenant de la même parcelle, de la même région et de la même année de collecte, par les virus à ARN ss négatif (marqué ici par un S), P = Partitivirus like ; DsV1 = Diplodia scrobiculata virus 1 like ... 150

Tableau 43: Détermination des CI50 moyennes des 9 fongicides pour les différentes espèces de Botryosphaeriaceae ... 157

Tableau 44 : Détermination des CI50 et CMI d’azoxystrobine, des souches de Botryosphaeriaceae. ... 158

Tableau 45 : Détermination des CI50 et CMI de cyazofamide, sur les souches de Botryosphaeriaceae. ... 164

Tableau 46 : Détermination des CI50 et des CMI de fluopyram, des souches de Botryosphaeriaceae. ... 169

Tableau 47 : Détermination des CI50 et CMI du tébuconazole, des souches de Botryosphaeriaceae ... 174

Tableau 48 : Détermination des CI50 et CMI de la spiroxamine, des différentes souches de Botryosphaeriaceae ... 178

Tableau 49 : Détermination des CI50 et CMI du thiophanate-méthyle, en mg/l, des différentes souches de Botryosphaeriaceae. ... 183

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Tableau 53: Evolution temporelle des gènes réprimés ou surexprimés dans les feuilles des trois cépages, Cabernet-Sauvignon (CS), Merlot (Me) et Ugni Blanc (UB), exprimée en pourcentage des gènes modulés. ... 212 Tableau 54 : Taille des chancres et des nécroses (mm) 12 mois après inoculation de boutures (N=20 par cépage) de Cabernet Sauvignon (CS), Merlot (Me) et Ugni Blanc (UB) avec la souche PER20 (N. parvum). ... 221 Tableau 55 : Gènes modulés spécifiquement dans le bois ou dans les feuilles des différents cépages ... 231 Tableau 56 : Taille des chancres et des nécroses (mm) 4 mois après inoculation de boutures de Cabernet Sauvignon avec PER20 et BdF00-3 (N. parvum) et LAT16 (D. seriata). ... 232

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ADN Acide désoxyribonucléique ADNc ADN complémentaire ARN Acide ribonucléique ARNm ARN messager ARNr ARN ribosomique avr avirulence BDA Black Dead Arm

CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures CI50 concentration inhibant 50%

CMI concentration minimale inhibitrice CODIT Compartmentalization Of Decay In Trees CS Cabernet Sauvignon

CTAB Hexadecyltrimethylammonium Bromide cv Cultivar

DEPC Diethylepyrocarbonate DMI DeMethylation Inhibitors

EDTA Acide Ethylène Diamine Tétraacétique EF1-α Facteur d’élongation 1 alpha

Et Ethylène

ETI effector triggered immunity GLSD Grapevine Leaf Stripe Disease GSTs Glutathione S transferases hpi heure post inoculation

IBS inhibiteur de la succinate deshydrogenase ISR Induced Systemic Resistance

ITS Espace Transcrit de l’ARNr JA Acide Jasmonique

MAMP microbe associated molecular pattern

Me Merlot

Nd non déterminé ORF Open Reading Frame Pal Phaeoacremonium minimum

PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern Pch Phaeomoniella chlamydospora

PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar PR Pathogenesis Related protein PTI PAMP triggered immunity PVPP Polyvinyl(poly)pyrolindone QiI quinone inside inhibtor QoI quinone outside inhibitor qPCR quantitative PCR

RdRp ARN-dépendante-ARN-polymérase Rpm Rotation Par Minute

RT Reverse transcription RT-qPCR Reverse Transcriptase qPCR SA Acide Salicylique

SAR Systemic Acquired Resistance SDHI succinate deshydrogenase inhibitor SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSC Sodium Saline Citrate SSTE SDS Salt TRIS EDTA STE Sodium Tris EDTA UB Ugni blanc

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2

Vitis vinifera L. est une plante pérenne cultivée pour ses fruits et pour les produits qui en

dérivent, dont le vin. Si la production de raisin de table et de cuve ne concurrence pas les grandes cultures agricoles comme le blé, le riz ou encore la canne à sucre, celle-ci représente toutefois l’une des cultures les plus répandues dans les pays producteurs de vin. En 2015, la culture de la vigne représentait 3% de la Surface Agricole Utile (SAU) française, avec 806 131 ha, (OVF,

FranceAgriMer, 2015), soit 15% de la valeur de la production agricole française (Communiqué de presse, OIV, 2014). À travers le monde, plus de 6000 cépages (aussi nommés cultivars ou variétés)

sont recensés. Dans le vignoble français, nous retrouvons de nombreuses variétés telles que : Chardonnay, Cabernet Sauvignon, Merlot, Cabernet Franc, Carignan, Pinot Noir, Sauvignon, Sémillon ou encore Ugni Blanc.

Cette liane ligneuse est soumise à de nombreuses variations environnementales (pratiques culturales, terroir et conditions climatiques), lesquelles peuvent favoriser l’émergence de diverses maladies, dont les maladies de dépérissement du bois. Parmi ces MDB, trois majeures ont été identifiées: l’Eutypiose (Eutypa lata), l’Esca (complexe de champignons dont Phaeomoniella

chlamydospora, Phaeoacremonium minimum, Fomitiporia mediterraneae, E. lata, Botryosphaeria sp.)

et les chancres dus aux Botryosphaeria spp. (Botryosphaeria dieback). Ces champignons se développent seuls ou conjointement au niveau du cep entrainant des nécroses dans le bois et parfois des symptômes foliaires. À plus ou moins long terme, les MDB peuvent conduire à une dépréciation de la qualité du vin, voire à la mort des ceps (Lorrain et al., 2012 ; Larignon et al., 2009). Récemment, l’Observatoire des Maladies Du Bois (MDB) montre une augmentation de l’incidence de dépérissements dans le vignoble français, supérieure à 10% pour l’Esca et les chancres à

Botryosphaeria et proche de 25% pour l’Eutypiose variant d’une région viticole à l’autre et selon les

cépages utilisés (Bruez et al., 2013 ; Spagnolo et al., 2014a).

La famille des Botryosphaeriaceae regroupe les agents responsables des chancres à

Botryosphaeria (Botryosphaeria dieback). Elle représente une vaste famille d’ascomycètes dont

l’implication dans les dépérissements est en constante augmentation. Ces champignons sont retrouvés à travers le monde entier comme endophytes, parasites ou saprophytes sur de très nombreuses plantes ligneuses : acacia, amandier, pommier, manioc, olivier, eucalyptus, pistachier et vigne (Latorre and Toledo, 1984, Maas and Ueker, 1984 ; Brown and Britton, 1986 ; Savocchia et al., 2007; Slippers and Wingfield, 2007 ; Moral et al., 2010; Inderbitzin et al., 2010 ; Yan et al., 2013 ; Jami et al., 2014).

Depuis 2011, plus de 21 espèces de Botryosphaeria sont considérées actuellement comme pathogènes sur vigne (Úrbez-Torres, 2011). Les espèces majoritairement retrouvées sont Diplodia

seriata (forme téléomorphe : Botryosphaeria obtusa) et Neofusicoccum parvum (forme téléomorphe : Botryosphaeria parva). Elles sont accompagnées des espèces Diplodia mutila (forme téléomorphe : Botryosphaeria stevensii), Lasiodiplodia theobromae (forme téléomorphe : Botryosphaeria rhodina), Botryosphaeria dothidea (forme téléomorphe : Fusicoccum aesculi), Neofusicoccum australe (forme

téléomorphe : Botryosphaeria australis) et Neofusicoccum luteum (forme téléomorphe :

Botryosphaeria lutea) (Phillips et al., 2013, Dyssanayake et al., 2016).

En 2008, une campagne de collecte dans 7 régions viticoles françaises et plus de 21 parcelles a permis de mettre en évidence la présence et la diversité de plusieurs genres et espèces de Botryosphaeriaceae (Corio-Costet, 2014, Projet CASDAR V906-907) et de constituer une mycothèque de plus de 600 souches (Collection CoCo). Les deux espèces les plus répandues dans le vignoble sont les D. seriata (86%), suivies des N. parvum (15%) (Larignon et al., 2001), mais de nouvelles espèces ont été identifiées (Comont et al., 2016). Leur pathogénie (décrite pour la première fois en Hongrie par Lehoczki en 1974) et leur agressivité varient beaucoup selon l’espèce considérée (Phillips, 1998 ; Úrbez-Torres and Gubler, 2009). En effet, N. parvum est une espèce très virulente se multipliant rapidement et responsable d’importantes nécroses dans le bois (en conditions contrôlées) alors que D.

(18)

3

seriata est considérée comme beaucoup moins virulente (Castillo-Pando et al., 2001 ; Wood et Wood,

2005 ; Pitt et al., 2013 et Bellée et al., 2017). De même, la virulence des Lasiodiplodia theobromae varie selon leurs régions d’origine (Taylor et al., 2005 ; Úrbez-Torres and Gubler, 2009).

Ces champignons ubiquistes peuvent être responsables de dépérissements du bois de la vigne qui se caractérisent par des chancres et des lésions vasculaires sectorielles (bandes brunes) observés sur les rameaux et les troncs. Des symptômes foliaires, chloroses et dessèchements (variant en fonction de la couleur du cépage infecté et difficilement distinguables des symptômes foliaires de l’Esca) ainsi que des nécroses dans le bois peuvent être observés. Ces agents pathogènes sont retrouvés sur l’écorce et dans le bois, conservés sous forme de pycnides (ou de périthèces). Ils peuvent pénétrer dans la vigne par des blessures (comme des plaies de taille), et ainsi coloniser le bois. La sporulation est favorisée par un climat pluvieux ou humide car en présence d’eau, les pycnides relâchent les ascospores engluées dans un mucus (appelé cirrhe gélatineux) dans l’environnement.

Les méthodes de lutte contre ces maladies sont peu nombreuses et les coûts mondiaux engendrés par le remplacement des ceps morts (par complantation) dépassaient les 1,5 milliards de dollars par an en 2012. En effet, la lutte contre ces maladies est confrontée à une impasse technique depuis le retrait de l’arsénite de sodium en 2001 et à ce jour aucune méthode de lutte chimique performante n’existe, et ce malgré quelques essais de lutte fongicide (Bester et al., 2007). Seules les plaies de tailles sont potentiellement protégées, en particulier contre Eutypa lata, mais les traitements sont coûteux et d’une efficacité souvent modérée. Des méthodes prophylactiques sont donc souvent la seule possibilité de lutte.

Les méthodes de lutte s’orientent aujourd’hui vers de la lutte biologique, la stimulation des défenses de la vigne ou l’amélioration variétale. Cette dernière méthode a permis par croisement de

Muscadinia rotundifolia avec d’autres variétés de Vitis vinifera, d’obtenir des cépages au génotype

partiellement ou totalement résistant (Gindro et al., 2007, Blasi et al., 2011) contre l’oïdium et le mildiou. Cependant, pour des maladies comme les MDB, aucune résistance partielle ou totale n’a été encore décrite (Guan et al., 2016). D’autre part, de nombreuses études concernant l’utilisation de microorganismes (Trichoderma atroviride, Pythium oligandrum) impliqués dans la lutte biologique ont été réalisées (Kotze et al., 2011 ; Yacoub et al., 2016) pour dégager de nouvelles pistes de lutte. Enfin, l’utilisation de stimulateurs de défense des plantes dès les premiers stades de développement de la plante peut être une autre méthode de lutte envisageable.

Mon projet de recherche s’est intégré dans un projet CASDAR 1302 et plus précisément dans l’action 3 « Microflores pathogènes et protectrices du bois de la vigne et réponses adaptatives de la

plante. Développement de marqueurs de tolérance et de diagnostic ». Ce travail avait pour but

d’acquérir des connaissances sur le pouvoir adaptatif des Botryosphaeriaceae aux contraintes environnementales afin de pouvoir expliquer leur agressivité variable et d’utiliser des marqueurs moléculaires de diagnostic, d’état physiologique et d’état de défense de la vigne afin de mieux comprendre les réponses de défense chez différents cépages.

Ainsi, l’objectif de mon étude a été de caractériser différents traits d’histoire de vie de ces agents pathogènes et dans un second temps d’évaluer la sensibilité de cultivars de vigne face à une infection avec N. parvum et D. seriata. J’ai caractérisé les traits d’histoire de vie des

Botryosphaeriaceae pour : (i) leur agressivité in planta, (ii) leur adaptation à des facteurs

environnementaux (e.g. température, fongicides) et (iii) la présence de mycovirus. J’ai par ailleurs étudié le potentiel de défense de différents cépages de vigne (Ugni Blanc, Cabernet Sauvignon et Merlot) selon leur sensibilité/tolérance à différentes souches de Botryosphaeriaceae.

(19)

4 L’ensemble des travaux menés permettront de mieux caractériser les espèces de

Botryosphaeriaceae retrouvées dans le vignoble français et leur degré d’agressivité. De même, l’étude

des interactions entre la vigne et ces agents pathogènes nous permettra de mieux comprendre comment la plante se défend, dans l’optique de développer ultérieurement des méthodes de lutte efficace.

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5

1. La culture de la vigne (Vitis vinifera)

La vigne cultivée est une plante pérenne, sarmenteuse et ligneuse pouvant s’adapter à des environnements variés. Sa culture, pour ses fruits charnus, est ancienne et remonte au deuxième millénaire av. JC (McGovern et al., 1996). En 2014, la superficie viticole mondiale représentait 7534 milliers d’hectares (dont 13,55% en Espagne, 11,01% en Chine, 10,4% en France, et 9,05% en Italie). Un peu plus de 42% de la production de vin (42,6%) est assurée par cinq pays européens (Italie, France, Espagne, Allemagne et Portugal), avec 117 millions d’hectolitres (OIV, 2016). En 2013, la vigne représente 806 131 ha de surfaces cultivées en France, soit 3% de la Surface Agricole Utile (FranceAgriMer, 2011 ; OVF, FranceAgriMer, 2015).

À l’heure actuelle, plus de 6000 cépages (ou cultivars) de Vitis vinifera sont recensés à travers le monde. Dans les vignobles français, nous retrouvons de nombreuses variétés (Figure 1), tels que : le Cabernet Sauvignon, le Merlot, le Cabernet Franc, le Carignan, le Chardonnay, le Gamay, le Grenache, le Pinot Noir, le Sauvignon, le Sémillon ou encore l’Ugni Blanc (Planche photographique 1). Les vignes américaines sont surtout utilisées comme porte-greffe car elles sont connues pour être résistantes à de nombreuses maladies, dont le phylloxera et présenter une meilleure tolérance à la sécheresse.

Figure 1 : Principaux cépages cultivés en France, d’après France AgriMer, DGDDI-CVI Foncier, 2015

Cette angiosperme dicotylédone appartient à l’ordre des Rhamnales et à la famille des Vitaceae. Les Vitaceae réparties pour la plupart dans l’hémisphère Nord, sous climat tempéré, comptent 14 genres dont la vigne (Vitis), et le genre Vitis est composé d’environ 80 espèces,. Il se subdivise en deux sous-genres, les Muscadinia et les Vitis (anciennement Euvitis). Le sous-genre Muscadinia, dont fait partie Muscadinia rotondifolia (utilisée dans les programmes d’amélioration et de résistance variétale), possède 2n=40 chromosomes et diffère morphologiquement et biologiquement du sous-genre Vitis (2n=38). Parmi les vignes cultivées, nous retrouvons notamment la vigne européenne, Vitis vinifera L., la plus répandue (P. Galet, 2000). Sous cette appellation nous retrouvons Vitis vinifera sylvestris, la vigne sauvage, et la vigne cultivée ou Vitis vinifera sativa. Celle-ci est divisée en de nombreuses variétés issues tant de croisements naturels que de la sélection variétale (Figure 2).

(22)

6

Planche photographique 1 : Exemples de cépages français étudiés au cours de ce projet de thèse

A- Cabernet Sauvignon ; B- Merlot noir ; C- Ugni Blanc (Ephytia, INRA)

Figure 2 : Schéma simplifié de la taxonomie de Vitis vinifera L.

A

B

C

Angiosperme Ordre des Rhamnales

Sous-espèce V. vinifera sativa Sous-espèce V. vinifera sylvestris Espèce Vitis vinifera Vitis (anciennement Euvitis) Muscadinia Sous-genres Genre Vitis Famille Vitaceae

Dont une espèce À titre d’exemple M. rotondifolia

(23)

7

Le développement de la vigne suit deux cycles distincts, le cycle végétatif, comprenant le cycle reproductif, et le cycle hivernal :

- Le cycle hivernal s’étend du mois de novembre dans l’hémisphère Nord et ce jusqu’au mois de février-mars, la vigne est alors en dormance et la circulation de la sève s’arrête. - La croissance végétative démarre quant à elle, entre les mois de mars et avril avec les pleurs - la sève se remet à circuler et le débourrement des bourgeons et le développement des inflorescences se produit. La croissance des feuilles et l’élongation des rameaux ont lieu jusqu’au mois de juillet. Entre mai et juin, c’est le début de la floraison avec la libération du pollen. Après fécondation, la grappe se forme et atteint sa taille définitive vers la fin de juillet. C’est l’étape de nouaison. La véraison s’effectue généralement en août avec un changement de couleur des baies : noir pour les cépages colorés et translucide ou jaunâtre pour les cépages blancs. La composition du raisin subit de fortes modifications : diminution de la teneur en acides (dont l’acide malique) et forte accumulation de sucres. La maturité a lieu entre fin août et fin septembre, c’est la période des vendanges. Le mois suivant, les rameaux s’épaississent et durcissent en prévision du nouvel hiver (aoûtement). Il y a défeuillaison et entrée en dormance (Figure 3).

-

Figure 3 : Cycle biologique non détaillé de Vitis vinifera L. (source personnelle)

2. Les bio-agresseurs de la vigne

La vigne cultivée est sensible à de nombreux agents pathogènes (Tableau 1). Elle peut être attaquée par des insectes ravageurs (dont les tordeuses de la vigne, les cicadelles ou le Phylloxera). Des phytovirus (plus de 70 virus différents) peuvent également infecter la vigne, tout comme des agents bactériens, des phytoplasmes et des agents fongiques.

Parmi les pathogènes fongiques, 3 pathogènes majeurs sont connus pour attaquer préférentiellement les parties herbacées de la vigne: Erysiphe necator, responsable de l’oïdium (Planche photographique 2), Botrytis cinerea, responsable de la pourriture grise

Cycle biologique de Vitis vinifera Débourrement Développement des feuilles Apparition des inflorescences Floraison Développement des fruits Maturation des baies

Sénescence _{Bourres, Pointe verte}Bourgeons, Pleures,

Feuilles rudimentaires Au stade Quatre feuilles étalées

Des grappes visibles et séparées aux boutons floraux

séparés

Floraison, ouverture des fleurs, pleines fleurs et fin de floraison

Nouaison, Stade petit pois Fermeture de la grappe Véraison et récolte Maturité des bois et chute des feuilles

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8

(Planche photographique 3), et Plasmopara viticola, un oomycète responsable du mildiou (Planche photographique 4). D’autres agents pathogènes fongiques sont préjudiciables pour le bois et la pérennité des ceps. Parmi ceux-ci, citons :

- l’Eutypiose ou la « maladie du bras mourant » causée par le champignon lignicole ascomycète Eutypa lata. Ce champignon a été identifié sur la vigne en 1973 par Carter et Price et attaque le tronc et les bras des ceps en entrainant un flétrissement et la mort du pied. Entre 2004 et 2008, 50% du vignoble français présentait des symptômes foliaires de type Eutypiose (Planche photographique 8). L’expression de la maladie varie en fonction de la parcelle, de l’âge du cep, des cépages et des années. Cette maladie nécessite de remplacer les ceps morts sur les parcelles, rendant les parcelles « jeunes » et hétérogènes, ce qui contribue à une dévaluation tant du volume récolté que de la qualité du vin

- l’Esca, caractérisé par Viala en 1926 comme une apoplexie des ceps associée à une pourriture blanche dans le bois (amadou). Les ceps les plus touchés sont en général âgés de 15 à 25 ans, toutefois des jeunes plants peuvent aussi montrer des symptômes (Romanazzi et al., 2009). Les symptômes apparaissent en été et sont récurrents pendant cette période mais leur expression peut varier d’une année à l’autre (Maher et al., 2012). Il y a formation de nécroses centrales ou sectorielles dans le bois dues à un complexe de champignons pathogènes (Phaeomoniella chlamydospora, Phaeocremonium aleophilum, Eutypa lata, Fomitiporia punctata, Stereum hirsutum et des Botryospaheriaceae). La plupart de ces champignons se disséminent par voie aérienne ou contaminent les ceps lors des tailles. Des symptômes foliaires peuvent être observés et ceux-ci s’expriment selon deux formes : la forme apoplectique ou foudroyante (le cep est totalement ou partiellement desséché en quelques heures ou quelques jours) ou bien la forme lente (coloration rouge/jaune autour des tissus nécrosés, brune sur le limbe des feuilles) (Lecomte et al., 2012). Les symptômes sur fruits peuvent se traduire par l’apparition de tâches brunâtres sur les baies ainsi que des flétrissements et dans certains cas un retard de la maturation (Planche photographique 9). - le Botryosphaeria dieback ou BDA (black dead arm) caractérisé par la présence de champignons de la famille des Botryosphaeriaceae, classés comme des agents pathogènes responsables de maladies de dépérissement chez la vigne. Ceux-ci ont une agressivité très variable d’une espèce à l’autre. Dans le vignoble français, 13 espèces de Botryosphaeriaceae ont été recensées (G. Comont et M-F. Corio-Costet, 2008, Comont et al., 2016). Parmi les genres rencontrés, nous retrouvons, les Botryosphaeria, les Diplodia, les Dothiorella, les Lasiodiplodia et les Neofusicoccum (Planche photographique 10).

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Tableau 1 : Exemples de maladies parasitaires et de ravageurs de la vigne (liste non exhaustive)

Type d’attaque Agresseurs Références

Ravageurs

Insectes phytophages

Cochylis Eupoecilia ambiguella Hübner 1796

Eudémis Lobesia botrana Denis and Schiffermüller 1775

Cicadelles Empoasca vitis Gothe 1875

Phylloxera Daktulosphaira vitifoliae Fitch 1851

Pyrale Sparganothis pilleriana Denis and Schiffermüller 1775

Insectes vecteurs Pourriture acide Drosophila spp. - Flavescence dorée Scaphoideus titanus -

Acariens phytophages

Acariose Calepitrimerus vitis Nalepa 1905

Erinose Colomerus vitis Pagenstecher

Acarien rouge Panonychus ulmi Koch

Maladies parasitaires

Bactéries et phytoplasmes

Maladie de Pierce Xylella fastidiosa Pierce 1892

Nécrose bactérienne Xylophilus ampelinus Panagopoulos 1969

Bois noir Hyalesthes obsoletus

Virus

Enroulement de la vigne Grapevine Leaf Roll associated

Virus

Court-noué Grapevine fanleaf virus Hewitt and Grogan, 1967 Arabic Mosaïc Virus

Grapevine fleck virus

Pinot gris virus Glasa et al., 2014

Grapevine Red globe virus Beuve et al., 2015a; 2015b

Champignons

Oïdium Uncinula necator

Mildiou Plasmopora viticola

Pourriture grise

Pourriture noble Botrytis cinerea

Maladie de Pétri Phaeomoniella chlamydospora

Esca/BDA Fomitiporia punctata Stereum hirsutum Phaeoacremonium aleophilum Eutypa lata Phaeomoniella chlamydospora Botryosphaeria

Eutypiose Eutypa lata

Moller et al., 1978, Mahoney et al., 2003 Lecomte et al., 2000

Anthracnose Elsinoë ampelina Shear 1929

Black rot Guignardia bidwellii Vialla and Ravaz 1982

Excoriose Phomopsis viticola Sacc. 1915

Dépérissement du aux

Botryosphaeriaceae Botryosphaeria spp.

3. Les mécanismes de défense chez les plantes

Toutes les plantes possèdent un système d’immunité innée (innate immunity) permettant la mise en place de signaux locaux ou systémiques à partir du point d’infection (Jones and Dangl, 2006). Une réponse de défense est alors induite par un signal que l’on nomme éliciteur, lequel peut être d’origine exogène ou endogène (Angelova et al., 2006), et peut correspondre à des oligosaccharides, des glycoprotéines ou encore à des lipides de l’agent pathogène et/ou issus de la dégradation de la plante par l’agent pathogène. Au cours de l’infection, la plante reconnait ces éliciteurs et peut induire deux types de réponse : la résistance basale PTI (PAMP-Triggered Immunity) ou la résistance race spécifique ETI (Effector-Triggered Immunity).

 La résistance basale PTI

Dans ce cas, la plante reconnait des éliciteurs généraux grâce à des récepteurs non spécifiques (PRR : Pattern Recognition Receptor). Selon l’origine des éliciteurs, leur terminologie diffère. En ce qui concerne les éliciteurs exogènes, ils sont nommés PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern) ou MAMP (Microbe Associated Molecular Pattern),

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Planche photographique 2: Symptômes d’oïdium par Erysiphe necator : A- Tâches duveteuses sur la face

supérieure de la feuille ; B- Poussière blanche couvrant les baies ; C-Tâches brunes sur tiges (Ephytia, INRA)

Planche photographique 3 : Symptômes de pourriture grise sur grappes par Botrytis cinerea (Ephytia, INRA)

Planche photographique 4 : Symptômes du mildiou par Plasmopara viticola : A- Tâches d’huile sur la face

supérieure de la feuille ; B- Feutrage blanc sur la face inférieure de la feuille (Ephytia, INRA)

A

B

C

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quand ils sont relatifs à un agent pathogène ou à un microorganisme, respectivement. Lorsque les éliciteurs sont endogènes, c’est-à-dire qu’ils proviennent de la plante elle-même et sont produits suite à l’action d’un agent pathogène sur celle-ci, ils sont nommés DAMP (Damage Associated Molecular Pattern) (Henry et al., 2012 et Kushalappa et al., 2016). Dans tous ces cas, suite à la reconnaissance des éliciteurs, il y a alors induction de la résistance basale (Boller and Felix, 2009 et Jones and Dangl, 2006).

 La résistance race-spécifique ETI

Certains agents pathogènes réussissent à coloniser des cellules de l’hôte par sécrétion d’effecteurs inactivant les PRR (Protein Recognition Receptors) pour contourner la PTI. Si toutefois la plante reconnait ce type d’effecteurs, non généraux, grâce à un récepteur spécifique R, produit par un gène dit d’avirulence (Avr), l’ETI est activée et la résistance est alors rétablie (Boller and Felix, 2009 ; Jones and Dangl, 2006).

 La transduction du signal et la mise en place des réactions de défense

Ainsi, l’évolution du système immunitaire chez la plante et ses mécanismes de reconnaissance sont influencés par la pression de sélection exercée par les bioagresseurs. Le modèle « ZigZag » représente ces interactions et cette co-évolution (Jones and Dangl, 2006). Une cascade de signalisation est déclenchée suite à la reconnaissance des éliciteurs, conduisant à une réponse de défense de la plante. Très rapidement après la perception du stress biotique, dans le but de détruire l’agent pathogène, de limiter sa progression dans la plante ou d’amplifier le signal, les flux ioniques, la production de formes actives de l’oxygène (FAO) sont modifiés au niveau intracellulaire (Zaho et al., 2005). Parmi les évènements précoces, sont également rapportées des phosphorylations/déphosphorylations, comme la phosphorylation de diverses MAP kinases permettant le transfert du signal vers le noyau (Zhang and Kesslig, 2001). Suite à ces premières réponses, l’expression de plusieurs gènes de défense va alors être modulée.

Cela permettra en aval, pour exemple, la synthèse de protéines PR (Pathogenesis-Related), le renforcement de la paroi (lignine et accumulation de glycoprotéines riches en hydroxy-proline (HRGP), de protéines riches en proline (PRP), et de protéines riches en glycine (GRP)), (Bradley et al., 1992 ; Low and Merida, 1996 ; Aziz et al., 2004), ainsi que, dans certains cas, des réactions d’hypersensibilité (HR) (Rodriguez et al., 2010).

Dans un second temps, pour assurer une réponse générale de défense au niveau de la plante entière, et non seulement au niveau local, suite à la reconnaissance du signal éliciteur, une signalisation intercellulaire se met en place : il s’agit de la résistance systémique acquise ou SAR (Systemic Acquired Resistance). Elle est assurée par trois hormones principales : l’acide salicylique (AS), l’acide jasmonique (AJ) et l’éthylène (Bari and Jones, 2009). Selon le type d’agent pathogène/l’éliciteur perçu, l’une ou l’autre, ou l’une et l’autre peut être activée et les interactions entre ces voies sont complexes. Il est décrit qu’avec un agent biotrophe l’activation de la voie de l’AS est favorisée, alors qu’un agent nécrotrophe induira plutôt celles du JA et de l’éthylène, même si aujourd’hui de nombreux travaux remettent en question ce modèle « simpliste ».

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Planche photographique 5 : Symptômes d’eutypiose par Eutypa lata : A- Lésions nécrotiques brunes,

intervernaires ; B- Nécrose sectorielle dans le bois ; C- Pousses issues d’un bras infecté avec une croissance ralentie, des entre-nœuds courts et des feuilles chlorotiques (Ephytia, INRA)

Planche photographique 6 : Symptômes d’Esca : A- Dépérissement du rameau ; B- Dessèchement de la

feuille ; C- Dessèchement de la grappe (Ephytia, INRA)

Planche photographique 7: Symptômes de dépérissements dus aux Botryosphaeriaceae : A- Nécroses

longitudinales ou bandes brunes ; B- Nécrose sectorielle ; C- Chancres dus aux Botryosphaeriaceae (Ephytia,

INRA)