REVUE
Les oxydoréductases intervenant en malterie-brasserie
Catherine BILLAUD*, Jacques NICOLAS
SUMMARY Main oxidoreductases involved in the malting and brewing technological processes.
Organoleptic quality of beer during storage can be dramatically altered as a result of chemical and/or enzymatic oxidation of endogenous polyunsaturated lipids and phenolic compounds originating from brewery barley. Enzymatic- mediated oxidative reactions can take place during different stages of the pro- cess, viz barley germination, malt kilning and at the beginning of mashing. In this respect, the action of oxidoreductases can lead to flavour deterioration resulting in the development of staling and off-flavours, occurrence of haze, modification of bitterness and astringency, as well as a modification of the colour of the processed product. This review is undertaken to get a better knowledge on the relative importance of five oxidoreductases in beer deterio- ration. As a matter of fact, superoxide dismutase is one of the most important antioxidative enzymes which protects the medium from superoxide radicals by catalyzing the dismutation of •O2–into molecular oxygen and H2O2. The action of this oxidoreductase can next be relayed by catalase. This latter, by speeding up the dismutation of H2O2, a reactive oxygen species, may constitute an in situ primary antioxidant system. Polyphenoloxidase and peroxidase are able to catalyze the O2or H2O2-mediated oxidation of endogenous polyphenols in reactive quinonic compounds and give rise to secondary oxidations altering the quality of beer. Moreover, peroxidase is also susceptible to realize oxidative cross-linking between proteins and/or soluble pentosans and, consequently, may hinder lautering and filterability of beer. Lastly, lipoxygenase, which cata- lyzes the oxidation of polyunsaturated free fatty acids, is mostly responsible for the production of volatile aldehydes such as trans 2-nonenal, originating from 9-hydroperoxide, widely suspected of leading to staling of beer. In this respect, the main biochemical characteristics of oxidoreductases and some of their physico-chemical properties will be first summarized ; thereafter, the effects of these enzymatic reactions during the processing, from barley to beer, will be described, with a special attention for the evolution of oxidoreductases activity as well as some possible interventions of these oxidoreductases on organolep-
Conservatoire national des arts et métiers, Chaire de biochimie industrielle et agroalimentaire, 292 rue Saint-Martin, 75141 Paris cedex 03, France.
* Correspondance billaudc@cnam.fr
tic and rheological properties of mash and beer during the technological pro- cess.
Key-words: oxidoreductase, superoxide dismutase, catalase, peroxidase, poly- phenoloxidase, lipoxygenase, malting, brewing.
RÉSUMÉ
La qualité organoleptique de la bière peut évoluer défavorablement au cours du stockage par suite de phénomènes d’oxydation chimique et/ou enzyma- tique des lipides polyinsaturés et des composés phénoliques endogènes de l’orge brassicole. Les réactions oxydatives catalysées par des oxydoréduc- tases peuvent survenir durant plusieurs étapes du procédé technologique de fabrication : germination de l’orge, touraillage du malt vert et début du bras- sage, au moment de la formation des moûts de brasserie. Leur action pourra entraîner une altération de flaveur, l’apparition d’un trouble colloïdal, des chan- gements d’amertume et d’astringence, ou une modification de coloration du produit fini. Cette revue se propose de mieux cerner l’intervention potentielle de cinq oxydoréductases : superoxyde dismutase, catalase, peroxydase, poly- phénoloxydase et lipoxygénase, sur la qualité sensorielle de la bière. Après avoir rappelé leurs principales caractéristiques biochimiques et certaines de leurs propriétés physicochimiques, nous décrirons l’évolution de leur activité tout au long du procédé de fabrication de la bière, en tentant de caractériser les interdépendances — synergies ou antagonismes — entre ces oxydoréduc- tases et avec d’autres systèmes enzymatiques. Nous envisagerons également leurs effets potentiels sur les modifications rhéologiques et organoleptiques des moûts et du produit fini.
Mots clés : oxydoréductase, superoxyde dismutase, catalase, peroxydase, polyphénoloxydase, lipoxygénase, maltage, brassage.
1 - INTRODUCTION
Tout au long du processus de fabrication et des étapes ultérieures, la qualité organoleptique de la bière dépend largement de la présence d’enzymes cataly- sant des réactions d’oxydoréduction. C’est ainsi que l’altération de la flaveur de la bière lors de son stockage est attribuée principalement à la présence de composés carbonylés. En particulier, un aldéhyde volatil, le trans 2-nonénal, dont le seuil de perception sensorielle est estimé à 0,035 µg·L–1, a été identifié comme composé responsable de flaveurs indésirables du type carton, papier…, plus communément désigné sous le terme de goût d’éventé ou d’oxydé (MEIL- GAARD, 1993). Son apparition, comme celle d’autres composés carbonylés, a souvent été mise en relation avec un processus d’oxydation des lipides de l’orge qui sont très majoritairement insaturés avec environ 15 % d’acide oléique, 57 % d’acide linoléique et 7 % d’acide linolénique (ANNESSet BAXTER, 1983).
L’orge renferme par ailleurs des composés phénoliques divers (acides phé- noliques, flavonoïdes, tannins) qui participent à la protection du grain vis-à-vis des mécanismes oxydatifs. En association avec les polyphénols extraits du houblon, ils joueront un rôle important dans la perception organoleptique de la
bière puisqu’ils sont en grande partie responsables de son caractère d’amer- tume et d’astringence, mais aussi de sa coloration.
De nombreux types de réactions oxydatives peuvent se produire par autoxy- dation, catalysées par des ions métalliques de transition (Cu2+, Fe2+) ou par suite de l’activité d’enzymes d’oxydoréduction. L’oxydation des acides gras insaturés catalysée par la lipoxygénase semble être la voie prioritaire de forma- tion de faux-goûts dans la bière (DROSTet al., 1990).
L’oxygène moléculaire est donc un élément essentiel à prendre en compte pour la sauvegarde des propriétés sensorielles de la bière après son condition- nement. La présence d’enzymes d’oxydoréduction dans l’orge et le malt est susceptible d’orienter les réactions catalytiques vers la production privilégiée de métabolites primaires (hydroperoxydes pour les acides gras polyinsaturés, composés quinoïdes pour les polyphénols), instables et donc très réactifs. Ces derniers, formés dès le début du maltage, sont capables d’agir très rapidement sur un grand nombre de molécules (protéines, composés thiols, polyosides, pigments, vitamines…) et d’en modifier les propriétés nutritionnelles, organolep- tiques et fonctionnelles (MATHEISet WHITAKER, 1984a, b).
Plusieurs systèmes enzymatiques interviennent en malterie-brasserie pour catalyser des réactions redox impliquant l’oxygène et ses dérivés : superoxyde dismutase, catalase, peroxydase, polyphénoloxydase et lipoxygénase (BILLAUD, 1999). Les enzymes sont apportées par l’orge, le malt et les céréales (succéda- nés) employés au moment du brassage. Certaines vont promouvoir l’apparition d’espèces réactives de l’oxygène ou, à l’inverse, tendre à les détruire (BAM- FORTH et al., 1993). D’autres utilisent directement l’oxygène moléculaire pour catalyser l’oxydation de composés endogènes de l’orge et du malt (polyphé- nols, lipides insaturés) et peuvent aussi conduire à une modification de la qua- lité sensorielle du produit fini. L’importance technologique de ces enzymes d’oxydoréduction en technologie brassicole justifie donc de leur accorder une attention particulière et la mise au point que nous proposons au lecteur.
Après avoir rappelé le(s) mécanisme(s) réactionnel(s) de chacune d’entre elles, nous insisterons sur leur présence et leur incidence sur la qualité organo- leptique de la bière.
2 - STRUCTURE DU GRAIN D’ORGE ET LOCALISATION DES OXYDORÉDUCTASES
L’orge de brasserie (Hordeum vulgare L.) est une céréale à grains vêtus dont l’enveloppe (ou écorce, tégument) dure et résistante est formée de deux glu- melles en-dessous desquelles se trouve le péricarpe. Celui-ci représente la véri- table enveloppe du grain et recouvre le testa (figure 1A). L’amande du grain renferme un amas de cellules où sont emmaganisés des granules d’amidon (albumen) insérés dans une matrice protéique. Les parois des cellules de l’albu- men sont principalement constituées de chaînes de β-glucanes reliées par de courtes chaînes peptidiques et que recouvre une couche superficielle d’arabi- noxylanes.
En périphérie, une couche à aleurone, plus riche en matières protéiques que le reste de l’amande, dont les parois cellulaires sont, elles aussi, formées d’une couche externe de pentosanes et d’une couche interne de β-glucanes, consti- tue « la fabrique d’enzymes » de la graine. À l’une des extrémités de l’amande, l’embryon, siège des activités vitales du grain et à partir duquel émergeront pousses et racines, est séparé de l’albumen par les cellules de l’épithélium scu- tellaire et le scutellum.
Le développement du grain s’accompagne de la croissance de l’embryon et de la production de phytohormones qui vont activer la couche à aleurone, puis de la synthèse d’enzymes hydrolytiques et d’oxydoréduction qui diffuseront à travers l’albumen (OLKKU et al., 1990). Au sein du grain mature, les systèmes enzymatiques d’oxydoréduction sont diversement localisés (figure 1B). Il faut cependant préciser que cette répartition n’est pas figée, la période germinative du grain s’accompagnant le plus souvent de l’apparition de nouvelles formes enzymatiques, dont la distribution dans les parties du grain est variable.
Figure 1
Structure simplifiée du grain d’orge (A). Localisation des systèmes enzymatiques d’oxydoréduction dans le grain mature (B)
Simplified structure of the barley kernel (A). Distribution of oxidoreductases in the mature grain (B)
A
B
3 - RÉACTIONS OXYDATIVES AU COURS DE LA TECHNOLOGIE DE LA FILIÈRE MALTERIE-BRASSERIE
Les étapes de fabrication qui mènent du grain à la bière font appel à deux industries le plus souvent géographiquement séparées mais étroitement asso- ciées : la malterie et la brasserie. Les procédés technologiques de maltage de
Figure 2
Réactions oxydatives intervenant durant les étapes de fabrication de la bière E, NE : réactions de type enzymatique (E) ou chimique (NE)
Oxidative reactions occurring during the processing of beer E, NE: enzymatic (E) or chemical reactions (NE)
l’orge, du brassage et de la fermentation du malt ont été rappelés dans une revue récente (BILLAUDet DELESTRE, 2000). Au cours de ces différentes étapes, des réactions d’oxydation chimiques et/ou enzymatiques des constituants du malt et de la bière sont susceptibles d’intervenir (figure 2). Elles seront intensi- fiées par les opérations d’aération, d’hydratation et les traitements thermiques modérés appliqués au malt vert et au moût de brasserie. En fin de touraillage et au moment de l’ébullition du moût, les chauffages plus intenses auront pour conséquence une inactivation des systèmes enzymatiques thermosensibles puis une destruction totale des oxydoréductases.
4 - LE SYSTÈME SUPEROXYDE DISMUTASE
4.1 Caractéristiques biochimiques et localisation
Les superoxyde dismutases (SOD, superoxyde : superoxyde oxydoréduc- tase, EC 1.15.1.1) fournissent in situ un système de protection naturel contre les réactions oxydatives de la bière. Il s’agit de métalloprotéines qui catalysent la dismutation de l’anion superoxyde (•O2–) en O2moléculaire et H2O2, l’ion métal- lique du site actif subissant des cycles d’oxydoréduction (FRIDOVICH, 1983) et dont l’équation générale est la suivante :
2 •O2–+ 2 H+→H2O2+ O2
C’est une des réactions enzymatiques les plus rapides connues à ce jour. Il existe trois types distincts de SOD — présentes virtuellement chez tous les organismes vivants — qui catalysent le même type de réaction avec une effica- cité comparable. Leur distinction est basée sur la nature de l’ion métallique de transition du site actif, qui est le fer non héminique (Fe3+/Fe2+), le manganèse (Mn3+/Mn2+) ou le cuivre (Cu2+/Cu+). Différentes propriétés caractérisent et diffé- rencient ces trois formes de SOD (tableau 1). Il faut néanmoins souligner que cette classification et la distribution des SOD souffrent de nombreuses anoma- lies et exceptions.
La plupart des Fe-SOD et Mn-SOD sont spécifiques de l’ion métallique situé au site actif, et son remplacement entraîne une perte d’activité enzymatique. De la même façon, dans le cas des Cu, Zn-SOD, le cuivre fonctionne comme trans- porteur d’électrons pendant le cycle catalytique, tandis que le zinc semble avoir un rôle structural en maintenant la conformation du site actif (figure 3). Le rem- placement du cuivre par un autre ion métallique entraîne l’inactivation complète de l’enzyme (FRIDOVICH, 1975).
Les SOD sont le premier rempart d’un système élaboré de défense dont font partie également les catalases et les peroxydases ; ces trois systèmes enzyma- tiques agissent en synergie et se protègent mutuellement (FRIDOVICH, 1983).
Dans les grains, la SOD est majoritairement localisée dans l’embryon, le scu- tellum et parfois dans les tissus de réserve (albumen ou cotylédons). Son acti- vité augmente fortement avec la germination et les premiers stades de développement de la plante (GIANNOPOLITISet RIES, 1977), en relation avec l’ap- parition de plusieurs isoformes (DONNELY et ROBINSON, 1991 ; ROBINSON et al., 1996).
Tableau 1
Propriétés des trois types de SOD (d’après DONNELLYet ROBINSON, 1991) Table 1
Properties of the metalloforms of SOD (from DONNELLYet ROBINSON, 1991)
Caractéristique CuZn-SOD Mn-SOD Fe-SOD
Dimère Dimère (procaryotes) Dimère, quelquefois Forme moléculaire 2 sous-unités tétramère (eucaryotes) tétramère
identiques 2 (4) sous-unités 2 (4) sous-unités
identiques identiques
Ion métallique du 1 Cu2+et 1 Zn2+ 1 ou 2 Mn2+par dimère 1 Fe3+par sous-unité groupement par sous-unité
prosthétique
Poids moléculaire 32 000 42 000 à 40 000 à
46 000 (dimère) 46 000 (dimère) Inhibition par CN– Inhibition à 1 mM Pas d’effet Pas d’effet Inhibition par H2O2 Inhibition à 0,5 mM Pas d’effet Inhibition à 0,5 mM Inhibition par le Pas d’effet Effet inhibiteur Effet inhibiteur chloroforme/éthanol
Effet de l’azoture 10 % d’inhibition 30 % d’inhibition 70 % d’inhibition (10 mM)
Effet du sodium Stable jusqu’à 4 % Instable à 1 % Instable à 1 % dodécyle sulfate (SDS)
Effet du pH sur Pas d’effet entre Diminution de l’activité Diminution de l’activité l’activité enzymatique pH 5 et 10 à pH > 8 à pH > 8
Figure 3
Mécanisme réactionnel de la CuZn-SOD Im : noyau imidazole d’un résidu histidine (d’après FRIDOVICH, 1986)
Reactional scheme of CuZn-SOD
Im: imidazole ring from an histidine residue (from FRIDOVICH, 1986)
Tableau 2 Évolution de l’activité SOD au cours du maltage Table 2 Evolution of SOD activity during malting OrgeMesureOrgeOrgeMaltMalt Références (récolte)de l’activité SODnativetrempéeverttouraillé var. SonjaSpectrophotométrie—d’après BAMFORTH, 1983 (< 1983)(550 nm), pH 7,8a2,0 unités/grainc2,210,5 var. TriumphSpectrophotométrie (< 1991)(550 nm), pH 8,0a1,0b—6,17,4dBAMFORTHet al., 1991 var. TriumphSpectrophotométrie (< 1992)(550 nm), pH 8,0a50,4 unités·g–1m.s.c107,6304,8375,5dCLARKSONet al., 1992 a: Mesure de l’activité enzymatique basée sur l’inhibition de la réduction du ferricytochrome c dans un système ferricytochrome c (10 mM)/xanthine (50 µM)/xanthine oxydase; b: unités arbitraires; c: 1 unité d’activité SOD équivaut à la quantité d’enzyme nécessaire pour provoquer 50% d’inhibition de la réduction du ferricyto- chrome c par l’anion superoxyde formé au cours de l’oxydation de la xanthine; d: malt de type lager.
4.2 Évolution et rôle de la SOD en malterie-brasserie
Dans l’orge native, elle se présente sous trois isoformes dont deux formes prédominantes (CuZn-SOD) et une forme d’activité plus discrète (Mn-SOD) pro- bablement d’origine mitochondriale (BAMFORTH, 1983). Selon la variété étudiée, les quantités de SOD varient de 1 à 3 (BAMFORTH, 1983).
Le trempage du grain entraîne un accroissement de l’activité SOD globale (tableau 2), mais c’est surtout au cours de la germination que l’activité se déve- loppe fortement dans l’acrospire, les radicelles et l’albumen (CLARKSON et al., 1992) par suite d’une synthèse de novo, en partie stimulée par l’acide gibbérél- lique (BAMFORTH, 1983).
Tableau 3
Niveaux relatifs d’activité SOD, CAT, POD, PPO et LOX dans différents types de malts
Table 3
Relative SOD, CAT, POD, PPO and LOX levels in different malts
Orge Orge Malt commercial Malt commercial Références
native de type lager a de type ale b SOD
var. Sonja 1,0 3,02-3,7 1,7-2,4 d’après BAMFORTH, 1983
var. Triumph 1,0 6,9-7,5 3,4 BAMFORTHet al., 1991 ;
CLARKSONet al., 1992 CAT
var. Triumph 1,0 13,0-15,0 1,1 BAMFORTHet al., 1991 ;
CLARKSONet al., 1992 POD
var. Triumph 1,0 2,2-2,8 2,6 BAMFORTHet al., 1991 ;
CLARKSONet al., 1992 PPO
var. Triumph 1,0 0,003-0,04 0 BAMFORTHet al., 1991 ;
CLARKSONet al., 1992 LOX
var. Triumph 1,0 0,1 0,04 d’après BAXTER, 1982
— 1,0 0,1-0,4 0,04-0,09 SCHWARZet PYLER, 1984
a: Pour les malts destinés à la production de bières de type lager, l’étape de séchage débute à une température proche de 50-55 °C et les températures maximum de touraillage dépassent rarement 75- 85 °C ; b: Pour les malts destinés à la production de bières de type ale, l’étape de séchage débute à une température proche de 60-65 °C et les températures maximum de touraillage peuvent atteindre 95-105 °C.
Le touraillage du malt vert, dans des conditions de formation de malt de type ale, détruit partiellement la SOD alors que des conditions moins sévères de touraillage (type lager) affectent peu l’activité (tableau 3).
L’activité résiduelle contenue dans le malt touraillé résiste au début de l’étape de brassage (45-55 °C) mais, pendant le brassage, lorsque le moût est porté à une température proche de 65 °C, elle est rapidement détruite (CLARK- SONet al., 1992). De ce fait, la bière est pratiquement dépourvue d’activité SOD.
La levure de brasserie (S. cerevisiae) contient une CuZn-SOD cytosolique et une Mn-SOD mitochondriale qui montrent in vitro des propriétés antioxydantes vis-à-vis de l’oxydation de l’acide linoléique et de l’acide ascorbique (LINGNERT et al., 1989 ; CLARKSON et al., 1991b). Leur thermostabilité est remarquable et elles possèdent la capacité de régénérer une partie de l’activité enzymatique perdue au cours d’un traitement thermique (LINGNERTet al., 1989).
Les SOD, en appauvrissant le milieu en •O2–, vont freiner l’apparition de radi- caux hydroxyles (OH•), très agressifs vis-à-vis de l’oxydation lipidique (GORDON, 1990). Les SOD des matières premières utilisées en malterie-brasserie sont ainsi capables d’enrayer les phénomènes d’oxydation non-enzymatique des lipides initiés par les ions superoxydes depuis l’orge jusqu’au moût de brasse- rie. Elles apparaissent donc bénéfiques au plan organoleptique pour la stabilité de la bière (BAMFORTHet PARSONS, 1985).
5 - LE SYSTÈME CATALASIQUE
5.1 Caractéristiques biochimiques et localisation
Les catalases (CAT, hydrogène peroxyde : hydrogène peroxyde oxydoré- ductase, EC 1.11.1.6) constituent, avec les peroxydases, un deuxième système antioxydant primaire endogène. Ce sont des enzymes ubiquitaires présentes chez tous les organismes eucaryotes et les cellules aérobies d’organismes infé- rieurs (DEISSEROTHet DOUNCE, 1970).
Figure 4
Structure de la ferriprotoporphyrine IX, commune aux sites actifs de la catalase et de la peroxydase (d’après WHITAKER, 1972)
Structure of ferriprotoporphyrin IX, common to active sites of catalase and peroxidase (from WHITAKER, 1972)
Il s’agit d’hémoprotéines principalement intracellulaires dont le centre cataly- tique possède un groupement prosthétique constitué par une ferriprotoporphy- rine IX (figure 4) à l’état oxydé (protohémine), associé de façon non covalente à une chaîne polypeptidique (WHITAKER, 1985 ; ROBINSON, 1991). Elles se présen- tent habituellement à l’état d’oligomères contenant quatre sous-unités iden- tiques, chacune renfermant un groupement protohémine et dont la masse moléculaire totale est comprise entre 220 et 270 kDa.
Figure 5
Modifications de l’état d’oxydation du fer du centre catalytique de la catalase dans des réactions de type catalasique (1 + 2) et peroxydasique (1 + 3)
(d’après DEISSEROTHet DOUNCE, 1970 ; WHITAKER, 1972)
Iron site in catalase during catalasic (1 + 2) and peroxidative (1 + 3) reactions (from DEISSEROTHet DOUNCE, 1970 ; WHITAKER, 1972)
Compte tenu de leur structure, les CAT sont peu thermostables et se déna- turent rapidement dès 35-40 °C. Elles sont pour la plupart actives dans un domaine de pH compris entre 3 et 9. Au delà et en deçà de cette valeur, il se produit des phénomènes de dissociation des sous-unités, ou du groupement prosthétique qui se sépare alors de l’apoprotéine (WHITAKER, 1972). Selon la concentration en H2O2du milieu, l’action de la CAT est variable, l’enzyme pos- sédant deux types d’activité, catalasique et peroxydasique (figure 5). Si cette teneur est supérieure à 10–4M, l’enzyme favorise la décomposition très rapide du substrat selon une réaction de dismutation au cours de laquelle le peroxyde joue les rôles d’accepteur et de donneur d’hydrogène. Elle présente dans ce cas une activité catalasique :
2 H2O2 → 2 H2O + O2 (réactions 1 + 2) À plus faible concentration en H2O2, la CAT agit alors comme une peroxy- dase en oxydant un grand nombre de composés donneurs d’hydrogène (étha- nol, acide ascorbique, formiate, phénol, nitrite…) :
RH2+ H2O2 → R + 2 H2O (réactions 1 + 3) ou 2 RH + H2O2 → R-R + 2 H2O
Tableau 4 Évolution de l’activité CAT au cours du maltage Table 4 Evolution of CAT activity during malting OrgeMesure de l’activitéOrgeOrgeMaltMaltRéférences (récolte)CATnativetrempéeverttouraillé var. TriumphSpectrophotométrie 1,0b—11,013,0dBAMFORTHet al., 1991 (< 1991)(240 nm), pH 7,0a var. TriumphSpectrophotométrie 0,06 µkat·g–1m.s.0,140,650,76dCLARKSONet al., 1992 (< 1992)(240 nm), pH 7,0a 9 var. différentesPolarographie4,35-13,8 µkat·g–1m.s.—139-291 96-183e BILLAUDet al., 1999c (1996)pH 6,3c a: dosage effectué en présence d’H2O210 mM; b: unités arbitraires; c: dosage effectué en présence d’H2O2 1 M; d:malt de type lager; e: procédé de micromaltage de type I.F.B.M.
La spécificité de la CAT pour les peroxydes est étroite puisqu’elle n’agit que sur H2O2, CH3OOH et CH3CH2OOH. En revanche, elle accepte un grand nombre de composés donneurs d’hydrogène, y compris les hydroperoxydes (WHITAKER, 1972 ; ROBINSON, 1991).
Des études cinétiques ont mis en évidence que l’enzyme utilise un méca- nisme à deux étapes dans des réactions à la fois peroxydasique et catalasique, la réaction prédominante dépendant de la concentration du donneur d’hydro- gène et de la concentration d’H2O2dans le milieu (AEBI, 1984). Dans le cas où la réaction peroxydasique prédomine, l’efficacité de la CAT est beaucoup plus faible que celle de la peroxydase (WHITAKER, 1972).
5.2 Les formes moléculaires des CAT végétales et leur activité Contrairement aux catalases animales, celles du monde végétal existent sous de nombreuses isoenzymes codées par des gènes multiples (SCANDALIOS et al., 1997).
Plusieurs cDNA de CAT ont été isolés dans un grand nombre de végétaux, mais seulement six gènes de CAT ont été complètement caractérisés, dont trois à partir du maïs (SCANDALIOSet al., 1997) et deux à partir de l’orge (ACEVEDOet al., 1996). Chaque isoenzyme offre des spécificités et des activités particulières et, bien qu’ayant des propriétés catalytiques similaires, le rapport des activités peroxydative/catalasique varie d’une isoforme à l’autre (HAVIRet MCHALE, 1989).
Le rôle fondamental de la CAT est d’éliminer le peroxyde d’hydrogène par la voie catalasique ou peroxydasique et de permettre ainsi aux cellules aérobies de réutiliser l’oxygène produit dans le métabolisme de certains substrats (FRI- DOVICH, 1975 ; ROBINSON, 1991 ; SCANDALIOSet al., 1997). Cependant, compte tenu d’une faible affinité vis-à-vis de son substrat, la fonctionnalité de la CAT in situ dépendra des niveaux endogènes de ce composé (BILLAUDet al., 1999c).
MEYER et al. (1997) ont étudié l’activité de la CAT en présence de constituants alimentaires dont l’éthanol ou l’acide ascorbique et en fonction des conditions physicochimiques du milieu (concentration, force ionique, pH, température de stockage…). Selon qu’ils sont utilisés seuls ou en combinaison, ils exercent un effet stabilisant ou, à l’inverse, inhibiteur.
5.3 Évolution et rôle de la CAT en malterie-brasserie
L’activité CAT dans l’orge native est élevée (tableau 4). Selon la variété étu- diée, les niveaux d’activité varient de 1 à 3 et correspondent à une forme enzy- matique active (BILLAUDet al., 1999c). L’activité double dès l’étape de trempage du grain (CLARKSONet al., 1992) et elle est au minimum décuplée au cours de la germination, alors qu’apparaît une seconde forme enzymatique (BILLAUDet al., 1999c). Malgré une thermolabilité notable, elle résiste intégralement dans des conditions de touraillage du type lager, mais l’activité développée dans le malt vert disparaît avec les conditions plus drastiques de touraillage, dans le cas des malts de type ale (tableau 3). Dans des conditions de touraillage intermédiaires, lorsque le dernier palier de chauffe n’excède pas 80 °C, la perte globale de l’ac- tivité varie, selon la variété analysée, entre 8 et 46 %, associée à la disparition d’une isoforme (BILLAUDet al., 1999c).
C’est au cours du chauffage du brassin à 65 °C que la perte rapide et totale de l’activité catalasique est observée (BAMFORTHet al., 1991).
De ce fait, la CAT semble incapable d’éliminer le peroxyde d’hydrogène pro- duit par l’action de la SOD et une éventuelle action antioxydante à ce stade du processus semble peu probable (CLARKSONet al., 1992). Sa contribution à réduire le phénomène de détérioration oxydative, plus précisément à combattre la per- oxydation lipidique, devrait donc se limiter aux étapes de maltage et d’empâtage.
Peu d’études ont été consacrées à l’intervention de la CAT en malterie-bras- serie. Seuls CLARKSONet al. (1989, 1992) ont montré que l’addition de CAT exo- gène au moût avant la phase d’ébullition se traduit par une augmentation du trouble, un appauvrissement en polyphénols endogènes et par une modification de la coloration du moût vers les teintes rouges. Ces modifications n’apparais- sent pas lorsque la CAT est introduite sous une forme inactive, ou dans des moûts provenant d’orge mutante déficiente en proanthocyanidines. Selon ce dernier résultat, l’action de la CAT semble liée à l’oxydation des polyphénols endogènes (CLARKSONet al., 1992). Dans ce contexte, l’activité peroxydative de la CAT ne peut s’expliquer que par un apport exogène en H2O2résultant d’une contamination de la préparation commerciale enzymatique par de la glucose oxydase. En effet, les mêmes effets sont observés lorsque le moût est supplé- menté en H2O2(CLARKSONet al., 1989, 1992).
6 - LE SYSTÈME PEROXYDASIQUE
6.1 Caractéristiques biochimiques
Les peroxydases (POD, donneur : hydrogène peroxyde oxydoréductase, EC 1.11.1.7), comme les catalases, utilisent H2O2comme substrat oxydant et pré- sentent avec ces dernières des similitudes de groupement prosthétique et de mécanisme d’action. Elles se différencient cependant par leur structure pro- téique globale et par leur activité enzymatique principale (WHITAKER, 1985 ; RODRIGUEZ-MARAÑON et VAN HUYSTEE, 1994). Les POD sont des enzymes ubi- quitaires, localisées dans pratiquement tous les compartiments et organites cel- lulaires, plus particulièrement dans les vacuoles, le cytoplasme, les parois cellulaires et les espaces libres intracellulaires. Elles se trouvent sous forme libre ou liée par le biais d’interactions ioniques ou de liaisons covalentes. Ce sont des glycoprotéines d’une masse moléculaire comprise entre 32 à 50 kDa, dotées d’un groupement prosthétique héminique (ferriprotoporphyrine IX à l’état oxydé, figure 4), avec un seul groupement hémine par enzyme (VAMOS-VIGYAZO, 1981 ; WHITAKER, 1985 ; ROBINSON, 1991). Elles existent sous la forme de nombreuses isoenzymes codées par des gènes séparés, localisés sur des chromosomes dif- férents ; elles se distinguent entre elles par leur mobilité électrophorétique, leur comportement chromatographique, leur composition en acides aminés et en oses, leurs propriétés catalytiques et probablement leurs rôles physiologiques.
L’isoenzyme C de la peroxydase de raifort (forme majeure de PM = 42 000), de loin la plus étudiée, est constituée d’un groupement prosthétique héminique associé à une chaîne polypeptidique simple, constituée de 308 acides aminés, dont la masse moléculaire est de 34 kDa. Elle renferme quatre ponts disulfures intramoléculaires (WELINDER, 1979). L’apoprotéine présente neuf sites de glyco- sylation dont huit sont glycosylés. La fraction glucidique, neutre, est liée à un
résidu asparagine par des ponts N-glycosidiques localisés à la surface de la pro- téine. L’enzyme contient aussi deux ions Ca++qui contrôleraient la conformation du site actif, en assurant notamment la stabilité thermique de la partie héminique (ROBINSON, 1991 ; IORIet al., 1995 ; ADAMSet al., 1996 ; BANCI, 1997).
La chaîne polypeptidique de la plupart des POD montre une homologie pré- cise dans la séquence d’acides aminés et la longueur de la chaîne. À l’inverse, selon les isoformes, la partie glycosidique présente une hétérogénéité dans sa composition, le nombre et le degré de branchements, ainsi que dans les sites d’attachement à la protéine. Elle est responsable du polymorphisme des POD.
Les composantes osidiques des POD végétales jouent un rôle critique dans l’acquisition des activités catalytiques, la stabilisation et les propriétés secré- toires de la protéine (VAN HUYSTEEet MCMANUS, 1998).
Les POD se trouvent sous différents états d’oxydation et catalysent quatre types de réactions dont trois font intervenir des espèces radicalaires (figure 6).
Figure 6
Les différentes réactions catalysées par la peroxydase (d’après WHITAKER, 1972) The different reactions catalyzed by peroxidase (from WHITAKER, 1972)
• La réaction peroxydasique répond à l’équation générale suivante : ROOH + AH2 → A + H2O + ROH
ou ROOH + 2 AH → A-A + H2O + ROH
Il s’agit d’une réaction à deux substrats, dans laquelle la POD possède une étroite spécificité pour le peroxyde ROOH (avec R = H, CH3 ou C2H5) et un
spectre d’action beaucoup plus large vis-à-vis du donneur d’hydrogène AH2 dont la nature est très variée (phénols, amines aromatiques, acides orga- niques…). In vitro, cette réaction est prédominante en présence d’un substrat phénolique.
La réaction est catalysée par des complexes binaires enzyme-substrat sui- vant un mécanisme ping-pong (DUNFORDet STILLMAN, 1976 ; RICHARDet NICO- LAS, 1989). Les composés I et II correspondent à différents degrés d’oxydation de l’enzyme et sont identifiables par leur spectre d’absorption. Les radicaux AH•formés conduisent, par suite de réactions non enzymatiques de dismuta- tion (AH•+ AH•→A + AH2) ou de polymérisation (AH•+ AH•→ AH-AH) à des produits colorés.
• La réaction catalasique se produit en absence d’un donneur d’hydrogène ; dans cette réaction de dismutation, le peroxyde d’hydrogène joue à la fois le rôle de donneur et d’accepteur d’électrons :
2 H2O2 → 2 H2O + O2
Cette activité est négligeable par rapport aux activités peroxydative et oxy- dative.
• La réaction oxydative se produit en absence de H2O2et en présence de certains donneurs d’hydrogène (acides dihydroxyfumarique, indole-3-acétique et ascorbique, thiols, hydroquinones) (ROBINSON, 1991 ; OBINGER et al., 1996).
La réaction requiert de l’oxygène moléculaire et des cofacteurs (Mn++, phénol).
• La réaction hydroxylante exige O2, conduit à l’hydroxylation de composés aromatiques variés (tyrosine, p-crésol…), en présence d’un donneur d’hydro- gène similaire à ceux impliqués dans l’activité oxydative. Elle conduit à la for- mation d’un o-diphénol. Cette réaction n’est pas catalysée directement par la POD, mais découle de réactions secondaires issues de la formation de radicaux libres.
Les POD liées aux parois cellulaires végétales interviennent de façon spéci- fique dans le pontage oxydatif des précurseurs de la lignine, des résidus tyro- sine des glycoprotéines et dans les liaisons entre les résidus d’acides hydroxycinnamiques des polysaccharides pectiques et hémicellulosiques (MATHEIS et WHITAKER, 1984a, b, 1987 ; FRY, 1986 ; LAMPORT, 1986 ; IIYAMA et al., 1994). La maturation des fruits (via l’oxydation de l’acide indole acétique), la protection contre les attaques bactériennes et fongiques sont aussi sous le contrôle des POD (ROBINSON, 1991). Elles prennent part, avec d’autres oxydo- réductases (lipoxygénases, polyphénoloxydases), à la détérioration de la colora- tion, de la flaveur, de la texture et de la valeur nutritionnelle des produits alimentaires transformés, du fait de leur thermostabilité reconnue et de leur effet oxydant sur les lipides insaturés, les protéines et les constituants phénoliques endogènes (BURNETTE, 1977 ; HAARD, 1977 ; MATHEIS et WHITAKER, 1984a, b ; WHITAKER, 1985 ; WILLIAMSet al., 1986).
6.2 Paramètres affectant l’activité POD
Les POD présentent une stabilité variable vis-à-vis du pH et de la tempéra- ture. Le pH optimum d’activité dépend de la source de POD, de la composition en isoenzymes, du substrat donneur d’hydrogène et de la nature du milieu réac- tionnel (LUet WHITAKER, 1974 ; BURNETTE, 1977). Généralement on observe de
larges plages qui se situent entre pH 4 et pH 7, dues à la présence des diffé- rentes isoformes (VAMOS-VIGYAZO, 1981). Une acidification du milieu entraîne généralement une dénaturation réversible de l’enzyme, par suite d’un détache- ment de l’hème et d’une modification de la structure de l’apoenzyme. Dans ce cas, les POD les plus thermosensibles subiront en plus un phénomène d’agré- gation et la partie hématinique exposée pourra catalyser l’oxydation des lipides (ERIKSSONet al., 1971 ; KANNER et KINSELLA, 1983 ; ADAMSet al., 1996), mais elles perdent leur activité peroxydative (BURNETTE, 1977). Les POD comptent parmi les enzymes les plus thermostables des tissus végétaux (VAMOS-VIGYAZO, 1981 ; BAMFORTHet al., 1991, 1993 ; ROBINSON, 1991 ; CLARKSON et al., 1992).
D’après VAMOS-VIGYAZO (1981), les températures optimales pour la plupart d’entre elles se situent vers 45-50 °C mais certaines isoenzymes demeurent actives à des températures bien plus élevées. Les cinétiques d’inactivation ther- mique, rarement simples, témoignent d’un mélange d’isoformes ayant des ther- mostabilités variables et/ou de la formation transitoire d’agrégats encore actifs (ROBINSON, 1991).
La thermodénaturation des POD est un processus souvent réversible. Les POD sont en effet connues pour leur capacité de régénération de l’activité enzymatique lors du refroidissement (CLOCHARD, 1974 ; ROBINSON, 1991). Ce phénomène qui dépend à la fois de l’origine de la POD et aussi des différentes isoformes à l’intérieur d’une même variété, peut apparaître quelques heures après l’arrêt du traitement thermique. Il serait lié à une recombinaison entre l’hème et l’apoprotéine (LUet WHITAKER, 1974). La régénération est d’autant plus importante que l’enzyme est thermostable (NAVEH et al., 1982) ; elle dépend de la sévérité et de la durée du chauffage, du pH et de la composition du milieu (LU et WHITAKER, 1974 ; VAMOS-VIGYAZO, 1981 ; CHANG et al., 1988 ; HENDRICKXet al., 1992 ; ADAMS, 1997).
In vitro, les POD peuvent être inactivées de façon réversible par un excès de H2O2, en présence (NICELLet WRIGHT, 1997) ou en absence (ARNAOet al., 1990 ; HINER et al., 1996) d’un autre substrat réducteur et par des chélateurs d’ions métalliques ou des agents réducteurs (acide ascorbique, cystéine, métabisulfite) qui interviennent soit sur le fer hématinique, soit sur des produits de la réaction (VAMOS-VIGYAZO, 1981). À l’inverse, plusieurs cations (Ca2+, Fe3+, Mn2+) peuvent être activateurs du système POD (JEANJEANet al., 1975 ; IORIet al., 1995).
Selon NICOLIet al. (1991) et PITOTTIet al. (1995), les produits de la réaction de Maillard et de la caramélisation des sucres auraient la capacité d’inhiber for- tement l’activité POD et d’induire une phase de latence dans l’apparition des produits d’oxydation colorés.
6.3 Nature et évolution des composés phénoliques endogènes, substrats potentiels des POD
Les composés phénoliques forment une des principales classes de métabo- lites secondaires et présentent une grande diversité de structure fondée à la fois sur le nombre d’atomes de carbone constitutifs et sur la structure du sque- lette de base (figures 7 et 8). Ils contribuent largement aux qualités organolep- tiques et nutritionelles des produits frais ou transformés (MACHEIXet al., 1990 ; ROBINSON, 1991). Chez les végétaux, la plupart de ces composés ne sont pas présents à l’état libre mais sous forme d’esters ou plus généralement sous forme d’hétérosides.
Dans l’orge, on retrouve principalement les acides hydroxybenzoïques et hydroxycinnamiques et les flavonoïdes, auxquels on peut ajouter les tannins, qui se présentent sous forme libre ou liée et insoluble. Leur analyse a permis d’identifier la présence des acides vanillique, p-coumarique, m-, p- hydroxyben- zoïque, férulique et diférulique. Parmi eux, les acides trans-férulique et trans-p- coumarique sont prépondérants (tableau 5). Les cellules des téguments externes du grain, le péricarpe, le testa et l’aleurone sont plus riches en acides phénols totaux (entre 0,6 et 0,9 % de matière sèche) que l’albumen (≤0,1 %).
La libération des acides phénols liés de l’orge et l’extraction des acides p- coumarique, caféique et gallique du houblon ont surtout lieu au cours du bras- sage (VERZELE, 1986 ; DE KEUKELEIRE, 1993). On retrouve majoritairement dans
Figure 7
Structure des principales familles de flavonoïdes Structure of the main flavonoid families
Squelette flavonoïde
Flavones Flavonols
Flavanones Flavanonols
Flavanols Anthocyanidols
Chalcones
la bière les acides férulique, vanillique et p-coumarique (ROSTON et KISSINGER, 1981). Pendant la production du moût, apparaît le 4-vinyl gaïacol par suite d’une fragmentation thermique de l’acide férulique, mais ce composé volatil est en partie perdu dans l’espace de tête au cours de la fermentation (MADIGANet al., 1994a).
De leur côté, les flavonoïdes sont principalement localisés au niveau du testa et des téguments externes du grain (MCMURROUGH et al., 1983). Les flavanols, majoritaires, peuvent être mono-, di- ou trimériques (figure 8). Ils sont associés à des tannins de haut poids moléculaire. Ces proanthocyanidines sont toutes constituées de sous-unités de (+) catéchine et de (+) gallocatéchine (MCMUR- ROUGH, 1979 ; MCMURROUGHet al., 1983 ; MOLLet al., 1984 ; JERUMANIS, 1985 ;
Figure 8
Structure de différents acides phénols, substrats potentiels des peroxydases d’orge (A) et de proanthocyanidines (dimères et trimères de flavanols) identifiés
dans l’orge, le malt et la bière (B)
Structure of different phenolic acids, potential substrates for peroxidases from barley (A) and of proanthocyanidins (dimers and trimers of flavanols)
isolated from barley, malt and beer (B)
Tableau 5 Teneurs en composés phénoliques d’extraits d’orge (O), de malt (m), de houblon (H), de moût (M) et de bière (B) Table 5 Phenolic contents of barley (O), malt (m), hop (H), mash (M) and beer (B) extracts Références Composés phénoliques McMURROUGH, 1979NORDKVISTet al., 1984JERUMANIS, 1985MADIGANet al., 1994a, b Flavanolsa:(O) 75 mg·kg–1m.s. (+) cat(O) 26-55 mg·kg–1m.s. (+) cat(O) 230-234 mg·kg–1PdB3 • Monomères catéchiques (O) 150 mg·kg–1m.s. PcB3 et PcC2(O) 136-276 mg·kg–1m.s. PcB3(O) 88-142 mg·kg–1PcB3 ((+) cat, (-) épi, GC, EGC)(O) 250 mg·kg–1m.s. PdB3(O) 272-362 mg·kg–1 m.s. PdB3(O) 10-14 mg·kg–1(+) cat. • Proanthocyanidines (m) 30 mg·kg–1m.s. (+) cat(O) 27-110 mg·kg–1m.s. PcC2(Be) 1,1 mg·L–1(-) épi dimères (PcB3, PdB3),(m) 150 mg·kg–1m.s. PcB3 et PcC2(H) 817-2821 mg·kg–1m.s. (+) cat(Be) 4,2 mg·L–1(+) cat trimères (PcC2, (m) 260 mg·kg–1m.s. PdB3(H) 428-1472 mg·kg–1 m.s. PcB3(Be) 3,1-3,3 mg·L–1PdB3 et PcB3 procyanidines T1-T4), (M) 68 mg·L–1flavanols simples(H) 287-875 mg·kg–1 m.s. PcC2 tétramères, pentamères(B) 29 mg·L–1flavanols simples Acides phénols(acides o-,(O) 1474-1590 mg·kg–1m.s. (B) 0,52-2,50 mg·L–1acide férulique m-, p- coumarique, cis-,acides phénols totauxd trans- férulique, vanillique, m-, p- OH-benzoïque) Sourceorge, var. Emmaorge, var. Bomi8 var. d’orge, 4 var. houblon3 var. orge, 4 types de bières DéterminationCLHP-UV et colorimétriefCPG et CLHP-UVCLHPCLHP-ECc
F L A V O N O Ï D E S
Tableau 5 (suite) Teneurs en composés phénoliques d’extraits d’orge (O), de malt (m), de houblon (H), de moût (M) et de bière (B) Table 5 (continued) Phenolic contents of barley (O), malt (m), hop (H), mash (M) and beer (B) extracts Références Composés phénoliques MAILLARD, 1996Mc MURROUGHet al.,1996GOUPYet al., 1999ANDERSENet al.,2000 Flavanolsa:(O) 18,1mg kg–1m.s. (+) cat.(B) 1,7-4,3 mg·L–1(+) cat(O) 12,4-255,1 mg kg–1m.s. équiv. (+) cat.(B) 0,2-3,7 mg·L–1(+) cat •Monomères catéchiques (O) 105,8 mg·kg–1m.s. PcB3(B) 0,9-1,3 mg·L–1(-) épi(m) 4,9-52,5 mg·kg–1m.s. équiv. (+) cat.(B) 0-4,5 mg·L–1PdB3 ((+) cat, (-) épi, GC, EGC)(O) 84,6 mg·kg–1 m.s. PdB3(B) 1,1-2,5 mg·L–1PdB3(B) 0-3,6 mg·L–1PcB3 • Proanthocyanidines (mg) 9,4 mg·kg–1m.s. (+) cat(B) 0,7-1,7 mg·L–1PcB3 dimères (PcB3, PdB3),(mg) 47,5 mg·kg–1m.s. PcB3(B) 1,0-1,6 mg·L–1trimères totaux trimères (PcC2, (mg) 61,1 mg·kg–1m.s. PdB3 procyanidines T1-T4), tétramères, pentamères Flavonols(O) 10,9-66,9 mg·kg–1m.s. équiv. rutine (m) 4,6-8,5 mg·kg–1m.s. équiv. rutine Acides phénols(acides o-, (O) 2,0 mg·kg–1m.s. acides phénols (O) 1,0-17,5 mg·kg–1m.s. équiv. acide (B) 1,6-3,4 mg·L–1acide férulique m-, p- coumarique, cis-, libresférulique trans- férulique, vanillique, (mg) 4,9 mg·kg–1m.s. acides phénols (m) 3,9-9,4 mg·kg–1m.s. équiv. acide m-, p- OH-benzoïque)libresférulique Sourceorge, var. Triumphbière de type lager, 9 var. d’orge2 var. d’orge, non stabilisée et stabilisée 4 bières de type lager DéterminationCLHP-UVbCLHP-ECcCLHP-UVbCLHP-ECc a: (+) cat: (+) catéchine; (-) épi: (-) épicatéchine; GC: gallocatéchine; EGC: épigallocatéchine; PcB3: procyanidine B3; PdB3: prodelphinidine B3; PcC2: procyani- dine C2; b: détection UV-visible à barrette de diodes; c: détection électrochimique; d: acides phénoliques liés insolubles; e: bière de type lager; f: Analyseur Techni- con utilisant le diméthylaminocinnamaldéhyde comme réactif; g: orge germée.
F L A V O N O Ï D E S
MAILLARD, 1996). Les plus fréquemment identifiés sont : la (+) catéchine (mono- mère), son isomère la (-) épicatéchine n’étant pas présente dans l’orge, la pro- delphinidine B3, la procyanidine B3 et la propélargonidine (dimères), enfin, les catéchines (Cat) et gallocatéchines (Gal) trimériques comme la procyanidine C2 appelée aussi procyanidine T4 (Cat-Cat-Cat), les procyanidines T1 (Gal-Gal- Cat), T2 (Gal-Cat-Cat) et T3 (Cat-Gal-Cat).
Peu de modifications quantitatives sont observées pour les oligomères entre l’orge et le malt (MCMURROUGHet al., 1983), contrairement à la (+) catéchine dont la teneur diminue considérablement (entre 40 et 70 %) au cours du mal- tage, probablement parce qu’elle est plus sensible à l’oxydation que ses formes dimérisées (MOLLet al., 1984).
Au cours du brassage par infusion, entre 46 et 91 % des flavanols simples sont extraits du brassin sous forme inchangée. À l’inverse, le taux des flavanols complexes augmente pendant la cuisson du moût par suite d’une solubilisation partielle des dimères (MCMURROUGH, 1979). Leur extraction demeure cependant incomplète (MOLLet al., 1984).
L’apport des matières amérisantes au moment du houblonnage modifie les concentrations en flavonoïdes du moût. En effet, les extraits ou les cônes de houblon renferment de fortes teneurs en trimère C2, procyanidines B3, B4, (+) catéchine et contiennent en outre de la (-) épicatéchine, des dérivés de chal- cones, des flavanones et des flavonols (kaempférol, quercétine) (VERZELE, 1986 ; DE KEUKELEIRE, 1993). Les proportions relatives des différents polyphé- nols varient largement avec l’origine du houblon et son mode d’introduction dans le moût, mais la quantité totale de flavanols dans le moût est environ huit fois supérieure à celle contenue dans l’orge et le malt (MCMURROUGH, 1979 ; MOLLet al., 1984 ; STEVENSet al., 1997).
Au moment de l’ébullition du moût, les conditions de pH et de température déstabilisent les formes dimériques et conduisent à une augmentation de la teneur en (+) catéchine dont une partie se transforme en (-) épicatéchine (MOLL et al., 1984).
L’étape de fermentation entraîne une perte de l’ensemble des flavanols complexes et d’anthocyanogènes alors que la teneur des deux catéchines demeure peu modifiée (MOLL et al., 1984). Au total, dans la bière stockée, la concentration en polyphénols totaux varie entre 60 et 300 mg·L–1, en fonction de la matière première, du procédé de fabrication, des conditions d’extraction et de dosage utilisées (SAKUMAet al., 1995). La teneur en flavanols est faible, comprise entre 10 et 30 mg·L–1, dont 1/3 de monomères et de dimères de la (+) catéchine (tableau 5).
6.4 Présence et caractérisation des POD d’orge et de malt
La nature et la répartition des POD fluctuent largement au cours de la crois- sance et de la maturation du grain, mais aussi en fonction de la variété (LABERGEet al., 1973 ; LABERGE, 1975 ; LABERGEet KRUGER, 1976 ; COCHRANE, 1994 ; ANTROBUSet al., 1997). Au sein d’une même espèce, les POD sont distri- buées sous la forme d’isoenzymes dont les points isoélectriques (pHi) varient entre 3,5 et 10. Elles sont classées en POD basiques ou cationiques, neutres et acides ou anioniques.
C’est ainsi que jusqu’à 20 isoformes cationiques et/ou anioniques ont été dénombrées et étudiées dans l’orge mature ou germée (LABERGEet al., 1973 ; LABERGEet KRUGER, 1976 ; CLARKSON et al., 1991a, 1992 ; BAMFORTH et al., 1991 ; HEJGAARDet al., 1991 ; RASMUSSENet al., 1991 ; KERBYet SOMERVILLE, 1992 ; ANTROBUSet al., 1997 ; BILLAUDet al., 1999a). L’identification, la caracté- risation biochimique et l’étude de la composition des différentes isoenzymes sont rendues difficiles du fait du grand nombre de donneurs d’hydrogène (syn- thétiques ou naturels) utilisés comme substrats pour la détection de l’activité POD (LABERGEet al., 1973 ; BILLAUDet al., 1999b).
La quantité de POD dans le grain d’orge est estimée à 0,1 g·kg–1(JOHANS- SON et al., 1992). À partir de ce pool d’activité enzymatique, HEJGAARD et al.
(1991) ont séparé et caractérisé trois POD cationiques. Parmi elles, une forme majoritaire représentant 75 % de la fraction POD totale a été isolée sous la forme de deux variants (RASMUSSENet al., 1991 ; JOHANSSONet al., 1992). D’un PM d’environ 37000, elle a été cristallisée par HENRIKSENet al. (1992). Elle pré- sente moins de 50 % d’homologie de séquence avec d’autres POD cationiques végétales (raifort, navet), ce qui laisse supposer qu’elle possède une fonction physiologique distincte.
Cette forme est exprimée majoritairement dans l’albumen et plus discrète- ment dans l’aleurone, mais pas dans le germe (RASMUSSEN et al., 1991). Elle possède des propriétés enzymatiques et spectroscopiques très distinctes de celles d’autres POD végétales (RASMUSSENet al., 1997). En particulier, son acti- vité catalytique est contrôlée par les ions Ca2+et le pH du milieu, qui induisent un changement conformationnel de l’enzyme (RASMUSSEN et al., 1995, 1998).
Elle présente une faible activité vis-à-vis des substrats classiques des POD et elle est dépourvue d’activité pour les composés phénoliques précurseurs de la lignine (RASMUSSENet al., 1991).
6.5 Évolution des POD au cours de la fabrication de la bière
Les nombreuses isoenzymes localisées dans le grain d’orge mature (LABERGEet al., 1973) sont activées dès la période de trempe (tableau 6), leur activité augmentant d’un facteur 1,5 à 5 en fin de germination. Selon BILLAUD (1999), l’étape de germination n’entraîne pas la synthèse de novo d’isoenzymes, mais une augmentation de l’activité globale de l’ensemble des fractions enzy- matiques, plus marquée pour les formes cationiques.
Au cours du séchage du malt vert en touraille, les POD supportent les condi- tions technologiques de fabrication de malt du type lager ou ale et leur activité globale contenue dans le malt touraillé demeure supérieure à celle de l’orge (tableau 3). Lorsque des pertes d’activités sont enregistrées, elles ne semblent concerner que quelques isoformes (ANTROBUS et al., 1997) qui présentent une thermosensibilité plus importante (BILLAUD, 1999).
Les POD peuvent agir à l’empâtage car elles sont fonctionnelles au pH du moût (CLARKSON et al., 1989). Au brassage, l’inactivation partielle d’une partie des isoenzymes devient effective dès 80 °C (SCRIBANet DUPONT, 1973 ; BAM- FORTHet al., 1991 ; CLARKSONet al., 1991a, 1992). Enfin, l’activité POD disparaît à l’ébullition du moût (CLARKSONet al., 1992).
Les POD tendent à oxyder les anthocyanogènes endogènes qui se polyméri- sent et précipitent (CLARKSON et al., 1992). Le phénomène augmente la colora-
Tableau 6 Évolution de l’activité POD au cours du maltage Table 6 Evolution of POD activity during malting OrgeMesure de l’activité Orge OrgeMaltMaltRéférences (récolte)PODnativetrempéeverttouraillé var. TriumphSpectrophotométrie3,3 unités/graind3,86,66,3CLARKSONet al., 1989 (< 1989)(405 nm), pH 4,0a var. TriumphSpectrophotométrie1,0b—2,02,2BAMFORTHet al., 1991 (< 1991)(405 nm), pH 4,0a var. TriumphSpectrophotométrie82,9 unités·g–1m.s.d95,6168,9184,6CLARKSONet al., 1992 (< 1992)(405 nm), pH 4,0a var. ChariotSpectrophotométrie1,8 unités·g–1graind.—8,56,0ANTROBUSet al., 1997 (< 1997)(405 nm), pH 4,0a 9 var. différentesSpectrophotométrie43,3-83,3 µkat·g–1 m.s.—55,4-141,3 57,6-93,0 BILLAUDet al., 1999b, c (1996)(410 nm), pH 4,7c a: dosage effectué dans un système 2,2’-azinobis[3-ethylbenzthiazoline 6-sulphonate]ou ABTS (0,85 mM)/H2O2(5 mM); b: unités arbitraires; c: L’activité POD est dosée par spectrophotométrie selon une méthode chronométrique faisant intervenir l’acide L-ascorbique, décrite par BILLAUDet al. (1999b), dans un système acide férulique (10 mM)/H2O2(20 mM); d: 1 unité d’activité POD équivaut à la quantité d’enzyme nécessaire pour former 1 µmole de radical cationique oxydé·min–1.
tion du moût et limite la formation ultérieure du trouble colloïdal de la bière (BAMFORTHet al., 1991). Ces derniers auteurs considèrent que les POD comp- tent parmi les oxydoréductases les plus susceptibles de promouvoir l’oxydation pendant le brassage, du fait de l’activité notable des formes cationiques majori- taires, dans un moût porté à 65 °C pendant une heure. Cependant, en préve- nant l’accumulation d’H2O2 pendant le brassage, elles pourront ralentir la formation d’espèces réactives et protégeront alors le moût contre les réactions d’oxydation non spécifiques, notamment celle des acides gras polyinsaturés.
Figure 9
Réactions catalysées par les polyphénoloxydases Reactions catalyzed by polyphenoloxidases
7 - LE SYSTÈME POLYPHÉNOLOXYDASIQUE
7.1 Caractéristiques biochimiques et localisation
Le terme « polyphénoloxydase » regroupe une gamme d’enzymes suscep- tibles de catalyser l’oxydation des mono- et di-phénols en quinones en pré- sence d’oxygène moléculaire. La Commission Enzymes de l’IUB (International Union of Biochemistry) distingue trois groupes d’enzymes (figure 9) :
