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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Van Gool, F. (2008). Métabolisme du NAD et contrôle de la réponse inflammatoire (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.

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Université Libre de Bruxelles Faculté des sciences

Laboratoire de Physiologie Animale

Métabolisme du NAD et contrôle de la réponse inflammatoire.

Thèse présentée en vue de l'obtention du titre de Docteur en Sciences

Promoteur : Professeur Oberdan Léo

Frédéric Van Gool

Mai 2008

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Métabolisme du NAD et contrôle de la réponse inflammatoire.

Thèse présentée en vue de l'obtention du titre de Docteur en Sciences

Promoteur : Professeur Oberdan Léo

Frédéric Van Gool

Mai 2008

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te souhaiter une agréable retraite qui je l'espère te mènera dans les îles Marquises sur les traces de Gauguin et de Brel.

Arrivé dans le Laboratoire de Physiologie Animale, j'ai eu la chance de faire partie de l'équipe d'Oberdan. Tous les étudiants de biologie et d'agronomie connaissent Oberdan comme un professeur sympa, intéressant et passionné (comme le diraient les Américains : C'est un scientifique très Smart). Et je peux vous le confirmer, il est comme ça même au labo. Son bureau est toujours ouvert et il est toujours prêt à vous aider, que ce soit pour l'interprétation ou la réalisation des manips. A mes yeux, une des caractéristiques d'Oberdan, c'est sa capacité à établir de nouvelles pistes de recherches à partir d'une simple observation expérimentale et de quelques heures de recherches bibliographiques. Ceci dit. Cela prend peu de temps à Oberdan mais ça correspond à quelques mois de travail pour les étudiants ! Merci à toi pour m'avoir donné le goût de la recherche.

En plus de l'avoir côtoyé en tant que chef au labo, j'ai eu la chance pendant de longues années de pouvoir « me faire conduire » par Oberdan pour aller à Gosselies. Il est intéressant de constater que notre sujet de conversation favori était la nourriture. En effet, il n'y avait pas un trajet entre Bruxelles et l'IBMM sans que l'on fasse au moins une fois allusion à un resto, à une boulangerie ou tout ce qui a attrait à la bonne bouffe. C'est dans ces moments-là que les origines italiennes d'Oberdan se manifestaient le plus. Je crois que c'est le seul homme avec qui j'ai autant parlé de nourriture. En tant qu'italien, il aurait peut être autant, si pas plus, préféré parler de foot, mais pas de chance le ballon rond c'est pas trop mon dada et je préfère pratiquer le sport que d'en parler ;op (Pour info, Nico est la personne idéale pour remplacer Frans dans le rôle de monsieur foot !). Merci de m'avoir co-voituré pendant toutes ces années.

Ce que je ne devrais pas dire c'est qu'Oberdan aime aussi se faire conduire, ce qui fait que régulièrement c'est Muriel qui conduisait pour les trajets WO-IBMM (Je ne dirai pas ici qui conduit le mieux ;o). Merci d'avoir toujours été prévoyante afin que je puisse faire les trajets avec vous. Merci aussi d'avoir été mon promoteur durant mon année TELEVIE.

Merci à Anthony de m'avoir encadré au début de ce travail et de m'avoir fait découvrir les petits chemins de Gaume. Ces randonnées VTT avec Erika, Pascal et Guillaume était très agréables.

En tant que « meuble » du laboratoire de physiologie animale, on m'a souvent déménagé de bureau. Bien que cela ne m'aie jamais fait plaisir (il fallait à chaque fois ranger toutes mes affaires...) cela m'a permis d'avoir de nouveau voisins.

Le premier bureau était vraiment très chouette, nous étions trois jeunes mémorants (Laurent, Julien et moi) installés au fond du couloir loin de toutes agitations, Julien pouvait lire sont canard enchaîné à son aise ;op Un conseil si vous avez envie d'une bonne lecture ou d'un bon film, demandez l'avis de Juju, vous ne serez pas déçus. Bon amusement à Münich...

On était tellement bien installés qu'à la fin de notre mémoire, ils ont préféré déplacer la

salle des mémorants plutôt que nous!

(5)

Delphine nous a par la suite rejoints dans ce bureau. Merci pour toutes les excursions extra labo qui nous ont conduits de Maubuisson jusqu'au ranch du cercle aya ;o). J'attends avec impatience que tu ouvres le tiens que ce soit en Europe ou au Canada. J'espère que ton chat n'a pas été trop traumatisé suite à son séjour sous mon toit ! Courage pour la fin de ta thèse...

Après de multiples déménagements et un oubli d'Annette, je me trouve actuellement dans le bureau de Mara et Caroline.

J'ai eu la chance durant cette thèse de travailler avec Mara. En effet, une grande partie des travaux présentés dans ce manuscrit on été réalisés en collaboration étroite avec cette petite italienne. Je dirais simplement que cela à été un plaisir de travailler avec toi. En effet, bien que le monde de la science ne soit pas toujours rose, ta bonne humeur et ta gentillesse ont toujours réussi à me redonner des couleurs. Si on pouvait les mettre en cachets le monde serait plus souriant. Et puis merci de m'avoir fait découvrir les petits cafés italiens, les biscotos et surtout les rossanas (et oui avec les Italiens on en vient toujours à parler de nourriture ;o) J'espère que tu trouveras ta voie !

Caroline, c'est la sportive du labo. De la gym en salle (sport typiquement féminin mais tellement fatiguant) en passant par le VTT et le ski elle sait tout faire comme une pro. Merci de m'avoir entrainé dans tes expéditions sportives, je recommence quand tu veux ;o) La seule chose quelle ne supporte pas c'est les sensations fortes, Guillaume en est toujours sourd d'une oreille ;o) De plus, on partage une passion commune : les voyages. La seule différence c'est que Caroline les fait en réalité tandis que moi c'est dans mes rêves (j'attend toujours ma photo de gibbons ;o) Courage pour la rédaction...

Bien qu'il n'ait jamais été dans mon bureau, Fouad est toujours dans le bureau des autres et donc un petit peu dans celui de Caroline et Mara. Un conseil : si vous prenez l'avion avec lui, n'oubliez surtout pas les tranquillisants... Bon amusement chez BioVallée et n'oublie pas qu'on doit aller faire du sport avec Caro.

Question sport, Sébastien se défend bien aussi. Merci de m'avoir fait découvrir les rollers parades de Namur et de Bruxelles. Une nouvelle saison recommence bientôt, mais bon, à moins que ton fils soit un précoce du roller, tu auras sûrement d'autres occupations (vive les Pampers). J'en profite aussi pour remercier les deux techniciennes de choc du labo que sont Valérie et Marjorie, elles sont toujours prêtes à vous donner un coup de main.

Un grand merci aussi à Fabienne et Annette pour leurs conseils et leur gentillesse.

Annette, profite bien du temps libre qui s'ouvre à toi. Et si tu veux fêter le début de cette nouvelle période de ta vie autour de la piscine avec un BBQ on est tous partants (c'est un message qui n'est pas très subliminal ;op).

Cette thèse n'aurait pas été aussi agréable à réaliser sans le soutien logistique d'Isabelle

et de Françoise. Et elle n'aurait sûrement pas aussi bien débuté sans la présence d'Erika, Frans,

Cari, Magali, Maryse, Guillaume, Sylvie, Anne-Sophie, Virginie, Nicolas, Geoffroy, Georgette

(merci pour les sortings), Cyril (merci pour les profils de polysome) et Véronique (merci pour les

NB et le covoiturage de secours ;o).

(6)

marié), Alice, Nathalie, Julie, Nicolas... et des biochimistes. Coco, Tong, Nathalie, Isabel, Basile...

Enfin, je voudrais remercier mes parents ainsi que ma sœur Sandrine pour leurs aides et leur soutien au cours de mes études. Sans votre persévérance et votre présence à mes côtés, je n'aurai certainement pas pu commencer ces études universitaires à rallonges. Bien que cela n'ait pas du être facile tous les jours de courir de cours de logopédies en cours de psychomotricités en passant par tous les spécialistes possibles de la dyslexie, tous vos efforts m'ont permis d'arrivé à la fin de cette thèse. Merci !

Finalement, je voudrais saluer le petit Harald qui a marqué la fin de cette thèse par sa naissance, félicitation à Sandrine et Raphaël qui à leur tour deviennent parents.

A tous, un grand merci !

(7)

LISTE DES ABRÉVIATIONS______________________________________________________ 3

1 INTRODUCTION______________________________________________________________5

1.1 L

e

NAD : UN COENZYME INDISPENSABLE AU MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE DE LA

CELLULE 7

1.2 L

a

BIOSYNTHÈSE DU NAD 11

1.2.1 L

a

VOIE DE SYNTHÈSE DE NOVO 11

1.2.1.1 Catabolisme du trvptophane et réponse immune 13

1.2.2 L a VOIE DE SYNTHÈSE DE RECYCLAGE 14

1.3 NAD ET ADP RIBOSYLATION 19

1.3.1 L a M ono ( ADP-RIBOSYL) ation 19

1.3.2 L

a

P0LY(ADP-RIB0SYL)ATI0N ET LES PARPS 23

1.3.2.1 PARP-1 25

1.3.2.2 La famille PARP 32

1.4 L

e

NAD : PRÉCURSEUR DE MOLÉCULE MOBILISATRICE DE CALCIUM 36

1.5 L

afamilledes

S

irtuines

38 1.5.1 SIR2 : UNE DÉSACÉTYLASE NAD DÉPENDANTE 39

1.5.2 S

irtuines

:

unefamillededésacétylases

NAD

dépendanteetd

’ADP-

ribosyl

TRANSFÉRASES 42

1.5.3 F

onctionsbiologiquesdessirtuines

46 1.5.3.1 Chromatine et transcription 46

1.5.3.2 Sirtuines et le contrôle de la survie cellulaire 47 1.5.3.3 Sirtuines et le contrôle du métabolisme énergétique 50

1.5.4 S

irtuines

:

unlienentremétabolismeetvieillissement

54 1.5.5 M

étabolismedu

NAD

etactivitédessirtuines

55 2 BUT DU TRAVAIL___________________________________________________________ 59

3 RÉSULTATS_________________________________________________________________ 62

3.1 E

tude

/N V/VO DES PROPRIÉTÉS IMMUNOMODULATRICES DU NICOTENAMIDE 62 3.2 E

tudeinvitrodumécanismed

’

actiondunicotinamide

69 3.2.1 L

enicotinamide

INHIBE LA SYNTHÈSE DE LA PROTÉINE TNF 69

3.2.2 L

e

NICOTINAMIDE INHIBE LA SYNTHÈSE DU TNF À UNE ÉTAPE

POST-TRANSCRIPTIONNELLE 71

3.2.3 L

e

NICOTINAMIDE INHIBE L’EFFICACITÉ DE TRADUCTION DU TNF 73

3.3 L

aconcentrationintracellulairede

NAD

régulelasynthèsedu

TNF 77

3.4 L

asynthèsedu

TNF

estréguléeparunmécanismedépendantdessirtuines

81 3.4.1 L’

inhibitionpharmacologiquedessirtuinesréduitlasynthèsedu

TNF 82

(8)

3.4.1.1 Caractéristiques des différents inhibiteurs de sirtuines utilisés 82 3.4.1.2 Le sirtinol et le cambinol inhibent la synthèse de TNF 85

3.4.2 SIRT 6 CONTRÔLE LA SYNTHÈSE DU TNF 87

4 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES__________________________________________ 91

4.1 C

ontrôledelasynthèsedu

TNF

parlemétabolismedu

NAD 91

4.2 L

emétabolismedu

NAD

TNF

parun

mécanismepost

-

transcriptionnel

93 4.3 SIRT6

TNF 96

4.4 P

erspectivethérapeutique

99 4.4.1 L

enicotinamide

99 4.4.2 L

esinhibiteurs

DE SIRTUINES 100

4.4.3 L

a

NICOTINAMIDE PHOSPHORIBOSYLTRANSFÉRASE 101

4.5 C

onclusiongénérale

103 5 MATÉRIELS ET MÉTHODES ___________________________________________________________ 105

5.1 S

ourisettraitementinvivo

105 5.2 C

ulturescellulaires

105 5.2.1 M

ilieux

DE CULTURE POUR CELLULES EUCARYOTES : 105

5.2.2 L

ignéescellulaires

106 5.2.3 C

ellules

DE RATE 106

5.3 PURIFICATION DES CELLULES DENDRITIQUES SPLÉNIQUES 107

5.4 GÉNÉRATION DES CELLULES DENDRITIQUES DÉRIVÉES DE MOELLE OSSEUSE 107

5.5 G

énération

C

ytométriedeflux

107 5.6 E xtraction

d

’ARN 108

5.7 RT-PCR quantitative 108

5.8 E tude de la stabilité de

l

’ARN

m

du TNF 109

5.9 N orthern blot 109

5.10 P

rofile

DE

polysomes

111 5.11 P

lasmides

ET TRANSFECTiON 111

5.12 W

estern

B

lot

ET I

mmunoprécipitation

111 5.12.1 E

xtractiondesprotéines

111 5.12.2 E

lectrophorèsedeprotéines

112 5.13 ELISA (E

nzyme

-L

inked

-I

mmunoabsorbent

A

ssa

Y) 113

5.14 M

arquagemétabolique

114 5.15 D

osage

DU NAD 114

5.15.1 E

xtractiondespyridinesnucléotides

114 5.15.2 DÉTERMINATION DE LA QUANTITÉ DE NAD 114

6 BIBLIOGRAPHIE 117

(9)

Liste des abréviations

Act D : Actinomycine D

ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ADNr : ADN ribosomique ARN : acide ribonucléique ARNm : ARN messager ARNr : ARN ribosomique

ART : mono(ADP-ribosyl)transférases ATP ; adénosine triphosphate

ARE : région AU-riche BER : Base Excision Repair cADPR : cyclic ADP-ribose CIA : collagen-induced arthritis CLP : cecal ligation and puncture

CpG : oligonucléotides immunostimulants contenant des motifs CpG non méthylés D-gal : D-galactosamine

GaPDH : glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase EDO : indoléamine 2,3-dioxygénase

IL : interleukine i.p. : intra péritonéal LPS : lipopolysaccharide Na : acide nicotinique

NAD : nicotinamide adénine dinucléotide

NADP : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NAm : nicotinamide

NaMN : acide Nicotinique Mononucléotide

Na/NMNATase : acide nicotinique/ nicotinamide mononucléotide adénylyltransférase NAmPT : nicotinamide phosphoribosyltransférase

NaPT : acide nicotinique phosphoribosyltransférase Niacine : nicotinanic acid vitamin

NMN : nicotinamide mononucléotide OAADPr : 0-acétyl-ADP-ribose

PARG : poly(ADP-ribose) glycohydrolase PARP : poly(ADP-ribose)polymérase PBEF : Pre-B-cell colony-Enhancing Factor PB S : phosphate-buffered saline

PCR : Polymerase Chain Reaction

(10)

rpm : roots per minute

RT-PCR : Reverse Transcriptases-Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis SIR : S lient Information Regulator

TNF-a : Tumor Necrosis Factor-alpha

UTR : untranslated région

(11)

(12)

(13)

1 Introduction

Les vitamines sont des composés organiques essentiels que les organismes vivants doivent se procurer via leur alimentation. Bien que l’existence de ces composés soit connue depuis longtemps, il a fallu attendre le début du siècle pour que le biochimiste polonais Casimir Funk isole pour la première fois 1’ « amine vitale » dont la carence est responsable du béribéri et qui est connu aujourd’hui sous le nom de vitamine B1. Le caractère essentiel joué par les vitamines dans notre alimentation est dû au rôle majeur exercé par de nombreux coenzymes générées à partir de ces « amines vitales ».

Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide ou NAD et son proche parent le NADP furent les premiers coenzymes identifiés. Leurs découvertes et caractérisations biochimiques remontent au début du 19®™® siècle et aux recherches de Sir Arthur Harden sur la fermentation alcoolique'. Il mit en évidence que la fermentation induite par un lysat de levure était due à une combinaison de deux réactifs. Le premier appelé « zymase » est un composé de haut poids moléculaire sensible à la chaleur tandis que le second est une molécule dialysable de faible poids moléculaire résistante à de hautes températures et appelée « cozymase » ou coenzyme. La caractérisation de ce composé ne fut pas facile et il fallu attendre les années 1930 pour que les laboratoires de Hans van Euler-chelpin et Otto Warburg réussissent à déterminer la stmcture chimique du coenzyme à nicotinamide^. Peu de temps après, l’équipe de O. Warburg découvre les caractéristiques oxido réductrices des nucléotides à pyridines. Cette particularité biochimique permet au NAD de jouer un rôle fondamental dans un grand nombre de réactions d’oxydoréduction essentielles au métabolisme énergétique de la cellule.

Plus récemment, le monde de la biochimie du NAD a retrouvé une « seconde jeunesse ». En effet, les cofacteurs à nicotinamide ont été identifiés dans un second temps comme jouant un rôle crucial dans un nombre croissant et varié de processus biologiques et ce, indépendamment du pouvoir réducteur de cette molécule . C’est ainsi que le NAD

-a

sert de substrat lors de modifications post-traductionnelles de protéines appelées

ADP-ribosylations, qu’il est nécessaire à l’activité enzymatique des désacétylases de

type III connues sous le nom de sirtuines ou bien encore qu’il est le précurseur de

molécules mobilisatrices de calcium.

(14)

a.

Acide nicotinique (Na) Nicotinamide (NAm)

Na + NAm = Niacine = vitamine PP = vitamine B3

Forme oxydée Forme réduite

r

Mononucléotide de nicotinamide

(NMN)

Adénosine monophosphate

(AMP)

V. O

NAD^ (NADP^) NADH (NADPH)

Figure A :

a. Structure de l’acide nicotinique (Na) et du nicotinamide (NAm).

b. Structure de la forme oxydée et réduite du NAD ainsi que du NADP. Le NADP est obtenu par la

substitution de l’hydroxyle 2 ’ de l’adénosine monophosphate par un groupe phosphate.

(15)

1.1 Le NAD : un coenzyme indispensable au métabolisme énergétique de la cellule

L’activité de nombreuses enzymes est assujettie à la présence de composants appelés « cofacteurs ». D existe deux types de cofacteurs : d’une part, les ions essentiels et d’autre part, les composés organiques appelés aussi coenzymes. Quel que soit le type de cofacteur, celui-ci constitue une part essentielle du site actif de l’enzyme à laquelle il se fixe spécifiquement.

On classe les coenzymes dans deux catégories distinctes selon la manière dont ils entrent en interaction avec l’apoenzyme : d’une part les cosubstrats qui s’attachent de manière réversible au sein de l’enzyme et d’autre part les groupes prosthétiques qui ne quittent jamais la protéine.

Pour les organismes animaux, une des sources principales en précurseurs de coenzymes se situe dans l’alimentation, sous la forme de vitamines hydrosolubles et, plus précisément, dans le groupe des vitamines B. C’est ainsi que les coenzymes à nicotinamides (NAD et NADP) sont en partie formées à partir de la vitamine B3 (figure A) connue aussi sous le nom de niacine (nicotinic ^id vitamin) ou vitamine PP (Pellagra Preventative factor). Niacine est le nom générique couramment utilisé pour faire référence à l’acide nicotinique (Na) et au nicotinamide (NAm).

Ces deux molécules sont des composés essentiels de l’alimentation, on retrouve la vitamine B3 aussi bien dans les produits végétaux qu’animaux"^. Elle se trouve principalement sous forme d’acide nicotinique dans les plantes, tandis que le nicotinamide est la forme prédominante dans les produits d’origine animale. Cependant, chez de nombreuses espèces, le NAD"^ peut également provenir du catabolisme du tryptophane (voir la biosynthèse du NAD).

Le NAD est composé d’une adénosine monophosphate et d’un ribonucléotide de

nicotinamide, encore appelé nicotinamide mononucléotide (NMN). Ces deux

5’- nucléotides sont unis par une liaison phosphoanhydride. Afin d’obtenir la structure du

NADP, l’hydroxyle 2’ du sucre de l’adénosine est substitué par un groupe phosphoryle

(figure A). Ces deux coenzymes à nicotinamide sont des transporteurs d’électrons. Ils

remplissent un rôle fondamental dans de nombreuses réactions d’oxydation ou de

réduction catalysées par des enzymes.

(16)

Glucose

Phosphorylation oxydative

2e

V nad ^

lYt + 1/2 O 2 HoO

Figure B : Le NAD est un coenzyme indispensable au bon fonctionnement des nombreuses

réactions d’oxydations du métabolisme énergétique de la cellule. Les propriétés oxydo-réductrices

du NAD sont entre autres cruciales pour la production d’énergie générée au niveau de la

mitochondrie par la phosphorylation oxydative.

(17)

transfert direct de l’ion hydrure (H ) du substrat vers le C-4 du noyau pyridine du coenzyme pour former leurs formes réduites, NADH et NADPH. Les réactions d’oxydation et de réduction qui nécessitent des coenzymes à nicotinamides engagent donc toujours une paire d’électrons à la fois.

Le NAD'^ sert d’accepteur d’électrons lors de l’oxydation des substrats du catabolisme (glucide, acides gras,...). Le NADH produit est ensuite oxydé par la chaîne respiratoire de transport d’électrons se trouvant au niveau de la membrane interne des mitochondries. Cette dernière réaction d’oxydation couplée à la formation d’ATP est un processus appelé phosphorylation oxidative (figure B). Le NADPH quant à lui, fournit l’énergie et les atomes d’hydrogène aux réactions de réduction se déroulant lors des processus anaboliques^ (par exemple : la synthèse des acides gras). H est également nécessaire au maintien d’un pouvoir réducteur indispensable à la cellule pour se protéger des dommages oxydatifs. Par exemple, l’élimination des métabolites toxiques de l’oxygène telle que fanion superoxyde ou le peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ) s’effectue entre autres grâce à la glutathion peroxydase. Cette enzyme qui dégrade l’H 202 est active seulement en présence de la forme réduite du glutathion qui est continuellement recyclée grâce au potentiel réducteur du NADPH^. A l’opposé de son rôle protecteur lors d’un choc oxydatif, le NADPH peut également être utilisé par certaines cellules telles que les macrophages afin de générer des anions superoxydes. Ces dérivés toxiques sont générés par la NADPH oxydase afin de détruire les pathogènes phagocytés par les macrophages.

L’importance du NAD en tant que coenzyme est connue depuis longtemps. Sa participation dans les réactions de transfert d’électrons ne provoque pas une consommation de pyridines nucléotides.

Métabolite (réduit) + NAD(P)^ U Métabolite (oxydé) + NAD(P)H + H^

Dans ces conditions, le NAD passe continuellement de sa forme oxydée à sa forme réduite et inversement, de sorte que la quantité totale de coenzyme à nicotinamide n’est pas affectée par cette utilisation.

Ce n’est que plus récemment que le NAD a été identifié comme le substrat d’un

nombre croissant d’enzymes impliquées dans le contrôle de nombreuses voix de

signalisation. Toutes ces réactions enzymatiques NAD dépendantes ont en commun de

cliver le lien glycosidique entre le nicotinamide et l’ADP-ribose du coenzyme.

(18)

IDO^^'^TDO ---"Sir---

V V

V ^---^ ---.^,,

Quinolinate X )

f NMNATs

Acide nicotiniqut . Acide nicotinique mononucléotide " ' adenine dinucléotide '

PAR-protéines O-acétyl-ADP-ribose

Figure C : Représentation schématique du métabolisme du NAD. Les réactions enzymatiques impliquées dans la biosynthèse du NAD des cellules de mammifère sont représentées par les flèches dessinées avec les traits continus. La flèche dessinée en traits discontinus représente une voie de recyclage du nicotinamide présent chez certains organismes (S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster...) Pour plus d’informations, voir le texte. PAR-protéines = protéines ADP-ribosylées

Tableau 1 : Réactions enzymatiques du métabolisme du NAD

Nom de l’enzyme EC Réaction

Tryptophane 2,3-dioxygénase (TDO) 1.13.11.17 L-Trp + O² Formylkynurénines Indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO) 1.13.11.11 Indole + O2 ît; Formylkynurénines

Kynurénine formamidase 3.5.1.9 Formylkynurénines + H2O Formate + L-kynurénine Kynurénine 3-hydroxylase 1.14.13.9 L-kynurénine + NADPH + H2O 3-hydroxykynurénine + NADP*

+ H:0

Kynuréninase 3.7.1.3 3-hydroxykynurénine + H2O

S

3-hydroxyanthranilate + L-Ala 3-Hydroxyanthranilate 3,4-dioxygénase 1.13.11.6 3-hydroxyanthranilate

+

02^4 2-amino-3-carboxymuconate

sémi aldéhyde

Quinolinate phosphoribosyltransférase (QPT) 2.4.2.19 Quinolinate + PRPP

^

NMN + PPi

+

CO2

Acine nicotinique phosphoribosyltransférase

(NaPT) 2.4.2.11 Na

+

PRPP îî NMN +PPi

NMN adénylyltransférase (NMNATs) 2.7.7.1 NMN + ATP NAD*

+

PPi NaMN adénylyltransférase (NaMNATs) 2.7.7.1 NaMN

+

ATP NaAD*

+

PPi

NAD* synthase (NADS) 6.3.1.5 NaAD*

+

ATP

+

NH³

S

NAD*

+

AMP + PPi Nicotinamide phosphorybosyltransférase

(NAmPT) 2.4.2.12 NAm

+

PRPP NMN -nPPi

Nicotinamide ribose kinase (Nrk) 2.7.1.22 ATP

+

NR

5

ADP

+

NMN

Nicotinamidase 3.5.1.19 NAm + H2O Na + NH3

Tableau 1 : Liste des réactions enzymatiques impliquées dans le métabolisme du NAD.

PRPP = phosphoribosyl pyrophosphate, PPi = pyrophosphate inorganique

(19)

déplétion de la concentration intracellulaire en N AD a accru l’intérêt de la communauté scientifique pour l’étude du métabolisme du NAD et de son influence sur les réactions cellulaires dépendantes des pyridines nucléotides.

1.2 La biosvnthèse du NAD

Suivant l’organisme étudié, le NAD peut-être synthétisé à partir de quatre précurseurs présents dans l’alimentation (figure C). La voie de synthèse dite de novo utilise l’acide aminé tryptophane comme précurseur principal (certaines bactéries et quelques plantes peuvent initier cette voie à partir d’aspartate). L’acide nicotinique, le nicotinamide et le nicotinamide riboside peuvent quant à eux servir de précurseurs pour la formation de NAD à partir d’une voie de synthèse appelée voie de recyclage*.

1.2.1 La voie de synthèse de novo

Le tryptophane est l’acide aminé essentiel le plus rare, il ne représente que 1% des acides aminés présents dans les protéines cellulaires. Son rôle en tant que précurseur de NAD est mis en évidence par la maladie de Hartnup. Cette maladie héréditaire est causée par une mutation provoquant une anomalie du transport des acides aminés et, de ce fait, une diminution de l’absorption du tryptophane’. Les patients souffrant de cette maladie présentent les symptômes de la pellagre, une maladie due à une carence en précurseur de NAD (voir la voie de recyclage). Inversement, les personnes atteintes de la pellagre causée par une alimentation trop pauvre en précurseurs de pyridine nucléotide peuvent être soignées par l’administration de compléments alimentaires riches en tryptophane^.

La dégradation de cet acide aminé s’effectue par la voie des kynurénines (figure C, D et tableau 1) et génèrent des composés bioactifs tels que les kynurénines et l’acide quinolinique ou quinolinate^. L’utilisation de cet acide aminé par la voie de novo débute par l’oxydation du tryptophane en formylkynurénine. Cette première étape du catabolisme du tryptophane est initiée chez les mammifères par deux enzymes, la tryptophane 2,3-dioxygénase (TDO) et l’indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO).

L’expression de l’enzyme TDO est presque exclusivement limitée au foie, où elle est

induite par l’administration de tryptophane. Le rôle de cette enzyme dans le contrôle de

l’homéostasie du tryptophane fut par ailleurs à la base du premier exemple d’enzyme

inductible chez les mammifères. La seconde enzyme pouvant dégrader le tryptophane

ainsi qu’un grand nombre de composés à noyau indole est l’IDO. Cette enzyme présente

(20)

Formylkynurenine L-Kynurenine

K3H

Quinolinic acid 2-Amino-3-carboxy- 3-Hydroxyanthranylic acid 3-Hydroxykyninurenine muconate semialdehyde

Figure D : Représentation schématique de la voie de synthèse de synthèse de novo du NAD^.

Pour plus d’informations voir le texte. TDO = Tryptophane 2,3-dioxygénase, IDO = Indoléamine

2,3-dioxygénase, KFase = Kynurénine formamidase, K3H = Kynurénine 3-hydroxylase,

Kyase = Kynuréninase, 3HAO =3-Hydroxyanthranilate 3,4-dioxygénase, N.E. = réaction non

enzymatique

(21)

placenta et les cellules du système immunitaire. Récemment, une nouvelle enzyme possédant les mêmes caractéristique qu’TDO à été identifiée et nommée fDO-2. Bien qu’à ce jour, peut d’informations soit disponible à propos de cette enzyme, une caractéristique d’IDO-2 est d’être exprimé dans le foie*'^. La synthèse d’IDO ne semble pas être sensible à la concentration en tryptophane mais l’expression de cette enzyme est induite par de nombreux stimuli inflammatoires tels que l’interféron-y, les produits bactériens et viraux.

Les formylkynurénines produites par TDO/IDO sont rapidement transformées par la kynurénine formamidase en L-kynurénine qui est à son tour convertie en acide kynurenic ou en 3-hydroxykynurénine. Ce dernier composé neurotoxique est dégradé par la kynuréninase en acide 3-hydroxyanthranylique qui est utilisé par la dernière enzyme de la voie des kynurénine pour former du 2-amino-3-carboxymuconate sémialdéhyde (ACMS). L’ACMS est un produit instable qui spontanément va donner naissance à de l’acide quinolinique^.

Le branchement de la voie des kynurénines sur le métabolisme du N AD s’effectue grâce à l’activité enzymatique de la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPT). L’acide quinolinique produit à partir de la dégradation du tryptophane est spécifiquement utilisé par cette enzyme pour synthétiser de l’acide nicotinique mononucléotide qui sert à la biosynthèse du N AD. En plus de la réaction catalysée par TDO/IDO, l’activité enzymatique de la QPT est une étape limitante dans la voie de synthèse de novo". En effet, l’expression de cette phosphoribosyltransférase varie fortement suivant le type cellulaire et l’organisme étudié^. L’absence de gène homologue de la QPT chez Drosophila melanogaster et Caenorhabditis elegans suggère que le catabolisme du* tryptophane peut être découplé de la biosynthèse du NAD chez ces organismes. Chez les mammifères, cette enzyme s’exprime principalement dans le foie et le rein, ce qui suggère que la majorité des tissus n’ont pas la possibilité de connecter la voie des kynurénines au métabolisme du NAD. Cependant, il n’est pas exclu que dans certaines conditions, par exemple au cours de la réponse immune, le NAD puisse être synthétisé à partir de quinolinate et ce en dehors du foie”.

1.2.1.1 Catabolisme du tryptophane et réponse immune

Au cours de la réponse immune, l’expression des enzymes intervenant dans le

catabolisme du tryptophane est fortement régulée. En effet, l’inflammation induit une

augmentation de l’expression de l’IDO et une inhibition de l’activité de TDO. Cette

(22)

« réorganisation enzymatique » provoque un déplacement de la dégradation du tryptophane du foie vers les tissus extra hépatiques. L’activation d’EDO dans le cadre de la réponse immunitaire est principalement étudiée pour le rôle immunosuppresseur joué par cette enzyme. D a notamment été décrit que l’expression d’IDO par certaines populations de cellules présentatrices d’antigènes (par exemple, les cellules dendritiques plasmacytoïdes) leur confère des propriétés tolérogènes'^’’"*.

Les effets immunomodulateurs exercés par IDO sont généralement expliqués par deux mécanismes complémentaires'^. Premièrement, l’augmentation de l’expression d’IDO induit une chute locale de la concentration en tryptophane, le plus rare des acides aminés essentiels. La diminution de la concentration de cet acide aminé aromatique provoque une augmentation du nombre d’ARN de transfert non chargés en tryptophane, ce qui active la kinase GCN2'^. L’activation de cette voie de signalisation inhibe la synthèse protéique et provoque l’arrêt de la prolifération cellulaire'^. Deuxièmement, la dégradation du tryptophane par la voie des kynurénines génère des produits immunomodulateurs. Le relargage dans le milieu extracellulaire de ces métabolites du tryptophane inhibe la prolifération des lymphocytes T et induit leur apoptose. Les mécanismes moléculaires par lesquels ces produits exercent leurs effets immunosuppressifs ne sont pas bien connus. En effet, ce n’est que récemment qu’un récepteur capable de fixer l’acide kynurénique a été identifié'^.

La fonction immunomodulatrice exercée par l’induction de l’expression de l’enzyme IDO dans les tissus extra hépatiques ne semble pas directement liée à la synthèse du NAD. La diminution de l’activité enzymatique de TDO observée au cours d’une infection permet d’augmenter la quantité de tryptophane disponible pour le rôle immunosuppressif joué par les cellules exprimant IDO. Dans ces tissus, la synthèse du NAD doit dès lors se faire à partir d’autres précurseurs tels que l’acide nicotinique et/ou le nicotinamide.

1.2.2 La voie de synthèse de recyclage

Cette voie permet de synthétiser le NAD à partir de l’acide nicotinique et du

nicotinamide (figure C, E et tableau 1). Ces deux précurseurs peuvent provenir de

l’alimentation (sous forme de vitamine) mais également des réactions enzymatiques qui

utilisent le NAD comme substrat^.

(23)

évidence par l’observation suivante : une carence sévère en niacine conduit à une maladie appelée la pellagre*^. Celle-ci est caractérisée par des lésions cutanées, des troubles digestifs, psychiques et neurologiques. Les premiers cas de cette maladie sont apparus en Europe au lô®™^ siècle, peu après que se soit développée la culture de maïs. A cette époque, le maïs était devenu l’aliment de base pour certaines populations. Longtemps considérée comme une maladie infectieuse, ce n’est qu’au début du 20 ®'"® siècle que Joseph Goldberger mit en évidence que l’on pouvait guérir la pellagre avec une modification des habitudes alimentaires. En effet, malgré la présence de nombreux malades atteints par cette maladie dans les hôpitaux et les orphelinats, aucun employé de ces institutions ne souffrait de la maladie. Cette observation, associée au fait que l’ingestion, l’inhalation, l’injection d’échantillons prélevés sur des personnes soufrant de pellagre ne rendait pas Goldberger et son équipe malade, suggérait que cette maladie ne pouvait pas être due à un agent infectieux. Il montra par la suite que l’introduction d’une nourriture fraiche et variée au sein des hôpitaux permettait de soigner tous les symptômes des patients atteints de la pellagre. Malgré ces recherches, Goldberger ne découvrit pas précisément le composé manquant responsable de cette maladie^®.

Il faudra attendre les années 1930 et l’étude d’une maladie similaire répandue chez le chien, la maladie de la langue noire, pour que Elvehjem et ses collaborateurs mettent en évidence le rôle de la niacine dans cette pathologie. Ils ont établi que c’était l’absence d’acide nicotinique et de nicotinamide dans l’alimentation des chiens qui était à l’origine de la maladie et l’ajout de ces vitamines était suffisant pour traiter la pellagre^'. Depuis lors, l’association « pellagre - régime alimentaire à base de maïs » est bien comprise, le maïs étant une céréale pauvre en tryptophane et fournissant une faible quantité de niacine disponible. En effet, la niacine est présente dans le maïs mais principalement sous une forme glycosylée qui n’est pas efficacement assimilée et métabolisée par l’organisme .

Il est intéressant de constater que la pellagre n’est pas une maladie répandue dans

des pays comme le Mexique ou le Guatemala, où le maïs est à la base du régime

alimentaire. L’absence de carence en niacine dans les pays d’Amériques central

s’explique par la méthode traditionnelle utilisée pour cuisiner cette céréale. En effet, les

tortillas sont préparées à base de farine de maïs baignée dans une solution basique

(contenant de la chaux). Ce traitement provoque la libération de nicotinamide non

glycosylé qui est métabolisable par l’organisme.

(24)

Figure E : Représentation schématique de la voie de synthèse de recyclage du métabolisme du NAD.

L’ensemble des réactions enzymatiques permettant de synthétiser du NAD à partir d’acide nicotinique est

appelée voie de Preiss-Handler. Le recyclage du nicotinamide s’effectue soit directement par l’utilisation de la

NAmPT (cellules de mammifères), soit en dégradant le nicotinamide en acide nicotinique par la NAm

déaminase (levure).

(25)

impliquées dans la synthèse du NAD à partir de l’acide nicotinique provenant de l’alimentationV Cette voie de biosynthèse^^, appelée voie de Preiss-Handler, utilise l’acide nicotinique phosphoriboryle transférase (NaPT) pour modifier l’acide nicotinique en acide nicotinique mononucléotide (NaMN). Ce dernier composé, également produit par la voie de synthèse de novo, sert de substrat à l’acide nicotinique/nicotinamide mononucléotide adénylyltransférase^"^ (NMNATs) pour former l’acide nicotinique adenine dinucléotide (NaAD). La dernière étape de la biosynthèse du coenzyme consiste en une amination du NaAD en NAD catalysé par la NAD synthase^.

L’utilisation du nicotinamide comme précurseur de NAD nécessite, suivant l’organisme, la présence de la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAmPT) ou la présence d’une déamidase*^. Dans le cas où la NAmPT est présente, le nicotinamide est converti en nicotinamide mononucléotide (NMN). Ce mononucléotide est alors utilisé par la NMNATs pour former le NAD (voir figure E). La seconde possibilité pour que le nicotinamide serve de précurseur à la synthèse de NAD est la présence d’une déamidase.

Cette enzyme est nécessaire pour la transformation du nicotinamide en acide nicotinique qui est alors utilisé par la voie de Preiss-Handler.

D y a plus de 70 ans, les travaux menés afin de soigner la pellagre ont permis de

découvrir le rôle du tryptophane, de l’acide nicotinique et du nicotinamide dans la

synthèse du NAD. Le métabolisme de ce cofacteur, découvert au siècle passé, s’est depuis

peu enrichi de deux nouveaux précurseurs. En effet, les études réalisées sur la levure par

l’équipe de Charles Brenner ont mis en évidence le rôle du nicotinamide ribose (NR) dans

la biosynthèse du NAD^^. Ces résultats obtenus à partir de recherches fondamentales,

montrent que cette nouvelle vitamine, présente entre autres dans le lait, peut générer du

NAD à partir d’une enzyme appelée NR kinase (Nrk). Cette protéine caractérisée chez la

levure et les vertébrés forme du NMN qui peut être utilisé par la NMNATs pour produire

des nucléotides de pyridine. Récemment, de nouveaux résultats obtenus par cette équipe

ont mis en évidence chez la levure l’existence d’une voie alternative permettant la

synthèse du NAD à partir de la dégradation du NR en nicotinamide (voie Nrk

indépendante) . De plus, ils ont montré que l’acide nicotinique ribose (NaR), une

nouvelle vitamine synthétique, pouvait également servir de substrat aux voies Nrk

dépendantes et indépendantes . L’identification du nicotinamide ribose génère de

nombreuses questions. En effet, on ne connait ni le lieu, ni la manière dont il est

produit, ni le rôle physiologique qu’occupe ce nouveau précurseur dans la biosynthèse des

cofacteurs à pyridine.

(26)

Figure F : L’ADP-ribosylation est une réaction enzymatique catalysée par les ADP-ribosyl

transférase qui consiste en un transfert du groupe ADP-ribose du NAD sur une chaîne latérale

d’un résidu d’acide aminé spécifique de la réaction. Au cours de cette réaction, une molécule de

nicotinamide est libérée.

(27)

de biosynthèse du NAD, au niveau de la voie de recyclage, une dichotomie semble apparaître dans l’utilisation du nicotinamide. Ainsi chez la levure S. cerevisiae, chez le nematode C. elegans et chez la mouche D. melanogaster, il n’a pas pu être mis en évidence l’existence de la nicotinamide phosphoribosyltransférase. Mais on trouve dans ces organismes la déamidase nécessaire au passage nicotinamide-acide nicotinique. Par contre, chez les mammifères qui possèdent la NAmPRT, le gène codant pour la nicotinamidase est absent de leur génome (voir annexe 1 ).

Ces observations suggèrent que le recyclage du nicotinamide est un processus indispensable pour tous les organismes et ce, quelque soit le mécanisme utilisé. En effet, en plus d’être une vitamine, le nicotinamide est également produit au sein de la cellule par l’ensemble des réactions enzymatiques utilisant le NAD comme substrat. Ces enzymes NAD dépendantes ont pour caractéristique de cliver le nucléotide de pyridine en nicotinamide et ADP-ribose. Suivant la réaction enzymatique étudiée, l’ADP-ribose est transféré sur divers substrats allant de macromolécules telles que les protéines (ADP-ribosylation) jusque de petites molécules telles que l’eau (formation d’ADP-ribose).

1.3 NAD et ADP ribosvlation

L’ADP ribosylation est une modification covalente courante des protéines qui se déroule comme la phosphorylation, de façon réversible, aussi bien dans le cytoplasme que dans le noyau, et qui sert à réguler l’activité biologique de certaines protéines^*.

L’ADP ribosylation consiste en une réaction de transfert de l’ADP-ribose du NAD^ vers une protéine acceptrice tout en libérant une molécule de nicotinamide (figure F). Le site sur lequel a lieu la modification est une chaîne latérale d’un résidu d’acide aminé spécifique de la réaction. Les ADP-ribosyl transférases, enzymes qui catalysent cette modification, ont été isolées tant dans des eucaryotes que dans toutes les cellules procaryotes étudiées à ce jour^®.

1.3.1 La Mono(ADP-ribosvl)ation

L’activité enzymatique de certaines toxines bactériennes, connue sous le nom de

mono(ADP-ribosyl)ation, est le premier mécanisme de régulation dépendant du NAD qui

fut découvert. L’importance de cette modification est particulièrement bien illustrée par

(28)

loxim:

A7P r.-'-v.-.-»PPi

Figure G : La toxine cholérique provoque la mono(ADP-ribosyl)ation de résidus arginines dans

la sous unité a de la protéine Gs de la cellule hôte. Cette modification a pour conséquence le

blocage de l’activité GTPase de Gsa et l’activation permanente de l’adénylate cyclase (AC) .

(29)

cellulaires de l’hôte. Ces observations ont permis de classifier les mono(ADP-ribosyl)transférases (ART) en fonction de la spécificité du résidu d’acide aminé modifié sur la protéine acceptrice^^.

Ainsi, certaines toxines modifient spécifiquement les résidus arginines (la toxine du vibrio choleraé), asparagines (la toxine C3 du Clostridium botulinum) et cystéines (la toxine de Bordetella pertussis) des protéines cellulaires.

Pour illustrer la manière dont cette modification peut bouleverser l’activité biologique des protéines cibles, examinons l’effet de la toxine cholérique (figure G).

Après l’introduction de cette toxine dans le cytoplasme, elle provoque la mono(ADP-ribosyl)ation de résidus arginines dans la sous unité a de la protéine Gs de la cellule hôte. Il en résulte que l’activité GTPase de Gsa est bloquée et que l’adénylate cyclase est stimulée de façon continue. Cela provoque une augmentation de la concentration en AMPc qui conduit à terme, au niveau de la cellule et de l’organisme, à une perte massive en eau et en sodium^^.

Les mono(ADP-ribosyl)transférases d’origine eucaryotes les mieux caractérisées à

ce jour sont, soit des ectoenzymes liées à la membrane cellulaire par un ancrage

glycosylphosphatidylinositol (GPI), soit des enzymes sécrétées. Cette famille de

protéines, qui compte 5 membres chez les mammifères, transfère l’ADP-ribose sur un

résidu arginine ou cystéine de leur protéine cible. Ces enzymes s’expriment

principalement sur les cellules du système immunitaire où, étant donné leur localisation,

elles participent à la régulation de processus extracellulaires^^. Récemment, une étude a

mis en évidence la mono(ADP-ribosyl)ation d’un peptide anti microbien connu sous le

nom de défensine HNP-l^^ Cette modification, catalysée par l’enzyme ARTl et induite

au cours de la réponse inflammatoire, provoque la perte de l’activité lytique de HNP-1

(figure H). Un autre exemple, qui met en évidence le rôle joué par ces enzymes dans le

contrôle de la réponse immune, est l’induction de l’apoptose des lymphocytes T naïfs par

le NAD extracellulaire. En effet, l’ADP-ribosylation par ART2 du récepteur purinergique

P2X7 provoque son activation qui induit une cascade de réactions aboutissant à la mort

cellulaire . Les travaux menés par l’équipe de M. Seman suggèrent que ce mécanisme

contribue, in vivo, à réguler l’homéostasie des lymphocytes T en favorisant l’expansion

des cellules T de mémoire^^.

(30)

Intracellulaire

"O^s I

°-po ( O K__ ^

OH OH N

‘0-P*0

I ''N'*'

O--- OCHa

O---CH2

Acgi4-"

fi

“o-p=o

I ^

OH OH

'O-P-O

N

I '•N

O---OCH2

OH OH

NAM CJ H*

Extracellulaire

Figure H : Les substrats des mono(ADP-ribosyl)transférases eucaryotes sont des protéines

extrcellulaires (défensine HNP-1) et intracellulaires (sous unité p des protéines G). Le niveau

d’ADP-ribosylation de la sous unité P des protéines G est contrôlé par des ADP-ribosylhydrolases

cytoplasmiques (ARH)^"*. GPI = glycosylphosphatidylinositol

(31)

présentent une localisation extracellulaire, la mono(ADP-ribosyl)ation de protéines intracellulaires a également été observée. Un substrat bien connu de cette modification est la sous unité P des protéines G. L’activité de cette sous unité est contrôlée par un cycle d’ADP-ribosylation régulé par une ART et une ADP-ribosylhydrolase cytoplasmique (figure H). Il existe d’autres exemples de protéines intracellulaires mono-ADP-ribosylées (l’actine, la protéine chaperonne GRP78 ou encore la glutamate déshydrogénase) ; cependant, il existe très peu d’informations sur les enzymes responsables de ces modifications^'^. Etant donné que toutes les séquences d’ADN homologues aux ARTs extracellulaires codent pour des enzymes connues, il apparaît dès lors que les ARTs intracellulaires font parties d’une ou de plusieurs nouvelles familles de protéines ne présentant pas d’homologie de séquence avec les ARTs conventionnelles. L’existence d’une telle mono(ADP-ribosyl)transférase a récemment été démontrée grâce à l’identification de l’enzyme responsable de l’(ADP-ribosyl)ation de la glutamate déshydrogénase^^. Cette enzyme, appelée SIRT4, fait partie de la famille des sirtuines (voir chapitre 1.5.2) et ne présente pas de similarité de séquence avec les ARTs extracellulaires.

1.3.2 La Polv(ADP-ribosvl)ation et les PARPs

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle des protéines se déroulant principalement dans le noyau de toutes les cellules eucaryotes, à l’exception de la levure^^. Cette réaction enzymatique est catalysée par les poly(ADP-ribose)polymérases ou PARPs. Bien que cette modification soit connue depuis plus de 40 ans, ce n’est que depuis ces dernières années qu’est apparue l’existence d’une famille PARP produite dans les cellules humaines à partir de 17 gènes différents . Au sein de cette famille de protéines, l’enzyme prototype et la mieux caractérisée est connue sous le nom de PARP-1.

Ces enzymes PARPs catalysent la formation de polymères d’ADP-ribose (PAR).

La première étape impliquée dans la synthèse de cette structure consiste à transférer un ADP-ribose provenant du NAD sur un résidu glutamate, aspartate ou lysine de la protéine cible. Après cette initiation, ce premier ADP-ribose sert de point de départ pour la formation d’un homopolymère constitué d’ADP-riboses liés entre eux par une liaison glycosidique 1”-» 2’ (2’-OH sur le ribose proximal et l”-OH sur le ribose distal).

Suivant l’enzyme étudiée et son état d’activation, cette modification peut être constituée

de polymères de tailles et de structures très variables allant de quelques dizaines

(32)

Figure I :

1. La poly(ADP-ribosyl)ation est une réaction catalysée par les PARPs qui consiste à transférer le groupe ADP-ribose du NAD"*^ sur un résidu glutamate d’une protéine acceptrice. Ce premier ADP-ribose servira par la suite de point de départ pour la formation d’un polymère ramifié pouvant compter plus de 200 résidus d’ADP riboses. Cette modification post-traductionnelle est réversible grâce à l’activité enzymatique des PARC (poly(ADP-ribose)glycohydrolase) qui dégradent les polymères d’ADP-ribose . 2. Les polymères ramifiés, formés lors de la poly(ADP-ribosyl)ation, sont des molécules chargées

négativement qui provoquent généralement une diminution drastique des propriétés biologiques des

protéines cibles. L’addition de polymères d’ADP-ribose sur une protéine se fixant à l’ADN peut

provoquer la perte de son affinité pour l’ADN et ce, à cause des répulsions électrostatiques et de

l’encombrement stérique.

(33)

"^7

pouvant être ramifiées (figure I).

La poly(ADP-ribosyl)ation peut également constituer une modification non covalente des protéines^^. En effet, les polymères d’ADP-riboses peuvent interagir spécifiquement avec de nombreuses protéines possédant soit un motif de fixation au PAR (XRCCl, DNA ligase III, DNMTl...) qui se localise souvent dans des domaines protéiques fonctionnellement importants, soit un « domaine macro » (macroH2A, BAL...)^^

La fixation covalente ou non de polymères provoque généralement une diminution drastique de l’activité biologique des protéines cibles. Dans beaucoup de cas, cette perte d’activité peut être expliquée par l’encombrement stérique et/ou les modifications électrostatiques provoquées par l’ajout de nombreuses charges négatives lors de la poly(ADP-ribosyl)ation'^^ (figure I). Cela a pour effet de faire perdre à la protéine acceptrice sa capacité à interagir avec d’autres protéines ou avec l’ADN (figure I).

Néanmoins, dans certaines conditions, la poly(ADP-ribosyl)ation peut également servir de signale déclencheur pour le recrutement et la formation de complexes protéiques

37

(voir PARP-1 et le contrôle de l’intégrité du génome).

1.3.2.1 PARP-1

Au sein de la famille des protéines PARPs, l’enzyme PARP-1 est la plus abondante et la mieux caractérisée . L’une des tâches clefs de cette enzyme semble être le maintien de l’intégrité du génome à travers la modulation de multiples événements physiologiques tels que la division cellulaire, la réparation de l’ADN, l’expression des gènes ou encore la mort cellulaire^^.

PARP-1 et le contrôle de l’intégrité du génome

Durant un stress génotoxique causé soit par des radiations ionisantes, soit par des

agents alkylants ou oxydants, PARP-1 reconnaît et se fixe spécifiquement à l’ADN

endommagé. Cette liaison déclenche l’activité catalytique de cette enzyme, laquelle

provoque la poly(ADP-ribosyl)ation des protéines cibles, tels que certains facteurs de

transcription, les histones, les topoisomérases I et II et PARP-1 elle-même^’. Il apparaît,

vu le nombre de protéines nucléaires modifiées par l’ajout de PAR, que la

(34)

Figure J : Lorsque l’ADN est endommagé, PARP-1 est recruté au niveau de la cassure de l’ADN. La

synthèse des Polymères d’ADP-ribose permet le recrutement de la machinerie de réparation de l’ADN

(XRCCl, Pol b, DNA ligase III (Lig3), PARP-2). Lorsque la réparation de l’ADN est initiée,

l’automodification de PARP-1 provoque son détachement de la cassure permettant la remise en état de

l’ADN

(35)

dommage causé à l’ADN^^. Les études menées sur les souris invalidées pour le gène codant pour PARP-1 ont permis de vérifier cette hypothèse Elles ont mis en évidence le rôle de cette protéine dans les complexes impliqués dans la réparation de l’ADN'^^’'^^, SSBR (Single-Strand Break Repair), DSBR (Double-Strand Break Repair), BER (Base Excision Repair) nécessaires à la détection et à la réparation rapide de l’ADN dégradé.

Le rôle de PARP-1 dans le maintien de l’intégrité du génome peut être expliqué grâce à un modèle en trois étapes"^:

L’ADN cassé provoque le recrutement et l’activation de PARP-1.

L’état d’activation de PARP-1 « informe » la cellule sur l’étendue des dégâts, de sorte qu’elle peut choisir entre la réparation de son patrimoine génétique ou la mort cellulaire.

La production de PAR permet le recrutement rapide et efficace des facteurs nécessaires à la réparation de l’ADN.

Dans ce modèle, PARP-1 est considérée comme un interrupteur favorisant l’initiation de la réparation de lADN et empêchant la transcription des gènes au niveau de l’ADN endommagé'^^. Lorsque PARP-1 est activée par une cassure dans l’ADN, l’extrémité N- et C-terminale des histones, des facteurs de transcription ainsi que PARP-1 elle-même sont modifiés par ajout de PAR (figure J). Cette modification contribue à la relaxation de la fibre de chromatine et empêche les facteurs de transcription de se placer au niveau de leur site de fixation à l’ADN"^^. L’ouverture de la chromatine permet à PARP-1 de recruter de façon efficace ses partenaires appartenant à la machinerie de réparation de l’ADN (SSBR, DSBR ou BER)"*^. L’assemblage de ces complexes est dépendant d’une activité de poly(ADP-ribosyl)ation qui permet la formation d’un

«échafaudage» de PAR sur lequel les protéines (XRCCl, DNA polymérase P, DNA ligase III ...) se fixent de manière spécifique et interagissent entre elles. L’équipe de G.

de Murcia a notamment démontré que la mise en place de ces structures, qui débute par le recrutement de XRCCl sur l’ADN endommagé, est dépendante de la formation de PAR

Lorsque la réparation de l’ADN est initiée, l’automodification de PARP-1 provoque par répulsion électrostatique son détachement de la cassure laissant ainsi l’accès aux enzymes nécessaires à la remise en état de l’ADN : la réparation de l’ADN est activée (figure J).

Malgré l’existence de nombreux mécanismes impliqués dans la réparation de

l’ADN, l’exposition des cellules à un stress génotoxique massif peut provoquer

(36)

l’introduction de modification dans le patrimoine génétique. La formation de ces mutations peut potentiellement provoquer le développement de cellules tumorales^°. Afin d’éviter l’apparition de ces cellules suite à une dégradation trop importante de l’ADN, PARP-1 joue le rôle d’aiguillage entre réparation et mort cellulaire.

Au cours d’un stress génotoxique, l’activation de PARP-1 est l’une des premières réponses cellulaires observées"^. Lorsque les dégâts sont modérés, PARP-1 permet une réparation rapide et efficace des cassures de l’ADN. Dans ces conditions, l’enzyme joue un rôle fondamental pour la survie de la cellule endommagée. Cependant, lorsque les dommages causés à l’ADN sont trop importants, l’activation de PARP-1 est supra- optimale et provoque une diminution rapide de la concentration en NAD conduisant à une crise énergétique et à la mort cellulaire^’.

La mort cellulaire dépendante de PARP-1 est un phénomène intervenant dans de nombreuses pathologies (ischémie-reperfusion, maladies neurodégénératives, inflammation...)^^ Bien que l’implication de PARP-1 soit clairement établie dans ces maladies, le mécanisme par lequel cette enzyme induit la mort cellulaire reste ouvert à de nombreuses discussions^^. Il existe cependant quelques étapes clés indispensables pour induire une mort PARP-1 dépendante.

Lorsqu’une cellule est soumise à un stress génotoxique sévère, l’activation de

PARP-1 génère rapidement la formation de polymères d’ADP-riboses qui sont aussitôt

dégradés par l’intermédiaire d’une poly(ADP-ribose)glycohydrolases (PARC) . L’hyper-

activation de cette boucle (synthèse et dégradation des polymères d’ADP-ribose)

provoque une chute rapide de la concentration intracellulaire de NAD et une baisse de la

production d’ATP^'’. De plus, afin de restaurer son stock de NAD, la cellule consomme

l’équivalent de trois molécules d’ATP pour synthétiser un coenzyme de pyridine à partir

d’une molécule de nicotinamide^^. La déplétion du NAD intracellulaire n’est pas la seule

conséquence directe de l’activation de ce cercle futile. En effet, l’activité enzymatique de

PARC génère des oligomères de PARs libres^^. Ces oligo/polymères, produits lors de

l’hyper activation de PARP-1, provoquent le transfert de la protéine AIE de la

mitochondrie vers le noyau où elle induit la fragmentation du génome par un mécanisme

connu sous le nom de chromatinolyse^^. La crise énergétique déclenchée par l’activation

de la boucle PARP-1/PARC et la délocalisation d’AEF vers le noyau aboutit à terme à la

mort de la cellule par un mécanisme de mort cellulaire régulé indépendamment des

caspases.

(37)

PARP-1 ou l’inhibition pharmacologique de cette enzyme sont suffisants pour réduire fortement la mortalité cellulaire^' et ce, en bloquant la chute du niveau de NAD et la migration du facteur

PARP-1 et inflammation

L’enzyme PARP-1 est connue depuis longtemps pour jouer un rôle essentiel dans la progression de l’inflammation causée par de nombreuses maladies . Cela a été mis en

CQ

évidence par le fait que les souris génétiquement invalidées pour cette protéine (souris PARP-f^'), ou des souris traitées avec des inhibiteurs de PARP sont moins sensibles à de nombreux modèles expérimentaux d’inflammation chronique ou aigue^'’^^ (voir Tableau 2). Cette protection peut s’expliquer par le fait que la protéine PARP-1 intervient dans l’activation et le maintien d’une cascade d’évènements qui participe au développement de ces pathologies''^.

Tableau 2 : PARP et inflammation

Modèle expérimentale Souris PARP Inhibition pharmacologique

Choc sceptique Augmentation de la survie Protection

Arthrite L’inflammation est diminuée Diminution des œdèmes

Inflammation intestinal Diminution de l’inflammation Amelioration des paramètres vitaux Inflammation

des voies respiratoires Réduction de l’infiltrat Protection

Asthme - Protection

Tableau 2 : Liste des modèles expérimentaux d’inflammation dans lesquels le rôle de PARP-1 a été étudié.

Bien que le développement de ces maladies présente des origines différentes, ces

maladies ont en commun de déclencher l’expression de gènes impliqués dans le contrôle

de la réponse immune et inflammatoire. L’induction de ces gènes dépend entre autres de

facteurs de transcription dont le plus connu et le plus étudié est NF- k B^"’^'. L’utilisation

des souris PARP-L^’ a permis de mettre en évidence l’implication de cette enzyme dans le

contrôle de la transcription de gènes codant pour des médiateurs pro-inflammatoires

dépendants de NF- k B tels que iNOS, des cytokines, des chimiokines et des molécules

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d’adhésion®. De nombreuses études découlants de ces observations ont montré que PARP-1 joue le rôle de coactivateur pour NF- k B et permet une transcription plus efficace des gènes d’intérêts. Bien qu’il n’existe pas dans la littérature de consensus sur le mécanisme d’interaction entre PARP-1 et NF- k B, certains résultats suggèrent que l’activité coactivatrice de PARP-1 est indépendante de sa capacité à lier l’ADN et ne requiert pas son activité enzymatique®’®^’®^.

Ces observations doivent cependant être nuancées, car suivant le type cellulaire considéré, le stimulus utilisé et le gène étudié, les résultats peuvent fortement varier.

Considérons à titre d’exemple le gène iNOS (NO synthase inductible), dont l’expression est régulée par PARP-1®^. La production d’iNOS est inhibée dans les souris PARP-F^', de plus, l’utilisation d’un inhibiteur de PARP (3,4-dihydro-5-[4-(l-piperidinyl)butoxy]-l- (2H)-isoquinolinone ou DPQ) inhibe la synthèse de iNOS produit par une lignée de macrophages stimulés au LPS®®. Cela suggère que la production d’iNOS est dépendante de PARP-1 et de son activité enzymatique. Cependant, lorsque ces cellules sont activées par du LPS plus de l’interféron-y, le DPQ n’affecte pas la synthèse de iNOS. En conclusion, bien que la synthèse d’iNOS soit dépendant de PARP-1, il est intéressant de constater que suivant les conditions expérimentales utilisées, l’activité enzymatique de PARP-1 est plus ou moins nécessaire afin d’induire l’expression de cette protéine.

Indépendamment de cette polémique, l’importance du rôle de PARP-1 et les effets protecteurs des inhibiteurs de PARP dans divers modèles d’inflammation ont été démontrés par de nombreux laboratoires®^. Les propriétés protectrices de ces inhibiteurs sur le développement de ces pathologies peuvent entre autres s’expliquer par l’effet de ces molécules sur la mort cellulaire provoquée par la réaction inflammatoire. En effet, au cours de la réponse immune de nombreuses cellules (neutrophiles, macrophages) productrices d’iNOS infiltrent le site de l’inflammation et produisent une grande quantité de dérivés hautement toxiques du monoxyde d’azote (peroxynitrite) et d’oxygène (ion superoxyde, peroxyde d’hydrogen). La production de ces radicaux libres provoque un stress oxydant qui génère de nombreuses cassures dans l’ADN des cellules avoisinantes et cause l’activation de PARP-1®®. La mort cellulaire caspase indépendante qui résulte de la dégradation de l’ADN entraîne une amplification de l’inflammation par la libération de composants intracellulaires aux propriétés pro-infiammatoires'*’ (HSP, HMG...).

L’utilisation des inhibiteurs de PARP permet, dans ces conditions, de diminuer la mort

cellulaire PARP-1 dépendante et de bloquer la mise en place d’une boucle de régulation

positive (libération de médiateur pro-inflammatoire, activation et recrutement des

cellules effectrices) qui mène, en final, au développement d’une inflammation systémique

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Macrophage

PARP- 1 ^

inhibitors

PARP-J inhibitors

.PARf-î InhibjtoTî

Stress inflammatoires

0/ NO ____ 1

HjO, NO-A----

_OHOO-

Mort cellulaire caspases

indépendamment Inflammation

Figure K : Au cours de la réponse inflammatoire, PARP-1 intervient à deux niveaux"^’ :

Premièrement, PARP-1 peut contrôler la production des médiateurs pro-inflammatoires (iNOS) induit par l’activation des cellules du système immunitaire (macrophage) en régulant l’activité du facteur de transcription NF- k B.