Article pp.315-323 du Vol.26 n°4 (2006)

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L’ALIMENTATION ET LA VIE

Étude des conditions de revivification pour deux espèces bactériennes stressées

thermiquement

A. Boubetra

^1*

, F. Billaux

¹

, A. Kobilinsky

²

1. Institut scientifique d’hygiène et d’analyse – 25, avenue de la République – 91300 Massy – France.

2. Unité de Biométrie – Institut national de recherche agronomique – 78352 Jouy-en-Josas – France.

* Correspondant : [email protected]

SUMMARY

Study of the resuscitation conditions of two heat-injured bacterial species Two bacterial strains are studied: Escherichia coli and Listeria monocytogenes.

The main aim of this work is to establish resuscitation protocols for the heat injured micro-organisms. In the first time, composition and incubation conditions of primary suspension are studied. The results show that the addition of magnesium ions in this suspension increases the recovery of E. coli, nevertheless, addition of phosphates decreases the recovery of the two strains. (30 ± 5) minutes at (30 ± 1) °C are the best conditions of primary suspension incubation. In the second time, aerobic conditions, inoculation type and culture media composition are studied. The results show that addition of oxyrase in culture media increases the recovery of the two strains studied in particular L. monocytogenes.

Keywords

stress, micro-organisms, resuscitation, methods.

Dans chaque numéro, cette rubrique met en avant un article traitant d’un des aspects de la nutrition, du rôle des technologies agroalimentaires sur la qualité des aliments jusqu’à la

« cuisine », en passant par les problèmes nutritionnels, la toxicologie alimentaire, et plus générale- ment les conséquences sur la santé des pratiques alimentaires. Les articles retenus sont soit des travaux de synthèse de haut niveau faisant le point sur une question, soit des publications origina- les rendant compte de travaux de recherche appliquée récents apportant un regard nouveau.

La Société scientifique d’hygiène alimentaire (SSHA), société savante créée en 1904 pour contri- buer à la diffusion des connaissances en nutrition et sécurité sanitaire, est aujourd’hui formée de deux départements : l’Institut supérieur de l’alimentation (ISA) développe des actions de formation, d’information et de conseil ; l’Institut scientifique d’hygiène et d’analyse (ISHA) propose un catalogue complet d’analyses (composants nutritionnels, contaminants, analyse sensorielle, microbiologie…).

Les propositions d’articles, remarques et suggestions peuvent être envoyées à : Claude Bourgeois

SSHA

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RÉSUMÉ

Le but principal de ce travail est de mettre au point des protocoles de revivification pour des bactéries stressées thermiquement. Deux espèces bactériennes sont étudiées : Escherichia coli et Listeria monocytogenes. Dans un premier temps, la composition et les conditions d’incubation de la suspension-mère sont étudiées. Les résultats obtenus montrent que la présence d’ions magnésium dans la suspension- mère augmente le recouvrement des cellules d’E. coli, alors que, la présence de phosphates diminue ce recouvrement pour les deux souches étudiées. Les conditions d’incubation de la suspension-mère sont de (30 ± 5) minutes à (30 ± 1) °C.

Dans un deuxième temps, sont étudiées les conditions de dénombrement (type d’ensemencement, aérobiose…). Les résultats montrent qu’en présence d’oxyrase dans le milieu de culture le recouvrement est plus important notamment, chez L.

monocytogenes.

Mots clés

stress, micro-organismes, revivification, méthodes.

1 – INTRODUCTION

Les nouvelles technologies de transformation des produits alimentaires (ionisation, cuisson sous vide, salage, etc.) conduisent de plus en plus fréquemment à une destruc- tion incomplète des microorganismes. Les cellules survivantes, stressées par les traitements technologiques ou par un environnement hostile, sont difficilement détectables par les techniques de microbiologie classique. Cependant, elles sont capables de restaurer leurs activités dans l’aliment et peuvent être à l’origine d’altérations commerciales ou d’intoxications alimentaires. La détection de ces bactéries viables mais stressées néces- site une étape de réparation cellulaire (BRISSONNET et al., 1994). L’absence de cette étape peut conduire à une sous-estimation du nombre de microorganismes présents dans un aliment et pourrait avoir un impact non négligeable en terme de santé publique (MIHOUB et al., 2003a).

Malgré une abondante bibliographie sur le sujet (MOSSEL et VAN NETTEN, 1984) il n’y a actuellement pas de consensus sur la méthode de revivification à utiliser pour récupérer lors d’un dénombrement ou d’une recherche, les germes stressés présents dans le pro- duit alimentaire. L’objectif de ce travail est de proposer une méthode de revivification après un stress thermique.

Les essais ont porté dans un premier temps sur la suspension-mère ; l’ajout de molé- cules (EL-KEST et al. 1992), la température et le temps d’incubation de cette suspension ont été étudiés. Dans un deuxième temps, les conditions de dénombrement telles que : l’aérobiose, type d’ensemencement, ajout de molécules dans le milieu de culture, tempé- rature d’incubation du milieu de culture, ont été étudiés.

Deux espèces bactériennes ont été testées, une bactérie Gram positif (Listeria mono- cytogenes) et une bactérie Gram négatif (Escherichia coli), deux bactéries largement répandues dans les industries agroalimentaires.

La répétabilité des essais et la fréquence d’utilisation des traitements thermiques dans l’industrie, ont conduit à choisir ce traitement comme stress appliqué.

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2 – MATÉRIELS ET MÉTHODES

2.1 Souches

Deux espèces bactériennes ont été utilisées ; E. coli (CIP 54127) et L. monocytogenes (LO28). Les cellules sont stockées sous forme congelée et subissent plusieurs repiquages successifs avant utilisation.

2.2 Protocole de repiquage et traitement thermique

Des billes congelées contenant les cellules bactériennes sont incubées 8 heures à 37 °C dans le bouillon TSB (Tryptone Soy Broth : AES), suivie d’un repiquage à 1 % dans le même bouillon avec une incubation de (16 ± 2) heures à 37 °C. 0,5 ml de ce bouillon sont inoculés dans 100 ml de bouillon TSB et incubés 4 heures à 37 °C. Un premier lavage par centrifugation à 1 000 g pendant 15 minutes est réalisé, suivi d’un deuxième lavage dans les mêmes conditions. Enfin le culot est remis en suspension dans le milieu de Raybaud (5 g d’extrait de viande, 5 g de peptone pancréatique de caséine et 10 g de peptone universelle M66 pour 1000 mL d’eau distillée). Cette suspension est répartie à raison de 2 ml par tube de TDT (Thermal Death Tube) avant immersion dans le bain-marie et application du traitement thermique. Le refroidissement est réalisé à 15 °C pendant 5 minutes avant les dénombrements sur milieux de culture.

2.3 Mesure du stress

La caractérisation du stress est réalisée par un dénombrement en parallèle sur milieu sélectif pour chaque espèce (PALCAM : Oxoid, pour L. monocytogenes et VRBL : AES pour E. coli) et sur milieu non sélectif (TSA : AES). L’intensité du stress est mesurée par rapport à l’écart des dénombrements entre les 2 milieux (MIHOUB et al. 2003b).

2.4 Barèmes thermiques utilisés

Plusieurs essais ont été réalisés pour déterminer le meilleur barème (temps, tempéra- ture) qui donne un écart important [au moins 1 log de CFU (Colonie Formant Unité)/ml]

entre le milieu sélectif et le milieu non sélectif.

Les traitements appliqués sont de 30 minutes à 51 °C et de 10 minutes à 55 °C pour respectivement E. coli et L. monocytogenes. L’écart des dénombrements entre les deux milieux de culture utilisés est de 2.5 en log pour E. coli et 2 en log pour L. monocytoge- nes.

2.5 Plans d’expériences

Les plans d’expériences ont été réalisés en suivant les plans élaborés par le logiciel PLANOR et analysés par le logiciel ANALYS (unité biométrie de l’Inra de Versailles).

2.6 Plan d’expériences n° 1

Ce plan est basé sur la matrice d’HADAMARD irrégulière 32 × 32 obtenue par permuta-

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Tableau 1

Modalités des facteurs (plan d’expériences n° 1).

Table 1

Modality of factors (experimental design n° 1).

2.7 Plan d’expériences n° 2

Le plan n° 2 est prévu pour étudier 11 facteurs, il comprend 32 unités réparties en 2 blocs. Il est de résolution IV. Les facteurs sont répartis en 2 groupes (important et secondaire) en fonction des résultats obtenus dans le plan d’expériences n° 1 (tableau 2).

Facteurs Modalités

Diluant 1 : tryptone sel 0 : eau peptonée

Molécules du cycle de Krebs Acétate , fumarate, citrate, malate, pyruvate et

succinate

1 : présence 0 : absence

Acides aminés

Glutamate, bétaïne et proline 1 : présence 0 : absence Sucres

Glucose, saccharose, lactose et glycérol

1 : présence 0 : absence

Sels et molécules diverses

Na₂HPO₄ 1 : présence 0 : absence

KH₂PO₄ 1 : présence 0 : absence

MgSO₄ 1 : présence 0 : absence

FeSO₄ 1 : présence 0 : absence

Tween 80 1 : présence 0 : absence

Catalase 1 : présence 0 : absence

Extrait de levure 1 : présence 0 : absence

Temps suspension-mère 1 : 60 min. 0 : 30 min.

Température suspension-mère 1 : 30 °C 0 : 22 °C

Niveau de contamination N1 : 10⁶cellules/ml N2 : 10⁴cellules/ml

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Tableau 2

Modalités des facteurs (plan d’expériences n° 2).

Table 2

L’état physiologique 30 min. et 60 min. signifie respectivement 30 et 60 minutes avant la fin de la phase exponentielle de croissance caractérisée par l’endroit où la courbe de croissance présente un point d’inflexion.

2.8 Plan d’expériences n° 3

Ce plan a pour objectif l’étude de l’optimisation des conditions de dénombrement. Le plan de base retenu comprend 64 traitements différents. C’est une fraction 1/4 du plan factoriel complet 4 × 26, répartie en 4 blocs correspondants aux 4 journées nécessaires pour réaliser cette expérience. Cette fraction est régulière de résolution V et permet d’estimer l’effet considéré ici comme additif du facteur bloc. En outre, 8 des 64 traitements ont été répétés 2 fois supplémentaires et le plan comporte donc 80 [64 + (2 × ^8)]

unités expérimentées à raison de 20 par jour chacune des 4 journées.

Facteurs Modalités

Facteurs importants

Na₂HPO₄ + KH₂PO₄ 1 : présence 0 : absence

Diluant 1 : tryptone sel 0 : eau peptonée

MgSO₄ 1 : présence 0 : absence

Lactose 1 : présence 0 : absence

État physiologique 1 : 30 min. 0 : 60 min.

Bloc 1 : jour 1 0 : jour 2

Facteurs secondaires

Acétate 1 : présence 0 : absence

Catalase 1 : présence 0 : absence

Extrait de levure 1 : présence 0 : absence

Bétaïne 1 : présence 0 : absence

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Tableau 3

Modalité des facteurs du plan d’expériences n° 3.

Table 3

3 – RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

Pour la mise en évidence des effets des différents facteurs, plusieurs outils statisti- ques ont été utilisés. L’analyse de variance et le graphique de Daniel, et l’analyse de Box- Meyer quand le nombre de degrés de libertés résiduels est insuffisant pour trancher avec la seule analyse de variance. L’interprétation des résultats est faite essentiellement sur les données obtenues en milieu sélectif et, s’il y a lieu, sur la différence du milieu sélectif et du milieu non sélectif.

Facteurs Niveaux Modalités

Diluant 4 1 - diluant spécifique***

2 - diluant général**

3 - eau peptonée

4 - eau peptonée tamponnée

Aérobiose 2 1 - incubation en aérobiose

2 - incubation en anaérobiose

Température* 2 1 - température basse (30 °C)

2 - température haute (37 °C)

Type d’ensemencement 2 1 - en surface

2 - en profondeur

Catalase 2 1 - présence

2 - absence

Oxyrase 2 1 - présence

2 - absence

État physiologique 2 1 - 30 min.

2 - 60 min.

Jour 4 1 - jour 1

2 - jour 2 3 - jour 3 4 - jour 4

* Pour E. coli les 2 modalités température sont : 37 °C/37 °C pendant 4 h puis (44 °C).

** Diluant général : eau peptonée + acétate + bétaine + saccharose + lactose + glycérol + ion magnésium + Tween 80 + catalase + extrait de levures.

*** Diluant spécifique (E. coli) : eau peptonée + ion magnésium + Tween 80.

*** Diluant spécifique (L. monocytogenes) : eau peptonée + acétate + citrate + malate + bétaine + proline + saccharose + lactose + extrait de levures.

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3.1 Plan d’expériences n° 1

L’analyse de variance sur l’ensemble des résultats obtenus pour E. coli, montre que le facteur magnésium est significatif à 0,1 %. La présence d’ions magnésium dans le diluant augmente le recouvrement en milieu sélectif (VRBL) de 0,76 en logarithme et en moyenne. Cependant la présence dans le diluant de sels tels que les phosphates et le sulfate de fer augmente le stress. L’ajout du sulfate de fer diminue le recouvrement des cellules stressées de 0,36 en logarithme et en moyenne. De même la présence de Na₂HP0₄diminue ce recouvrement de 0,42 en logarithme et en moyenne. D’autre part l’effet du diluant est significatif à 1 % avec une meilleure récupération de cellules stres- sées en eau peptonée (0,38 en logarithme et en moyenne d’augmentation par rapport au typtone sel).

Ces résultats montrent l’effet important de l’ion magnésium dans la réparation des cellules stressées car il joue un rôle primordial dans la stabilité des membranes cellulaires. La richesse en nutriments de l’eau peptonée confère également des propriétés répa- ratrices pour les cellules stressées.

On notera qu’aucun effet significatif n’a été observé chez L. monocytogenes en dehors de l’effet niveau de contamination et de l’effet bloc. Cette absence d’effets significatifs vient de l’importance de l’écart-type résiduel. Après suppression de quelques don- nées, l’écart-type diminue de façon sensible et on retrouve certains effets, notamment celui du diluant, avec une meilleure récupération en eau peptonée.

La température et le temps d’incubation de la suspension-mère ne sont pas significatifs, mais pour des raisons pratiques on a choisi le couple temps température de (30 ± 1) minutes à (30 ± 1) °C pour les 2 souches.

3.2 Plan d’expériences n° 2

L’effet du facteur phosphate est retrouvé pour ce second plan (α = 1 %) pour E. coli, en présence de ces anions le recouvrement diminue de 0,34 en logarithme et en moyenne. Même constat pour L. monocytogenes, la présence des phosphates diminue le recouvrement de 0,26 en logarithme et en moyenne. Les résultats montrent pour les 2 bactéries un effet important de l’état physiologique. En effet une différence de 0,74 et de 0,38 en logarithme et en moyenne est observée entre les 2 modalités du facteur (30 et 60 minutes avant le point d’inflexion de la courbe de croissance) pour E. coli et L. mono- cytogenes respectivement. Le stress est plus important quand les cellules sont traitées 60 minutes avant le point d’inflexion, dans ce cas les cellules sont plus sensibles. En effet les cellules en phase exponentielle de croissance sont très hétérogènes et par consé- quent plus sensibles aux traitements subis ; plus on approche de la phase stationnaire, plus la population microbienne est homogène et donc plus elle est résistante.

Le facteur bloc est également significatif à 1 %, cet effet est dû à la mauvaise repro- ductibilité des essais d’un jour à l’autre.

3.3 Plan d’expériences n° 3

L’analyse de variance effectuée sur les résultats obtenus pour E. coli montre un effet significatif du diluant (α = 1 %). Le calcul des moyennes confirme l’effet négatif des phosphates sur cette souche. De même les diluants de type spécifique et général donnent les même taux de recouvrement (respectivement 4,75 et 4,69 en logarithme et en moyenne) en aérobiose. L’effet aérobiose est observé pour E. coli. En présence d’oxygène, le recouvrement augmente de 1,06 en logarithme et en moyenne dans les diluants spécifi- que et général. Même si les facteurs oxyrase et catalase ne sont pas significatifs, ils pré-

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L’analyse statistique des résultats obtenus pour L. monocytogenes montre que les facteurs température, type d’ensemencement et oxyrase sont significatifs à 1 %.

La meilleure récupération de cette souche est observée à 30 °C. L’augmentation du taux de recouvrement par rapport à 37 °C est de 0,85 en logarithme et en moyenne.

L’ensemencement en surface donne de meilleurs résultats de recouvrement par rapport à l’ensemencement en profondeur (la différence entre les 2 modalités du facteur est de 0,4 en logarithme et en moyenne).

La présence de l’oxyrase dans le milieu de dénombrement augmente le recouvrement des cellules stressées de 0,98 en logarithme et en moyenne.

Comme pour E. coli, l’effet négatif des phosphates dans le diluant est confirmé même si ce facteur n’est pas significatif.

Les résultats obtenus confirment ceux des plans précédents pour la présence des phosphates dans le diluant. L’effet de l’oxyrase est démontré notamment chez L. mono- cytogenes. Cette enzyme joue un rôle important dans la dégradation des radicaux libres présents dans le milieu de culture qui accentuent le stress des cellules (RAY and SPECK, 1978, RAY, 1979, ABEE and WOUTERS, 1999) même si cette enzyme est utilisée pour créer l’anaérobiose dans les milieux de culture (A^BBIS, 1983). L’effet de l’ensemencement pour L. monocytogenes montre qu’un ensemencement en profondeur diminue le taux de recouvrement des cellules stressées car ce type d’ensemencement engendre un stress secondaire. Une température de 30 °C semble adéquate pour récupérer le maximum de cellules stressées.

4 – CONCLUSION

Ce travail a permis de mettre au point un diluant d’usage général pour la revivification des microorganismes ayant subi un stress thermique. L’utilisation de ce diluant n’a pas une efficacité optimale du fait des conditions d’incubation retenues pour la suspension- mère [(30 ± 1) minutes à (30 ± 1) °C] ; l’effet des molécules utilisées serait plus important pour une incubation plus longue. Le choix de telles conditions d’incubation est condi- tionné d’une part par le fait que la mise en œuvre d’une étape de revivification ne doit pas conduire à une multiplication des cellules intactes et d’autre part pour des raisons pratiques dans les laboratoires d’analyse microbiologique. Même dans ces conditions on a noté un effet positif important des ions magnésium dans la revivification des cellules stressées de E. coli, alors que, la présence de phosphates dans le diluant diminue le recouvrement chez les 2 souches. L’ion magnésium joue un rôle important dans l’équili- bre des membranes cellulaires et dans le cas d’un traitement thermique ces membranes sont un des sites cibles pour ce type de stress (RUSSELL, 1984). D’autres études ont mon- tré l’effet inhibiteur des phosphates sur d’autres espèces bactériennes (BOUBETRA, 2005).

L’optimisation des conditions de dénombrement a montré l’effet de l’oxyrase surtout chez L. monocytogenes. De même que l’effet de l’ensemencement en surface et l’incubation à 30 °C chez cette même souche. Ces résultats donnent des perspectives intéres- santes pour l’utilisation d’enzymes, de molécules et de sels dans les milieux de culture afin d’améliorer la récupération des cellules stressées.

Il est important de réaliser la même étude avec d’autres souches de L. monocytoge- nes et d’ E. coli et de l’élargir à d’autres espèces bactériennes.

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RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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