Article pp.399-414 du Vol.24 n°5 (2004)

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NOTE

Évaluation du pouvoir antioxydant (TEAC) d’extraits de végétaux

en vue d’utilisations alimentaires

F. Marc^1,4*, F. Brisbarre¹, A. Davin², M. Baccaunaud^1,3, C. Ferrand¹⁴

SUMMARY

Antioxidant potential evaluation (TEAC) of vegetable extracts for food use.

Antioxidant potential of vegetable extracts was evaluated for food utilisation as natural additive by the Trolox Équivalent Antioxidant Capacity (TEAC) method. This useful method is fast and suitable for a lot of components with various efficiencies. The absorbance decrease (inhibition %) of ABTS^•+ radical cation solution indicate the antioxidant sample effect by comparison with a reference line build with Trolox. Kinetics and thermodynamics of the ABTS^•+ radical cation scavenging reaction were also analysed. The antioxidant potential evolution of these vegetable extracts, stored in solution, during a week at 25°C shows variable, which makes it unsuitable to delay the TEAC analysis. Among the vegetable extracts analysed, only the extracts of blueberry, curcuma and particularly extracts of grape seeds and green tea, express an interesting antioxidant capacity for food use as natural additive.

Key words

antioxidant potential, TEAC, vegetable extract, natural additive.

RÉSUMÉ

La méthode mesurant la Capacité Antioxydante en Équivalent Trolox (TEAC) a été utilisée pour déterminer le potentiel antioxydant d’extraits végétaux.

Cette méthode pratique est rapide et utilisable dans divers solvants pour un grand nombre de composés d’efficacités variées. La diminution de l’absor-

1. Laboratoire d’Analyse et Valeur Biologique des Aliments - DUSA - Université Bordeaux 1 - Avenue Michel-Serres - 47000 Agen - France.

2. Laboratoire de Génie Chimique - UMR 5503 CNRS / UPS / INP-ENSIACET - 118, route de Narbonne - 31077 Toulouse cedex 4 - France.

3. Agrotec - BP 102 - 47931 Agen cedex 9 - France.

4. TREFLE - UMR 8508 - Site ENSAM - Esplanade des Arts et Métiers - 33405 Talence cedex - France.

*Correspondance : f.marc@dus-agen.u-bordeaux1.fr.

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bance (% d’inhibition) de la solution de radical cation d’ABTS^•+ traduit l’effet de l’échantillon antioxydant par comparaison avec une droite d’étalonnage réalisée à partir du Trolox. L’aspect cinétique initial et l’équilibre thermodynamique de la réaction de piégeage du radical cation ABTS^•+, marqueur de l’efficacité de l’antioxydant, ont été examinés. L’évolution du potentiel antioxydant des échantillons a montré une stabilité variable lors de leur stockage à température ambiante pendant une semaine, ce qui ne permet pas d’envisager de différer les mesures du TEAC. Parmi les échantillons analy- sés seuls l’extrait de myrtille, le curcuma et surtout les extraits de pépins de raisin et de thé vert sont à retenir pour leur pouvoir antioxydant et pour leur utilisation en agroalimentaire.

Mots clés

potentiel antioxydant, TEAC, extrait végétal, additif naturel.

1 – INTRODUCTION

Les antioxydants sont de plus en plus utilisés pour ralentir les phénomènes d’oxydation des produits alimentaires ; leurs propriétés découlent de la pré- sence de noyaux aromatiques, de liaisons conjuguées, de doublets d’électrons non liants, dans des molécules aptes à piéger les radicaux libres, caractéristi- ques de l’oxydation des denrées alimentaires. En outre depuis plusieurs années, des propriétés bénéfiques pour la santé leur sont attribuées (limitation du stress oxydatif lié à l’activité naturelle de l’organisme ou à des facteurs exo- gènes tels que tabagisme, alcoolisme, exposition au soleil, mal-être…). De ce fait de nombreuses études internationales portent sur cet aspect santé ; c’est le cas entre autres du régime « crétois » ou « méditerranéen » dans lesquels inter- viennent massivement fruits et légumes ainsi que plantes aromatiques. La détermination du pouvoir protecteur de ces plantes ou extraits de plantes en fonction de leur capacité antioxydante semble pertinente pour un régime alimentaire plus sain. Si ces faits sont confirmés, l’industrie pourrait alors utiliser des extraits naturels comme « antioxydants » dont l’action ne se limiterait pas à protéger l’aliment mais serait aussi bénéfique pour la santé des consommateurs.

Dans cette étude, le pouvoir antioxydant de certains extraits végétaux est examiné dans le but d’en évaluer le potentiel tout en vérifiant l’aptitude globale de la technique analytique utilisée (méthode du TEAC : Capacité Antioxydante en Équivalent Trolox).

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2 – ÉTAT ACTUEL DES CONNAISSANCES

2.1 Aliments et antioxydants

L’oxydation des composés insaturés alimentaires a pour conséquences la détérioration des qualités organoleptiques et hygiéniques (couleur, goût et odeur altérés par les produits de terminaison, formation de composés, …) et la perte des qualités nutritionnelles (en acides gras insaturés essentiels, en vitamines,

…). C’est pourquoi les industriels attachent une grande importance à la lutte contre l’oxydation tant pour garantir une conservation satisfaisante nécessaire à la commercialisation que pour assurer un intérêt nutritionnel à leurs produits.

D’autre part, les agressions quotidiennes (tabac, alcool, stress, rayonnement ultraviolet…) augmentent la production de radicaux libres et aggravent leurs effets : la production de substances régulatrices devient insuffisante. Il peut alors être particulièrement intéressant de se pourvoir en éléments antioxydants via l’alimentation (complémentation).

2.2 Antioxydants agroalimentaires

Pour lutter contre la dégradation rapide des matières alimentaires, différents moyens d’action sont mis en œuvre tels que le conditionnement sous vide ou sous atmosphère modifiée (protection contre l’oxygène), en emballages opa- ques (protection contre lumière et U.V.), la réfrigération ou la congélation, ou encore l’utilisation d’additifs spécifiques. En règle générale, différentes métho- des de protection sont combinées afin d’obtenir le meilleur résultat, tant par effets additifs que synergiques.

Les antioxydants¹ de l’industrie agroalimentaire, souvent synonymes d’antioxygènes, sont par définition des composés chimiques, naturels ou de synthèse, qui ont la propriété de protéger les denrées alimentaires de l’action oxydante de l’oxygène moléculaire. Ces composés, dont le potentiel d’oxydo- réduction est très bas, doivent être capables de ralentir, retarder ou prévenir les processus d’oxydation. Ils neutralisent ou réduisent les dommages causés par les radicaux libres dans la matrice alimentaire, mais aussi dans l’organisme. Ne faisant pas forcément partie des ingrédients principaux d’une préparation alimentaire, ils sont considérés comme des additifs², rajoutés à la préparation afin d’en préserver les qualités nutritionnelles et gustatives. Les antioxydants ont pour principale propriété de s’oxyder plus rapidement et en priorité avant les molécules à protéger. En fonction de son mode d’action, l’additif est un agent de prévention et/ou de terminaison capable à la fois d’éviter et de piéger la formation des radicaux libres :

• Certains composés antioxydants (acides citrique et phosphorique, par exemple) agissent en empêchant ou en diminuant la formation de radicaux

1. Le terme officiel en français est antioxygène, mais le terme antioxydant est le plus souvent utilisé.

2. En tant qu’additifs alimentaires, ils doivent être non toxiques, ne pas altérer les goûts, odeurs et couleurs des aliments, être efficaces à faible concentration et facilement incorporables, être stables et résistants aux processus de fabrication et enfin être peu onéreux.

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libres, en complexant les métaux catalyseurs des réactions, en réagissant avec l’oxygène ou en protégeant l’aliment des effets de la lumière ou autres rayonnements. Ils retardent ainsi la vitesse de réaction de la phase d’initiation (GORDON, 1990).

• D’autres réagissent avec les radicaux libres et se transforment en radicaux à durée de vie très longue et peu réactifs bloquant la réaction de propaga- tion.

Hormis les dérivés du soufre, l’industrie agro-alimentaire a d’abord utilisé des composés naturels, telles que la fumée de bois, puis synthétisé des substances d’activité antioxygène plus élevée (composés phénoliques substitués).

Actuellement de nombreux antioxydants différents, d’origine naturelle ou de synthèse, identiques aux naturels sont autorisés par la législation européenne (MOURE et al., 2001).

2.3 Détermination du potentiel antioxydant

Plusieurs méthodes, plus ou moins anciennes, permettent d’évaluer le potentiel antioxydant (MARC et al., 2004). Il existe deux façons pratiques d’éva- luer le potentiel antioxydant d’un produit alimentaire :

• par la détermination et l’évaluation des produits résultant de l’oxydation.

Ces méthodes anciennes demandent une certaine connaissance des com- posés étudiés (méthodes au thiocyanate (MITSUDAet al., 1966), de l’acide thiobarbiturique (SINNHUBER et YU, 1958), de la dégradation du β-carotène en présence d’acide linoléïque (MANSOURE et KHALIL, 2000 ; CRUZ et al., 1999) ;

• par l’évaluation directe de l’aptitude du constituant à piéger des radicaux libres dans des systèmes modélisés. Ces méthodes, plus récentes, demandent des réactifs de dosage spécifiques citons la méthode du Tro- lox Équivalent Antioxidant Capacity (TEAC), (ARNAO et al., 2001 ; RE et al., 1999 ; VAN DER BERG et al., 1999 ; HAGERMAN et al., 1998 ; MILLER et al., 1996), celle utilisant le radical stable DPPH^•(LU et FOO, 2000), ou encore par spectroscopie de résonance électronique (ESR) (GARNER et al., 2000).

La méthode TEAC repose sur la détermination de l’activité antioxydante d’une molécule en fonction de sa capacité à inhiber le radical ABTS^•+ (obtenu à partir de l’ABTS : sel d’ammonium de l’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazo- line-6-sulfonique) comparativement à un autre antioxydant le Trolox (acide 6- hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique), pris comme référence, et dont la structure est proche de celle de la vitamine E (α-tocophérol). La figure 1 fournit le schéma réactionnel utilisant le radical ABTS^•+, absorbant à λmax = 734 nm et qui, mis en contact avec un donneur de H^•, conduit à l’ABTS⁺ entraî- nant une décoloration de la solution.

Classiquement, l’activité antioxydante TEAC est exprimée en équivalents Trolox (concentration en mmol/l de Trolox), ayant la même activité antioxydante que 1 mmol/l de substance testée. Si la masse molaire du produit (ou du mélange de produit) est inconnue l’unité retenue peut être le mg/l.

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3 – MATÉRIELS ET MÉTHODES

3.1 Échantillons d’extraits de végétaux testés

Les échantillons testés sont issus d’extraits végétaux potentiellement actifs fournis par différentes firmes recensées par Agrotec¹ ; ils permettent, du fait de leurs différentes formulations (poudres ou solutions) et de la diversité des molé- cules impliquées, de vérifier l’aptitude globale de la méthode du TEAC. Les poudres et solutions à tester sont dissoutes dans une solution saline de tampon phosphate (PBS) à 5 mmol/l ou dans du méthanol, (en fonction de leur solubi- lité) de telle sorte que les % d’inhibition mesurés soient inclus dans la droite dose-réponse établie pour le Trolox.

1. Voir note 3 page 399.

CH₃

CH₃ C H₃

O H

O CH₃

COOH S

N

N N

N

S NH₄+SO₃ NH₄+

SO₃– –

SO₃ NH₄+ – C₂H₅ C₂H₅

S N

N N

N S NH₄+

SO₃–

C₂H₅ C₂H₅

S

N+ N N

N

S SO₃–

NH₄+ NH₄+

SO₃–

C₂H₅ C₂H₅ H

CH₃

CH₃ C H₃

O

O CH₃

CO OH Trolox

ABTS : sel d’ammonium de l’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) – e – + e –

ABTS + +

(ou antioxydant à tester donneur de H )

+

ABTSH +

Figure 1

Création puis piégeage du radical ABTS^•+par donneur de H^• (LIEN et al., 1999).

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• Concentré de carotte (solution) / Extrait de carotte pourpre (poudre) La carotte est riche en carotènes (α, β, γ). Ces composés, jaunes ou rouges sont très utilisés comme colorants de masse et de surface pour beurres, fromages, charcuteries, confiseries, glaces, sirops, liqueurs, etc. Les carotènes sont très hydrophobes d’où la difficulté de les extraire ou de les utiliser en émulsion aqueuse.

• Extrait de romarin (poudre) / Flavor’ plus (solution)

Le romarin contient de l’acide rosemarinique et du carnosol. Il est reconnu pour ses qualités antioxydantes qui préviennent entre autres, asthme, athéros- clérose et développement de la cataracte (AL-SEREITI et al., 1999). Très présent dans la cuisine méditerranéenne, il fait partie du régime culinaire « crétois ». Le concentré Flavor’ plus (solution) est une préparation hydrosoluble utilisable contre l’oxydation dans les émulsions et les solutions aqueuses ; il est préco- nisé pour la protection des couleurs et des arômes.

• Extraits de pépins de raisin (poudre) / de vin rouge (poudre) / de myrtilles (poudre) / de pomme (poudre) / Exxpel SF (solution)

Les complexes bioflavonoïdes de couleur rouge violacé, de la peau des fruits : raisins, cerises, myrtilles, sont connus sous le nom d’Oligomères Procya- nidoliques (PCO)¹; ils se sont révélés particulièrement efficaces comme antioxydants et sont cités comme anti-inflammatoires, anti-allergiques et anti- mutagéniques (BAGCHI et al., 2000). De toutes les sources de ces composés, les pépins de raisin en sont les mieux pourvus.

Le vin rouge, boisson alcoolique plus ou moins allongée d’eau, du régime crétois contient des polyphénols capables de neutraliser les radicaux libres ; ceux-là sont un moyen efficace de lutter, avec une consommation modérée de vin, contre les maladies cardio-vasculaires.

La myrtille et la pomme sont aussi riches en polyphénols.

Ce produit Exxpel SF (solution) est un concentré d’extrait de pulpe et de pépins d’agrumes employé pour retarder le mûrissement. D’autres usages en sont faits en agriculture découlant d’un effet fongicide et bactéricide et d’une action anti-parasitaire et inhibitrice des moisissures. Il présente une action antioxydante et de préservation des aliments, à des concentrations de 10 à 250 ppm.

• Extrait de thé vert (poudre)

Les qualités du thé vert sont reconnues de tous ses consommateurs du fait des polyphénols présents, mais le potentiel antioxydant d’extrait, à vocation d’additifs, ne paraît pas avoir fait l’objet d’études antérieures.

• Curcuma (poudre)

La curcumine ou curcuma est le principe actif extrait de la poudre de rhizo- mes de curcuma longa. Le curcuma est utilisé comme colorant (E100) dans les produits à conditionnement protecteur de la lumière. Il est très utilisé dans les boissons et les plats préparés, souvent en combinaison avec d’autres colorants. L’échantillon est composé de trois isomères : la curcumine

1. Les PCO (Oligomères Procyanidoliques) bioflavonoïdes ont aussi d’autres appellations : Proanthocyani- dine, Procyanidine, Leucoanthocyanosides, Anthocyanidine.

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(C₂₁H₂₁O₆), la deméthoxycurcumine et la bisdeméthoxycurcumine (pureté globale 97 %).

• Papaïne et broméline (poudres)

Ces enzymes protéolytiques sont extraites de jus de plantes tropicales, en particulier de celui de Carica papaya (papayacées) et de l’ananas. La papaïne est autorisée comme attendrisseur chimique de la viande ou utilisée dans la préparation de la bière et des céréales.

La broméline est rencontrée dans les ananas mais aussi dans les pommes de pins. Son potentiel antioxydant tout comme celui de la papaïne est inconnu.

Remarques : seules la papaïne et la broméline sont des préparations puri- fiées, (protéines susceptibles d’avoir une activité antioxydante du fait des struc- tures de certains acides aminés). Pour les autres, la composition exacte de la poudre ou de la solution n’est pas connue ; c’est pour cette raison que les concentrations seront systématiquement exprimées en mg/l et non en concentration molaire. Pour compléter l’examen de la méthode TEAC, les échantillons seront estimés d’après leur stabilité en solution (stockage d’une semaine à tem- pérature ambiante et à l’abri de la lumière).

3.2 Méthode du TEAC : détermination du pouvoir antioxydant

3.2.1 Principe des mesures

La méthode du TEAC nécessite tout d’abord la détermination d’une courbe dose-réponse étalon établie à partir des pourcentages (%) d’inhibition de diffé- rentes solutions de concentrations connues en Trolox (C_Troloxen mg /l).

% d’inhibition = [(DOi - DOf) / DOi] ✕ 100

% d’inhibition = A ✕ C_Trolox + B

DOi = DO à 734 nm de la solution d’ABTS^•+ initiale, à 25 °C.

DOf = DO à 734 nm de la solution d’ABTS^•+, en présence de l’antioxydant de référence (Trolox), à 25 °C et après un temps t défini au préalable.

Le TEAC d’un antioxydant à tester, de concentration connue, est obtenu à partir du % d’inhibition de l’échantillon rapporté sur la courbe dose-réponse étalon du Trolox (et en le ramenant à une concentration unitaire de 1 mg /l).

TEAC = [(% d’inhibition échantillon - B) / A ] ✕ [1 / concentration de l’extrait]

3.2.2 Produits et matériels utilisés

Les produits chimiques courants sont fournis par VWR, les réactifs spécifi- ques par Sigma Aldrich.

• phosphate de potassium monobasique (99 % de KH₂PO₄),

• hydroxyde de potassium (99 % de KOH),

• méthanol (99,8 % de CH₃OH),

• sel d’ammonium de l’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (98 % d’ABTS),

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• oxyde de manganèse II (99 % de MnO₂),

• acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl-2-carboxylique (97 % de Trolox).

Les mesures colorimétriques sont effectuées avec un spectrophotomètre UV/visible Lambda 25 de la société Perkin Elmer Instruments, dans des microcuves PVC (100 µl ).

3.2.3 Protocole expérimental

• Préparation des solutions

La solution de tampon phosphate, PBS, à 5 mmol/l et pH = 7,4, est prépa- rée à partir de phosphate monopotassique (KH₂PO₄) ; le pH est ajusté avec une solution d’hydroxyde de potassium (KOH) à 0,1 mol/l.

La solution de radical cation d’ABTS^•+ est obtenue après mise en contact, pendant deux heures, d’une solution mère préalablement préparée d’ABTS de 5,0 mmol/l dans du PBS avec du dioxyde de manganèse MnO₂ (20 g de MnO₂ pour 250 ml de solution d’ABTS). La solution d’ABTS^•+est ensuite filtrée à tra- vers du papier filtre Wattman n° 5 posé sur verre fritté, puis avec un filtre nylon de porosité 45 µm. La DO initiale du filtrat est ajustée à (0,76 ± 0,02) en diluant éventuellement avec la solution de PBS. La solution ainsi préparée doit être uti- lisée dans la demi-journée. La solution mère stockée au réfrigérateur peut être utilisée durant 48 heures.

• Établissement de la relation linéaire dose-réponse étalon

À partir d’une solution mère de Trolox préparée dans du PBS à une concentration de 625 mg/l (soit 2,5 mmol/l), on réalise en triple exemplaire, une gamme de concentrations entre 12,5-225,0 mg/l dans du PBS. 40 µl de chaque solution de cette gamme sont ensuite placés dans un tube à hémolyse où ils sont complétés par 1960 µl de la solution d’ABTS^•+. Les concentrations en Trolox dans les cuves spectrophotométriques de mesure sont alors comprises entre 0,25 et 4,50 mg/l. Le blanc de référence correspond à la solution de PBS pure.

Au-delà d’une certaine concentration le % d’inhibition n’est plus linéaire- ment relié à la concentration, ce qui conduit à limiter celle du Trolox à 5,0 mg/l.

Pour les échantillons examinés le % d’inhibition ne peut être considéré comme valable qu’à condition qu’il corresponde à des concentrations de Trolox infé- rieures à cette valeur.

• Calcul du TEAC des échantillons et suivi cinétique du dosage

La DO est mesurée, après mélange au vortex durant 30 secondes, dans des microcuves à 734 nm et à 25 °C exactement une minute (DO i) après mise en contact, puis à des temps définis à partir de cette première mesure.

Les % d’inhibition, déterminés exactement au bout d’une minute, fournis- sent un aspect cinétique initial de la réaction de piégeage de radicaux cations d’ABTS^•+ , à savoir le pouvoir antioxydant « instantané » (capacité de l’antioxydant à réagir rapidement). Ce même potentiel antioxydant instantané est mesuré sur les échantillons en solution stockés pendant une semaine. La possi- bilité que certaines analyses soient différées est déduite des variations obser- vées avec ou sans stockage.

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Le suivi cinétique pendant une heure des % d’inhibition permet d’accéder à l’équilibre de la réaction, c’est-à-dire au potentiel antioxydant total, en calculant le TEAC lorsque la DO n’évolue plus. L’équation de tendance de la courbe mathématique, représentant le suivi du TEAC au cours du temps, est très majoritairement de type :

% inhibition = a Ln (t) + b, (où t est le temps en minutes)

Cette équation permet de déterminer à quel moment (t_∞) la réaction peut être considérée comme achevée (figure 2). Le TEAC calculé alors (noté TEACt) correspond au potentiel antioxydant total de la substance testée. Le niveau stable est considéré comme atteint lorsque la variation relative entre deux mesures successives de DO (espacées de 30 secondes) est inférieure ou égale à 0,2 % ; en effet, pour une telle variation, l’écart observé sur le TEAC mesuré n’est que de 0,01 %, ce qui ne traduit pas une réelle évolution de la réaction.

4 – RÉSULTATS

4.1 Établissement de la droite d’étalonnage dose-réponse de référence

La courbe dose-réponse de référence est réalisée à partir des inhibitions correspondantes aux différentes solutions (concentrations en mg/l) de la gamme de Trolox. Plusieurs essais avec des solutions d’ABTS^•+ de DO initiales différentes mettent en évidence l’influence de cette dernière, notamment sur le % d’inhibition calculé. Ceci amène à fixer une DO initiale (0,76 ± 0,02) pour la solution d’ABTS^•+. L’équation de régression dose-réponse (figure 3) :

% inhibition = 12,454 C_Trolox +1,7017, de coefficient de corrélation R = 0,9997, y = 5,0993Ln(x) + 44,024

R = 0,9962

0 10 20 30 40 50 60 70

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Temps en minutes

% d’inibition de l’ABTS.+

t ∝ = 25 minutes

Figure 2

Exemple d’évolution du % d’inhibition en fonction du temps d’une solution de thé vert dans le PBS.

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a été établie à partir de trois gammes de concentrations en Trolox. Il en résulte que la régression calculée sur chaque point de la droite correspond à la moyenne arithmétique des neuf mesures, avec un domaine de confiance de 95 % de probabilité.

4.2 Détermination des TEAC

• Le TEAC initial (TEACi) est mesuré au bout d’une minute (temps minimum au bout duquel le piégeage des radicaux cations ABTS^•+ peut être raison- nablement examiné). Les résultats sont présentés dans le tableau 1 selon le solvant dans lequel les échantillons à tester sont dissous.

• TEACt et équilibre à t∞. L’évolution du % d’inhibition des échantillons est suivie pendant une heure avec un pas de mesure de 30 secondes. Dans ce contexte sont déterminés à la fois t_∞ (durée au bout de laquelle l’antioxydant ne joue plus de rôle significatif, soit l’état d’équilibre) et le TEAC total (TEACt), présentés dans le même tableau 1.

Ainsi un classement des échantillons selon leur activité antioxydante, c’est- à-dire de leur TEACi et de leur TEACt, peut être proposé figure 4.

Par ailleurs, pour l’évaluation du vieillissement des solutions des échantillons après une semaine de stockage (TEACis), à l’abri de la lumière, à température ambiante (sauf pour le concentré de carotte, dont la conservation doit se faire à 4 °C, selon les indications du fournisseur), les TEACis sont également présentés dans le tableau 1.

0 10 20 30 40 50 60 70

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

CTrolox en mg/l

% d’inhibition

Figure 3

Droite d’étalonnage dose-réponse

% d’inhibition en fonction de la concentration en Trolox (mg/l).

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Tableau 1

TEACi, TEACt, TEACis et t∝ d’échantillons d’extraits végétaux Échantillons d'extraits végétaux TEACi

en mg/l ± 0,01

TEACt en mg/l ± 0,01

t ∝ en mn

TEACis en mg/l ± 0,01 En solution dans le PBS

Concentré de carotte < 0,01 < 0,01 6 < 0,01

Extrait de carotte pourpre 0,06 0,09 14 0,06

Flavor' plus 0,21 0,31 23 0,16

Poudre de vin rouge 0,04 0,05 7 0,03

Curcuma 1,18 1,55 26 0,99

Extrait de thé vert 2,33 2,39 25 1,60

Extrait de pomme 0,04 0,09 44 0,02

Papaïne 0,03 0,04 13 0,03 < 0,01

Broméline Indétectable – Indétectable

En solution dans le méthanol

Concentré de carotte < 0,01 < 0,01 6 Indétectable

Romarin 0,09 0,1 3 0,09

Leucocyanides d'extrait de pépins de

raisins 1,58 1,98 18 1,74

Extrait de myrtille 0,34 0,47 36 0,34

Extrait de thé vert 2,38 2,57 28 2,15

Exxpel SF 0,06 Pas de variation – 0,01

TEACi : mesuré à 1 min (aspect cinétique), TEAC t : mesuré à t ∝ min (aspect thermodynamique, t ∝ : temps au bout duquel la réaction est équilibrée), TEAC is : mesuré à 1min après une semaine de stockage.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

broméline

concentré de carotte dans le PBS concentré de carotte dans le méthanol

papaïne

poudre de vin rouge extrait de pomme extrait de carotte pourpre

exxpel SF romarin

flavor’plus extrait de myrtille

curcuma

leucocyanides extrait p épins de raisin

extrait de thé vert dans le PBS extrait de thé vert dans le méthanol Échantillons d’extraits végétaux

TEACi et TEACt (mg/l)

TEACi TEACt

Figure 4

TEAC i et TEAC t (mg/l) d’échantillons d’extraits végétaux.

TEACi : mesuré à 1 min (aspect cinétique),

TEAC t : mesuré à t ∝ (aspect thermodynamique, réaction équilibrée).

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5 – DISCUSSION

5.1 Aspect cinétique initial : TEACi et TEACis

Au vu des différents résultats du tableau 1 et de la figure 4, deux familles se détachent parmi les 13 échantillons. La famille des antioxydants forts et celle des substances à activité antioxydante très faible.

L’extrait de thé vert, quel que soit le solvant, l’extrait de pépins de raisin et dans une moindre mesure, le curcuma peuvent être qualifiés d’antioxydants forts. Ces trois échantillons possèdent des TEACi supérieurs ou égaux à 1,2 mg/l. Ce même classement se retrouve après stockage des échantillons en solution pendant une semaine (figure 5) bien que les valeurs reflètent parfois une dégradation du potentiel de l’échantillon.

Il est à noter que la conservation des échantillons en solution en vue d’une analyse différée est difficilement envisageable du fait de la dégradation de leur valeur antioxydante observée sur la majorité des échantillons. Néanmoins le solvant méthanol paraît moins dommageable que le PBS.

Le cas de la carotte (concentré et extrait) de très faible valeur antioxydante est à expliquer par d’autres analyses, en particulier avec un dosage du carotène. Il est probable que pour ces préparations, tout comme celle de la poudre de vin rouge, seul l’aspect pigmentaire (usage en tant que colorant) a été pris en compte. Dans tous les cas les protéines enzymatiques susceptibles d’être incorporées dans les préparations pour leur action hydrolytique, ne présentent quasiment aucune pro- priété antioxydante dans le test TEAC, par rapport à celle du Trolox (référence de réducteur au potentiel d’oxydo-réduction bas, versus l’oxydant radical).

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Échantillons naturels d’extraits végétaux

TEAC i et TEAC is (mg/l)

TEAC i TEAC is

broméline

papaïne

exxpel SF romarin

flavor’plus extrait de myrtille

curcuma

leucocyanides extrait pépins de raisin extrait de thé vert dans le PBS

extrait de thé vert dans le méthanol

Figure 5

TEAC i et TEAC is (mg/l) d’échantillons d’extraits végétaux.

TEACi : mesuré à 1 min (aspect cinétique), TEAC is : mesuré à 1 min après une semaine de stockage.

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5.2 Examen de l’aspect équilibre thermodynamique : TEACt et t∞ La mise en parallèle des TEACi et TEACt (figure 5), montre que les extraits ayant un TEACi faible (ou fort) gardent un TEACt faible (ou fort), exception faite de l’extrait de pomme qui a un TEACi de 0,04mg/l et un TEACt proche de 0,09 mg/l (soit une augmentation de 130 %), rapprochant son pouvoir antioxydant de celui de l’extrait de romarin.

La mise en parallèle du temps t_∞ au bout duquel l’équilibre de réaction de piégeage des radicaux est atteint et le TEACt des échantillons (figure 6), montre que les échantillons les plus efficaces (thé vert, leucocyanides et curcuma) ont des t_∞ moyens (environ 20 minutes).

La mesure du TEACt du thé vert, dans les deux solvants, n’évolue que fai- blement au cours du temps et la réaction de piégeage des radicaux paraît rapide. Les échantillons de thé vert sont les extraits les plus antioxydants parmi ceux testés (probablement du fait de la concentration importante en composés actifs et de leur niveau oxydo-réducteur très bas).

Les échantillons de TEACt faible ont majoritairement des t_∞ courts, exception faite de la pomme qui possède le t_∞ le plus long correspondant à l’accrois- sement relatif de TEAC le plus fort. L’action de l’extrait de pomme est lente par rapport aux autres antioxydants, mais son activité antioxydante totale atteint ainsi celle des extraits de carotte et de romarin et dépasse même celui de la poudre de vin. Ces trois derniers ont des TEACi très bas et également les t_∞ les

broméline

papaïne

exxpel SF romarin flavor’plus

extrait de myrtille curcuma

leucocyanides extrait pépins de raisin extrait de thé vert dans le PBS

extrait de th é vert dans le méthanol 0

10 20 30 40 50 60

Échantillons d’extraits végétaux

TAEC t (mg/l)

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

t infini (min)

t infinie (min) TEACt (mg/l)

Figure 6

TEAC t (mg/l) et t ∝ (min) d’échantillons d’extraits végétaux.

t _∞ : temps en min au bout duquel la réaction est équilibrée, TEAC t : mesuré à t ∝.

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plus petits ; de trois à sept minutes. Pour ces trois échantillons on peut émettre l’hypothèse que les traitements d’extraction ou leur stockage ont pu engendrer des pertes importantes en substances antioxydantes, ou que les matières pre- mières utilisées n’en contenaient pas suffisamment.

6 – CONCLUSION

L’objectif d’évaluer les qualités antioxydantes d’une série d’échantillons d’extraits végétaux, par la méthode TEAC (Capacité Antioxydante en Équivalent Trolox) et de valider l’aptitude de cette dernière, quels que soient les produits en cause, a été atteint. La méthode TEAC peut être appliquée aussi bien aux échantillons pour déterminer leur pouvoir antioxydant initial (TEACi), que pour effectuer un suivi du pourcentage d’inhibition au cours du temps (TEAC total ou TEACt) et évaluer le temps au bout duquel la réaction de piégeage est terminée (équilibrée). Le temps t_∞en minutes au bout duquel cette mesure est possible est obtenu par extrapolation. Néanmoins une critique peut être formulée : la valeur obtenue ne peut être que relative sans informer réellement sur les substances impliquées, ni sur leur potentiel électrochimique.

La stabilité des solutions d’extraits, testée par la mesure du TEAC (TEACis) au bout d’une semaine, n’autorise pas, a priori, la conservation des échantillons en solution sauf pour le cas particulier des leucocyanides d’extrait de pépins de raisin ou des solutions dans le méthanol. En effet pour la plupart des autres solutions d’échantillons dans le PBS la stabilité est médiocre puisque en moyenne le TEACis révèle une perte en potentiel antioxydant de 25 % voire plus.

Seuls quelques échantillons sur les 13 analysés se révèlent vraiment efficaces comme antioxydants. L’extrait de thé vert dans le méthanol est le plus actif de tous, avec un TEACt de 2,57 mg/l, suivi des leucocyanides d’extrait de pépins de raisin avec un TEACt de 1,98 mg/l puis la curcuma avec un un TEACt de 1,55 mg/l. Les autres échantillons sont peu efficaces (Flavor' plus, extrait de myrtille et de romarin) par rapport au Trolox, voire même inefficaces comme les protéines : broméline et papaïne, ou le concentré de carotte dans lequel la pré- sence en carotène actif reste à démontrer. Les antioxydants les plus efficaces sont aussi les plus rapidement actifs, comme le prouve leur TEACi.

L’utilisation d’antioxydants naturels à la place de produits de synthèse ouvre de nouvelles perspectives aux professionnels de l’agroalimentaire, tant pour préparer les concentrés que pour les utiliser mais nécessite encore de nombreux travaux pour aboutir à des produits performants. Mieux connaître les antioxydants naturellement présents dans les fruits, les légumes et les condi- ments est un des objectifs de la recherche actuelle. La méthode TEAC semble apte à y contribuer, Bien qu’imparfaite, elle peut aussi fournir une indication du statut des composants après traitement. Une méthode électrochimique présen- terait cependant l’avantage de fournir outre le niveau de potentiel d’oxydoré- duction une possibilité de dosage direct du pouvoir antioxydant.

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Parmi les adjuvants actuellement utilisés à d’autres fins (colorant par exemple) l’aspect antioxydant n’est pas à négliger (cas des curcumines), et peut évi- ter d’avoir recours à des molécules chimiques de synthèse, très efficaces mais pas toujours compatibles avec les attentes des consommateurs.

7 – REMERCIEMENTS

Nous remercions l’Agrotec³ pour avoir mis à disposition les échantillons d’extraits végétaux utilisés dans cette étude.

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