Étude de la compartimentalisation de sous-populations
de la Fragile X Mental Retardation Protein au sein de la
cellule.
Thèse
Alain Dury
Doctorat en Neurobiologie
Philosophiae Doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
© Alain Dury, 2017
II
Résumé de la thèse :
Le syndrome du X fragile, première cause de retard mental héréditaire, est une maladie monogénique liée au chromosome X. Le syndrome affecte environ un homme sur 4000 et une femme sur 6000 dans la population générale. Il est causé par l’inactivation du gène Fragile Mental Retardation 1 (FMR1) entraînant l’absence de la Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP). Celle-ci est une protéine de liaison à l’ARN ayant pour rôle présumé de coordonner le devenir et la traduction d’un grand nombre d’ARN messagers (ARNm). L’absence de FMRP provoquerait une dérégulation subtile du transport des ARNm, conduisant à une altération de la synthèse protéique locale nécessaire à la connexité synaptique, entraînant ainsi le retard mental.
Il est accepté que la FMRP possède des signaux de localisation nucléaire et d'exportation cytoplasmique (Nuclear Localisation Signal et Nuclear Export Signal ; NLS et NES) permettant à la protéine de pénétrer dans le noyau et supposément d’en ressortir. Cependant, les anticorps disponibles dans le passé ne permettent pas d'étudier la localisation et le rôle de FMRP dans le noyau. Grâce à de nouveaux anticorps monospécifiques développés dans le laboratoire, nous avons pu étudier la compartimentalisation de sous-populations de la protéine FMRP. Je développerai donc ici brièvement le devenir de la FMRP cytoplasmique (cFMRP) dans les neurones, et je caractériserai la FMRP nucléaire (nFMRP), que de nombreux laboratoires ont recherché durant de nombreuses années, et qui serait constituée par des isoformes particulières de la protéine FMRP qui se localiseraient dans les corps de Cajal, structures décrites il y a plus d’un siècle par Santiago Ramon y Cajal. Les données présentées ici soulèvent le doute sur le modèle de trafic nucléo-cytoplasmique de la FMRP, suggéré sur la base de rares travaux.
La découverte de la nFMRP pourrait avoir d’importantes implications dans le domaine du Syndrome du chromosome X Fragile en ouvrant un champ nouveau d’étude sur le rôle nucléaire de la FMRP dans les cellules, et donc sur les conséquences de son absence chez les patients.
III
Thesis abstract :
Fragile X syndrome, a monogenic disease linked to the chromosome X, is the first cause of inherited mental retardation. The syndrome affects about one out of 4000 man, and one out of 6000 woman. Fragile X is caused by the inactivation of the Fragile X Mental retardation (FMR1) gene, leading to the absence of its product, the Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP). The absence of FMRP, an RNA binding protein, is believed to cause translation dysregulation and defects in mRNA transport essential for local protein synthesis and for synaptic development and maturation.
It is accepted that FMRP possesses a nuclear localisation signal (NLS), and a nuclear export signal (NES), allowing the protein to enter the nucleus, and possibly to exit from it as well. However, available antibodies do not allow to study the nuclear localisation of FMRP. Thanks to a new generation of monospecific antibodies developed in our laboratory, we were able to study the cytoplasmic and the nuclear distribution of FMRP. I will therefore shortly develop the fate of cytoplasmic FMRP (cFMRP) in neurons, and I will characterise the nuclear FMRP (nFMRP) that has been sought after for many years. nFMRP consists in particular nuclear FMRP isoforms that localize to Cajal bodies, structures described more than a century ago by the famous neuroscientist Santiago Ramon y Cajal. Data presented here also raise doubts on the nucleocytoplasmic traficking model, which relies on very few evidence.
The discovery of nFMRP could have great implication in the Fragile X domain, opening a whole new field of investigation on the role of FMRP in the cell nucleus, and therefore on the consequences of its absence in patients.
IV
Table des matières
Résumé de la thèse : ... II Thesis abstract : ... III Table des matières ... IV Liste des figures ... VI Liste des figures supplémentaires ... VI Liste des abréviations et des sigles ... VII Remerciements ... IX 1. Introduction générale ... 1 1.1. FMRP et le X Fragile ... 3 1.1.1. La maladie ... 3 1.1.2. La protéine ... 4 1.2. Fonctions de la FMRP ... 11
1.2.1. La FMRP en association avec l’appareil de traduction ... 11
1.2.2. FMRP dans la transmission neuronale ... 13
1.2.3. FMRP dans le noyau ... 19
1.3. Le développement de thérapies dans le X Fragile ... 20
1.4. Objectifs de la recherche ... 23
2. FMRP dans les granules de transport de l'ARN. ... 25
2.1. Dynamique des granules en microscopie en temps réel ... 27
2.2. Les granules neuronaux de transport de l'ARN présentent un contenu très divers en protéines de liaison à l'ARN. ... 31
3. Caractérisation de la Fragile X Mental Retardation Protein nucléaire (article 1). ... 35
3.1. RÉSUMÉ ... 41
3.2. ABSTRACT ... 43
3.3. AUTHOR SUMMARY ... 45
3.4. INTRODUCTION ... 47
3.5. RESULTS ... 48
3.5.1. FMRP is associated with Cajal bodies ... 48
3.5.2. FMRP ISO6 and ISO12 are targeted to Cajal bodies ... 52
3.5.3. FMRP present in Cajal bodies is cleaved ... 59
V
3.5.5. FMRP ISO6-I304N is defective in Cajal bodies association ... 62
3.6. DISCUSSION ... 64
3.7. MATERIALS AND METHODS ... 68
3.7.1. Cell cultures ... 68
3.7.2. Protein studies ... 69
3.7.3. Nucleic acids studies ... 70
3.7.4. Sub-cellular fractionation ... 71 3.8. ACKNOWLEDGMENTS ... 72 3.9. REFERENCES ... 72 3.10. SUPPLEMENTARY FIGURES ... 79 ... 79 ... 79 4. Discussion générale ... 85
4.1. La FMRP nucléaire, 20 ans de flou. ... 87
4.2. Les corps de Cajal ... 89
4.3. Interprétation des résultats ... 91
4.3.1. FMRP est détectable dans les Corps de Cajal grâce à l'anticorps IgY#C10 ... 91
4.3.2. La hFMRP ISO 6 est adressée aux CB grâce à 17 aa absents de la mFMRP Iso6 ... 92
4.3.3. La nFMRP est retrouvée sous une forme clivée par la calpaïne dans les CB ... 93
4.3.4. Les propriétés de liaisons à l'ARN de la nFMRP seraient importantes dans son rôle dans les CB. 94 4.4. Compartimentalisation des sous-populations étudiées de FMRP. ... 95
4.5. Perspectives ... 98
5. Bibliographie ... 101
6. Annexes ... 115
6.1. Article 2 : Fragile Mental Retardation Protein interacts with the RNA-Binding Protein Caprin1 in neuronal RiboNucleoProtein complexes. ... 117
6.2. Article 3 : A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator135 6.3. Article 4 : Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticules Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.... 155
VI
Liste des figures
Figure 1: Représentation schématique de l'épissage alternatif des transcrits primaires de FMRP. .... 7
Figure 2 : Représentations des domaines présents dans ISO 1 pleine longueur... 8
Figure 3 : Structure des membres de la famille FXRP et distribution de ces protéines dans divers 10 Figure 4 : Modèle entourant la fonction de la FMRP dans le neurone. ... 13
Figure 5 : Oscillations des granules neuronaux de transport de l'ARN. ... 28
Figure 6: Les granules de transport FMRP positifs voyagent jusqu'au cône de croissance. ... 29
Figure 7 : Fusion des GT en cargos. ... 30
Figure 8: Diversité de la composition en FXRP des granules neuronaux de transport d'ARN. ... 31
Figure 9 : Diversité de la composition en RBP des granules neuronaux de transport d'ARN. ... 32
Figure 10: Co-immunofluoresence FMRP-S6. ... 33
Figure 11: FMRP is present in Cajal bodies... 49
Figure 12: FMRP is present in the isolated nuclear fraction but not in nuclei. ... 50
Figure 13: Effects of Leptomycin B on nuclear FMRP localization. ... 51
Figure 14 : Nuclear ISO6 and ISO12 FMRP are present in Cajal bodies. ... 53
Figure 15 : The Cajal body localization signal of human ISO6 is localized to a 17aa C-terminal domain. ... 55
Figure 16 : Effects of Leptomycin B on cytoplasmic and nuclear GFP-FMRP localizations. ... 58
Figure 17 : ISO6 FMRP is cleaved by calpain in isolated Cajal bodies. ... 59
Figure 18 : ISO6 binds to RNA homopolymers. ... 61
Figure 19 : ISO6-I304N FMRP is defective in its Cajal body association. ... 63
Figure 20 : Proposed model for the fate of the nuclear ISO6 and full length ISO1 FMRP. ... 67
Figure 21 : Modèle du trafic nucléo-cytoplasmique. ... 88
Figure 22 : Microscopie électronique de corps de Cajal. ... 90
Figure 23 : Modèle de travail. ... 97
Liste des figures supplémentaires
Figure S - 1 : FMRP is detected as perinuclear granules with mAb1C3 after gentle lysis of HeLa cells. ... 79Figure S - 2 : Immunoblot analysis of transiently expressed FMRP isoforms. ... 79
Figure S - 3 : Cellular localization of transfected FMRP isoforms. ... 80
Figure S - 4 : Exon structure of the human FMR1 gene generating different isoforms through utilization of both differential splice-sites and alternate reading frames in exon 15-17. ... 81
Figure S - 5 : Figure S5 – Conservation of proximal and distal splice acceptor sites in exon 17 of human and mouse FMR1. ... 83
VII
Liste des abréviations et des sigles
aa Acide Aminé A / poly(A) Adénine / poly-adénine A260 Absorbance à 260 nm ADN Acide déoxyribonucléique ADNc Acide déoxyribonucléique complémentaire ARN Acide Ribonucléique ARNm Acide Ribonucléique messager ARNr Acide Ribonucléique ribosomal b Bases C / poly(C) Cytosine / poly-cytosine CB Cajal Bodies CRS Cytoplasmic Retention Domain DAPI 4,6-diaminido-2-phenylindol DMEM Dulbecco’s modified eagle’s medium DIV Days In Vitro EDTA EthyleneDiamineTetraacetic Acid EM Electron Microscopy FXS Fragile X Syndrome g Constante gravitationnelle G / poly(G) Guanine / poly-guanine GT Granules neuronaux de Transport de l'ARN HRP Horse radish peroxidase kDa Kilodaltons (103 Daltons) LTP Long Term Potentiation LTD Long Term Depression MF Fraction mobile mg Miligramme (10-3 gramme) mRNPs Ribonucléoparticules messager ng Nanogramme (10-9 gramme) nm Nanomètre (10-9 mètre) NP-40 Nonidet P-40
VIII NES Nuclear Export Signal NLS Nuclear Localisation Signal pb Paire de bases PBS Phosphate Buffered Saline PFA Paraformaldéhyde rpm Rotation par minute RBP RNA Binding Protein RT-PCR Reverse Transcripase Polymerase Chain Reaction SDS Sodium Dodecyl Sulfate SMN Survival Motor Neuron SMA Spinal Muscular Atrophy snRNP Small Nuclear RiboNucleoProtein t1/2 Temps de demie vie de récupération U / poly(U) Uracile / poly-uracile μg Microgramme (10-6 gramme) μm Micromètre (10-6 mètre)
IX
Remerciements
Je tiens en tout premier lieu à remercier mes parents, Hélène et Christian Dury, sans lesquels je n'aurais jamais pu entreprendre les longues études qui ont précédé mon doctorat. Malgré la distance géographique que mes choix nous ont imposé, ils furent toujours présents pour moi tout au long du processus sur tous les plans, et je n'aurais jamais accompli quoi que ce soit de tel sans leur soutien.
Je ne pourrais bien entendu jamais assez remercier mon directeur Edward Khandjian et mon co-directeur Paul De Konninck pour tout ce qu'ils m'ont enseigné au cours des années passées à ses cotés, et durant lesquelles Pr. Khandjian m'a laissé bénéficier de son célèbre œil bionique. Il m'est également impossible de passer sous silence l'aide considérable que mon coach Gilles Charpenet m'a apporté depuis mes premières années en milieu universitaire, jusqu'à la fin de ce doctorat.
Il me reste à remercier tous les membres actuels et passés des laboratoires Khandjian et De Koninck, avec une mention particulière à Sandra Tremblay et Francine Nault.
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1.1.
FMRP et le X Fragile
1.1.1. La maladie
Historique du X fragile
Martin and Bell (1943) firent mention pour la première fois d'un trouble de retard mental héréditaire qui affectent principalement les hommes. Il faudra attendre l’avènement des techniques de cytogénétiques avant d’identifier le site fragile présent sur le chromosome X qui donnera son nom au syndrome du chromosome X fragile (FXS), ou encore X fragile. Ce n’est donc que plus de 25 ans plus tard que Lubs (1969) pu observer une constriction au locus Xq27.3 des patients avec un retard mental associé au chromosome X. Ces résultats furent confirmés par l’étude des caryotypes de familles atteintes de retard mental lié au X suite à l'analyse de l’influence des milieux de culture sur l'apparition de sites fragiles (Sutherland, 1977). Le gène responsable de l’apparition de la maladie, et de la cassure observée sur le chromosome X des patients, fut identifié et confirmé en 1991 par différentes équipes de recherche (Fu et al., 1991, Verkerk et al., 1991, Yu et al., 1991), ce gène a donc été nommé Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1). Il fut rapidement admis que l’expansion d’une répétition -CGG- et sa méthylation anormale était en cause dans l’arrêt de l’expression du gène FMR1 (Oberle et al., 1991, Sutcliffe et al., 1992). La protéine FMRP fut mise en évidence deux ans plus tard (Devys et al., 1993, Siomi et al., 1993). En 1993, Le premier modèle animal fit son apparition en 1994, ce qui permit une grande expansion du domaine (Bakker et al., 1994).
Le syndrome du chromosome X fragile
La caractéristique principale du X Fragile est une altération des fonctions cognitives supérieures. Les sujets atteints présentent leurs premiers signes durant l'enfance, généralement de façon modérée. Il fut cependant observé que le quotient intellectuel des patients subissait un déclin progressif au cours de leur existence (Hay, 1994). Outre le retard mental observé, les difficultés de langage et d’élocution sont importantes chez les hommes atteints. Les patients montrent souvent des comportements autistiques incluant un faible contact visuel, des structures de comportement restreintes et répétitives, ou encore de l’anxiété sociale. À ces traits s’ajoutent l’hyperactivité, la susceptibilité à l’épilepsie, la macroorchidie (augmentation du volume testiculaire) chez les hommes, l’hyperlaxité des membres, l’allongement du visage et des oreilles, la proximité des yeux,
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ou encore les pieds plats (Hagerman and Hagerman, 2002a). Ces nombreuses caractéristiques physiques apparaissent de façon variable, et certains individus seront peu différenciables d’un sujet non affecté par le syndrome.
D’un coté plus physiopathologique, l’absence de la Fragile X mental Retardation Protein (FMRP) provoque des troubles du développement et de la plasticité neuronale. Les potentialisation et dépression à long terme (Long Term Potentiation, Long Term Depression; LTP et LTD) sont affectées, et aussi bien les patients que les souris Fmr1 nulles présentent des épines dendritiques surnuméraires et immatures. Ceci pourrait constituer la base neuroanatomique du retard mental observé chez les personnes atteintes (Comery et al., 1997, Irwin et al., 2000).
1.1.2. La protéine
Du gène à la maladie
Le syndrome du X fragile est à l’heure actuelle la première cause de retard mental héréditaire. Il affecte environ un homme sur 4000 et une femme sur 6000 dans la population générale (Chelly and Mandel, 2001). La différence entre hommes et femmes s’explique par l’inactivation aléatoire de l’un des deux chromosomes X chez les femmes durant le développement embryonnaire, ce qui diminue leurs risques d’être affectées.
Tel qu’évoqué plus haut, le FXS est causé par l’expansion du nombre de répétitions d’un triplet CGG au locus Xq27.3, dans la région 5’ non codante du gène FMR1. Le syndrome se développe généralement lorsque le nombre de répétitions dépasse 200 (Oberle et al., 1991, Verkerk et al., 1991). Une hyperméthylation concomitante des îlots CpG situés en amont du gène FMR1 est souvent observée, causant l'inactivation subséquente d’expression de la FMRP (Sutcliffe et al., 1992).
Les allèles possédant de 54 à 200 répétitions sont dits prémutés (Fu et al., 1991). Les individus porteurs de la prémutation ne présentent pas de retard mental, mais peuvent être sujet à l’Ataxie cérébelleuse tardive (FXTAS : Fragile X Tremor/Ataxia Syndrome). Environ 20 % des femmes porteuses de la prémutation souffrent de ménopause prématurée (POF : Premature Ovarian Failure)(Hagerman and Hagerman, 2002b). Au delà de 200 répétitions CGG, le gène
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FMR1 n'est plus fonctionnel et n'est pas transcrit (Fu et al., 1991, Oberle et al., 1991, Verkerk et al., 1991).
Les mutations ponctuelles dans le gène FMR1
Bien que la très grande majorité des cas de patients atteints par les symptômes du X fragile le doivent à l’augmentation du nombre de répétitions du triplet CGG (Verkerk et al., 1991, Ashley et al., 1993), ce n’est pas le cas de tous. Le séquençage du gène FMR1 de patients présentant des caractéristiques phénotypiques d’une atteinte par le FXS a permis d’identifier des mutations du gène FMR1 qui seraient la source du développement des symptômes chez ces patients. La première identifiée, et plus connue d’entre elles, décrite par De Boulle et al. (1993), affectait l’isoleucine (I) 304 qui était substituée par une asparagine (N), (Figure 2) retrouvée chez un individu déjà diagnostiqué pour une maladie génétique du métabolisme des glucides liée au chromosome X (locus Xp22) causée par une déficience en phosphorylase kinase, et entrainant une hépatomégalie. Les symptômes sévères attribués à la mutation I304N, n'étaient pas retrouvés chez 29 parents atteints de la même glycogénose (De Boulle et al., 1993). Ces symptômes incluaient un quotient intellectuel en dessous de 20, d’importantes déformations au visage, et une forte augmentation du volume testiculaire (plus de 100 ml).
La découverte de la mutation I304N a suscité un grand intérêt dans la communauté du X Fragile, avec notamment la mise au point d’un modèle animal exprimant la protéine mutée (Zang et al., 2009). Cette souris mutante est venue confirmer définitivement que la source des symptômes du patient décrit en 1993 était bien cette mutation dans le gène FMR1. En effet, chez ce modèle animal, malgré l’expression de la protéine FMRP, la mutation I304N affectant le domaine KH2 (décrit plus loin) suffit à reproduire la majorité des manifestations du FXS décrites chez la souris Fmr1 nulle.
Ce n’est que 17 ans après la découverte de la première mutation ponctuelle affectant la séquence codante de FMR1 par De Boulle et al. (1993) qu’une seconde mutation fut décrite par Collins et al. (2010). Cette étude fut réalisée auprès de 963 patients masculins avec retard de développement, mais ne présentant pas l’augmentation du nombre de répétitions CGG caractéristique du FXS. La substitution de l’arginine 138 pour une glutamine se situe dans le signal d’adressage nucléaire (aa 115 à 150, Figure 2 (Eberhart et al., 1996, Sittler et al., 1996)) de la
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protéine et n'a pas encore été sujette d'autres travaux. Les modèles bioinformatiques se contredisent quant à la pathogénicité de cette mutation R138Q, dont l’arginine est très conservée, exceptée chez Takifugu rubripes et Tetraodon nigroviridis, deux espèces de poisson-ballons chez qui c’est une glutamine qui est utilisé (Collins et al., 2010). L’arginine 138 serait cependant conservée chez la drosophile, modèle particulièrement intéressant du fait de l’absence des protéines homologues FXR1 et FXR2 qui ne pourraient donc pas compenser une malfonction de FMRP (Bardoni and Mandel, 2002).
L’épissage alternatif de FMR1
Le transcrit primaire du gène FMR1 subit des épissages alternatifs, conduisant à de nombreuses possibilités de formation d’ARNm. En effet, le gène FMR1, long de 38 Kb, comprend 17 exons. En RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction), il est possible d’identifier jusqu’à 20 variants d'ARNm, tandis que 5 à 7 protéines sont détectables en western-blot, à condition d’utiliser un anticorps dirigé contre la partie N-terminale de la protéine, présente chez toutes les isoformes de FMRP (Devys et al., 1993, Khandjian et al., 1995, Sittler et al., 1996).
Les exons principalement concernés par l’épissage alternatif sont les exons 12 et 14, mais un facteur important serait également le choix d’accepteur dans les exons 15 et 17 (Ashley et al., 1993, Eichler et al., 1993, Verkerk et al., 1993, Sittler et al., 1996). En effet, lorsque l’exon 14 est exclu, l’accepteur change dans l’exon 15, et un changement de cadre de lecture est engendré pour la suite de la protéine. Un codon stop différent sera rencontré par l’appareil de traduction (Ashley et al., 1993, Verkerk et al., 1993, Sittler et al., 1996). Ce changement de cadre de lecture conduit à l’apparition de quatre isoformes de FMRP dont l’extrémité C-terminale est complètement différente de celle des isoformes classiquement exprimées dans la cellule (isoformes 1 et 7). L’extrémité C-terminale traditionnelle de la protéine contient entre autres son signal d’export nucléaire (NES), et ce changement de cadre de lecture aura une grande incidence sur la localisation de la protéine, tel que détaillé plus loin. Les isoformes créées par ce changement de cadre de lecture sont les isoformes notées 4, et 6, qui utilisent respectivement des accepteurs en position 4 et 76 de l'exon 15, et donc montrent un changement de cadre lecture différent également. Aux isoformes 4 et 6, qui contiennent l’exon 12, s’ajoutent respectivement les isoformes 10 et 12, qui l’excluent (Figure 1).
7 Figure 1: Représentation schématique de l'épissage alternatif des transcrits primaires de FMRP. Représentation schématique des patrons d'épissage des exons 12 et 14, avec les accepteurs utilisés par chacune des isoformes murines 1 à 12. Les isoformes 1 à 6 contiennent l'exon 12, contrairement aux isoformes 7 à 12. Les isoformes utilisent des accepteurs différents dans l'exon 15, ce qui conduit à des changements de cadre de lecture dans les isoformes concernées (Brackett et al., 2013).
Le rôle et les conséquences de l’épissage alternatif du gène FMR1 ne sont pas connu, et aucune différence de fonction n’a jusqu’à présent été démontré parmi les différentes isoformes obtenues, si ce n’est que les isoformes 4, 6, 10 et 12 sont nucléaires lorsque surexprimées après transfection avec des vecteurs d'expression (Sittler et al., 1996). Les isoformes endogènes correspondantes n'ont cependant jamais été détectées jusqu’à présent par immunobuvardage. Par ailleurs, des prévisions bioinformatiques suggèrent que les ARNm des isoformes 4 et 10 seraient adressés au système de dégradation des ARNm non-sens (NMD pour nonsense-mediated mRNA decay), et ne seraient donc pas exprimés dans la cellule.
Les ARN messagers codant pour la protéine Fmrp murine, qui partage 97% d’identité avec son orthologue humaine, ont été récemment sujets de travaux plus approfondis par Brackett et al. (2013), qui se sont penchés sur la quantification spatiale et temporelle des différentes isoformes d’ARNm retrouvés au cours du développement de la souris. Outre les différences spatiotemporelles dans les quantités de transcrits retrouvés, il important de noter que les auteurs ont montré l’association de 12 variants d’ARNm murin avec les polyribosomes (codant pour les isoformes 1 à 12), ce qui impliqueraient qu’elles sont toutes traduites, dépendant du niveau d’ARNm retrouvé.
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La FMRP
Chez l’adulte, bien qu’exprimée dans presque tous les tissus, FMRP est particulièrement abondante dans le cerveau et les testicules, ce qui corrèle avec les manifestations du syndrome du X fragile (Figure 3, (Khandjian et al., 1995)) Dans le cerveau, FMRP est fortement exprimée dans les neurones corticaux, ainsi que dans les cellules de Purkinje de la couche granulaire du cervelet. Dans les testicules, FMRP est particulièrement présentes dans les spermatogonies. FMRP n’est pas exprimée dans les muscles striés où l’on retrouve plutôt la protéine FXR1 décrite plus bas.
La protéine FMRP contient plusieurs domaines connus, tels que des domaines de liaison à l’ARN (KH1 et 2, RGG), ou des domaines d’interactions avec d’autres protéines, entre autres les membres de la famille des FXRs, ou encore certaines kinésines (Davidovic et al., 2007). La protéine possède également deux domaines d’adressage et d’export nucléaire (NLS et NES pour Nuclear Localisation Signal, et Nuclear Export Signal) (Eberhart et al., 1996, Fridell et al., 1996, Sittler et al., 1996).
Figure 2 : Représentations des domaines présents dans ISO 1 pleine longueur.
Représentation schématique de la carte physique de FMRP ISO 1 ainsi que des domaines d'interaction de ses différents partenaires protéiques connus (modifié depuis Dury et al., 2013).
Il fut également rapporté que la Sérine 499 de mFMRP (Ser500 chez l’homme) serait un site potentiel de phosphorylation de la protéine, ce qui permettrait la modulation de son activité de régulateur de la traduction (Cheever and Ceman, 2009, Coffee et al., 2012, Nalavadi et al., 2012).
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La famille des FXRs
FMRP fait partie d’une famille de protéines liant l’ARN appelée Fragile X Related (FXR). Cette famille comprend les paralogues FXR1 et FXR2, pour Fragile X Related (Coy et al., 1995, Siomi et al., 1995, Zhang et al., 1995, Khandjian, 1999). La structure des protéines FXR1P et FXR2P codées par ces gènes autosomaux sont très similaires à FMRP bien que les régions C-terminales des protéines divergent fortement. Le transcrit primaire de FXR1 est sujet à l’épissage alternatif, avec 2 isoformes majeures révélées par RT-PCR, et également visibles en western blot (Coy et al., 1995, Siomi et al., 1995, Kirkpatrick et al., 1999). Tout comme FMRP, FXR1 contient deux domaines KH et un domaine RGG, caractéristiques des protéines de liaison à l’ARN, ainsi que des domaines NLS et NES très similaires à ceux de FMRP. FMRP, FXR1, et FXR2 peuvent toutes les trois interagir, et sont toutes les trois associées à l’appareil de traduction (Siomi et al., 1996, Khandjian et al., 1998, Dube et al., 2000).
La distribution tissulaire et les degrés d’expression de FXR1 ressemblent beaucoup celle de FMRP, à l'exception des muscles. En effet, FXR1 est la seule des FXR à être exprimées dans les muscles cardiaques et squelettiques. Le protéine FXR1 y est d’ailleurs exprimée sous une longue forme particulière de 82 KDa environ qui apparait durant la différentiation des myoblastes en remplacement d’isoformes plus courtes normalement exprimées chez ces cellules lorsqu’elles ne sont pas différentiées (Khandjian et al., 1998, Dube et al., 2000).
Bien que le modèle de souris Fxr1 -/- ait été créé, peu d’information ont pu en être tirées. En effet, les souris Fxr1 nulles meurent rapidement après leur naissance (Mientjes et al., 2004) du fait d’un développement anormal des muscles tel que le suggère une étude menée chez la grenouille (Huot et al., 2005).
Peu de travaux sont consacrés à FXR2P, cependant, le modèle murin Fxr2 -/- existe, et reproduit certains comportements similaires à ceux de la souris Fmr1 -/- (Bontekoe et al., 2002). Le double knock out Fmr1, Fxr2 -/- existe également, et montre un phénotype similaire aux souris Fmr1 nulles, mais aggravé (Spencer et al., 2006). Ces informations suggèrent fortement une certaine redondance fonctionnelle des protéines FXR, qui expliquerait peut-être les variations observables chez les individus atteints du FXS.
10 Figure 3 : Structure des membres de la famille FXRP et distribution de ces protéines dans divers
tissus et organes de la souris adulte.
A) Structure des protéines FXR : les barres verticales (en vert foncé) correspondent aux acides aminés (aa) identiques, tandis que les barres horizontales (en rouge) représentent les aa divergents entre les membres de la famille des FXR. B) Distribution des FXRP chez la souris adulte. Les niveaux les plus élevés de FMRP se retrouvent dans le testicule, le cerveau et le cervelet. FMRP fut détectée dans tous les tissus étudiés exceptés les muscles. FXR1P présente une distribution similaire à l'exception des muscles striés ou l'on retrouve ses isoformes longues (Khandjian et al., 1998, Dube et al., 2000). FXR2P ne semble pas suivre les mêmes distributions que ses homologues. Les poids moléculaires apparents (kDa) sont donnés vis-à-vis de chaque protéine. Tiré de Davidovic et al. (2006b). (PPID : Protein Protein Interaction Domain ; PhD : Phosphorylation Domain ; NLS : Nuclear Localisation Domain ; KH1,2 : K Homolog Domain 1, 2 ; NES : Nuclear Export Signal ; RGG : Glycine Arginin Rich Domain)
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1.2.
Fonctions de la FMRP
1.2.1. La FMRP en association avec l’appareil de traduction
Suite aux travaux décrivant l'affinité de FMRP à l'ARNm et son association avec l’appareil de traduction (Khandjian et al., 1996, Corbin et al., 1997, Feng et al., 1997), de nombreux laboratoires ont entrepris la caractérisation de ces ARNm. Dans le passé, plus d’un millier d’ARNm avaient été répertoriés dans la littérature comme cibles putatives de FMRP (Brown et al., 2001, Darnell et al., 2001, Darnell et al., 2005). Seuls quelques un avaient cependant été validés (voir Bassell and Warren (2008)), dont les ARNm de FMR1 (Schaeffer et al., 2001) et celui de la Sod1 (Superoxyde dismutase 1) (Bechara et al., 2009). Darnell et al. (2011) ont récemment réalisé une étude identifiant plus de 800 ARNm dans les cerveaux de souris de plusieurs âges par des méthodes de Cross-Link UV (réticulation des ARN/protéines par irradiation aux UV-C), qui permettrait une meilleur spécificité et reproductibilité des cibles identifiées.
Suite aux travaux de Feng et al. (1997), Laggerbauer et al. (2001) et Mazroui et al. (2002), il est actuellement généralement admis que FMRP est un répresseur de la traduction et permettrait de réprimer les ARNm durant leur transport depuis le soma vers des sites spécialisés distaux (Mazroui et al., 2002, Bardoni et al., 2006). Il a été mis en évidence par Darnell et al. (2011) que FMRP est capable de lier des polyribosomes à l’état de veille, c'est-à-dire plusieurs ribosomes complets en place sur l’ARN, mais non en traduction active (stalled polyribosomes). Concordant avec ces données, il a été observé aussi que des granules ARN neuronaux, contenant FMRP, voyagent dans les prolongements des neurones afin de transporter les ARNm sur de grandes distances, par exemple jusqu’aux synapses (Figure 4) (Antar et al., 2004, Davidovic et al., 2005, Davidovic et al., 2006a) en utilisant les moteurs kinésines (Davidovic et al., 2007, Dictenberg et al., 2008). Sous-jacent aux synapses, une synthèse locale hautement spécifique dans laquelle serait impliquée FMRP permettrait l’établissement des réseaux neuronaux (revue par Bassell and Warren (2008)). FMRP serait ainsi impliquée dans la régulation de la plasticité neuronale, qui est à la base d’un fonctionnement optimal du cerveau (Schuman et al., 2006). L’absence de FMRP provoquerait une dérégulation subtile de la synthèse protéique locale par l'absence ou la réduction de certains ARN transportés, conduisant à une altération du développement et de la connexité synaptique, entraînant ainsi le retard mental (Comery et al., 1997, McKinney et al., 2005, Grossman et al., 2006, Bassell and Warren, 2008).
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La protéine FMRP n’est pas indispensable au fonctionnement des cellules, mais elle est capitale pour l’activité neuronale impliquant une traduction protéique finement régulée (Khandjian et al., 1996). Dans les neurones, nous avons localisé FMRP dans trois sous-domaines cytoplasmiques, à savoir le soma, les épines dendritiques et les cônes de croissance. De plus, nous retrouvons FMRP distribué sous forme de granules mobiles voyageant entre le soma et les extrémités à la périphérie du neurone. Deux fonctions, intimement liées, sont à l’heure actuelle proposées pour FMRP. Une première population de la protéine serait associée aux polyribosomes, aux sites de traduction active, dans un but de modulation de la traduction (Mazroui et al., 2002 ; Khandjian et al., 2004 ; Stefani et al., 2004 ; Davidovic et al., 2007 ; Bechara et al., 2009 ; Khandjian et al., 2009). Une seconde population servirait de répresseur pour les ARNm devant être transportés dans les neurites afin de rejoindre les sites de traduction locale présents dans les synapses et les cônes de croissance (Figure 4)(Antar et al., 2004, Davidovic et al., 2005, Darnell et al., 2011).
13 Figure 4 : Modèle entourant la fonction de la FMRP dans le neurone.
Une fois la "décision prise", les granules sont transloqués sur les microtubules pour être transportés vers des microdomaines lointains. Ces granules sont mis en réserve pour être réactivés par des stimuli, et sont ensuite décondensés pour former l'appareil de traduction nécessaire à la synthèse protéique locale.
1.2.2. FMRP dans la transmission neuronale
Suite aux travaux de l’équipe de Bear (Huber et al., 2002), qui ont ouvert la porte de la théorie du mGluR dans le X fragile (développée plus bas), de nombreux laboratoires se sont penchés sur les implications de non seulement le système Glutamatergique, mais également les différents systèmes de neurotransmission dans le FXS. Les tentatives de thérapies dans le X Fragile sont par ailleurs très majoritairement basées sur ces études, et c’est pourquoi il est important de s’y attarder.
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La transmission GABAergique
L'acide γ-aminobutyrique, ou GABA, est le principal neurotransmetteur inhibiteur du cerveau des mammifères. Que ce soit chez les modèles de la souris ou de la drosophile Fmr1 nulles, il semblerait qu’il y ait une réduction significative de la quantité de récepteurs GABA-A dans le cerveau en l’absence de la protéine FMRP (El Idrissi et al., 2005, D'Hulst et al., 2006, Gantois et al., 2006). De plus, d’après Olmos-Serrano et al. (2010), la souris Fmr1 nulle présenterait une forte réduction dans la fréquence et l’amplitude des courants post-synaptiques inhibiteurs, dans les courants inhibiteurs toniques, de même que dans le nombre de synapses inhibitrices. Les souris Fmr1 nulles seraient également sujettes à une hyperexcitabilité neuronale dans l’amygdale, réversible par l’augmentation pharmacologique du tonus inhibiteur en utilisant l’agoniste GABA gaboxadol (THIP) (Olmos-Serrano et al., 2010), ainsi qu’à des courants GABA-A anormaux dans les neurones subiculaires (Curia et al., 2009).
Intéressés par la baisse de récepteurs GABA pour leur implication possible dans le phénotype épileptique des souris Fmr1 nulles (El Idrissi et al., 2005), El Idrissi et al. (2009) ont peoposé une tentative de traitement des souris par la taurine, un agoniste des récepteurs GABA. D’après les auteurs, le traitement pourrait permettre de rétablir certains aspects du phénotype de la souris Fmr1 nulle. Ces travaux sont cependant assez préliminaires, et nécessiteraient d’être reproduits et poussés. De plus El Idrissi et al. (2009) rapportent une hausse de la quantité d’acide L-glutamique décarboxylase (GAD, enzyme limitante dans la synthèse du neurotransmetteur GABA) chez la souris Fmr1 nulle, ce qui entre en contradiction avec les résultats de Olmos-Serrano et al. (2010), qui montrent une réduction significative des niveaux de cette enzyme chez la souris Fmr1 nulle.
Ces résultats suggèrent un déséquilibre entre l’inhibition et l’excitation neuronale en faveur de l’excitation chez les souris Fmr1 nulles, ce qui est en accord avec le phénotype épileptique du modèle animal et des sujets atteints du X fragile, qui ont une prévalence plus forte à l’épilepsie en comparaison à la population générale (Berry-Kravis et al., 2010). Afin de tenter de restaurer les niveaux d’inhibition GABA, deux voies ont principalement été étudiées, impliquant l’emploi d’un coté d’agonistes des récepteurs GABA-A, et de l’autre, d'agonistes des récepteurs GABA-B. L’utilisation d’agonistes GABA-A permettrait d’agir directement sur le manque de récepteurs
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GABA-A, tandis que les agonistes GABA-B permettraient eux de baisser présynaptiquement la relâche globale de glutamate, et de réduire l’activation des récepteurs mGluR .
Chez le modèle murin, les agonistes GABA-A le ganaxolone (Heulens et al., 2010) et la taurine (El Idrissi et al., 2009) ont été respectivement rapportés comme réduisant les crises épileptiques audiogènes, et améliorer les performances des souris dans un test de d’évitement passif. L’agoniste GABA-B R-baclofen réduit également le phénotype audiogène de la souris Fmr1 nulle (Pacey et al., 2009). Chez le modèle de la drosophile, différents agonistes GABA amélioreraient les phénotypes de neuropathologie, de traduction protéique excessive, le phénotype nuptial anormal ou encore le phénotype toxicité du glutamate (Chang et al., 2008).
La transmission Potassique
Il existe de nombreux types de canaux potassiques dans le système nerveux. Certains permettent de maintenir le potentiel de repos des membranes (Nichols and Lopatin, 1997, Enyedi and Czirjak, 2010), tandis que d’autres, voltage-dépendant, participent à la formation et propagation des potentiels d’action (Lai and Jan, 2006). La souris Fmr1 nulle présenterait des altérations au niveau de trois différents types de canaux potassiques. Les canaux potassiques Slack-B, activés par le sodium (KNa), (Brown et al., 2010), les canaux voltage-dépendant Kv3.1b
(Strumbos et al., 2010), et les canaux voltage-dépendant Kv4.2 (Lee et al., 2011).
Slack-B, un partenaire protéique de FMRP
Dans une étude à la fois électrophysiologique et biochimique, Brown et al. (2010) avancent que FMRP lierait l’extrémité C-terminale du canal potassique Slack, activé par le sodium, Slack. D’après les auteurs, cette liaison conduirait à l’activation du canal. Ces travaux sont les premiers à suggérer l’interaction de la protéine FMRP avec une protéine membranaire, à plus forte raison avec un canal. L’activation du canal Slack contribue au patron de décharges d’une large variété de neurones. Dans les neurones des voies auditives du tronc cérébral, l’activation de Slack pourrait maintenir la précision temporelle des décharges en réponse à des stimulations à hautes fréquences (Yang et al., 2007). Brown et al. (2010) suggèrent donc que certaines anormalités neuronales retrouvées dans le X Fragile seraient causés par des patrons de décharges neuronaux altérés, conséquence eux-mêmes de l’absence de FMRP. Dans ce cas précis, le phénotype observé ne serait alors pas dû aux rôles très largement étudiés de FMRP dans la régulation de la traduction et
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localisation des ARN messagers, mais bien à la perte de l’association directe du FMRP avec le canal Slack B, conduisant en temps normal à l’activation du canal.
L’ARNm de Kv3.1 est une cible de FMRP
Tel que mentionné plus haut, les souris Fmr1 nulles présentent une sensibilité anormale aux stimuli auditifs pouvant conduire à des crises épileptiques audiogènes. Bien que les crises épileptiques audiogènes n’aient pas été rapportées chez les patients, le déclenchement et la manifestation des comportements autistiques chez ces individus corrèlent avec une hypersensibilité auditive (Penagarikano et al., 2007). L’ARN messager codant pour le canal Kv3.1 serait une des nombreuses cibles de la protéine FMRP (Darnell et al., 2001, Strumbos et al., 2010, Darnell et al., 2011), et le rôle physiologique des canaux Kv3.1 est de permettre à certains types de neurones de décharger à de hautes fréquences (Kaczmarek et al., 2005), ce qui aiderait à décoder certains sons. Les canaux Kv3.1 sont fortement retrouvés dans les neurones des noyaux de l’audition (Wang et al., 1998) et leurs propriétés permettent aux neurones de déclencher de longs trains de potentiels d’actions à haute fréquences. La fidélité de l’encodage des sons serait dépendante d’un gradient tonotopique précis de l’expression de l’isoforme Kv3.1b dans le NMCT (Noyau Médian du Corps Trapézoïde) des voies auditives du tronc cérébral. En effet, les niveaux de Kv3.1 sont les plus élevés à l’extrémité médiale, correspondant aux hautes fréquences (Kaczmarek et al., 2005). Par des approches d’immunohistochimie et d’électrophysiologie, Strumbos et al. (2010) ont pu montrer une perte importante du gradient tonotopique de l’expression du canal Kv3.1b et des courants potassiques associés chez les souris Fmr1 nulles avec des niveaux plus élevés là où ils seraient plus faibles chez les souris saines. Après 30 minutes de stimulations auditives hautes fréquences et d’amplitudes modulées, l’immunoréactivité de Kv3.1b semblerait avoir subi une importante augmentation chez les souris contrôles, mais pas chez les souris Fmr1 nulles. Au vu de leurs résultats, les auteurs suggèrent que les neurones des voies auditives sont hyperexcitables chez le modèle animal et les individus atteints du X fragile, et que le rôle de répresseur de la traduction de FMRP serait nécessaire au maintient du gradient tonotopique de Kv3.1b dans le NMCT. Cependant, la base de la dérégulation de l’expression de Kv3.1b chez les souris Fmr1 nulles n’est pas connue, et bien que Strumbos et al. (2010) ne l’évoquent pas, il est possible qu’il s’agisse d’une question de variation dans l’épissage alternatif de Kv3.1. En effet, bien que cette étude soit isolée,
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et non reprise jusqu'à présent dans la littérature, Didiot et al. (2008) suggèrent un rôle de FMRP dans l’épissage.
FMRP permettrait de réguler l’expression de l’ARNm de Kv4.2
Tout comme celui de Kv3.1, l’ARNm codant pour Kv4.2 a été identifié comme un ARN cible de la protéine FMRP (Darnell et al., 2011, Lee et al., 2011). Le canal Kv4.2 serait la forme la plus abondante de canal potassique voltage dépendant de type A retrouvé chez les neurones pyramidaux de la région CA1 de l’hippocampe. En effet, en l’absence de ce canal, ces courants sont perdus (Chen et al., 2006). Le canal Kv4.1 fut rapporté comme étant enrichi aux épines des neurones pyramidaux du CA1, où il serait alors régulé par l’activité synaptique, permettant à son tour de jouer un rôle dans la plasticité synaptique (Jung et al., 2008, Kim and Hoffman, 2008). Dans une étude sur des tranches d’hippocampes, et des cultures neuronales primaires d’hippocampe, Lee et al. (2011) rapportent non seulement la présence de l’ARNm de Kv4.2 dans les dendrites, mais que les niveaux de l’ARN seraient abaissés en l’absence de FMRP qui lierait cet ARN dans sa région 5’ non codante (5’UTR).
L’altération des potentialisations à long terme chez la souris Fmr1 nulle fut rapportée à plusieurs reprises (Lauterborn et al., 2007, Shang et al., 2009). D’après Lee et al. (2011), il est possible de rétablir ce phénotype en réduisant la quantité de Kv4.2, qui ne seraient plus adéquatement régulé au niveau traductionnel par FMRP. Les auteurs s’avancent dans un modèle où la répression de l’expression de Kv4.2 par FMRP serait levée par la phosphorylation de la protéine en Sérine 499, modèle sur lequel peu de groupes de recherche se sont pour l’instant penchés. Il n’en est pas moins intéressant que l’hétéropodatoxine (HpTx2), une toxine d’araignée bloquant les Kv4.2, semblerait capable de rétablir les altérations de la LTP dans les tranches d’hippocampe de souris Fmr1 nulles, ce qui constitue une piste préliminaire non négligeable pour la recherche de nouveaux traitements dans le X fragile.
La théorie du mGluR5
L'identification des ARNm associés à l'appareil de traduction dans les sites distaux de traduction locales, isolés sous forme de synaptoneurosomes, permit de découvrir que l'ARNm de FMRP y était associé, en particulier suite à la stimulation des récepteur mGluR1 (Weiler et al., 1997). Suite à ces premiers travaux évoquant un lien entre la FMRP et les récepteurs mGluR, c’est
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en 2002 que fut montré que la LTD déclenchée par l’activation des récepteurs métabotropiques au glutamate (mGluR-LTD) est plus forte en l’absence de FMRP (Huber et al., 2002). L’implication de FMRP dans cette forme de plasticité dépendante de la traduction protéique locale concordait très bien avec les nombreuses études portant sur l’association de la protéine FMRP avec l’appareil de traduction. En effet, Huber et al. (2002) proposent que FMRP, répresseur de la traduction, réduit en temps normal l’expression des ARNm présents localement dans les dendrites. En son absence, il y aurait donc une levée de la limitation de l’expression de ces ARNm, et une mGluR-LTD anormalement élevée (Bear et al., 2004, Qin et al., 2005).
D’après certains travaux, la régulation des ARNm dont l’expression est induite durant la mGluR-LTD serait dépendante de l’état de phosphorylation de FMRP, régulé par S6K1 et PP2A (Narayanan et al., 2007, Narayanan et al., 2008, Muddashetty et al., 2011). L’activation des récepteurs mGluR conduirait à la déphosphorylation de FMRP, ce qui permettrait alors la traduction d’ARNm impliqués dans la mGluR-LTD. Ces ARN messagers pourraient correspondre à des cibles de FMRP codant pour des protéines étudiées pour leur fonction à la synapse(Bassell and Warren, 2008).
L’hyperactivité de la mGluR-LTD étant suggérée comme étant à la base de certains symptômes du X fragile, il faudrait alors orienter les traitements vers une diminution de l’activité des récepteurs mGluR en cause afin de rétablir la situation. Le MPEP (2-méthyl-6-(phényléthynyl)-pyridine) est un antagoniste sélectif des récepteurs mGluR5 capable de traverser la barrière hémato-encéphalique. Les études utilisant le MPEP comme traitement se multiplient chez la souris Fmr1 nulle et de nombreux traits retrouvés chez le modèle animal de la maladie semblent pouvoir être corrigés/améliorés. On retrouve :
• Les crises épileptiques audiogènes (Yan et al., 2005)
• Les phénotypes associés à l’anxiété en test de champs ouvert (Yan et al., 2005) • L’excès de synthèse protéique dans les tranches d’hippocampe (Chuang et al., 2005) • Les décharges épileptiformes prolongées dans les tranches d’hippocampe (Chuang et al.,
2005)
• La baisse de la quantité de granules de transport d’ARN messagers (Aschrafi et al., 2005) • L’excès d’internalisation des récepteurs AMPA (Nakamoto et al., 2007)
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• L’augmentation de densité de filopodes dendritiques dans les cultures primaires d’hippocampe (de Vrij et al., 2008)
• Le déficit d’inhibition préimpulsion du réflexe de sursaut (de Vrij et al., 2008)
• La déphosphorylation des sérines inhibitrices de GSK3α et β conduisant à l'augmentation de son niveau d'activité (Glycogène Synthase kinase-3) (Min et al., 2009).
Dolen et al. (2007) ont par ailleurs montré que par la diminution des niveaux d’expression des récepteurs mGluR5 chez les souris Fmr1 nulles il était possible d’améliorer le phénotype de l’animal, ce qui apporte une confirmation supplémentaire quant aux implications des récepteurs mGluR5 dans la maladie. Plus récemment, après l’administration subchronique d’un nouvel inhibiteur de la mGluR5, le CTEP, plus efficace que le MPEP, (Lindemann et al., 2011), Michalon et al. (2012) semblent avoir été capables de rétablir plusieurs aspects du phénotype du X fragile chez les souris Fmr1 nulles. Le traitement aigu au CTEP semble corriger les altérations au niveau de la LTD, de la synthèse protéique et crises épileptiques audiogènes. Cependant, d’après les auteurs, le traitement chronique au CTEP chez les souris jeunes adultes avec une occupation des récepteurs à 81% ± 4% rétablirait les déficits cognitifs, l’hypersensibilité auditive, la densité synaptique aberrante, l’hyperactivité des voies de signalisation de ERK et mTOR, et corrigerait partiellement la macroorchidie.
1.2.3. FMRP dans le noyau
Peu de groupes de recherches se sont concentrés sur l’étude de la protéine FMRP dans le noyau des cellules. Tel qu’évoqué plus haut, la protéine FMPRP possède un signal d’adressage nucléaire (NLS, aa 115 à 150) (Eberhart et al., 1996), ainsi qu’un signal dit d’export nucléaire (NES, aa 429 à 437) (Eberhart et al., 1996, Fridell et al., 1996), préalablement nommé domaine de rétention nucléaire (CRD) par Sittler et al. (1996) (Figure 2). Il semblerait qu'un pourcentage faible de la population de FMRP se trouve dans le noyau. Ainsi, il fut suggéré que FMRP aille chercher des ARNm spécifiques dans le noyau afin de les exporter au corps cellulaire et dans les prolongements neuronaux par la suite (Eberhart et al., 1996, Feng et al., 1997, Kim et al., 2009). Il est important de noter qu’aucune étude n’a jamais apporté de preuves d’un tel export autrement qu’en utilisant des constructions codant pour une protéine FMRP altérée par le retrait de certaines parties de sa séquence. Kim et al. (2009) n'ont effet rapporté que seulement 0,4% de cellules
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présentant un signal nucléaire lorsque transfectées avec une protéine FMRP pleine longueur et non altérée, marquée d’une étiquette GFP. L'utilisation d'une construction codant pour une FMRP dépourvue de son NES ne suffisant pas provoquer une accumulation significative de la protéine dans le noyau, les auteurs ont donc fusionné un NLS très fort de SV40 à cette FMRP recombinante. On peut donc se questionner quant à la signification physiologique de résultats obtenus à l’aide d’une telle chimère.
Seules les isoformes de FMRP ne possédant pas l’exon 14 (contenant le NES) sont efficacement adressées au noyau. En effet, par transfection, les isoformes 4, 6, 10 et 12 présentent une localisation fortement nucléaire (Sittler et al., 1996). Malgré cette intéressante localisation, ces isoformes de FMRP considérées comme mineures n’ont jamais été sujettes à travaux plus approfondis.
Feng et al. (1997) ont pu mettre en évidence la présence de particules d’or dans le noyau de neurones lors d’analyses d’immunomarquage dirigé contre FMRP. Cependant, ces travaux furent réalisé avec un anticorps qui ne permet pas de discerner quel isoforme de FMRP est observée dans le noyau. Aucune étude n’apporte d’élément probant allant de le sens d’un trafic nucléo-cytoplasmique de la protéine FMRP. Il est impossible d’exclure avec les données présentement disponibles que les isoformes 4, 6, 10 ou 12 de FMRP soient celles observées dans le noyau. Ces isoformes ne possédant pas de NES, il serait improbable qu’elles participent à un mécanisme d’export des ARNm.
1.3.
Le développement de thérapies dans le X Fragile
Il n’existe actuellement aucun traitement pour compenser l’absence de la protéine FMRP chez les patients. Seuls des traitements palliatifs sont administrés, tels les antidépresseurs, le lithium, les antagonistes des récepteurs glutamatergiques métabotropiques, ou les anxiolytiques, permettant d’atténuer certains symptômes comme l’anxiété, l’hyperactivité ou l’automutilation (Hagerman et al., 2012).
L'inhibition de GSK3, qui est hyperactif dans le X fragile, permettrait elle-seule une amélioration des déficits de LTP et de cognition chez les souris Fmr1 nulles (Franklin et al., 2013). GSK3 est inhibée par le lithium, qui semble justement avoir un effet positif sur les troubles
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cognitifs retrouvés dans le X Fragile (King and Jope, 2013). Depuis quelques années, l’intérêt porté aux molécules agissant sur les transmissions synaptiques GABAergique, Glutamatergiques, et plus récemment potassiques ne cesse de grandir (Hagerman et al., 2012).
Au cours des dix dernières années, la recherche autour de ce qui fut nommé « la théorie du mGluR » connut un essor très important, et est aujourd’hui la source la plus importante d’espoirs de thérapies pour le Syndrome du chromosome X fragile (Berry-Kravis et al., 2011, Hagerman et al., 2012). L’administration chronique de MPEP, ou plutôt du récemment mis au point CTEP seraient capables de rétablir une bonne partie des phénotypes connus chez la souris Fmr1 nulles, mais ne seraient pas en mesure d’intervenir sur le déficit dans la LTP, généralement associée à la mémoire et l’apprentissage. Le phénotype du X fragile n’est donc pas entièrement causé par les altérations de la transmission Glutamatergique, et il sera important dans l’avenir de poursuivre les travaux entrepris concernant les transmissions GABAergiques et potassiques, également affectées dans le syndrome. Le BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) semblerait permettre une facilitation de la LTP chez les souris Fmr1 nulles, avec un retour à un niveau d’induction similaire à celui des souris saines (Lauterborn et al., 2007). Certains travaux se sont aussi intéressés au système dopaminergique chez les souris Fmr1 nulles, qui serait lui aussi touché. Fulks et al. (2010) ont entre autres montré que les souris Fmr1 nulles présentent des niveaux réduits de dopamine au niveau du striatum. L’intérêt porté système dopaminergique dans le X fragile pourrait donc lui aussi connaitre une croissance dans les années à venir.
Étant donné la diversité des mécanismes en cause dans le phénotype observé chez les patients atteints du X fragile, le traitement idéal devra en tenir compte. Pacey et al. (2011) ont justement réalisé une étude dans laquelle les souris recevaient une combinaison d’antagonistes mGluR5 (MPEP), et d’agonistes GABA-B (R-Baclofen), et ont malheureusement montré que les effets bénéfiques du traitement (effet antiépileptique) était rapidement réduits par une tolérance induite par le R-baclofen, mais pas par le MPEP.
La même molécule (R-Baclofen), est actuellement en essais cliniques et sembleraient permettre une amélioration chez les sujets sous traitement en comparaison avec ceux sous placebo, en particulier chez les sujets présentant des symptômes importants, tels que les sujets autistes (Hagerman et al., 2012).
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Des essais cliniques sont également conduits avec différentes molécules inhibitrices des mGluR, la plus connue étant le Fénobam (Berry-Kravis et al., 2009, Hessl et al., 2009), qui fut suivie par le AFQ056 (Jacquemont et al., 2011), le R04917523 (Roche Pharmaceuticals) ou encore le STX107 (Seaside Therapeutics). Ces traitements semblent apporter une certaine amélioration chez les patients en comparaison au contrôle, les études futures devront s’intéresser aux effets à long terme de ces drogues, et à de potentiels traitements chroniques. Étant donné les limitations des traitements actuels, même chez la souris, il sera bien entendu très important de continuer d’approfondir la compréhension du Syndrome du Chromosome du X fragile, et d’explorer les voies prometteuses qu’offrent les différents modes de transmissions synaptiques.
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1.4.
Objectifs de la recherche
Après avoir effectué des travaux de maitrise sur la dynamique de FMRP dans le compartiment cytosolique, l'opportunité apportée par la nouvelle série d'anticorps ovins a mené à une réorientation des travaux vers le compartiment nucléaire, dont la localisation de FMRP y était encore très peu connu. Les travaux décrits plus loin peuvent dont se résumer en deux objectifs :
1. Approfondir la compréhension de la dynamique des granules de transport d'ARN via l'étude des granules FMRP positifs.
2. Tenter de comprendre si oui ou non la protéine FMRP est capable d’entrer dans le noyau, si oui, quelles sont les caractéristiques de cette protéine, où va-t-elle dans le noyau, et est elle capable d’en ressortir afin de remplir une fonction de transport nucléo-cytoplasmique tel que suggéré dans certaines études (Feng et al., 1997, Kim et al., 2009)
La localisation de la FMRP au noyau est source de nombreuses interrogations depuis les premiers articles de ce champs d’étude (Eberhart et al., 1996, Fridell et al., 1996, Sittler et al., 1996). Certains modèles de recherche largement acceptés dans la communauté scientifique ne sont basés que sur peu de résultats, de surcroits souvent indirects.
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27
2.1.
Dynamique des granules en microscopie en temps réel
Les granules neuronaux de transport de l'ARN permettent l'export des ARNm du soma vers les sites distaux de traduction locale tels les synapses et les cônes de croissance. L'export de ces ARNm participe à la plasticité des neurones, qui peuvent ainsi traduire les protéines directement aux synapses lorsque besoin est, comme lors de stimulations (Figure 4). Comprendre le comportement des granules en microscopie en temps réel ouvrira des pistes de recherche sur les implications de l'export des ARNm dans les mécanismes de plasticité neuronale, essentielle au bon développement et fonctionnement des tissus neuronaux.
La transfection est un outil très utile dans l'étude des protéines, tout particulièrement pour leur suivi par imagerie. Cependant, cette approche représente certains défis. Les protéines endogènes normalement exprimées dans la cellule le sont à un niveau précis, régulé par divers mécanismes de contrôle de la transcription et de la traduction. Lorsque l'on transfecte des cellules en utilisant un plasmide, le contrôle de l'expression de son insert d'ADNc est, dans la majorité des cas, assuré par un promoteur SV40 ou encore CMV, tous deux très forts. De plus, de nombreuses copies du plasmide rentrent dans les cellules en même temps, et autant de plasmides s'expriment. La FMRP étant une protéine de liaison à l'ARN, sa surexpression conduit à l'apparition de granules de surexpression qui paralysent l'appareil de traduction de la cellule (Mazroui et al., 2002) et empêche l'étude de la cellule dans son état physiologique.
Du fait de ces inconvénients récurrents, le comportement de la FMRP dans les granules de transport fut peu étudié, et ce dans des conditions loin d'être idéales, avec des granules de transport peu différenciables de granules nocifs de surexpression. Afin de pallier ce problème, nous avons développé deux vecteurs adénoviraux exprimant la protéine FMRP dont l'expression de la GFP-cDNA (FMR1), est contrôlé respectivement par deux promoteurs différents. Le premier utilisant un promoteur CBA (Chicken β Actin), permettant une expression ubiquitaire, le second utilisant un promoteur Synapsine, faible et neurospécifique. L'avantage de la technique se révéla malheureusement être également son inconvénient. L'efficacité redoutable des adénovirus, avec des taux d'infection proches du 100%, même pour des cellules post-mitotiques comme les neurones, souleva d'importantes difficultés imprévues au niveau des techniques d'imagerie. Le signal GFP en abondance dans la quasi totalité des neurones, avec les neurites s'entrecroisant,
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rendait difficile non seulement le travail d'imagerie, mais aussi la compréhension des données obtenues.
En raison des difficultés techniques éprouvées avec les adénovirus, nous sommes revenus aux transfections, peu efficaces dans les neurones, ce qui permet d'avoir des cellules exprimant la protéine recombinante isolées les unes des autres. Afin de minimiser les problèmes causés par la surexpression, nous avons réduit les quantités d'ADN utilisées au minimum permettant encore l'observation de la GFP, mais avant que ceci ne crée l'apparition de granules de surexpression.
Figure 5 : Oscillations des granules neuronaux de transport de l'ARN.
Des neurones de 5 DIV exprimant GFP FMRP ISO 7 furent imagés en temps réel à raison d'une image toutes les 5 secondes. Les images furent déconvoluées à l'aide du logiciel Métamorph.
Les expériences furent réalisées chez différents âges de neurones d'hippocampe de rat en culture allant de 5 jours de culture in vitro (DIV) à 15. Les neurones matures, à 15 DIV, semblent présenter peu de mouvements de GT, tandis que les plus jeunes, à 5 DIV, sont très actifs (Figure
5). Les mêmes granules purent être observés pendant qu'ils effectuaient des mouvements saltatoires
aussi bien antérogrades que rétrogrades, ou encore faire des pauses. Nous pensons cependant que les mouvements rétrogrades observés faisaient plus partie d'oscillations que de réels mouvements rétrogrades qui atteindraient éventuellement le soma (Figure 5). Ces oscillations pourraient avoir pour but d'attendre un signal afin d'entrer dans une synapse, et d'utiliser le chargement des granules
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de transport (Figure 4). Les différences observées entre les âges des neurones pourraient provenir soit de la densification du réseau d'actine qui compliquerait le passage des granules, soit d'une grande importance des granules de transport au moment de la croissance des neurones et de l'établissement des synapses, besoin qui diminuerait par la suite.
Figure 6: Les granules de transport FMRP positifs voyagent jusqu'au cône de croissance.
Des neurones de 5 DIV furent co-transfectés avec mRuby lifeact, un marqueur de l'actine filamenteuse, et un vecteur codant pour GFP FMRP ISO 7. Les neurones furent imagés en temps réel à raison d'une image dans chaque longueur d'onde toutes les 5 secondes. Ici un arrêt sur image.
Les GT voyagent jusqu'aux extrémités des neurones pour se rendre aux cônes de croissances (GT n°1 et 2, Figure 6). Nous ne savons cependant pas ce qu'il advient des GT une fois utilisés. Les GT pourraient être dégradés sur place dans des systèmes de dégradation locale (Verma et al., 2005, Frampton et al., 2012). Il est expérimentalement difficile de prouver cette théories. En effet, lorsqu'on l'image un GT visible grâce à la GFP fusionnée à FMRP et que son signal s'amenuise ou disparait (GT 3, Figure 6), plusieurs artéfacts expérimentaux pourraient intervenir tels qu'une sortie du granule de la zone de mise au point, ou encore un photoblanchiment progressif de la GFP.
Lors des observations réalisées en temps réel sur les neurones, nous avons pu constater que dans les neurones les plus dynamiques, certains granules de transport avaient tendance à se regrouper pour former des cargos. La fusion de ces granules, bien que difficile à caractériser, pût être observée clairement, comme en Figure 7 A, où différentes fusions se produisent les unes après les autres.
30 Figure 7 : Fusion des GT en cargos.
A) Des neurones de 5 DIV exprimant GFP FMRP ISO 7 furent imagés en temps réel à raison d'une image toutes les 5 secondes. Une série d'images est présentée à des temps déterminés. Ces images furent déconvoluées à l'aide du logiciel Métamorph. B) Quantification de l'intensité des GT en comparaison avec les cargos formés. On peut constater une augmentation du signal des GT après formation de cargos.
L'intensité du signal de la GFP détecté dans les granules, puis des cargos formés, furent quantifiées, et nous avons pu constater que les intensités des signaux GFP augmentent après fusion des GT (Figure 7 B). Le cargo ainsi formé conserve sa mobilité, et poursuit son trajet (19:50,
Figure 7). Les implications de la formation de tels cargos sont floues. Ceci pourrait permettre
l'acheminement conjoint de différents ARN dont le besoin pourrait être simultané à la synapse, comme ceux requis lors de potentialisations à long terme. Il n'est pour l'instant pas possible d'écarter complètement la possibilité que les observations de formation de cargos constituent un artéfact de la surexpression de FMRP. En effet, des granules dont la composition en protéines de liaison à l'ARN est forte en FMRP pourraient avoir un potentiel d'agrégation plus fort, de par les
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propriétés agrégantes de la FMRP (Sjekloca et al., 2009, Sjekloca et al., 2011). Même si tel était le cas, il est possible que la surexpression de la FMRP ne fasse qu'exacerber un mécanisme endogène préexistant. La formation des cargos pourrait ainsi être basée sur les affinités des RBP présentes dans les granules les unes pour les autres.
2.2.
Les granules neuronaux de transport de l'ARN présentent
un contenu très divers en protéines de liaison à l'ARN.
Afin d'explorer la possibilité qu'un mécanisme de formation de cargos de façon endogène, nous avons tout d'abord souhaité analyser le contenu des GT en RBP. S'il est possible en microscopie confocale à haute définition de détecter différentes RBP dans un même granule, alors ceux-ci pourraient bien être des cargos, issus de la fusion de différents granules. Pour ce faire, les protéines de la famille des FXR, à savoir FMRP, FXR1 et FXR2 furent détectées simultanément dans les mêmes neurones. On peut observer en immunofluorescence sur des neurones d'hippocampe de rat en culture primaire matures (14 DIV) que les trois FXR présentent des distributions indifférenciables les unes des autres. Si l'on regarde une vue globale du neurone, les trois FXR semblent a priori colocaliser parfaitement.
32 Des neurones de 15 DIV furent fixés par PFA 4% puis traités pour l'immunofluorescence, en appliquant chaque anticorps de manière séquentielle. L'acquisition des images fut réalisée en microscopie confocale, puis elles furent déconvoluées utilisant le logiciel Métamorph.
A plus fort grossissement, en se concentrant sur une partie isolée de neurite, et après déconvolution des images, on peut rapidement constater que les colocalisations ne sont plus parfaites. Lorsque l'on regroupe les 3 protéines sur une même image, on peut constater qu'il existe une colocalisation très diverse entre les différents signaux (Figure 8 Merge). Afin de quantifier ces colocalisations, le logiciel Métamorph fut utilisé. Par l'utilisation d'un seuil minimum d'intensité, les pixels se voyaient attribués une valeur de 0 ou 1. Chaque pixel comportant le signal de deux protéines comptait comme colocalisant. Grâce à cette méthode de quantification, il a pu être déterminé que les protéines présentaient des distributions relativement similaires, avec une grande diversité des colocalisations. Chacune des FXR peut être retrouvée avec les autres membres, de même qu'on peut les retrouver indépendamment les unes des autres à hauteur de 48, 33 et 43 % respectivement pour FMRP, FXR1 et FXR2.
Figure 9 : Diversité de la composition en RBP des granules neuronaux de transport d'ARN.
FMRP est celle des trois FXR qui a la plus forte proportion de protéine retrouvée sans ses partenaires (48%). Il fut également remarqué que l'anticorps C10 (dirigé contre FMRP) permet une détection accrue de signal dans les extrémités les plus petites des neurites par rapport aux autres anticorps utilisés. De telles arborisations dendritiques sont pointées par des flèches en Figure 8
FMRP. Il est tout à fait envisageable que ceci ne soit en fait qu'un artéfact dû à une meilleure
