Les granules neuronaux de transport de l'ARN présentent un contenu très divers en protéines de

Afin d'explorer la possibilité qu'un mécanisme de formation de cargos de façon endogène, nous avons tout d'abord souhaité analyser le contenu des GT en RBP. S'il est possible en microscopie confocale à haute définition de détecter différentes RBP dans un même granule, alors ceux-ci pourraient bien être des cargos, issus de la fusion de différents granules. Pour ce faire, les protéines de la famille des FXR, à savoir FMRP, FXR1 et FXR2 furent détectées simultanément dans les mêmes neurones. On peut observer en immunofluorescence sur des neurones d'hippocampe de rat en culture primaire matures (14 DIV) que les trois FXR présentent des distributions indifférenciables les unes des autres. Si l'on regarde une vue globale du neurone, les trois FXR semblent a priori colocaliser parfaitement.

32 Des neurones de 15 DIV furent fixés par PFA 4% puis traités pour l'immunofluorescence, en appliquant chaque anticorps de manière séquentielle. L'acquisition des images fut réalisée en microscopie confocale, puis elles furent déconvoluées utilisant le logiciel Métamorph.

A plus fort grossissement, en se concentrant sur une partie isolée de neurite, et après déconvolution des images, on peut rapidement constater que les colocalisations ne sont plus parfaites. Lorsque l'on regroupe les 3 protéines sur une même image, on peut constater qu'il existe une colocalisation très diverse entre les différents signaux (Figure 8 Merge). Afin de quantifier ces colocalisations, le logiciel Métamorph fut utilisé. Par l'utilisation d'un seuil minimum d'intensité, les pixels se voyaient attribués une valeur de 0 ou 1. Chaque pixel comportant le signal de deux protéines comptait comme colocalisant. Grâce à cette méthode de quantification, il a pu être déterminé que les protéines présentaient des distributions relativement similaires, avec une grande diversité des colocalisations. Chacune des FXR peut être retrouvée avec les autres membres, de même qu'on peut les retrouver indépendamment les unes des autres à hauteur de 48, 33 et 43 % respectivement pour FMRP, FXR1 et FXR2.

Figure 9 : Diversité de la composition en RBP des granules neuronaux de transport d'ARN.

FMRP est celle des trois FXR qui a la plus forte proportion de protéine retrouvée sans ses partenaires (48%). Il fut également remarqué que l'anticorps C10 (dirigé contre FMRP) permet une détection accrue de signal dans les extrémités les plus petites des neurites par rapport aux autres anticorps utilisés. De telles arborisations dendritiques sont pointées par des flèches en Figure 8

FMRP. Il est tout à fait envisageable que ceci ne soit en fait qu'un artéfact dû à une meilleure

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d'adressage des granules FMRP positifs par rapports à ceux contenant les autres FXR pourrait impliquer une exclusivité de certains sites à l'apport de matériel par des GT FMRP positifs. Ces sites seraient donc les plus touchés par l'absence de FMRP.

Le matériel utilisé pour traduire les ARNm dans les sites de traduction locale pourrait être recyclé. Ceci impliquerait que des granules de transport de l'ARN ne contiennent pas de protéines ribosomales, mais seulement des ARNm accompagnés de protéines de liaison à l'ARN. Nous avons donc réalisé des séries d'immunofuorescences afin d'évaluer la co-localisation de FMRP et S6, protéine de la petite sous-unité ribosomale. Bien qu'encore une fois les images à plus faibles grossissement et définition pourraient laisser penser le contraire, la colocalisation de FMRP et S6 observée ne fut que partielle Figure 10. La quantification de la colocalisation via Métamorph permit d'obtenir une approximation à 30 % de colocalisation du signal de S6 avec C10, tandis que le signal de C10 colocalise avec S6 à hauteur de 45 %. De nombreuses autres protéines de liaison prennent place dans les granules de transport de l'ARN, il n'est donc pas surprenant que les deux tiers du signal de S6 ne colocalisent pas avec FMRP. FMRP quant a elle, présente une plus forte proportion de signal colocalisant avec S6, mais laissant 55% du signal ne colocalisant pas. Ces granules contenant FMRP ne contiendraient pas de protéine ribosomale.

Figure 10: Co-immunofluoresence FMRP-S6.

Des neurones de 15 DIV furent fixés par la PFA à 4% puis traités pour l'immunofluorescence, en appliquant les anticorps C10 et anti-S6 de manière séquentielle. L'acquisition des images fut réalisée en microscopie confocale, puis elles furent déconvoluées utilisant le logiciel Métamorph. On peut voir ici les images

34 binaires utilisées pour la quantification. 30 % du signal de S6 colocalisait avec FMRP, tandis que C10 colocalisait à hauteur de 45% avec S6.

L'existence d'une telle population de granules sous-entendrait qu'il existe un mécanisme d'apport d'ARNm sans pour autant qu'ils ne soient déjà associés à l'appareil de traduction.

Il est important de souligner que la technique de quantification ne donne pas un résultat absolu, mais plutôt relatif, du fait de plusieurs faiblesses. Tout d'abord, la méthode est basée sur l'intensité des signaux, qui proviennent d'immunofluorescences. L'efficacité de la détection des épitopes par les anticorps présente certaines variations. Les anticorps n'ont pas tous des affinités aussi fortes pour leurs épitopes, ce qui influe directement sur l'intensité des signaux obtenus. La détection plus faible d'un épitope par un anticorps pourrait sous-estimer l'étendu de sa présence, et donc potentiellement sous-estimer la colocalisation du signal avec celui d'un autre anticorps efficace. La méthode analytique utilisée ici , quant à elle, ne permet pas la quantification absolue des signaux. Il faut en effet choisir un seuil minimum de signal pris en compte par Métamorph pour son calcul de colocalisation, ce qui influe directement sur les résultats obtenus. Afin de pallier ce problème si une quantification plus précise était voulue, il faudrait plutôt opter pour un calcul de corrélation des signaux, lequel permet de s'affranchir du biais que soulève le choix d'un seuil par l'expérimentateur, cependant ici le but était ici d'avoir un aperçu de la distribution des FXR dans le neurone, et non de quantifier précisément la proportion des granules contenant telle ou telle combinaison de chacune des FXR.

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