Nouveaux amphiphiles catanioniques analogues du galactosylcéramide : corrélation structure, propriétés physico-chimiques et activité anti-VIH

en vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UIVERSITE DE TOULOUSE délivré par

L’UIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER et L’UIVERSITE POLITEHICA BUCAREST

Spécialité : CHIMIE MACROMOLECULAIRE ET SUPRAMOLECULAIRE

par

Ana-Maria Cristina BOLOLOI

Ingénieur UPB – Bucarest

OUVEAUX AMPHIPHILES CATAIOIQUES

AALOGUES DU GALACTOSYLCERAMIDE :

CORRELATIO STRUCTURE, PROPRIETES

PHYSICO-CHIMIQUES ET ACTIVITE ATI-VIH

Présentée et soutenue le 19 mai 2008 devant la commission d’examen

Mme. M.J. Stébé, Directeur de recherche CNRS, Nancy Rapporteur Mlle. L.R. Stan, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Rapporteur M. B. Pucci, Professeur à la Faculté des Sciences, Avignon Examinateur M. A. Vigroux, Professeur à l’Université Paul Sabatier, Toulouse Examinateur Mme. I. Rico-Lattes, Directeur de recherche CNRS, Toulouse Directeur de thèse M. S.I. Rosca, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Directeur de thèse

Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique, UMR 5623 Université Paul Sabatier – Bât. 2R1, 118 route de 'arbonne, 31062 Toulouse Cedex 04

en vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UIVERSITE DE TOULOUSE délivré par

L’UIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER et L’UIVERSITE POLITEHICA BUCAREST

Spécialité : CHIMIE MACROMOLECULAIRE ET SUPRAMOLECULAIRE

par

Ana-Maria Cristina BOLOLOI

Ingénieur UPB – Bucarest

OUVEAUX AMPHIPHILES CATAIOIQUES

AALOGUES DU GALACTOSYLCERAMIDE :

CORRELATIO STRUCTURE, PROPRIETES

PHYSICO-CHIMIQUES ET ACTIVITE ATI-VIH

Présentée et soutenue le 19 mai 2008 devant la commission d’examen

Mme. M.J. Stébé, Directeur de recherche CNRS, Nancy Rapporteur Mlle. L.R. Stan, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Rapporteur M. B. Pucci, Professeur à la Faculté des Sciences, Avignon Examinateur M. A. Vigroux, Professeur à l’Université Paul Sabatier, Toulouse Examinateur Mme. I. Rico-Lattes, Directeur de recherche CNRS, Toulouse Directeur de thèse M. S.I. Rosca, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Directeur de thèse

Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique, UMR 5623 Université Paul Sabatier – Bât. 2R1, 118 route de 'arbonne, 31062 Toulouse Cedex 04

R

EMERCIEMENTS

Ces travaux de thèse ont été réalisés au Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique de l’Université Paul Sabatier à Toulouse, dirigé successivement par Mme Isabelle Rico-Lattes puis par Mme Monique Mauzac. Je tiens à les remercier toutes deux pour leur accueil au sein de cette grande famille des IMRCP et pour leur gentillesse.

Je tiens à remercier encore une fois Mme Isabelle Rico-Lattes, ma directrice de thèse, de m’avoir donné la possibilité de réaliser cette étude dans les meilleures conditions et de m’avoir suivie tout au long de ce travail. Je vous remercie pour votre rigueur scientifique, votre dynamisme et vos qualités humaines qui m’ont permis d’évoluer aussi bien sur le plan professionnel que personnel.

Je voudrais également remercier M. Sorin Ioan Rosca, mon deuxième directeur de thèse, de m’avoir permis de découvrir la beauté et quelques secrets de la chimie organique, de m’avoir dirigé vers les IMRCP et d’avoir accepté cette thèse en cotutelle. Je vous remercie également pour votre très grande pédagogie qui m’a beaucoup apportée.

Mes sincères remerciements s’adressent à M. Armand Lattes qui m’a accueillie très chaleureusement dans l’univers des IMRCP dont il est le créateur.

Je suis très reconnaissante à Muriel Blanzat et Emile Perez qui ont encadré quotidiennement ces travaux de recherche avec énormément de conseils, de motivation et de force de travail. Merci également pour votre bonne humeur, votre disponibilité et votre gentillesse.

Je voudrais remercier Mme Marie-José Stébé (Directeur de recherche CNRS à Nancy) et Mlle Raluca Stan (Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest) d’avoir accepté de juger ce travail en tant que rapporteurs.

Mes remerciements s’adressent également à M. Alain Vigroux (Professeur à l’Université Paul Sabatier à Toulouse) qui a accepté de présider le jury de cette thèse et à M. Bernard Pucci (Professeur à la Faculté des Sciences à Avignon) pour sa participation en tant qu’examinateur.

Je suis également très reconnaissante à M. Helmuth Möhwald et à M. Gerald Brezesinski de l’Institut Max-Planck à Golm, en Allemagne, de m’avoir accueillie dans leur laboratoire pendant mon stage Marie Curie.

Mes sincères remerciements s’adressent à Mme Anne-Marie Aubertin et à Géraldine Albrecht qui ont réalisé les expériences d’évaluation d’activité antivirale et qui m’ont accueillie très chaleureusement dans leur laboratoire de l’Institut de Virologie INSERM à Strasbourg.

Je suis très reconnaissante à Cédric-Olivier Turrin et à Grégory Spataro de l’équipe de M. Jean-Pierre Majoral (Laboratoire de Chimie de Coordination, Toulouse) pour la synthèse des dendrimères et leur si plaisante collaboration.

Je remercie encore une fois très chaleureusement M. Bernard Pucci et son équipe de l’Université d’Avignon (Laboratoire de Chimie Bioorganique et des Systemes Moléculaires Vectoriels) pour la synthèse des acides mixtes fluorés/hydrogénés et leur collaboration.

Je souhaite également remercier le Dr. Brigitte Tiersch et le Prof. Dr. Joachim Kötz de l’Université de Potsdam, Allemagne, pour leur collaboration en cryofracture et l’équipe de microscopistes, tout particulièrement, Vincent Collière et Lucien Datas du Service Commun de Microscopie Electronique de l’Université Paul Sabatier (TEMSCAN).

Je voudrais remercier très chaleureusement toute l’équipe : Stéphanie Cassel, Sophie Franceschi, Elodie, Romain, Sabrina, Roland, Roberto, Sergii, Lyuba, Plamen, Hugo, Alex, Cécile, Denis …Merci pour la bonne ambiance que vous avez su créer et pour les moments très agréables passés ensemble.

Je remercie également toutes les personnes des IMRCP pour leur amabilité et leur gentillesse. Un grand merci s’adresse particulièrement à : Lacramioara, Menana, Florence, Javier, Kamil, Waël, Yann, Florence Frechou, Fernanda, Arielle, Jean-Christophe, Sandrine, Charles Louis, Christian...

Un grand merci s’adresse aux amis de tarot : Muriel, Richard, Marlene, Marie, Elisabeth, Vincent, Clément, Kamal, Cosmin, Andreea et Raluca. Merci infiniment pour les moments magnifiques passés ensemble.

Je tiens également à remercier l’équipe de Bucarest : Mme Sanziana Rosca, Cristinel, Raluca, Dienut, Manuc, Andrada, Nico… Merci pour les moments inoubliables.

Diana et Vincent, Raluca et Bassam, Ana et Florin merci de tout cœur de votre amitié, de votre soutien et de votre compréhension.

Enfin, je tiens à remercier mes parents et ma famille pour tout ce que vous m’avez appris et offert.

Alin, merci de tout cœur d’avoir été toujours là pour me soutenir et me redonner la confiance et la force d’aller plus loin. Cette réussite nous appartient à tous les deux. Merci !

L

ISTE DES ABREVIATIONS

AD : Acide Désoxyribonucléique AR : Acide Ribonucléique

ARm : Acide Ribonucléique messager ARV : AIDS Related Virus

AZT : 3’-azido-2’-déoxytimidine

CA : Capside

CAC : Concentration d’Agrégation Critique CC50 : Concentration Cytotoxique à 50%

CCR : Récepteur de chimiokines non spécifiques (CC)

CD4 : Classe de Différenciation 4 (Récepteur cellulaire du VIH) CD4+ : Cellules exprimant le CD4

CD4- : Cellules n’exprimant pas le CD4

CEM-SS : Lignée cellulaire lymphocytaire; SS - "syncytial sensitivity" CXCR : Récepteur de chimiokines spécifiques à une seule protéine (CXC) DC3 : Dendrimère comportant des chaînes alkyles en C3

DC10 : Dendrimère comportant des chaînes alkyles en C10

FDA: American Food and Drugs Administration F8 : Acide CF3(CF2)7COOH

GalCer : GalactosylCéramide

GalCer +: Cellules exprimant le GalactosylCéramide

gp : Glycoprotéine

HAART: Highly Active Antiretroviral Treatment HTLV-III: Human T-Cell Leukemia Virus III H2F6H4 : Acide CH3(CH2)3(CF2)6(CH2)2COOH

H4F8 : Acide CF3(CF2)7(CH2)4COOH

IC50 : Concentration Inhibitrice à 50%

IP : Inhibiteurs de la Protéase

IR : Infrarouge

IRRAS : Spectroscopie Infrarouge de Réflexion-Absorption

ITI : Inhibiteurs Non-Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse ItTI : Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse IT : Indice Thérapeutique

LAV : Lymphadenopathy Associated Virus L12 : N-dodécylamino-1-déoxylactitol

L16 : N-hexadécylamino-1-déoxylactitol

L12DC3 : Association catanionique entre le L12 et le dendrimère DC3

L16DC3 : Association catanionique entre le L16 et le dendrimère DC3

L12DC10 : Association catanionique entre le L12 et le dendrimère DC10

L16DC10 : Association catanionique entre le L16 et le dendrimère DC10

L16H13 : Association catanionique entre le L16 et l’acide myristique, CH3(CH2)12COOH

L16H4F8 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CF3(CF2)7(CH2)4COOH

L16H2F6H4 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CH3(CH2)3(CF2)6(CH2)2COOH

L16F8 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CF3(CF2)7COOH

MA : Matrice virale

C : Nucléocapside

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

OUSIDA : Programme Commun des Nations Unies Sur le VIH/SIDA p17 : Protéines de la matrice

PR : Protéase

RM : Résonance magnétique nucléaire

RCI50 : Concentration Inhibitrice Normalisée

SIDA : Syndrome d’Immunodéficience Acquise T4

(T CD4+) : Lymphocytes exprimant le récepteur CD4 TEM : Microscopie Electronique à Transmission TI : Transcriptase Inverse

TS : Tension Superficielle V3 : Région variable 3

VIH : Virus d’Immunodéficience Humaine VIS : Virus de l’Immunodéficience du Singe

S

OMMAIRE

I

TRODUCTIO

G

E ERALE

... 1

C

HAPITRE

I :

M

ISE AU POI T BIBLIOGRAPHIQUE

... 7

I

I

TRODUCTIO

... 11

II

G

E ERALITES SUR LE

SIDA... 12

III

L

E

V

IRUS D

’I

MMU ODEFICIE CE

H

UMAI E

(VIH) ... 15

III.1 Généralités sur le VIH... 15

III.2 La structure du VIH-1 ... 16

III.3 Cycle de réplication du VIH... 19

IV

L

A CHIMIOTHERAPIE DU

VIH-1 ... 22

IV.1 Inhibiteurs de l’entrée virale... 24

IV.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation... 24

IV.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4 ... 25

IV.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120 ... 26

IV.1.1.3 Inhibiteurs des corécepteurs du VIH-1 ... 34

IV.1.1.3.1 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5... 34

IV.1.1.3.2 Inhibiteurs des corécepteurs CXCR4 ... 36

IV.1.1.3.3 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5 et CXCR4... 38

IV.1.2 Les inhibiteurs de fusion ... 38

IV.1.2.1 Inhibiteurs ciblant la région NHR de la gp 41... 39

IV.1.2.2 Inhibiteurs ciblant la région CHR de la gp 41. ... 40

IV.1.3 Inhibiteurs de la décapsidation (de la nucléocapside virale) ... 41

IV.2 Inhibiteurs de la transcriptase inverse... 42

IV.2.1 Structure et activité de la transcriptase inverse ... 42

IV.2.2 Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse... 42

IV.2.3 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse. ... 45

IV.2.4 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse ... 45

IV.3 Inhibiteurs de l’intégrase ... 47

IV.4 Inhibiteurs de transcription (transactivation)... 50

IV.5 Inhibiteurs de la protéase... 52

IV.6 Polythérapies... 54

IV.7 Le développement des systèmes de vectorisation pour la thérapie anti-VIH... 56

IV.8 Inhibiteurs de l’étape de latence du VIH ... 57

IV.9 Le stade actuel du développement des vaccins anti-VIH ... 58

V

C

O CLUSIO S

... 59

C

HAPITRE

II :

S

Y THESE

,

PROPRIETES BIOLOGIQUES ET PHYSICO

-CHIMIQUES DE OUVEAUX LEURRES DU

VIH ... 69

I

I

TRODUCTIO

... 73

II

I

TERET DES DERIVES CATA IO IQUES DE DRITIQUES A ALOGUES DU

G

AL

C

ER

... 74

III

S

Y THESE DE OUVEAUX TE SIOACTIFS CATA IO IQUES DE DRITIQUES A ALOGUES DU

G

AL

C

ER

... 79

III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer... 79

III.2 Analyse structurale par résonance magnétique nucléaire ... 81

IV

E

TUDE DE L

’

ASSOCIATIO DES DE DRIMERES CATA IO IQUES A L

’

I TERFACE EAU

/

AIR

... 83

IV.1 La technique de la balance de Langmuir ... 83

IV.2 Etude des monocouches d’amphiphiles catanioniques dendritiques par la technique de la balance de Langmuir ... 85

V

P

ROPRIETES BIOLOGIQUES DE OUVEAUX CATA IO IQUES DE DRITIQUES A ALOGUES DU

G

AL

C

ER

... 89

V.1 Caractéristiques biologiques... 89

V.1.1 Paramètres biologiques ... 89

V.1.2 Lignées cellulaires et souches virales... 90

V.1.3 Présentation de la méthode utilisée ... 90

V.2 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des dendrimères catanioniques analogues du GalCer... 91

VI

E

TUDE DE L

’

I TERACTIO ET DE L

’

I CORPORATIO DES DE DRIMERES CATA IO IQUES VIS

-

A

-

VIS D

’

U MODELE MEMBRA AIRE

... 96

VII

P

ROPRIETES PHYSICO

-

CHIMIQUES DES CATA IO IQUES DE DRITIQUES A ALOGUES DU

G

AL

C

ER

... 107

VII.1 Etude des propriétés tensioactives ... 107

VII.2 Etude de la distribution de taille des agrégats... 111

VII.3 Etude de la morphologie des agrégats... 113

VIII

C

O CLUSIO S ET PERSPECTIVES

... 120

IX

B

IBLIOGRAPHIE

... 123

C

HAPITRE

III :

M

ISE AU POI T DE VECTEURS CATA IO IQUES HYBRIDES A ALOGUES DU

G

AL

C

ER

... 125

II

M

ISE AU POI T BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES TE SIOACTIFS MIXTES

FLUORES

/

HYDROGE ES

... 131

II.1 Caractéristiques particulières des chaînes alkyles fluorocarbonées ... 131

II.2 Composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés de sucres132 II.3 Composés catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés ... 135

III

M

ISE AU POI T DE VECTEURS CATA IO IQUES HYBRIDES A ALOGUES DU

G

AL

C

ER

... 136

III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes actifs ... 136

III.2 Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer de nature hybride fluorocarboné / hydrocarboné ... 138

III.3 Analyse structurale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer... 142

IV

P

ROPRIETES PHYSICO

-

CHIMIQUES DES COMPOSES CATA IO IQUES HYBRIDES FLUORES

/

HYDROGE ES

... 145

IV.1 Etude des propriétés tensioactives ... 145

IV.2 Etude de distribution de taille des agrégats... 148

IV.3 Etude de la morphologie des agrégats... 151

V

E

TUDE DE L

’

I TERACTIO E TRE LES COMPOSES CATA IO IQUES ET DES MO OCOUCHES DE PHOSPHOLIPIDES

... 157

VI

E

VALUATIO DES PROPRIETES DE VECTORISATIO SUR CELLULES I FECTEES PAR LE

VIH... 162

VI.1 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des associations catanioniques hybrides analogues du GalCer ... 162

VI.2 Evaluation des propriétés physico-chimiques dans les conditions de vectorisation ... 164

VI.3 Formulations de l’AZT avec les tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8... 171

VII

C

O CLUSIO

... 174

VIII

B

IBLIOGRAPHIE

... 176

C

O CLUSIO GE ERALE

... 179

P

ARTIE EXPERIME TALE

... 185

I

P

RODUITS COMMERCIAUX UTILISES

... 189

I.1 Réactifs ... 189

I.2 Solvants ... 189

II

T

ECH IQUES DE CARACTERISATIO STRUCTURALE

... 190

II.3 Spectrométrie de masse ... 190

II.4 Analyses centésimales ... 191

III

S

Y THESE

... 191

III.1 ;-dodécylamino-1-désoxylactitol - L12... 191

III.2 ;-hexadécylamino-1-désoxylactitol - L16... 193

III.3 Dendrimères catanioniques analogues du GalCer ... 195

III.3.1 Mélanges catanioniques comportant le N-hexadécylamino-1-désoxylactitol : L16DC3 et L16DC10... 195

Mélange catanionique L16DC3... 195

Mélange catanionique L16DC10... 196

III.3.2 Mélanges catanioniques comportant le N-dodécylamino-1-désoxylactitol : L12DC3 et L12DC10... 197

Mélange catanionique L12DC3... 197

Mélange catanionique L12DC10... 198

III.4 Associations catanioniques bicaténaires analogues du GalCer ... 199

III.4.1 Association catanionique L16H4F8... 199

III.4.2 Association catanionique L16H2F6H4... 200

III.4.3 Association catanionique L16F8... 201

III.4.4 Association catanionique L16H13... 202

IV

T

ECH IQUES DE CARACTERISATIO PHYSICO

-

CHIMIQUE

... 203

IV.1 Préparation des solutions de catanioniques ... 203

IV.2 Mesure de tension de surface ... 203

IV.3 Evaluation de la taille et de la distribution de taille des agrégats - Diffusion quasi-élastique de la lumière (DLS)... 204

IV.4 Caractérisation des agrégats ... 205

IV.4.1 Microscopie électronique par transmission... 205

IV.4.2 Cryofracture ... 206

IV.5 Isothermes de compression ... 209

IV.6 Spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) ... 210

V

T

ESTS BIOLOGIQUES

... 212

V.1 Conditions expérimentales d’infection des cellules CEM-SS ... 212

V.2 Evaluation de l’activité anti – VIH : incorporation d’uridine tritiée ([3H]- uridine) ... 213

V.3 Evaluation de la cytotoxicité : test MTT ... 213

I

NTRODUCTION

G

ENERALE

L’origine exacte du Virus d’Immunodéficience Humaine (VIH), le virus responsable du Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA) demeure jusqu’à nos jours inconnue. Une première évidence de l’infection d’un être humain par ce virus, qui sera dénommé 27 ans plus tard VIH, provient d’un sérum prélevé en 1959 en Afrique. Ce n’est qu’en 1981 que l’épidémie de SIDA commence à se manifester comme une maladie inconnue dans les pays développés et qu’en 1983 que les scientifiques identifient l’action destructrice du VIH sur le système immunitaire humain comme cause de l’apparition du SIDA. Depuis, le nombre de personnes infectées par le VIH dans le monde et décédées suite au SIDA est en croissance continue. Encore aujourd’hui, ce qui semble être le centre épidémiologique, l’Afrique subsaharienne, reste la région la plus gravement touchée et le SIDA y est toujours la principale cause de mortalité.

Les importants progrès réalisés dans le domaine médical ont abouti à la mise au point de régimes polythérapeutiques anti-VIH qui sont capables d’améliorer et de prolonger la vie des personnes infectées par le VIH. L’efficacité de ces régimes polythérapeutiques est due à l’utilisation combinée d’au moins trois principes actifs agissant à différentes étapes du cycle de réplication du VIH : l’entrée virale, la transcription et la maturation du VIH.

De nombreux inhibiteurs de transcription et de maturation du VIH ont été déjà acceptés pour l’utilisation clinique. Ceux-ci agissent après l’infection, au sein de la cellule, afin de stopper la multiplication virale et la propagation de l’infection. Le nombre important des composés de cette classe est justifié par une recherche continue des composés de plus en plus actifs mais également par la nécessité de leur continue variation au sein des polythérapies afin d’éviter les effets secondaires et/ou une résistance virale à un certain produit.

En ce qui concerne les inhibiteurs de l’entrée virale, seulement deux principes actifs ont été agréés pour une utilisation clinique: l’enfuvirtide et le maraviroc. Malgré le rôle crucial de ces inhibiteurs des étapes précoces de l’infection, qui bloquent la reconnaissance et l’interaction entre le virus et la cellule, empêchant la pénétration du VIH et la contamination cellulaire, ils présentent des inconvénients non-négligeables tels: une faible biodisponibilité, un prix élevé de fabrication et des effets secondaires.

montré très prometteur. De par leur capacité à interagir et à bloquer les glycoprotéines virales gp120, par un effet de concurrence avec les récepteurs cellulaires principaux (CD4) du VIH, les analogues du GalCer empêchent le virus de pénétrer et d’infecter les cellules humaines. De ce fait, ces composés fonctionnent comme leurres du VIH.

Connaissant la nécessité d’obtention d’antirétroviraux à faible coût, lorsque la plupart des personnes infectées par le VIH vit dans des pays pauvres, des travaux précédemment réalisés au laboratoire des IMRCP ont eu comme but de rendre les analogues du GalCer économiquement attractifs. Ainsi, tout en conservant les impératifs structuraux indispensables pour mimer le récepteur cellulaire, une nouvelle famille originale d’inhibiteurs de l’entrée virale a été mise au point: les tensioactifs catanioniques analogues du galactosylcéramide. Issus d’une réaction acido-basique entre les deux composés constitutifs, ces produits se sont montrés très prometteurs en se distinguant par de bonnes activités antivirales, une méthode simple de synthèse et à faible coût.

Ainsi, en nous appuyant sur l’expérience antérieure de notre laboratoire dans ce domaine, l’étude actuelle aura pour but l’amélioration de l’activité antivirale de nouvelles associations catanioniques du GalCer. Deux approches différentes seront envisagées.

Dans un premier temps, nous mettrons à profit l’effet de multiplicité de sites actifs afin d’obtenir une affinité finale leurre multisite - virus supérieure à la somme des interactions individuelles monosite - virus. Afin d’améliorer la marge de sécurité de ces principes actifs, l’étude se concentrera également sur la diminution de la toxicité cellulaire de ces nouveaux analogues du GalCer multivalents. Dans ce sens, une nouvelle famille des composés catanioniques dendritiques sera synthétisée et étudiée.

Ainsi, la stratégie envisagée pour l’amélioration de l’activité antivirale sera celle d’une multiplication de sites de reconnaissances. Par ailleurs, la stratégie de diminuer la toxicité cellulaire impliquera des modifications structurales au sein de l’association catanionique afin de renforcer l’effet hydrophobe entre les éléments constitutifs pour empêcher une éventuelle dissociation de l’entité catanionique, dissociation supposée être responsable de la toxicité cellulaire de ce type de composés.

Concernant la synthèse de ces nouveaux analogues catanioniques du GalCer, certains facteurs structuraux indispensables pour l’affinité avec le virus seront conservés, à savoir, un motif galactose, une hydrophobie adéquate, une flexibilité des chaînes alkyles et certaines configurations stéréochimiques. Ainsi, la simplicité et la souplesse de la méthode de synthèse

utilisée nous permettront d’obtenir des amphiphiles dendritiques catanioniques pouvant se comporter comme des "clusters" de sites actifs, par simple association acido-basique des N-alkylamino-1-déoxylactitols (composés comportant les sites actifs) avec des composés acides dendritiques comportant des chaînes alkyles. Le squelette dendritique aura pour rôle de supporter les multiples sites actifs et, quant aux chaînes alkyles, elles participeront à la consolidation de l’entité catanionique ainsi qu’au renforcement de l’affinité avec le VIH.

Une étude des interactions entre ces nouveaux composés vis-à-vis des modèles membranaires ainsi qu’une étude physico-chimique détaillée nous permettra d’établir une corrélation entre les propriétés biologiques (activité antivirale et respectivement toxicité cellulaire) et les caractéristiques structurales de ces associations catanioniques dendritiques. Ainsi, nous verrons de quelle manière des éléments tels que la structure, l’hydrophobie, la conformation, et l’organisation supramoléculaire dans une solution aqueuse sont déterminants pour l’activité et la cytotoxicité de ces produits. L’analyse du mode d’organisation de chaque produit dans toute la gamme de concentrations utilisées en biologie cellulaire se montrera également d’une grande importance.

Dans un deuxième temps, nous allons profiter de la présence de la glycoprotéine gp120 autant à la surface du virus qu’à la surface des cellules infectées par le VIH afin d’augmenter l’activité antivirale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer par une stratégie de multiciblage. Cette fois-ci une famille hybride d’analogues catanioniques du GalCer sera synthétisée et étudiée à la fois pour la capacité d’agir à l’état non agrégé en tant que leurre du VIH, ainsi qu’en tant que système de délivrance spécifique de principes actifs anti-VIH, à l’état agrégé.

Nous verrons que de par leur design, cette nouvelle série d’analogues catanioniques mixtes du GalCer réunit des éléments bien adaptés pour la vectorisation de principes actifs anti-VIH. Ainsi, leur nature catanionique permet une auto-association en milieu aqueux avec la formation spontanée d’agrégats vésiculaires. De plus, la présence au sein des associations catanioniques d’un segment fluoré, plus hydrophobe, a été prévue pour améliorer la stabilité des vésicules au cours du temps. Aussi, la multiplicité des sites de reconnaissance existant à la surface des vésicules, engendrant une augmentation de la probabilité d’interaction avec le virus, pourrait assurer une bonne reconnaissance et spécificité pour la glycoprotéine gp120. Ainsi, des vésicules stables, formées spontanément par ces composés hybrides dans un milieu aqueux pourraient agir en tant que transporteurs spécifiques, guidant les principes actifs

anti-envisageable car, comme nous l’avons déjà mentionné, les analogues du GalCer ont une forte affinité pour les glycoprotéines virales gp120 qui bourgeonnent à la surface membranaire des cellules infectées par le VIH.

Concernant leur synthèse, des variations structurales seront réalisées au niveau de la longueur et de la position d’un segment fluoré au sein de l’association catanionique, tout en conservant les mêmes éléments structuraux antérieurement décrits pour maintenir l’affinité avec le virus. Ainsi, la structure du N-alkylamino-1-déoxylactitol sera conservée, car c’est cette structure qui permettra la reconnaissance avec la gp120, tandis que les modifications structurales seront réalisées seulement au niveau de l’acide gras fluoré, le deuxième composant de l’association catanionique.

Une étude des propriétés physico-chimiques et biologiques in vitro de ces nouveaux assemblages catanioniques nous permettra d’identifier le composé le plus adapté à l’application envisagée soit, la vectorisation de principes actifs anti-VIH.

Une dernière partie décrira les modes opératoires, les techniques d’analyse employées ainsi que les caractéristiques des produits préparés au cours de ces travaux.

Chapitre I

I

I

TRODUCTIO

... 11

II

G

EERALITES SUR LE

SIDA... 12

III

L

E

V

IRUS D

’I

MMUODEFICIECE

H

UMAIE

(VIH) ... 15

III.1 Généralités sur le VIH... 15 III.2 La structure du VIH-1 ... 16 III.3 Cycle de réplication du VIH... 19

IV

L

A CHIMIOTHERAPIE DU

VIH-1 ... 22

IV.1 Inhibiteurs de l’entrée virale... 24

IV.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation... 24 IV.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4 ... 25 IV.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120 ... 26 IV.1.1.3 Inhibiteurs des corécepteurs du VIH-1 ... 34 IV.1.1.3.1 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5... 34 IV.1.1.3.2 Inhibiteurs des corécepteurs CXCR4 ... 36 IV.1.1.3.3 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5 et CXCR4... 38 IV.1.2 Les inhibiteurs de fusion ... 38 IV.1.2.1 Inhibiteurs ciblant la région NHR de la gp 41... 39 IV.1.2.2 Inhibiteurs ciblant la région CHR de la gp 41. ... 40 IV.1.3 Inhibiteurs de la décapsidation (de la nucléocapside virale) ... 41

IV.2 Inhibiteurs de la transcriptase inverse... 42

IV.2.1 Structure et activité de la transcriptase inverse ... 42 IV.2.2 Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse... 42 IV.2.3 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse. ... 45 IV.2.4 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse ... 45

IV.3 Inhibiteurs de l’intégrase ... 47 IV.4 Inhibiteurs de transcription (transactivation)... 50 IV.5 Inhibiteurs de la protéase... 52 IV.6 Polythérapies... 54 IV.7 Le développement des systèmes de vectorisation pour la thérapie anti-VIH... 56 IV.8 Inhibiteurs de l’étape de latence du VIH ... 57 IV.9 Le stade actuel du développement des vaccins anti-VIH ... 58

V

C

OCLUSIOS

... 59

I

NTRODUCTION

De nos jours, le Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA) provoqué par le Virus d’Immunodéficience Humaine (VIH) est considéré comme la principale cause de mortalité dans l’Afrique subsaharienne et la quatrième pathologie mortelle dans le monde. On estime à 14 000 le nombre de personnes infectées par le VIH chaque jour (soit 5 millions de personnes par an), dont plus de 95% d’entres elles vivent dans des régions sous-développées du monde. La mise au point d'un remède contre le SIDA sûr, efficace, facile à administrer et peu coûteux est donc une urgence.

Ce premier chapitre présentera une mise au point bibliographique sur le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) : l’impact de sa propagation dans le monde, sa structure, son mécanisme de multiplication et les moyens de lutte développés ces 25 dernières années contre ce terrible virus.

En suivant les principales étapes du cycle de réplication du VIH, il sera fait une présentation des diverses stratégies thérapeutiques. Parmi cet "arsenal" anti-VIH riche d’une très vaste diversité de produits, on va retrouver des composés déjà agréés en chimiothérapie et d’autres, très prometteurs qui se trouvent encore dans différentes phases d’essais cliniques.

D’une manière générale, cette partie bibliographique veut offrir une image concise des avancées réalisées dans ce domaine afin de mieux situer l’apport de nos travaux dans la lutte contre le VIH.

I G

ENERALITES SUR LE

SIDA

Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) est devenu l’une des épidémies les plus dévastatrices de l’histoire. Depuis que les scientifiques ont identifié en 1981 le virus VIH (Virus d’Immunodéficience Humaine), cette épidémie a fait plus de 25 millions de victimes humaines.

Le SIDA s’installe dans l’organisme humain suite à l’infection par le VIH. Ce virus attaque les cellules T

CD4+

(les lymphocytes T4 et les macrophages) du système immunitaire humain et réussit à l’affaiblir en quelques années, le rendant inefficace contre des agents pathogènes externes comme les bactéries, les champignons ou d’autres virus .

Le VIH faisant partie de la famille des Lentivirus (lentus = lent), les symptômes du SIDA n'apparaissent qu'après une assez longue période d'incubation. Ainsi, l’évolution typique de l’infection par le VIH peut être divisée en trois phases : la primo-infection, la phase de latence clinique et la phase SIDA qui précède la mort (Figure 1).

Figure 1: Evolution typique de l’infection par le VIH [1].

La première étape s’installe environ 3 – 6 semaines après l’infection et se caractérise par une importante et rapide augmentation de la charge virale dans le sang, suite à la multiplication massive du VIH et à la mort de nombreuses cellules T CD4+. Souvent, les symptômes cliniques caractéristiques comme : fièvre, diarrhée, maux de tête, éruptions cutanées et léthargie peuvent induire en erreur vers d’autres maladies.

La phase de latence clinique peut durer, en fonction des individus, entre 8 et 12 ans et se définit par une absence de symptômes cliniques, une fausse période de bonne santé

résultant de la lutte soutenue du système immunitaire contre le VIH qui n’arrête pas de se multiplier. Il semble donc que pour un temps, le système immunitaire réussisse à contrôler la réplication virale. Durant cette période, un grand nombre de virus et de cellules infectées sont produits et détruits chaque jour afin de maintenir un équilibre entre la réplication virale et la réponse immunitaire. Des études ont montré que la demi-vie du virus dans le sang est d’environ 6 heures tandis que pour les cellules infectées, la demi-vie est de seulement 1,5 heures [2, 3].

Après quelques années, l’organisme ne peut plus combattre le VIH en raison d’une chute prononcée du nombre de lymphocytes T CD4+, la concentration en particules virales augmente alors rapidement, par exemple à la suite d’une maladie infectieuse et le SIDA s’installe [4, 5].

Malgré un accès récemment amélioré aux traitements antirétroviraux et à la prise en charge de la maladie dans de nombreuses régions du monde, en 2006 le nombre total de personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) a atteint son plus haut niveau, soit environ 39,5 millions de personnes. L’Afrique subsaharienne reste la plus touchée avec plus de 24 millions de personnes infectées, et les femmes de cette région géographique vivant avec le VIH représentant 77% du nombre total de femmes atteintes par le VIH dans le monde (Figure 2).

Durant cette même année 2006, plus de 4 millions de personnes ont contracté la maladie et l’épidémie de SIDA a fait plus de 3 millions de décès, dont plus d’un demi-million d’enfants. Prenant en considération l’explosion de l’infection dans l’Asie du sud-est, plus particulièrement en Chine, en Indonésie et au Vietnam, l’ONUSIDA (Le Programme Commun des Nations Unies Sur le VIH/SIDA) considère que l’épidémie est toujours dans son stade préliminaire et que sans un traitement efficace le nombre de victimes atteintes par ce virus va continuer d’augmenter d’une manière inquiétante [6].

La propagation du virus d’une personne à une autre se fait par plusieurs voies : plus fréquemment lors des relations sexuelles mais aussi par le contact direct avec du sang contaminé, et par transmission mère – enfant lors de l’accouchement ou de l’allaitement [7]. Aucun être humain n’est a l’abri de ce virus qui ne connait pas de limite d’age, de différences raciales ou sociales.

Les enjeux sont immenses. A l’échelle mondiale, moins d’une personne sur cinq exposée au risque d’infection par le VIH peut accéder à des services de prévention de base. Parmi les personnes vivant avec le VIH, une sur dix seulement a fait un test et sait qu’elle est infectée.

En dépit de remarquables progrès réalisés en chimiothérapie sur l’efficacité des traitements modernes qui peuvent diminuer la charge virale au-dessous des limites de détection du VIH, il subsiste toujours des problèmes, comme la résistance du virus aux principes actifs, qui entraîne un échec thérapeutique. La réalité est encore plus désolante dans les pays du tiers monde ou la thérapie anti-SIDA n’est pas accessible dans la plus grande majorité des cas. Tous ces éléments sont autant de signaux d’alarmes qui mettent en évidence le besoin urgent de développer de nouveaux principes actifs anti-VIH bons marchés, des méthodes de prévention et des vaccins efficaces.

II L

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V

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MMUNODEFICIENCE

H

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(VIH)

II.1 Généralités sur le VIH

Même si les premiers indices sur le VIH ont été consignés dans deux rapports du Centre de Contrôle des Maladies d'Atlanta, USA, en 1981 indiquant plusieurs jeunes homosexuels atteints d’une maladie inconnue, le virus a réellement été décrit pour la première fois en 1983, par les groupes français du Professeur Montagnier et du Docteur Barré-Sinoussi de l’Institut Pasteur à Paris [8]. Ils ont dénommé le virus LAV (Lymphadenopathy Associated Virus), et C. Dauguet, leur collaborateur, a été le premier à visualiser ce virus à l’aide de son microscope électronique.

En 1984, les équipes du Professeur Gallo et du Professeur Levy à San Francisco isolent indépendamment le virus du SIDA qu’ils appellent HTLV-III (Human T-Cell Leukemia Virus III) et respectivement ARV (AIDS Related Virus) [9, 10].

Ensuite, la situation dans la littérature spécialisée est devenue assez rapidement confuse en raison de cette multiplicité de noms (LAV, HTLV-III et ARV) utilisés pour désigner le même virus. Cette situation a été résolue en 1986, par l’Organisation Mondiale de Santé qui prend la décision finale d’appeler le virus responsable du SIDA le Virus d’Immunodéficience Humaine (VIH).

Actuellement dans le monde il y a deux espèces virales du VIH appelées VIH-1 et VIH-2. Le VIH-2, isolé par le groupe du Professeur Montagnier en 1986 n’a que 40% d’homologie avec le VIH-1, les différences étant situées surtout au niveau de leur enveloppe externe. De plus, le VIH-2 a la particularité d’être localisé dans la partie Ouest de l’Afrique, d’avoir un moindre potentiel infectieux que le VIH-1, d’évoluer plus lentement vers le SIDA et d’être plus proche du virus de l’immunodéficience du singe (VIS) que le VIH-1 [11].

Les souches de type VIH-1 ont été classées en deux grands groupes: M, et O. Le groupe M étant divisé en 9 sous-types qui peuvent être corrélés à des zones géographiques: A, B, C, D, E, F, G, H, et NT (Figure 3). La majorité des mutations créant ces différences se trouvent dans la région C2-V3 de la glycoprotéine de l’enveloppe virale et dans les protéines de la capside.

Figure 3: Répartition géographique mondiale des sous-types du VIH-1 (« Le Monde » 21 mai 2003)

Cette extraordinaire variabilité du VIH-1 est le résultat du fait que la transcriptase inverse (TI) produit une erreur tous les 2000-5000 nucléotides polymérisés [12], auquel s’ajoute le taux extrêmement élevé de réplication du virus qui atteint environ 1010 de particules virales produites chaque jour [13, 14].

Etant la source de cette variabilité virale inquiétante et impossible à contrôler, la transcriptase inverse (TI) est devenue une des principales cibles thérapeutiques anti-VIH.

II.2 La structure du VIH-1

L’étude de la structure du VIH a été une des premières préoccupations des scientifiques. Comprendre la complexité structurale du VIH et sa pathogenèse a été l’étape primordiale qui a permis d’envisager et de développer des stratégies thérapeutiques efficaces. Gelderblom et ses collaborateurs ont été les premiers à établir par microscopie électronique la morphologie et la structure du VIH-1 [15].

Les virus matures du VIH-1 ont une morphologie sphérique d’un diamètre d’environ 100-120 nm et sont protégés par une membrane d’origine cellulaire formée d’une bicouche lipidique transpercée de "spicules" composées des glycoprotéines globulaires de surface gp 120 et des glycoprotéines transmembranaires gp 41 (Figure 4). Initialement, le nombre de

"spicules" a été approximé à 72 par analogie avec le VIS (le Virus de l' Immunodéficience du Singe) [16] mais des résultats récents ont montré que le VIH dispose d’approximativement 14 ± 7 "spicules" Env par virion. [17]

Figure 4: Structure du VIH

(Source : Laboratoire du Pr. Dominique Dormont (CEA, Orsay)) Détail: Structure de la glycoprotéine d’enveloppe du VIH- 1 [18]

La protéine gp 41, insérée dans la membrane phospholipidique virale est liée de façon non-covalente à la glycoprotéine gp 120 extérieure, principalement par l’association des deux régions hydrophobes à l’extrémité carboxy-terminale (C-terminale - CHR) et amino-terminale (N-terminale - NHR) (Figure 4 détail) [19, 20].

Cette glycoprotéine d’enveloppe est une des principales cibles pour les stratégies thérapeutiques, car la gp 120 est responsable des processus de reconnaissance, co-reconnaissance et d’ancrage du virus dans la cellule hôte. La gp 41, par son extrémité N-terminale et une partie de la région centrale qui sont exposées à l’extérieur du virus, détient un rôle clef dans le processus de fusion virale [21, 22].

Sous la membrane extérieure, les protéines de la matrice (MA, ou p17) forment une sous-couche et les protéines de la capside (CA, ou p24) délimitent le cœur du virus, en forme de cône.

Le VIH-1 appartenant à la famille des rétrovirus, le matériel génétique est constitué par deux simples brins identiques d’ARN confinés par les protéines de la nucléocapside (NC, ou p7). Afin d’assurer sa réplication dans les cellules hôtes humaines, le VIH doit convertir les brins d’ARN en molécules d’ADN viral par le processus de transcription.

Outre le matériel génétique viral, à l’intérieur de la nucléocapside, le VIH possède trois enzymes essentielles à sa réplication (la transcriptase inverse (TI), l’intégrase (IN) et la protéase (PR)) ainsi que d'autres protéines virales (p6, Tat, Rev, Vif, Nef, Vpr et Vpu) et cellulaires (ex. actine).

La transcriptase inverse catalyse la transcription de l’ARN virale simple brin en un ADN double brin qui va être inséré par l’intégrase dans le génome de la cellule hôte. Le rôle de la protéase est d’ajuster la longueur de chaque protéine virale synthétisée dans la cellule hôte, processus appelé maturation virale.

Parce que l’activité de chaque enzyme virale est indispensable à la survie et à la multiplication du VIH, elles sont devenues des cibles thérapeutiques de choix dans le combat contre le VIH.

Connaître et comprendre le mécanisme complet du fonctionnement du VIH-1 implique aussi une bonne compréhension de son génome. Ainsi, les scientifiques qui ont étudié le sujet ont découvert que le matériel génétique du VIH-1 est constitué, comme pour tous les rétrovirus, de trois gènes principaux : gag, pol et env et de six gènes supplémentaires codant pour des protéines dites accessoires assurant différents rôles de régulation : Tat, Rev, Vif, Nef, Vpu et Vpr.

Le gène gag code pour les protéines structurales : de la matrice, de la capside, de la nucléocapside. La protéine p6, le gène pol (pour POLymérase) code pour les enzymes virales : la protéase, la transcriptase inverse et l'intégrase. Le gène env (pour ENVeloppe) code pour les protéines d'enveloppe, les glycoprotéines transmembranaires et de surface. Le produit de ces gènes est généré sous la forme de précurseurs (polyprotéines) qui sont rendus fonctionnels par l’action de clivage de la protéase [23, 24].

II.3 Cycle de réplication du VIH

Le mécanisme de réplication du VIH peut être résumé en six étapes principales. Ces étapes, schématisées dans la Figure 5, vont être détaillées dans les paragraphes suivants.

Figure 5 : Cycle de réplication du VIH

1. L’entrée virale est un processus complexe caractérisé par 4 sous-étapes : reconnaissance, fixation, fusion et décapsidation.

Le VIH-1 cible particulièrement les lymphocytes T CD4+, les macrophages et les cellules du système nerveux (plus particulièrement les macrophages de la moelle osseuse et du cerveau et les astrocytes) [25]. La reconnaissance et l’attachement entre le virus et les cellules visées se réalisent par l’intermédiaire de la glycoprotéine de surface du virus, gp 120, et des récepteurs présents sur la membrane cellulaire [26]. Les plus connus des récepteurs cellulaires sont :

i) le CD4 – le plus fréquent et le plus important récepteur, qui est présent sur la membrane cellulaire des lymphocytes T4 et des macrophages [25]. Le site d’interaction du CD4 avec la gp 120 se trouve dans la dépression formée à l’interface des trois domaines : interne, externe et le pont central [27] (Figure 6A). La boucle V3 joue également un rôle important dans ce processus de reconnaissance.

ii) les corécepteurs (récepteurs des chimiokines). Parmi la grande diversité des corécepteurs des chimiokines existants à la surface des cellules humaines, il y en a deux plus particulièrement importants, le CXCR4 et le CCR5 qui favorisent l’entrée du VIH-1 dans les lymphocytes, les monocytes et les macrophages [28]. Agissant après la fixation de la gp 120 sur le récepteur, les corécepteurs interagissent avec la gp120 au niveau de la boucle V3 (Figure 6A et 6B – exemplifié sur le CCR5) afin de renforcer l’interaction virus - cellule.

iii) le galactosylcéramide (GalCer), présent à la surface des cellules nerveuses, des cellules épithéliales du colon et des fibroblastes [29, 30], est un récepteur glycosphingolipidique avec une affinité très prononcée pour la même boucle V3 de la gp 120 [31, 32] (Figure 6A).

http://www.theses.ulaval.ca/2005/22933/ch02.html

Figure 6 : Représentation schématique de la gp 120(composée de cinq régions constantes intercalées entre cinq régions variables (V1 à V5)) et les sites d’interaction avec les récepteurs

et corécepteurs cellulaires

Apres ancrage, la glycoprotéine gp 41 se charge de réaliser la fusion entre la membrane virale et la membrane cellulaire. Suite à la fusion virus –cellule, la nucléocapside virale pénètre à l’intérieure de la cellule hôte et se libère par décapsidation.

Connaissant les détails de l’interaction virus – cellule, plusieurs approches thérapeutiques ont été imaginées afin de bloquer l’infection par le VIH-1 au niveau de son entrée dans la cellule. Comme nous venons de le voir, la boucle V3 est une cible essentielle

qui une fois bloquée pourrait stopper l’entrée virale, aussi bien dans les cellules comportant comme récepteur le CD4 ou le GalCer.

2. Rétrotranscription

Après décapsidation, l’ARN viral est largué dans le cytoplasme cellulaire et forme un complexe avec la transcriptase inverse qui va catalyser la rétrotranscription de cet ARN simple brin en ADN complémentaire double brin.

Des études ont montré que la rétrotranscription débute assez rapidement, l’ADN viral devenant détectable seulement 4 heures après l’infection par le VIH-1 [33]. Cette observation constitue une raison de plus pour intensifier les efforts thérapeutiques vers le développement d’inhibiteurs efficaces de l’entrée virale du VIH-1.

3. Intégration

Une fois l’ADN synthétisé, il forme un complexe de preintégration avec l’intégrase et d’autres protéines virales puis il est transporté dans le noyau cellulaire à travers les pores de la membrane nucléaire [25]. Dans le noyau, l’intégrase accomplit sa mission et insère l’ADN viral dans l’ADN de la cellule. De cette manière la cellule hôte est transformée en un provirus.

4. Transcription

Le génome proviral détient maintenant le contrôle de la machinerie de synthèse cellulaire et, en s’exprimant par l’intermédiaire de l’ARN polymérase il va détourner tous les organites cellulaires dans son propre but : la synthèse des protéines nécessaires à sa propre reproduction.

L’ARNm (messager) une fois synthétisé va être exporté dans le cytoplasme.

5. Traduction

Pendant cette étape commence la synthèse effective des éléments viraux sous le contrôle de l’ARN messager qui est traduit en polyprotéines (Gag, Gag-Pol et Env) et en protéines fonctionnelles (Tat, Nef et Rev).

6. Assemblage, maturation et bourgeonnement

bourgeonnement. Ces particules vont subir un processus de maturation et vont devenir infectieuses suite à l’action de la protéase sur les protéines Gag et Gag-Pol qui vont être clivées et transformées dans la capside conique par les enzymes virales actives [34-37].

La maturation se produit durant l’assemblage à la surface de la membrane cellulaire humaine et/ou après le bourgeonnement des particules virales dans le milieu extracellulaire

[38]

.

Il est important également de souligner que les glycoprotéines virales gp 120 bourgeonnent à la surface des cellules humaines infectées par le VIH. De ce fait, ces cellules acquièrent une affinité pour les cellules saines comportant des récepteurs CD4 avec lesquelles fusionnent. Ce processus détériore également les cellules humaines, engendrant la formation de syncitia [39] - cellules géantes comportant jusqu'à 500 noyaux.

III L

A CHIMIOTHERAPIE DU

VIH-1

Chacune des étapes du cycle de réplication du VIH offre une cible thérapeutique potentielle pour le combattre. Actuellement il y a 21 principes actifs agréés par la FDA (American Food and Drugs Administration) pour une utilisation clinique contre le VIH. En fonction de leurs structure chimique et de leur mécanisme d’action, ces composés peuvent être classés en 5 familles : i) inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (au nombre de 7); ii) inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse (1) ; iii) inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (3) ; iv) inhibiteurs de la protéase (8) et v) inhibiteurs de l’entrée virale (2) [40].

Initialement, le traitement des individus infectés par le VIH a consisté en l’administration de principes actifs appartenant à une seule classe - la monothérapie. Les résultats modestes enregistrés et surtout, l’apparition de résistance du virus au principe actif ont conduit au remplacement de la monothérapie [41, 42] par la polythérapie (HAART – Highly

Active Antiretroviral Treatment) qui consiste en l’administration de trois ou plusieurs principes actifs appartenant à deux ou plusieurs classes d’antirétroviraux.

Cette stratégie thérapeutique a conduit à une très importante diminution du nombre des décès et à une augmentation de l’espérance de vie parmi les personnes infectées par le VIH car elle diminue et maintient la charge virale plasmatique à un niveau inférieur à la limite de détection, et ce pour une longue période [43, 44].

Pour le moment, la polythérapie est la meilleure stratégie pour combattre le VIH mais elle présente aussi un nombre important d’inconvénients : les traitements sont rudes et toxiques, il y a apparition de réactions secondaires (lipodystrophie, diabète, augmentation des niveaux de triglycérides et de cholestérol, complications cardiovasculaires) et le plus grave – la résistance du virus aux médicaments, conséquence de l’élimination incomplète du VIH

[45-47]

. Connaissant ces limitations, la recherche de nouveaux traitements plus doux, et plus variés est cruciale.

Les pages suivantes présenteront une mise au point bibliographique sur la thérapie anti – SIDA, les principes actifs "classiques" et les nouvelles avancés tout en expliquant leur mécanisme d’action. Les produits seront présentés en suivant chaque étape du cycle de réplication du VIH.

Tout d’abord voici la définition de quelques paramètres biologiques importants qui caractérisent l’activité antivirale in vitro :

- la concentration inhibitrice à 50% (CI50) est définie comme la concentration

minimale en composé nécessaire pour inhiber de 50% l’activité d’un marqueur du virus (ex. la transcriptase inverse). Plus la valeur de la CI50 est faible, plus le produit est actif.

- la concentration inhibitrice à 90% (CI90) est définie comme la concentration

minimale en composé nécessaire pour inhiber de 90% la réplication du virus.

- la concentration cytotoxique à 50% (CC50) est définie comme la concentration létale

en composé pour 50% des cellules non infectées par le virus. Plus la valeur de la CC50 est

élevée, moins le produit est toxique.

- l’indice thérapeutique (IT) est défini comme le rapport entre la toxicité et l’activité inhibitrice (CC50 / CI50). Plus la valeur de l’IT est élevée, plus le produit est efficace.

III.1 Inhibiteurs de l’entrée virale

L’entrée virale est un processus qui se développe en trois étapes : l’adsorption, l’interaction des corécepteurs et la fusion. La première étape, qui consiste en l’interaction entre la glycoprotéine virale gp120 et le récepteur cellulaire CD4, produit un changement conformationel du complexe des deux récepteurs (gp120-CD4) qui permet l’intervention des corécepteurs (CCR5 ou CXCR4) afin de renforcer le rapprochement virus – cellule. Les études sur des cellules intestinales humaines HT-29 (CD4- /GalCer+/CXCR4+) ont montré que dans le cas des cellules dépourvues du récepteur CD4, la gp120 utilise le GalCer et un corécepteur (le CXCR4 dans le cas présent) afin d’initier cette première étape [48].

Dans l’étape suivante la glycoprotéine gp 41 forme un complexe à six hélices par interaction entre ses deux régions hydrophobes NHR (N-terminale) et CHR (C-terminale) ce qui favorise le rapprochement des deux membranes et leur fusion (Figure 7) [49, 50].

Dans les paragraphes suivants nous verrons les principaux inhibiteurs spécifiques à chacune des étapes de l’entrée virale.

Figure 7: Schéma détaillé de l’entrée virale du VIH

III.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation

Les inhibiteurs de reconnaissance et de fixation interfèrent soit avec les récepteurs (CD4, GalCer) ou les corécepteurs (CCR5, CXCR4) cellulaires soit avec les récepteurs viraux (gp 120) afin d’empêcher l’adsorption du virus sur la cellule humaine.

III.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4

Une stratégie afin d’empêcher la formation du complexe gp 120-CD4 a été de masquer les récepteurs CD4 avec des anticorps anti-CD4 [51]. Ainsi, l’utilisation d’anticorps monoclonaux anti-CD4 (mAbs) ont conduit à des résultats prometteurs mais ils n’ont jamais été considérés comme des principes actifs anti-VIH dû au risque immunosuppressif. Selon le même concept, un nouvel anticorps anti-CD4 a été mis au point, le TNX-355 [52]. Administré aux personnes infectées par le VIH, le produit a une bonne capacité à réduire la charge virale plasmique et il se trouve en phase clinique II. Son avantage réside dans le fait qu’il ne présente pas de danger immunosuppressif car, par rapport aux anticorps anti-CD4 qui ciblent le domaine 1 du CD4, le TNX-355 interagit avec le domaine 2 du récepteur sans interférer avec les fonctions immunologiques de celui-ci.

Une autre molécule capable de bloquer le récepteur cellulaire CD4 et, de cette manière l’interaction CD4 – gp120, est un pentapeptide modifié par Neffe et Meyer [53] (Figure 8). Les premiers résultats expérimentaux ont montré que le produit manifeste une bonne constante de fixation (KD = 39µM) sur le CD4.

III.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120

Une des premières tentatives afin de bloquer la fixation du virus sur la cellule par le biais de la gp 120, a été l’utilisation de fragments solubles de CD4 (sCD4) [54]. Les expériences in vitro ont montré une bonne activité de neutralisation virale mais in vivo les molécules ont présenté une faible efficacité. Dans le but d’améliorer l’affinité de fixation, la société Progenics a synthétisé une protéine de fusion CD4-immunoglobuline appelé PRO542

[55]

. Le produit possède une structure d’immunoglobuline modifiée avec des sites d’attachement spécifiques aux récepteurs CD4 afin de mieux leurrer les gp 120 du VIH. Contrairement aux sCD4, le PRO542 possède une très bonne activité anti-VIH-1 in vivo et in vitro, et il se trouve en deuxième phase des tests cliniques. Toutefois, le principal inconvénient du PRO542 reste son administration par voie intraveineuse.

Le BMS – 378806, un dérivé de 4-méthoxy-7-azaindole est un très bon inhibiteur de l’infection par le VIH in vitro et in vivo. Lin et ses collaborateurs [56] ont montré que le produit interagit avec le site de reconnaissance du CD4 situé sur la gp 120 [57]. Malgré sa bonne biodisponibilité et ses faibles interactions avec les protéines, les tests cliniques sur le BMS – 378806 ont été arrêtés en faveur de son analogue plus efficace BMS – 488043 (CI50 =

37nM) [58] qui a déjà dépassé les phases cliniques I et II (Figure 9).

Figure 9: Structures chimiques de deux inhibiteurs de petite masse moléculaire bloquant l’interaction gp120-CD4

Les dérivés polyanioniques sont d’autres inhibiteurs efficaces de la gp 120. Cette classe de molécules comprend des polysulfates, polysulfonates, polycarboxylates, polyphosphates, polyphosphonates, polyoxometalates, etc. Par exemple, voici quelques représentants parmi les plus connus de cette classe : le carrageenan (Carraguard) - fabriqué à partir de carragénine, substance tirée des algues rouges, le polymère naphtalène sulfonate - PRO 2000, l’analogue de cosalane [59], le sulfate de dextrine (D2S), le sulphate de cellulose et la suramine (Figure 10). La suramine étant le tout premier principe actif anti-VIH identifié [60] et utilisé dans le traitement clinique [61, 62].

BMS – 378806 BMS – 488043

Suramine

Figure 10: Exemple d’inhibiteurs polyanioniques de la gp 120

L’activité inhibitrice de ces composées réside dans le blocage des sites chargés positivement de la boucle V3 de la gp120 par des interactions électrostatiques avec le polyanion [63, 64] .

En raison d’une certaine toxicité et d’une faible efficacité in vivo, les dérivés polyanioniques n’ont pas été agréés comme médicaments systémiques anti-VIH, mais en tant que microbicides, ils se trouvent dans les dernières étapes des tests cliniques pour la prévention de la transmission sexuelle du VIH [65, 66].

Le FP – 21399 (Figure 10) est un dérivée bis(disulfonaphtalenique) qui, administré par injection intraveineuse, arrive a stopper l’infection par le VIH par fixation électrostatique au niveau de la boucle V3 de la gp 120 [67]. La bonne activité antivirale semble être due a l’accumulation dans les ganglions lymphatiques [68]. Ce produit se trouve dans la première phase des tests cliniques et mis à part quelques effets secondaires mineurs, il semble très prometteur [69].

Analogue de Cosalane

FP – 21399

Des études sur des cellules épithéliales du colon humain[30, 70, 71] et sur des cellules d’origines neuronale[72] ont montré que le VIH utilise le galactosylcéramide [29, 73] comme porte d’entrée dans ces cellules démunies des récepteurs CD4.

De structure glycosphingolipidique, le galactosylcéramide, généralement nommé GalCer comporte une seule unité de D-galactose fixée par une liaison β-O-glycosidique au céramide, d’où le nom de Galβ1Cer (Figure 11). Le céramide à son tour, présente une D-sphingosine liée par une fonction amide à un acide gras en C24 hydroxylé.

Figure 11: Structure chimique du galactosylcéramide (GalCer)

Etant identifié comme récepteur alternatif au VIH-1, en raison de son affinité prononcée pour la boucle V3[74, 75] de la protéine virale gp 120 et de la reconnaissance spécifique pour la séquence d’acides aminés 650-685 de la glycoprotéine virale gp41[76], le galactosylcéramide a ouvert de nouvelles perspectives dans le domaine thérapeutique anti-VIH. Ainsi, plusieurs groupes de recherche ont synthétisé et testé la capacité des analogues synthétiques du GalCer à leurrer le VIH, essayant de cette manière de stopper la propagation de l’infection virale.

Il est très important de souligner que les analogues synthétiques du GalCer, de par leur capacité à reconnaître et à se fixer sur la boucle V3 de la gp 120, sont capables de neutraliser l’infection par le VIH à la fois sur les cellules comportant le GalCer à leur surface mais aussi sur les cellules lymphocytaires comportant le récepteur CD4 [77, 78]. Cette inhibition est possible car une fois bloquée, par un effet de concurrence d’affinité, la boucle V3 n’est plus capable d’initier l’interaction avec le récepteur cellulaire CD4, rendant impossible l’infection virale des lymphocytes. De ce fait, les analogues synthétiques du GalCer représentent des outils très prometteurs pour la thérapie anti-VIH.

D-galactose céramide

liaison β-O-glycosidique

acide gras en C24 hydroxylé

D-sphingosine

HO 3’

Le groupe de Bernardski a synthétisé les premiers analogues du GalCer afin de leurrer le VIH et de l’empêcher d’entrer dans la cellule hôte en lui bloquant compétitivement l’accès aux récepteurs gp 120. Ces premiers analogues synthétiques comportaient une liaison C- ou O-glycosidique (Figure 12) et exprimaient une activité inhibitrice de l’étape de reconnaissance cellulaire caractérisé par une CI50 de 150µM[79].

O HO HO _OH OH O CH2 _CH3 NH3 Cl OH 12 analogue O-glycosidique NH CH2 _CH3 NH3 Cl O 12 analogue C-glycosidique O HO HO _OH OH

Figure 12: Analogues synthétiques C- ou O-glycosidiques du galactosylcéramide

De nouveaux analogues C- et aza-C- glycosidiques du galactosylcéramide (Figure 13) ont été synthétisés et testés pour leurs capacités à bloquer la fixation du VIH sur le GalCer. L’étude a mis en évidence que le dérivé aza-C- glycosidique possède une plus grande affinité pour la gp120 que le GalCer tandis que le dérivé C- glycosidique possède une affinité équivalente à celle du GalCer [80].

CH2 _CH3 1O analogue C-glycosidique O HO HO _OH OH CH2 _CH3 1O analogue aza-C-glycosidique NH HO HO _OH OH

Figure 13: Analogues C- et aza-C glycosidique du galactosylcéramide

En respectant encore plus les caractéristiques structurales du GalCer nécessaires au maintien de l’affinité avec la glycoprotéine gp 120, le groupe d’Isabelle Rico-Lattes a synthétisé des analogues bicaténaires hydrosolubles du galactosylcéramide. Les tests biologiques concernant leurs propriétés anti-VIH réalisés en collaboration avec l’équipe de Jaques Fantini [78] ont montré que l’analogue le plus actif du GalCer était le composé CA52 (Figure 14). Ce produit arrive à inhiber la fixation de la suramine, inhibiteur polyanionique précédemment décrit, sur la boucle V3 de la gp 120. Une concurrence peut exister entre ces deux composés du fait que le CA52 se fixe sur la séquence d’acides aminés 318 – 323 (GPGRAF) bloquant partiellement le site de reconnaissance de la suramine (IQRGP-R-F) sur la boucle V3 (Figure 14). En se fixant lui-même sur la boucle V3 du récepteur viral, le

épithéliales du colon HT-29 (qui comportent le récepteur GalCer mais pas le CD4) et dans les cellules mononucléaires du sang périphérique - PBMC (comportent le récepteur CD4 mais pas le GalCer). La valeur de la CI50 de 108 µM mesurée sur les cellules PBMC est similaire à

celle obtenue sur les cellules HT-29.

Figure 14: Structure du CA52 et des sites d’interactions caractéristiques (flèche bleu pour la CA52 et en rouge pour la suramine) sur la boucle V3 de la

gp120 [78]

Après quelques années, dans ce même groupe, une nouvelle classe d’analogues bicaténaires hydrosolubles du GalCer a vu le jour – les analogues catanioniques du galactosylcéramide (Figure 15). L’originalité de ces composés consiste en leur simplicité de synthèse car la liaison covalente entre les deux chaînes alkyles a été remplacée par une liaison ionique, facilement obtenue par une réaction acido-basique. Même s’ils possèdent des concentrations inhibitrices dans une large gamme (CI50 = 0,9 – 1000 µM, mesurées sur des

cellules lymphocytaires CEM-SS), ces composés se sont avérés peu efficaces, avec des indices thérapeutiques faibles en raison de leur cytotoxicité [81] . Cette étude a permis de vérifier que l’activité inhibitrice et la toxicité de ces composés semblent être directement proportionnelles à leur hydrophobie. La toxicité de ces dérivés bicaténaires hydrosolubles du GalCer a été expliquée par leur incorporation dans la membrane plasmique en raison de l’affinité des chaînes alkyles pour la membrane, ce qui engendre la perturbation des fonctions cellulaires.

Une autre stratégie adoptée afin d’améliorer l’activité anti-VIH des analogues du GalCer a été d’augmenter le nombre de sites actifs afin de favoriser et de stabiliser l’association avec le virus. En partant de cette idée, de nouveaux analogues géminis du GalCer et des dendrimères catanioniques analogues du GalCer ont été synthétisés comportant 2 et respectivement 6 ou 12 sites actifs (Figure 16).

O OH HO OH OH OH HO OH OH O NH2 n C O O 10 C O O O OH OH HO HO HO OH HO HO O NH2 n

Figure 16: Analogues catanioniques géminis et analogues catanioniques dendrimères du galactosylcéramide

Les résultats obtenus ont démontré que la partie hydrophobe de la molécule a une forte influence sur l’activité anti-VIH de ces composées. Plus particulièrement, le composé Gemini 16 (Figure 16) a montré une excellente activité anti-VIH (CI50 = 0,5 µM, sur des cellules

lymphocytaires CEM-SS) et un bon indice thérapeutique (IT > 200). Cette valeur est comparable avec celles de l’AZT et du DDI, deux principes actifs anti-VIH déjà utilisés en chimiothérapie [81].

En ce qui concerne les dérivés dendrimères [82], les tests biologiques réalisés in vitro ont montré que l’effet de multiplicité de sites actifs augmente considérablement l’activité antivirale de ces composés (Tableau 1). Ainsi, la concentration inhibitrice du composé dendritique G12 est de seulement 1,1 µM (testé sur cellules CEM-SS). Malheureusement, cette bonne activité antivirale est mise en défaut par l’importante cytotoxicité du produit (2,9 µM). Cette cytotoxicité a été associée à la conformation en "chou-fleur" adoptée par ces

Gemini 16 n=12

Dérivé dendritique G12 Dérivé dendritique G6