II I TERET DES DERIVES CATA IO IQUES DE DRITIQUES A ALOGUES DU
III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer
IV
E
TUDE DE L’
ASSOCIATIO DES DEDRIMERES CATAIOIQUES AL
’
ITERFACE EAU/
AIR... 83
IV.1 La technique de la balance de Langmuir ... 83 IV.2 Etude des monocouches d’amphiphiles catanioniques dendritiques par la
technique de la balance de Langmuir ... 85
V
P
ROPRIETES BIOLOGIQUES DE OUVEAUX CATAIOIQUESDEDRITIQUES AALOGUES DU
G
ALC
ER... 89
V.1 Caractéristiques biologiques... 89
V.1.1 Paramètres biologiques ... 89 V.1.2 Lignées cellulaires et souches virales... 90 V.1.3 Présentation de la méthode utilisée ... 90
V.2 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des dendrimères catanioniques analogues du GalCer... 91
VI
E
TUDE DE L’
ITERACTIO ET DE L’
ICORPORATIO DES DEDRIMERESCATAIOIQUES VIS
-
A-
VIS D’
U MODELE MEMBRAAIRE... 96
VIIP
ROPRIETES PHYSICO-
CHIMIQUES DES CATAIOIQUES DEDRITIQUESAALOGUES DU
G
ALC
ER... 107
VII.1 Etude des propriétés tensioactives ... 107 VII.2 Etude de la distribution de taille des agrégats... 111 VII.3 Etude de la morphologie des agrégats... 113
VIII
C
OCLUSIOS ET PERSPECTIVES... 120
I INTRODUCTION
La mise au point bibliographique sur le VIH comprenant les thérapies actuellement disponibles pour le combattre nous a montré la nécessité de développer de nouveaux inhibiteurs de l’entrée virale. Il devra s’agir de composés efficaces et bon marché qui pourront être utilisés dans les traitements antirétroviraux fortement actifs afin de stopper l’infection par le VIH-1.
À la lumière des faits présentés ci-dessus et en s’appuyant sur les travaux réalisés précédemment au laboratoire, les études de cette thèse seront centrées dans un premier temps sur la synthèse de nouveaux analogues catanioniques du GalCer qui grâce à leur affinité pour la glycoprotéine virale gp 120 peuvent agir comme des chimères pour le VIH-1. Afin d’optimiser leur efficacité en tant que leurres, nous nous intéresserons principalement aux composés comportant plusieurs motifs analogues du GalCer dans le but d’exploiter l’effet de multiplicité de sites de reconnaissance. Dans cette optique, de nouveaux composés catanioniques dendritiques comportant 12 sites de reconnaissance seront synthétisés. Au cours de ces travaux l’accent sera mis sur la stratégie permettant de diminuer la toxicité cellulaire de ces composés.
Par la suite nous présenterons la capacité de ces composés dendritiques à remplir leur rôle d’inhibiteurs de l’entrée virale tout en vérifiant leur viabilité cellulaire. La quantification de l’efficacité antivirale sera réalisée par des mesures de l’activité anti-VIH-1 et de la cytotoxicité.
Afin de mieux comprendre la relation entre l’activité antivirale, la cytotoxicité et les caractéristiques structurales de ces produits une corrélation entre les propriétés biologiques et physico-chimiques sera établie. Cette relation permettra ainsi d’envisager de nouvelles structures de composés catanioniques analogues du GalCer toujours plus efficaces d’un point de vue thérapeutique.
II
INTERET DES DERIVES CATANIONIQUES DENDRITIQUES
ANALOGUES DU GALCER
La partie sucre des glycosphingolipides fonctionne comme récepteur de différents agents pathogènes et suscite encore de nombreuses recherches car l’interaction sur un seul site hydrate de carbone – protéine est souvent de faible affinité 1. La nature à su résoudre ce problème en rassemblant les hydrates de carbone à la surface cellulaire sous forme de "clusters", ce qui renforce les interactions par un effet multisites [1, 2]. Ainsi, par cet effet de multiplicité de sites, l’affinité finale est supérieure à la somme des interactions individuelles hydrate de carbone – protéine.
Ce principe de multiplicité de sites a été adopté et employé dans le domaine biomédical afin d’obtenir une meilleure inhibition d’un agent pathogène. Le groupe de Whitesides [3] a souligné l’effet inhibiteur supérieur des inhibiteurs multivalents par rapport aux inhibiteurs monovalents. Ces derniers empêchent la fixation du virus à la surface cellulaire par une inhibition compétitive tandis que les composés comportant plusieurs sites de reconnaissance peuvent exercer leur action inhibitrice par une combinaison de deux mécanismes : une affinité augmentée par une inhibition compétitive multivalente et/ou par une inhibition stérique (Figure 1).
Figure 1 : Exemple d’inhibition d’une interaction polyvalente en utilisant des molécules multivalentes[3] Inhibiteur multivalent Inhibition compétitive monovalente Inhibition compétitive multivalente Stabilisation stérique Inhibiteur monovalent
En s’appuyant sur cette stratégie, le groupe de I. Rico-Lattes en collaboration avec l’équipe de J.P. Majoral, a présenté un nouveau système analogue du GalCer, un tensioactif catanionique dendritique comportant une grande densité de sites de reconnaissances à sa périphérie, afin d’augmenter la probabilité d’interaction entre le virus et le leurre sans pour autant augmenter la concentration active en produit [4]. Dans cette approche, les dendrimères ont la particularité de pouvoir présenter à leur surface un grand nombre de fonctions leur conférant une forte densité locale de sites réactifs [5, 6].
Afin d’évaluer l’influence de la multiplicité des sites actifs et de la structure sur l’activité anti-VIH, les dendrimères utilisés ont été choisis de différentes générations, comportant 6 et respectivement 12 fonctions acides en périphérie avec un cœur dendritique tri- ou hexafonctionnel. Les tensioactifs catanioniques ont été obtenus en employant 6 ou 12 équivalents de N-hexadécylamino-1-déoxylactitol pour 1 équivalent de dendrimère comportant 6 ou 12 fonctions acides en surface (Figure 2) [7].
Figure 2: Structure des tensioactifs catanioniques dendritiques synthétisés antérieurement dans les deux laboratoires [7]
Grâce à cette étude, les auteurs ont démontré que l’activité antivirale de ces tensioactifs catanioniques dendritiques multivalents (RCI50 = 1,44 - 13 µM) est nettement
supérieure à l’activité additive d’un nombre équivalent de monomères analogues du GalCer (Tableau 1).
Ces résultats [7] confirment l’effet de multivalence déjà enregistré sur les activités thérapeutiques de dérivés dendritiques [3, 8].
Composés CI 50 (µµµµM) RCI 50 (µµµµM) (*CI 50) CC50 (µµµµM) IT L16 1 50 50 70 1,4 1c-G1 6 2,1 12,6 3,5 1,7 1c-G2 12 1,1 13,2 2,9 2,6 2c-G0 6 0,37 2,22 9,3 25 2c-G1 12 0,12 1,44 3,9 32
(N x CI50 = RCI50, représente la concentration inhibitrice normalisée, exprimée comme la concentration inhibitrice du catanionique dendritique multipliée par le nombre de sites actifs, N)
Tableau 1 : Résultats biologiques des analogues catanioniques dendritiques synthétisés antérieurement [7]
La structure du cœur dendritique a une influence importante sur la conformation de l’assemblage catanionique et par conséquent sur l’activité anti-VIH. Les dendrimères trifonctionnels imposent une structure en forme de "chou-fleur" aux assemblages catanioniques tandis que les dendrimères hexafonctionnels conduisent à une forme cylindrique (Figure 3). En conséquence, les composés à cœur hexafonctionnel sont moins compacts, les sites actifs plus accessibles pour une interaction avec la gp120 virale et donc ces tensioactifs catanioniques présentent une activité antivirale supérieure (CI50=0,37 et 0,12 µM
pour les composés possédant 6 respectivement 12 sites actifs) à celles des composés à cœur trifonctionnel (CI50=2,1 et 1,1 µM pour les composés 6 et 12 fonctionnels respectivement) [7].
Figure 3: Modèles moléculaires obtenus après minimisation dans l’eau des tensioactifs catanioniques dendritiques à cœur trifonctionnel (1c-G2) et hexafonctionnel (2c-G1)
Il faut aussi mettre l’accent sur le fait que cette étude a mis en évidence une fois de plus, le rôle essentiel des chaînes alkyles présentes [9-11] dans la structure des analogues du GalCer lors de l’interaction avec la glycoprotéine gp120 du VIH. Dans ce sens, ces tensioactifs catanioniques dendritiques présentent des concentrations actives antivirales de l’ordre du micromolaire, soit mille fois plus actifs que les glycodendrimères dépourvus de chaînes alkyles présentés dans la littérature par Kensinger [12, 13].
Malgré leur bonne activité antivirale, ces dérivés catanioniques dendritiques analogues du GalCer présentent une toxicité cellulaire non négligeable, toxicité expliquée par les auteurs à l’aide de deux hypothèses.
Une première hypothèse lie la toxicité à une incorporation possible des composés dans la membrane plasmique, incorporation favorisée par la conformation adoptée par ces associations dendritiques et qui pourrait perturber les fonctions cellulaires. Ainsi, la cytotoxicité (CC50=3,5 et 2,9 µM des composés comportant 6 et respectivement 12 sites
actifs) des composés à cœur trifonctionnel (1c-G1 et 1c-G2) pourrait être attribuée à leur
conformation en "chou-fleur" (Figure 3). En effet, de par l’arrangement en bouquet des chaînes alkyles hydrophobes, cette conformation est plus prédisposée à une interaction et une incorporation dans la membrane cellulaire par rapport aux dendrimères catanioniques à cœur hexafonctionnel adoptant une forme cylindrique. Effectivement, de par la conformation cylindrique, les chaînes alkyles de l’association catanionique 2c-G1 minimisent leurs
interactions avec le milieu externe hydrophile en s’associant fortement entre elles par effets hydrophobes. Ainsi, l’accessibilité de ces chaînes est fortement limitée et l’interaction et la fusion du dérivé avec la membrane cellulaire est peu favorable.
Cette stratégie d’hydrophobie masquée développée pour les composés géminis [14] analogues du GalCer est présentée dans la figure 4 et, met en évidence la faible pénétration dans la membrane cellulaire des composés adoptant une forme cylindrique. Ces composés gémini qui ont une faible toxicité [14] se comportent donc comme des bolaamphiphiles (ou bolaformes), interagissant peu avec les membranes cellulaires [15, 16]. En effet, des études antérieurement réalisées au laboratoire, ont mis en évidence que les bolaformes [17] adoptant une conformation "étirée" (espaceur inférieur à 12 groupements méthylène) ne perturbent pas l’organisation membranaire. Ces composés, contrairement aux N-alkylamino-1-déoxylactitols
[18]
, ne manifestent donc pas la capacité d’interagir et de désorganiser les membranes cellulaires avec l’extraction des protéines membranaires, d’où leur faible toxicité cellulaire.
Figure 4: Représentation de l’influence de la conformation sur l’incorporation dans la membrane cellulaire [14] d’amphiphiles géminis
Cependant, malgré leur forme cylindrique, la cytotoxicité des composés 2c-G0 et 2c-
G1 à cœur hexafonctionnel reste assez importante (CC50=9,3 et 3,9 µM respectivement). Il
semble donc que d’autres paramètres soient responsables de la cytotoxicité de ces dendrimères catanioniques. Une deuxième hypothèse lie la toxicité cellulaire à une dissociation partielle de l’entité catanionique en raison d’un caractère hydrophobe trop faible des branches du dendrimère. Ainsi, en raison d’un effet hydrophobe faible existant entre les éléments constitutifs (dendrimère – aminolactitol) de l’association catanionique dendritique, l’aminolactitol pourrait être relarguer et provoquer une perturbation des fonctions cellulaires par un effet détergent sur les membranes cellulaires.
Conformation non - cylindrique "espaceur replié"
Conformation cylindrique "espaceur étiré"
III
SYNTHESE DE NOUVEAUX TENSIOACTIFS CATANIONIQUES
DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER
A la suite de ces travaux réalisés par M. Blanzat et C.O. Turrin dans les groupes de I. Rico-Lattes et de J.P. Majoral, l’étude présente propose la synthèse de nouveaux tensioactifs catanioniques dendritiques multivalents à cœur hexafonctionnel comportant 12 fonctions acides en surface car, comme nous l’avons précédemment présenté, ces deux caractéristiques structurales offrent une meilleure activité anti-VIH à ce type de composés.
L’originalité de ces nouveaux tensioactifs catanioniques est liée à la présence de chaînes alkyles terminales dans la structure des dendrimères qui auront pour rôle de renforcer les effets hydrophobes entre le dendrimère et l’aminolactitol. Par cette consolidation de l’assemblage catanionique dendritique nous espérons une diminution de la toxicité cellulaire de ces nouveaux composés puisque comme nous l’avons précédemment noté, cette cytotoxicité pourrait provenir d’un partiel désassemblage du système catanionique des dendrimères à cœur hexafonctionnel.
III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer
Ainsi, deux nouveaux dendrimères à cœur hexafonctionnel comportant 12 groupements acides phosphoniques terminaux et 12 chaînes alkyles supplémentaires, de deux longueurs différentes (C3 et C10) ont été synthétisés au Laboratoire de Chimie de Coordination
dans l’équipe de J.P. Majoral à Toulouse par C.O. Turrin et G. Spataro (Figure 5).
P N P N PN O N N Me P S O NH O P O OH OH O NH O P O OH OH R R O N N Me P S O NH O P O OH OH O NH O P O HO OH R R O N N Me P S O NH O P O HO HO O NH O P O OH HO R R O N NMe P S O NH O P O OH HO O NH O P O OH OH R R O N N Me P S O NH O P O HOOH O NH O P O HO HO R R O N N Me P S O NH O P O HO HO O NH O P O HO HO R R DC3: R = C3H7 DC10: R = C10H21
Le projet initial prévoyait l’utilisation, dans une toute première étape, d’un dendrimère d’une structure similaire à celle présentée ci-dessus, mais dépourvu des chaînes alkyles terminales. De par son utilisation, nous aurions pu réaliser un passage graduel vers la structure des dendrimères étudiés dans les travaux courants car, il nous aurait permis d’étudier l’influence sur les propriétés biologiques et physico-chimiques liée au remplacement des fonctions acides carboxyliques terminales par des acides phosphoniques. En raison de difficultés de purification qui ont conduit à l’obtention de ce dendrimère en quantités trop faibles, son utilisation dans le cadre de l’étude actuelle n’a pas été possible.
La présence du phosphore dans la structure des dendrimères ainsi que dans les groupements acides terminaux a permis une caractérisation aisée de ces structures et un meilleur suivi de la pureté des composés synthétisés. De plus, des études précédemment réalisées dans le groupe de J.P. Majoral ont mis en évidence le rôle clef des fonctions phosphoniques terminales [19, 20] sur l’activité biologique de ce type de dendrimères, tout particulièrement sur le processus d’activation des cellules monocytaires humaines.
Afin de déterminer l’hydrophobie adéquate de l’assemblage catanionique, générant une toxicité cellulaire réduite et une bonne activité anti-VIH, nous avons fait varier la longueur des chaînes alkyles de l’aminolactitol. Pour cela, nous avons employé deux aminosucres : le N-hexadécylamino-1-déoxylactitol (L16) et le N-dodécylamino-1-
déoxylactitol (L12). Nous rappellerons que ces deux aminolactitols (Figure 6) possèdent les
impératifs structuraux (le motif D-galactose lié par une liaison β-O-glycosidique et une longue chaîne hydrophobe) qui permettront la reconnaissance avec la gp120. De plus, les chaînes alkyles ont également été greffées sur les dendrimères afin de renforcer cette interaction avec le virus.
Les deux précurseurs cationiques, le N-dodécylamino-1-déoxylactitol (L12) et le N-
hexadécylamino-1-déoxylactitol (L16) ont été synthétisés en partant du lactose non protégé par
une méthode largement utilisée au laboratoire [21, 22]. Ainsi, la réaction spécifique des sucres réducteurs avec la dodécylamine et l’hexadécylamine respectivement, suivie par la réduction de l’imine intermédiaire par le borohydrure de sodium conduit à l’obtention du précurseur cationique.
Les nouveaux tensioactifs catanioniques dendritiques ont été synthétisés par simple addition dans un mélange eau : propan-1-ol (1: 3, v : v), à température ambiante, de 12 équivalents d’aminolactitol avec 1 équivalent du dendrimère comportant 12 fonctions acides en surface. L’addition du propan-1-ol a été nécessaire en raison de la solubilité réduite de l’acide dendritique dans l’eau (Figure 6).
L’équilibre acido-basique de la réaction est déplacé vers la formation du dendrimère catanionique grâce aux effets hydrophobes et aux interactions de van der Waals entre les chaînes alkyles des deux constituants de l’entité catanionique.
P HO OH O P HO HO O P HO HO O P OH HO O P OH HO O P OH OH O P OH OH O P OH OH O P OH OH O P HO OH O P HO OH O P HO OH O DC3 : C3H7 DC10 : C10H21 = = O OH HO OH OH OH HO OH OH O NH n + 12 L12 : n = 8 L16 : n = 12 Température ambiante 2 jours H2O: PrOH = 1: 3 L16 DC3 L12 DC3 L16 DC10 L12 DC10
Figure 6: Synthèse de nouveaux analogues catanioniques dendritiques du GalCer
Les tensioactifs catanioniques ont été obtenus avec des rendements quantitatifs après élimination des solvants par évaporation et lyophilisation.
Une étude par résonance magnétique nucléaire a ensuite été réalisée afin de confirmer la structure de ces nouveaux analogues catanioniques du GalCer, notamment afin de vérifier la formation des paires d’ions.