II I TERET DES DERIVES CATA IO IQUES DE DRITIQUES A ALOGUES DU
III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes actifs
/ hydrocarboné ... 138 III.3 Analyse structurale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer... 142
IV
P
ROPRIETES PHYSICO-
CHIMIQUES DES COMPOSES CATAIOIQUESHYBRIDES FLUORES
/
HYDROGEES... 145
IV.1 Etude des propriétés tensioactives ... 145 IV.2 Etude de distribution de taille des agrégats... 148 IV.3 Etude de la morphologie des agrégats... 151
V
E
TUDE DE L’
ITERACTIO ETRE LES COMPOSES CATAIOIQUES ETDES MOOCOUCHES DE PHOSPHOLIPIDES
... 157
VI
E
VALUATIO DES PROPRIETES DE VECTORISATIO SUR CELLULESIFECTEES PAR LE
VIH... 162
VI.1 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des associations catanioniques hybrides analogues du GalCer ... 162 VI.2 Evaluation des propriétés physico-chimiques dans les conditions de vectorisation
... 164 VI.3 Formulations de l’AZT avec les tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et
L16F8... 171
VII
C
OCLUSIO... 174
I
INTRODUCTION
Comme nous l’avons montré dans le premier chapitre bibliographique, la polythérapie est à l’heure actuelle, le seul moyen de diminuer et de contrôler la multiplication du VIH. Les régimes polythérapeutiques sont constitués de différentes combinaisons de principes actifs qui ciblent trois étapes clé du cycle de réplication du virus : l’entrée virale, la transcription et la maturation. Pourtant, cette stratégie se heurte toujours à d’importants inconvénients parmi lesquels, l’importante toxicité de certains médicaments. Une stratégie qui permet de réduire la dose de principe actif administrée, tout en améliorant l’efficacité biologique et en diminuant la toxicité du principe actif [1], consiste en l’emploi d’un système de vectorisation efficace.
Dans le chapitre précédent nous avons présenté l’influence de la multiplicité de sites actifs sur le processus de reconnaissance du VIH et sur l’activité antivirale des analogues dendritiques catanioniques du GalCer. Dans ce cas particulier, l’effet de multiplicité de sites se manifeste de deux façons car il est présent autant sous la forme monomère de l’édifice catanionique que sous la forme agrégée – vésiculaire. Pour être plus précis, les vésicules présentent à leur surface de nombreux groupements galactose qui peuvent être considérés comme des "clusters" de sites actifs. De ce fait, la probabilité d’interaction avec la membrane virale est augmentée.
Rappelons également que les glycoprotéines virales gp 120 bourgeonnent à la surface des cellules humaines infectées par le VIH, ce qui transforme la gp120 en une cible précieuse pour le développement des thérapies anti-VIH spécifiques [2].
Ainsi, les vésicules formées par les analogues catanioniques du GalCer pourraient être utilisées comme des vecteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH. En raison de leur toxicité cellulaire, les vésicules formées par les catanioniques dendritiques précédemment présentés ne peuvent pas être envisagées pour une utilisation dans le domaine de la vectorisation.
Dans ce troisième chapitre, nos recherches seront donc centrées sur la synthèse et l’étude d’une nouvelle famille de composés catanioniques analogues du GalCer capables de former spontanément des vésicules et d’agir ainsi comme des transporteurs spécifiques. De par la multiplicité de sites de reconnaissance des vésicules formées par ces nouveaux systèmes catanioniques mixtes fluorés/hydrogénés nous espérons augmenter la probabilité d’interaction avec la protéine virale et, de ce fait, obtenir une bonne reconnaissance et
spécificité pour la membrane des cellules infectées. De plus, les produits devront présenter des toxicités réduites aussi bien sous forme agrégée -vésiculaire que sous forme monomère.
L’ajout d’une chaîne fluorée, qui entraînera une augmentation de l’hydrophobie des associations catanioniques a pour objectif une amélioration de la stabilité dans le temps des agrégats vésiculaires formés par ces tensioactifs catanioniques hybrides.
Trois composés mixtes fluorés/hydrogénés, de structures chimiques variées, seront étudiés afin d’identifier les caractéristiques structurales qui peuvent offrir une meilleure stabilité des agrégats dans le temps, une toxicité diminuée et une bonne affinité pour le VIH. Un assemblage catanionique non – fluoré, possédant une hydrophobie proche de celle des composés catanioniques hybrides sera étudié parallèlement comme système de référence.
Après la synthèse et la caractérisation de ces nouveaux assemblages catanioniques, leurs propriétés physico-chimiques et biologiques seront décrites et analysées afin d’identifier le composé le plus adapté à l’application envisagée soit, la vectorisation de principes actifs anti-VIH. La capacité de ces composés d’agir sous forme monomère en tant que leurres du VIH sera également étudiée.
Ainsi, l’activité antivirale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer est envisagée être augmentée par une stratégie de multiciblage : l’utilisation des monomères en tant qu’inhibiteurs de l’entrée virale du VIH et l’emploi des agrégats supramoléculaires en tant que système de délivrance spécifique de principes actifs anti-VIH.
II
MISE AU POINT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES
TENSIOACTIFS MIXTES FLUORES / HYDROGENES
Avant de détailler la synthèse de ces nouveaux composés catanioniques hybrides, une brève incursion dans le domaine des composés mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés sera nécessaire afin de mieux cadrer nos recherches dans l’étude de cette famille de produits.
II.1 Caractéristiques particulières des chaînes alkyles
fluorocarbonées
La coexistence d’une chaîne fluorée avec une chaîne hydrogénée dans la structure intrinsèque d’un amphiphile peut totalement modifier les propriétés physico-chimiques du composé car d’importantes différences structurales [3, 4] existent entre ces chaînes. En raison de la taille plus grande de l’atome de fluor (rayon de van der Waals 1,47 Å) par rapport à celle de l’atome de l’hydrogène (1,20 Å), les chaînes fluorées sont plus volumineuses que les chaînes hydrogénées, avec des sections transversales d’approximativement 30 Å2 contre 20 Å2 pour les hydrogénés. Les volumes moyens des groupements CF2 et CF3 estimés à 38 Å3 et
respectivement 92 Å3 sont beaucoup plus importants que ceux du CH2 (27 Å3)ou du CH3 (54
Å3). Une conséquence de cette plus grande taille de l’atome de fluor par rapport à l’hydrogène est la plus grande rigidité des chaînes fluorées qui adoptent préférentiellement une conformation hélicoïdale, "all-trans" [5] (Figure 1).
A B
Figure 1 : Comparaison entre les modèles moléculaires d’un hydrocarbure (C10H22) - (A)
La grande surface des chaînes fluorées et la faible polarisabilité de l’atome de fluor sont les deux éléments responsables de leur importante hydrophobie; l’effet hydrophobe de la chaîne étant grossièrement proportionnel à l’aire moléculaire venant au contact de l’eau [6]. De plus, les forts effets hydrophobes existant entre les chaînes fluorées augmentent leur tendance à s’auto-organiser dans l’eau et leur adsorption à l’interface, ce qui se traduit par de fortes activités de surface. Malgré leur fort pouvoir tensioactif, les composés fluorocarbonés ont un effet détergent (délipidation des membranes) réduit ou même inexistant par rapport aux amphiphiles complètement hydrogénés [7]. Cette propriété est un véritable atout si l’on envisage l’utilisation d’amphiphiles fluorées pour des applications biomédicales [8].
Ainsi, la présence d’une chaîne fluorée peut avoir un rôle déterminant sur l’hydrophobie et la lipophobie des amphiphiles et implicitement, sur les propriétés physico- chimiques et biologiques des membranes, vésicules ou autres agrégats qu’ils sont capables de former dans l’eau. En imposant un arrangement plus rigide et plus ordonné dans la structure intrinsèque des agrégats, la chaîne fluorée peut notamment améliorer la stabilité [9-11], la fluidité, la rigidité [12], la perméabilité [13] et la capacité d’encapsulation des membranes vésiculaires [9].
II.2 Composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés
dérivés de sucres
La recherche bibliographique révèle l’existence d’un nombre impressionnant de produits covalents hybrides fluorés/ hydrogénés dérivés de polyols ou de sucres, d’aminoacides, de phosphocholine ou de phosphatidylcholine [14-16].
Des composés mixtes fluorés/ hydrogénés comportant comme partie hydrophile un sucre (lactose [17, 18], glucose [19], mannose ou galactose [20]) ont été synthétisés et étudiés pour leur propriétés physico-chimiques et biologiques (Figure 2). Ces produits se sont révélés capables de former dans l’eau des agrégats d’une grande variété morphologique: des hélices[18] , des tubules [21], des membranes [22], des vésicules [12]. En raison de la formation de vésicules d’une stabilité supérieure [9, 10] dans le temps comparativement aux produits totalement hydrogénés, ces systèmes hybrides représentent une bonne alternative pour l’encapsulation et la vectorisation spécifique de principes actifs [16].
O OH HO OH O OH OH OH OH OH Z O Z [NHCH2C(O)]pNHCH (CH2)2RF (CH2)8R Z NH(CH2)4CH NHC(O)(CH2)2C8F17 C(O)NH(CH2)9CH3 Z NHCH2C(O)NHCH (CH2)2S(CH2)2C6F13 (CH2)2C6H13 p=1; R=CH3; RF=C6F13, C8F17 p=1; R=CH=CH2; RF=C6F13, C8F17 p=2; R=CH3; RF=C6F13 O OH HO OH O OH OH OH OH OH N CnH2nCOO-Na+ COC2H4C8F17 n=10; n=11 O OH HO O OH OH CHOP(O)-2 RF(CH2)2 CH3(CH2)8 RF=C6F13; C8F17 O OP(O)-2OCH HO OH OH OH RF=C6F13; C8F17 (CH2)2RF (CH2)8CH3 O OP(O)- 2-X-CH HO OH OH OH X=O; RF=C6F13; C8F17 X=(CH2)5O; RF= C8F17 (CH2)2RF (CH2)8CH3
Figure 2 : Structures chimiques de quelques composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés de sucres
Riess et ses collaborateurs [5] ont représenté la structure membranaire de vésicules formées par ce type de composés mixtes fluorés/ hydrogénés comme une bicouche discontinue (Figure 3). Ce schéma met en évidence la ségrégation partielle des chaînes fluorocarbonées et hydrocarbonées avec la formation de domaines différents en raison de la faible affinité qui existante entre ces deux types de chaînes. Les études ont montré que la présence de ces domaines fluorés dans la membrane vésiculaire engendre une augmentation de la durée d’encapsulation de la carboxyfluorescéine dans les vésicules formées par les composés hybrides par rapport aux vésicules formées par les composés totalement hydrogénés[5].
Figure 3: Représentation schématique de la structure d’une membrane vésiculaire
F n C m C m H2O Tête polaire Espaceur Chaînes hydrogénées Chaîne fluorée Bicouche mixte fluorée / hydrogénée Vésicule fluorée H2O Dérivés du lactose
Nous trouvons encore plus de similitude avec notre étude dans les travaux de Fantini et de Vierling, car leurs recherches portent sur l’activité anti-VIH d’analogues covalents mixtes fluorocarbonés/hydrocarbonés du GalCer. Les composés [F8C7][C16]AEGal, [FxCy][FqCz]SerGal et HO[C24][F6C5]Gal incorporés dans des liposomes conventionnels (phospholipide : cholestérol - 2 :1 ) en raison de leur solubilité extrêmement faible dans l’eau, présentent une activité anti-VIH [2] sur des cellules GalCer(+)HT-29 supérieure à celle de l’analogue monocaténaire fluoré [F6C11]SerGal (Figure 4) [23]. De plus, les analogues hydrogénés des dérivés SerGal et du HO[C24][F6C5]Gal se sont révélés inactifs contre ce même virus. Ces résultats semblent indiquer que la glycoprotéine virale gp 120 se fixe préférentiellement ou exclusivement sur les domaines riches en glycolipides existants dans la bicouche liposomale, leur formation étant favorisée par la ségrégation des chaînes des composés fluorés [15].
Figure 4: Structures chimiques des analogues fluorés / hydrogénés du GalCer
Les inconvénients majeurs de ces amphiphiles fluorés sont leur complexité de synthèse et de purification ainsi que leur solubilité réduite dans l’eau, ce qui rend la formulation plus laborieuse.
Les produits dont nous allons faire l’étude, les amphiphiles catanioniques hybrides fluorocarbonés / hydrocarbonés analogues du GalCer, présentent trois avantages importants comparativement aux analogues covalents du GalCer précédemment cités, soit : une grande simplicité de synthèse, une excellente hydrosolubilité et la capacité d’auto-association dans l’eau.
II.3 Composés catanioniques mixtes fluorocarbonés /
hydrocarbonés
Les tensioactifs catanioniques représentent depuis quelques années un sujet fascinant de recherche, car ces mélanges de tensioactifs anioniques et cationiques possèdent des propriétés physico-chimiques inédites [24]. Nous mentionnerons la diversité morphologique dictée par la force des interactions intra- et intermoléculaires, le rapport stoechiométrique entre les deux tensioactifs, la géométrie des molécules, etc. [25] . Parmi les morphologies des agrégats formés par les tensioactifs catanioniques, les vésicules ont reçu un intérêt tout particulier en raison de leur formation spontanée [26] et aux applications qui en découle.
Dix huit ans après que le groupe de Kaler [26] eut développé cette nouvelle méthode de préparation de vésicules spontanées, en mélangeant dans l’eau deux tensioactifs monocaténaires de charges opposées, la littérature scientifique abonde d’exemples de composés catanioniques [27]. Des catanioniques bi- [28, 29], tri-, tétra- et pentacaténaires [30], des dérivés gémini [31, 32] ou dendritiques [33, 34], portant une grande variété de têtes polaires (le plus souvent ammonium [35], pour le cation et carboxylate [36], sulfate ou sulfonate [37] pour l’anion), ont vu le jour et ont fait l’objet de nombreuses études physico-chimiques.
Concernant les composés hybrides fluorocarbonés / hydrocarbonés catanioniques, la littérature n’offre que peu d’exemples comparativement aux composés complètement hydrogénés. Les travaux de référence dans le domaine, réalisés par les groupes de Kaler [38] et de Hoffmann [39] sur différents systèmes mixtes fluorés / hydrogénés (C16TAB / FC5 ,
respectivement C14DMAO /C6F13CH2COOH) (Figure 5) portent surtout sur l’étude des
propriétés auto-associatives dans l’eau et sur l’étude des diagrammes de phases à différents rapports molaires entre les deux amphiphiles.
N COO F F F F F F F F F F F + NaBr F F F F F F F F F F F F F COO N OH C14DMAO/ C6F13CH2COOH C16TAB/ FC5
Figure 5 : Structures chimiques de tensioactifs catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés
Des travaux récents réalisés au laboratoire des IMRCP [22] ont mis l’accent sur la synthèse et l’étude physico-chimique d’une nouvelle famille de tensioactifs mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés catanioniques à tête sucre (Figure 6). Ces études ont mis en évidence le fait que la présence d’une chaîne fluorée en C10 conduit, par sa forte hydrophobie,
à la formation d’agrégats rigides tels que des membranes enroulées ou des structures lamellaires plutôt que des vésicules. Par contre, une chaîne fluorée en C8 favorise la formation
spontanée de vésicules.
Figure 6 : Structures chimiques de tensioactifs catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés du lactose
Dans cette étude nous allons exploiter cette tendance des systèmes catanioniques comportant un segment fluoré en C8 pour induire la formation d’agrégats vésiculaires.
III
MISE AU POINT DE VECTEURS CATANIONIQUES HYBRIDES
ANALOGUES DU GALCER
III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes
actifs
Le but de l’étude courante sera de synthétiser et d’étudier la capacité de nouveaux tensioactifs catanioniques analogues du GalCer, notamment des dérivés bicaténaires mixtes fluorés/ hydrogénés, d’être utilisés en tant que systèmes vectoriels de principes actifs anti- VIH.
Des études récentes réalisées au laboratoire des IMRCP ont mis en avant le grand potentiel des associations catanioniques à être utilisées dans le domaine de la délivrance de principes actifs. Une première approche a porté sur la délivrance par voie cutanée d’un
principe actif anti-inflammatoire associé à un tensioactif dérivé de sucre (Figure 7). Cette association engendre une importante amélioration de l’activité anti-inflammatoire du principe actif car la nouvelle entité catanionique de par sa capacité à former spontanément dans l’eau des agrégats vésiculaires offre au principe actif une très bonne solubilité dans l’eau, une délivrance contrôlée et prolongée à travers la peau ainsi qu’une protection contre l’irradiation solaire [40, 41]. Dans ce cas précis, le principe actif participe à sa propre formulation.
O OH HO OH OH OH HO OH OH O NH2 9 C O O N O O Cl
Figure 7 : Structure chimique d’une association catanionique réalisée entre un anti- inflammatoire et un tensioactif dérivé de sucre
Une approche différente a été l’utilisation d’une association catanionique tricaténaire (Figure 8), afin de construire un système de vectorisation polyvalent, capable d’assurer le transport de principes actifs hydrophobes (dans la bicouche membranaire vésiculaire) et/ou de principes actifs hydrophiles (dans le cœur aqueux des vésicules). Ce système catanionique tricaténaire [42] doit la bonne stabilité au cours du temps des vésicules formées spontanément dans l’eau, à la présence d’une troisième chaîne alkyle. Ainsi, l’augmentation de l’hydrophobie permet l’obtention d’une entité catanionique comme système de vectorisation efficace. En effet, les vésicules formées spontanément se sont montrées capables d’encapsuler une quantité importante de substances actives hydrophiles, de garder cette charge pour une période de temps supérieure à 30 heures et de la délivrer par fusion avec la membrane cellulaire. O OH HO OH OH OH HO OH OH O NH2 12 P O O 9 9 OH OH
Figure 8 : Structure chimique d’une association catanionique tricaténaire
En nous appuyant sur cette expérience, la stratégie adoptée pour l’amélioration de la stabilité au cours du temps des agrégats vésiculaires, sera d’augmenter l’hydrophobie de l’ensemble catanionique par l’ajout d’une chaîne fluorée. Caractérisée par une meilleure hydrophobie et une plus grande rigidité, la partie fluorocarbonée devrait transférer ces propriétés à la membrane vésiculaire, conduisant ainsi à une meilleure stabilité des agrégats dans le temps et à une meilleure compaction ainsi qu’une faible perméabilité [9]. En conséquence, les vésicules formées spontanément par ces catanioniques hybrides fluorés/ hydrogénés qui de plus, comporteront à leur surface des sites de reconnaissance de la gp 120 pourraient s’avérer très utiles en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs anti- VIH.
Trois composés mixtes fluorés/hydrogénés, de structures chimiques variées, seront étudiés afin d’identifier les caractéristiques structurales qui peuvent offrir une meilleure stabilité des agrégats dans le temps et une toxicité diminuée.