Étude de la physiopathologie et du caractère inflammatoire de la Fièvre Méditerranéenne Familiale (FMF)

THÈSE

Pour l'obtention du grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR de médecine et de pharmacie

Laboratoire Inflammation, tissus épithéliaux et cytokines - LITEC (Poitiers) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges) Secteur de recherche : Biologie, Médecine, Santé

Cotutelle : Université libanaise

Présentée par :

José-Noël Ibrahim

Étude de la physiopathologie et du caractère inflammatoire de la Fièvre Méditerranéenne Familiale (FMF)

Directeur(s) de Thèse :

Jean-Claude Lecron, Myrna Medlej-Hashim Soutenue le 16 janvier 2014 devant le jury Jury :

Président Zeinab Saad Professeur, Université libanaise, Beyrouth

Rapporteur Hans Yssel Directeur de recherche INSERM, Université P. & M. Curie, Paris Rapporteur Gérard Lefranc Professeur émérite, Université de Montpellier

Membre Jean-Claude Lecron Professeur et praticien hospitalier, Université de Poitiers Membre Myrna Medlej-HashimProfesseur, Université libanaise, Beyrouth

Membre Bassam Badran Professeur, Université libanaise, Beyrouth

Membre Isabelle Jéru Maître de conférences et praticien hospitalier, CRSA, Paris Membre André Megarbané Professeur et praticien hospitalier, Université St Joseph, Beyrouth

Pour citer cette thèse :

José-Noël Ibrahim. Étude de la physiopathologie et du caractère inflammatoire de la Fièvre Méditerranéenne

Familiale (FMF) [En ligne]. Thèse Biologie, Médecine, Santé. Poitiers : Université de Poitiers, 2014. Disponible sur

THESE EN COTUTELLE

Pour obtenir le grade de Docteur délivré par

L’Université de Poitiers

(Ecole Doctorale 524 BioSanté)

et

L’Université Libanaise

(Ecole Doctorale des Sciences et Technologie)

Spécialité: Biologie, Médecine, Santé

Présentée et soutenue publiquement par

IBRAHIM José-Noel

Le 16 Janvier 2014

Etude de la physiopathologie et du caractère inflammatoire de la

Fièvre Méditerranéenne Familiale (FMF)

Directeurs de thèse :

Dr. Myrna Medlej-Hashim et Dr. Jean-Claude Lecron

Membres du Jury

Madame Zeinab SAAD,Doyen de l’EDST, Université Libanaise Président Monsieur Gérard LEFRANC, Professeur Emérite, Université Montpellier 2 Rapporteur

Monsieur Hans YSSEL, Directeur de Recherche Inserm, Paris Rapporteur

Madame Isabelle JERU, MCU-PH, INSERM/ AP-HP, Paris Examinateur

Monsieur André MEGARBANE, PU-PH, Université Saint Joseph Examinateur Monsieur Bassam BADRAN, Professeur, Université Libanaise Examinateur

Madame Myrna MEDLEJ-HASHIM, Professeur, Université Libanaise Directeur de thèse Monsieur Jean-Claude LECRON, PU-PH, Université de Poitiers Directeur de thèse

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A ma très chère mère

Je te rends hommage par ce modeste travail en guise de ma

reconnaissance éternelle et de mon infini amour.

ii

Remerciements

Je tiens à adresser mes plus chaleureux remerciements à mes directeurs de thèse Dr.

Myrna Medlej-Hashim et Dr. Jean-Claude Lecron pour la confiance qu'ils m'ont accordée en

acceptant d'encadrer ce travail doctoral, pour leur disponibilité, leurs encouragements et leur

soutien durant ces 3 années. Vos conseils toujours avisés et votre détermination m’ont

permis d’avancer à pas sûrs dans l’accomplissement de ce travail. Merci de m’avoir fait

profiter de vos larges connaissances et de me transmettre la passion de la recherche. Grâce à

vous j’ai pu apprendre beaucoup de choses dont certaines fort utiles pour mes travaux

académiques bien sûr, mais aussi des choses importantes pour mon développement personnel.

Je n’oublie pas enfin votre aide précieuse dans la relecture et la correction de ma thèse. Très

sincèrement, je suis très honoré de travailler avec vous. Merci pour tout.

J’exprime toute ma reconnaissance à Dr. Zeinab Saad et Dr. Gérard Mauco, à la tête

des deux Ecoles Doctorales au Liban et à

Poitiers, qui m’ont permis de me lancer dans ce

travail de thèse en co-tutelle. Merci Dr Saad pour avoir aussi bien voulu accepter de présider

le jury de ce mémoire. J’en suis honoré.

Je tiens tout particulièrement à exprimer mes remerciements au Pr. Gérard Lefranc et

à Dr. Hans Yssel

pour avoir accepté de juger mon travail et d’être Rapporteurs de ce

mémoire. Merci pour le temps que vous avez bien voulu me consacrer.

Je remercie également Dr. Isabelle Jéru, Dr. Bassam Badran et Dr. André Megarbané

pour avoir accepté d’examiner ce travail et de participer à ce jury. Merci aussi, Dr.

Megarbané, pour m’avoir accueilli au sein de votre laboratoire et accordé votre confiance. Je

vous en suis très reconnaissant.

Mes plus vifs remerciements vont évidemment à Dr.

Rania Jounblat dont l’écoute, la

patience et les qualités scientifiques ont imprégné une bonne partie de mon travail.

J’ai

beaucoup appris à vos côtés et je vous adresse ma gratitude pour tout cela.

Je désire exprimer ma reconnaissance infinie à Dr. Rita Nabbout et Dr. Nassim

Fares pour leurs remarques pertinentes, leurs conseils judicieux, leurs qualités humaines et

leurs critiques toujours extrêmement constructives. Un grand merci aussi à Dr. Eliane

iii

Chouery pour ses remarques, son ouverture d’esprit, sa franchise et sa clairvoyance. J’en

pro

fite pour vous exprimer ici ma plus profonde gratitude.

Je souhaite remercier l'ensemble des membres de l’équipe « Inflammation, Tissus

Epithéliaux et Cytokines

» à l’Université de Poitiers, pour l’aide précieuse que vous n’avez

jamais cessé de me prodiguer. Vous êtes un bel exemple d’homogénéité et de cohésion. Je

remercie plus particulièrement Mme Adriana Delwail pour son humour, son humilité et sa

gentillesse.

Je tiens à remercier également l’équipe « Physiopathologies Cellulaires et

Moléculaires », ER030, au sein de laquelle j’ai effectué mon travail de thèse à l’Université

Libanaise. Merci à tous les membres de l’équipe pour votre accueil et votre soutien.

Je n’oublie surtout pas les membres de l’Unité de Génétique Médicale à l’Université

Saint Joseph. Mention spéciale à Joelle, Nadine, Nabiha et Sandra pour m’avoir fait

pro

fiter de leurs larges compétences techniques et pour le temps qu’elles m’ont consacré. J’ai

eu beaucoup de plaisir à travailler avec vous. Merci pour votre amitié. A Leila, Rima C,

Rima K, Mireille, Salwa, Nagham, Maya, Tony et Alain : merci pour votre soutien et votre

sympathie.

Merci à tous les sujets, patients et contrôles, qui ont généreusement accepté de

participer à l’étude et sans qui ce travail n’aurait pas été possible.

Sur une note plus personnelle, je tiens à exprimer mes profonds remerciements à mes

amis pour leur soutien et leur disponibilité à n’importe quelle heure du jour et de la nuit, peu

importe les différents pays où nous étions tous. En particulier, je voudrais remercier Charbel

et Tony qui ont su me remonter le moral quand il le fallait. Je voudrais vous dire merci pour

votre présence, votre amitié, vos prières et votre encouragement pendant mes périodes de

doutes. J’ai l’honneur de partager avec vous ce bout de chemin et de vivre intensément cette

inoubliable aventure professionnelle mais surtout fortement humaine dont je garderais un

magnifique souvenir… Merci aussi à Cybel, Nancy et Rémi pour votre soutien, les longues

discuss

ions et les inoubliables moments de rire qu’on a pu avoir. Je ne peux que vous

souhaiter bonne continuation.

Enfin, les mots les plus simples étant les plus forts, j’adresse toute mon affection à

ma famille qui, avec cette question récurrente, « quand est-ce que tu la soutiens cette thèse ? »,

iv

bien qu’angoissante en période fréquente de doutes, m’a permis de ne jamais dévier de mon

objectif final. Merci d’avoir été là pour écarter les doutes, soigner les blessures et partager les

joies. Cette thèse est aussi la vôtre. Un remerciement spécial pour mon père, qui sans lui, je

n’aurai jamais eu l’opportunité de continuer mes études en France et effectuer cette thèse. Je

remercie également avec grande émotion ma grand-mère Olga, ma petite sœur Dayana, mon

frère Christian et mes tantes Adèle, Leila et Jacqueline pour leur irremplaçable et

inconditionnel soutien. Voilà! Je suis arrivé au bout et mon dernier remerciement, c’est pour

toi maman. Tu

m’as fait comprendre que la vie n’est pas faite que de problèmes qu’on

pourrait résoudre grâce à des formules chimiques et des algorithmes. Ton intelligence, ta

con

fiance, ta tendresse et ton amour me réconfortent et me guident tous les jours. Merci pour

avoir fait de moi ce que je suis aujourd’hui. Est-ce un bon endroit pour dire ce genre de

choses ? Je n’en connais en tous cas pas de mauvais. Je t’aime.

v

Avant-propos

Et si c'était à refaire, recommenceriez-vous une thèse de doctorat ? …

La première approche que j’ai vécu avec le monde de la recherche a été durant le stage de M2R en Génomique et Santé que j’ai effectué avec le Pr Myrna Medlej-Hashim à l’Ecole Doctorale des Sciences et de Technologies, à l’Université Libanaise. Cette expérience, extrêmement intéressante et bénéfique du point de vue scientifique, théorique et pratique a répondu à mes aspirations personnelles et m’a poussé à vouloir poursuivre ma formation de scientifique et de chercheur. Grâce au Pr Medlej-Hashim qui m’a choisi et a cru en mes capacités, j’ai eu la chance de mener une thèse en co-tutelle entre l’Université Libanaise (Liban) et l’Université de Poitiers (France) avec la co-direction de Pr. Jean-Claude Lecron.

Le sujet de thèse qui porte sur l’étude de la physiopathologie et du caractère inflammatoire de la Fièvre Méditerranéenne Familiale (FMF) résulte d’une collaboration amorcée il y a plus de 10 ans entre le Pr. Jean-Claude Lecron et le Pr. Myrna Medlej-Hashim. Ce travail s’inscrit donc dans la continuité de cette collaboration et associe l’expertise en génétique moléculaire du Laboratoire d’Histologie, de Biologie Cellulaire et Moléculaire et d’Immunologie au Liban à celle en biologie cellulaire de l’inflammation du Laboratoire Inflammation, Tissus Epithéliaux et Cytokines (LITEC) à Poitiers, en particulier sur peau et cytokines. La partie du travail effectuée au Liban a été le recrutement des patients FMF, la mise en culture des PBMC et des PMN du sang dans différentes conditions, l’évaluation du stress oxydant et l’étude de polymorphismes et de transcrits cellulaires d’intérêt. L’autre partie effectuée au sein du LITEC a été la quantification des cytokines par ELISA et par multiplexage Luminex, ainsi que le tri de lymphocytes par FACS et la mise en culture de ces cellules. J’ai été également associé à un projet au LITEC, visant à étudier sur un modèle murin le rôle de l’IL-1 dans la cicatrisation de la plaie infectée. Le rôle de l’IL-1 a été récemment prouvé dans le processus inflammatoire de nombreuses maladies dermatologiques, notamment le psoriasis. Par conséquent, ce projet présentera un intérêt particulier pour notre étude puisqu’il aiderait à comprendre les mécanismes inducteurs des manifestations cutanées de type érythème érisipéloïde observés chez les patients atteints de FMF. Comme ce projet est toujours en cours, on ne présentera dans ce rapport que les données concernant la partie FMF.

En parallèle, grâce au cofinancement qui m’a été accordé par l’Ecole Doctorale Biosanté, la Fondation de l’Université de Poitiers et les 2 laboratoires Libanais et Poitevin,

vi

j’ai pu assister aux différentes formations, journées scientifiques et conférences requises pour l’obtention de mon diplôme. De plus, j’ai eu la chance de participer et de présenter mes résultats au 7ème congrès international de la FMF et des maladies auto-inflammatoires à Lausanne, Suisse ainsi qu’au 16ème _{colloque national cytokines de la Société Française}

d’Immunologie au Croisic, France.

Avant d’être un apport scientifique, la thèse de doctorat est une épreuve morale pour tout nouveau chercheur. On m’avait dit : « la thèse est comme un énorme vortex, un tourbillon gigantesque qui nous aspire littéralement, et il faut lutter pour vivre. On y pense sans arrêt, on se lève thèse, on vit thèse, on mange thèse, on dort thèse. Pas le choix, car si on se change les idées quelques heures, on culpabilise pendant deux jours ensuite ! ». Après avoir vécu ma propre expérience, je suis complètement d’accord que la thèse est un travail exigeant qui demande beaucoup d’énergie, de motivation, de persévérance et de réflexion intellectuelle. Durant ces 3 ans, j’ai rencontré plusieurs difficultés, notamment au niveau de la collecte des échantillons, du prélèvement de sang pour les patients FMF en crise et de la mise au point des protocoles expérimentaux. Mais, au contraire, la thèse a été également une expérience formidable durant laquelle j’ai acquis de nouvelles compétences, j’ai développé une confiance en moi, une autonomie, un esprit critique et une rigueur intellectuelle. De plus, j’ai rencontré de nouveaux amis avec qui j’ai eu l’occasion de rigoler, de voyager et de passer des moments et des soirées inoubliables. Alors, de mon point de vue, la thèse est une épreuve de longue haleine, accompagnée de grandes satisfactions et de difficultés. C’est une succession de hauts et de bas, avec plus de hauts que de bas par ailleurs. Ce fut une belle expérience que je vais probablement revivre, d’une manière différente, dans l’accompagnement d’étudiants qui vont choisir de suivre ce même chemin …

vii

RESUME

Objectifs. Afin de mieux comprendre le mécanisme physiopathologique et inflammatoire

impliqué dans la fièvre Méditerranéenne familiale (FMF), nous avons étudié le profil cytokinique ex vivo monocytaire et lymphocytaire des patients FMF. Nous avons ensuite étudié l’implication potentielle dans la FMF de la protéine RAC1, qui semble jouer un rôle dans la production de l’IL-1β, d’une part, et dans la production du stress oxydant, d’autre part. Enfin, nous avons recherché une association potentielle entre les gènes IL-1β et IL-1RA et la

susceptibilité et/ou la sévérité de la maladie.

Matériels et Méthodes. La première partie de l’étude a porté sur 34 patients FMF

génétiquement confirmés, dont 9 ont été prélevés à deux reprises, en crise et hors crise, et 24 sujets sains. Les marqueurs inflammatoires MBL et CRP ont été dosés dans le sérum par ELISA, et les cytokines ont été quantifiées par Luminex dans le sérum et les surnageants de culture de PBMC de patients et des contrôles avec ou sans stimulation des monocytes par LPS et des lymphocytes par anti-CD3/CD28.

Dans la deuxième partie de ce travail, une étude comparative des niveaux d’expression du gène RAC1 chez les patients FMF, en crise ou non, et les contrôles a été effectuée par PCR quantitative en temps réel. L’IL-1β et l’IL-6 ont été dosées par ELISA en présence ou en absence de l’inhibiteur de RAC1 dans les surnageants de culture de PBMC, avec ou sans stimulation par LPS. La quantification des marqueurs du stress oxydant a été effectuée dans le plasma ainsi que dans les surnageants de culture de PMN stimulés ou non par LPS, en présence ou en absence de l’inhibiteur de RAC1.

Les génotypes au niveau des 3 polymorphismes à la position -511, -31 et +3954 du gène de l’IL-1β ont été étudiés chez 42 patients FMF et 42 contrôles par PCR-RFLP alors que le génotype relatif au polymorphisme VNTR du gène de l’IL-1RA a été déterminé par PCR, suivie d’une simple électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

Résultats. La plupart des cytokines testées dans le sérum ont à peine été détectées chez les

patients et les contrôles. La production spontanée des cytokines pro-inflammatoires est comparable chez les patients FMF en rémission et les contrôles. Cependant, les PBMC stimulées des patients FMF produisent plus d’IL-1β, d’IL-1α, d’IL-6, d’IL-17, d’IL-22 et de TNF-α et moins d’IL-4 et d’IFN-γque les sujets sains.

Une surexpression du gène RAC1 est observée chez les patients FMF en crise par rapport aux contrôles; les niveaux les plus élevés sont associés aux patients homozygotes pour la mutation M694V. L’inhibition de la protéine RAC1 entraîne une diminution de l’IL-1β sans pour autant affecter la production d’IL-6. De plus, une diminution des taux de MDA, associée à une augmentation de la catalase et du rapport GSH/GSSG, est observée chez les patients FMF en présence de l’inhibiteur de RAC1.

Le génotype CC et l'allèle C aux positions -31 et +3954 du gène de l’IL-1β sont plus fréquemment observés chez les patients FMF que chez les contrôles, contrairement au génotype TT et à l’allèle T. Aucune différence n’est observée dans les fréquences génotypiques et alléliques du polymorphisme VNTR de l’IL-1RA.

Conclusion. Ce travail met en relief l’importance de l’étude ex vivo, qui nous a permis de

définir une signature cytokinique spécifique de la FMF. Nos résultats montrent également le rôle de la protéine RAC1 dans la production accrue d’IL-1β, cytokine dépendante de la caspase-1, et des marqueurs du stress oxydant, suggérant son implication dans le processus inflammatoire de la maladie, même en période asymptomatique. Enfin, les polymorphismes aux positions -31 et +3954 du gène IL-1β sont associés à l’apparition et/ou la sévérité de la maladie.

viii

ABSTRACT

Objectives. In order to clarify the physiopathological and inflammatory mechanism

underlying familial Mediterranean fever (FMF), we evaluated the ex vivo PBMC cytokine profile of FMF patients and compared it with that of controls. Then, we tried to study the implication of RAC1 protein in oxidative stress generation and IL-1β production in FMF patients. Finally, we aimed at investigating the possible association between IL- 1β and IL- 1ra genes and susceptibility and/ or severity of the disease.

Materials and Methods. The first part of the study included 34 genetically confirmed FMF

patients, of whom 9 were studied during attack and remission, and 24 healthy controls. Inflammatory markers CRP and MBL were measured in serum by ELISA and cytokine levels were evaluated by Luminex technology in serum and supernatants of PBMC cultures with and without 24h stimulation of monocytes by LPS and T lymphocytes by anti-CD3/CD28 beads. In the second part of this work, we compared expression levels of RAC1 gene between FMF patients, during or between crises, and controls by quantitative real-time PCR. Then, we measured spontaneous and LPS-induced production of IL-1β and IL-6 by ELISA in supernatants of PBMC cultured in the presence or absence of RAC1 inhibitor. Evaluation of oxidative stress markers was performed in plasma and in unstimlated and LPS-stimulated PMN culture supernatants in the presence or absence of RAC1 inhibitor.

Genotype and allele distribution of IL-1β polymorphisms at positions -511, -31 and +3954

were analyzed in 42 FMF patients and 42 controls by PCR-RFLP whereas IL1-ra VNTR polymorphism was identified by PCR and fragment-size analysis.

Results. Most cytokines tested were hardly detected in sera of FMF patients and controls. The

spontaneous production of pro-inflammatory cytokines was comparable in FMF patients in remission and controls. Stimulated PBMC of FMF patients produced more IL-1β, IL-1α, IL-6, IL-17, IL-22 and TNF-α and less IL-4 and IFN-γ, compared with healthy subjects.

RAC1 gene was overexpressed in FMF patients in crises compared to those in remission or to

controls; the highest levels were observed in patients homozygous for M694V. Inhibition of RAC1 protein resulted in a decrease in IL-1β levels, but not IL-6. In addition, a decrease in MDA levels, associated with an increase in catalase and GSH/GSSG ratio was reported in FMF patients in the presence of RAC1 inhibitor.

The CC genotype and C allele at positions -31 and +3954 of IL-1β gene were observed more

frequently in FMF patients than in controls, unlike the TT genotype and T allele. No significant difference was observed in the genotypic and allelic frequencies of the IL-1RA VNTR polymorphism.

Conclusion. This work highlights the importance of the ex vivo study that allowed us to

define a “specific cytokine signature” in FMF patients. Our results show the implication of RAC1 protein in the inflammatory process of FMF, even in asymptomatic periods, by enhancing the production of IL-1β, caspase-1-dependant cytokine, and generating oxidative stress. Finally, IL-1β gene polymorphisms at positions -31 and +3954 may be associated with the occurence and/or severity of the disease.

Keywords: FMF, ex vivo, cytokines, RAC1, IL-1β, oxidative stress, polymorphisms, PBMC,

ix

SOMMAIRE

Introduction _______________________________________________________________ 1 I. Recherche Bibliographique _________________________________________________ 5

I.1. Réaction inflammatoire ______________________________________________________ 6

I.1.1. Définition ______________________________________________________________________ 6 I.1.2. Activation de l’inflammation _______________________________________________________ 6 I.1.2.1. Signaux de danger exogènes: les PAMPs __________________________________________ 6 I.1.2.2. Signaux de danger endogènes: les DAMPs _________________________________________ 7 I.1.3. Les récepteurs des signaux de danger _________________________________________________ 7 I.1.3.1. Les TLR ____________________________________________________________________ 7 I.1.3.2. Les NLR ___________________________________________________________________ 9 I.1.3.2.1. Les inflammasomes ______________________________________________________ 10 I.1.4. Les différentes phases de l’inflammation _____________________________________________ 11 I.1.4.1. Phase d’initiation: phase vasculaire ______________________________________________ 11 I.1.4.2. Phase d’amplification: phase cellulaire ___________________________________________ 13 I.1.4.2.1. Initiation de la réponse immunitaire innée _____________________________________ 13 I.1.4.2.2. Déclenchement de la réponse immunitaire adaptative ____________________________ 13 I.1.4.3. Phase de résolution de l’inflammation ____________________________________________ 15

I.2. Le système du complément __________________________________________________ 16

I.2.1. Vue d’ensemble_________________________________________________________________ 16 I.2.2. Les voies d’activation du complément _______________________________________________ 17 I.2.2.1. Voie classique ______________________________________________________________ 17 I.2.2.2. Voie des lectines ____________________________________________________________ 17 I.2.2.3. Voie alterne ________________________________________________________________ 18 I.2.2.4. La voie finale commune ______________________________________________________ 19 I.2.3. Implication de la MBL dans les maladies inflammatoires et auto-immunes ___________________ 19

I.3. Réseau cytokinique et inflammation ___________________________________________ 21

I.3.1. Vue d’ensemble sur les cytokines ___________________________________________________ 21 I.3.2. Cytokines de la famille de l’IL-1 ___________________________________________________ 21 I.3.3. Cytokines monocytaires/lymphocytaires _____________________________________________ 24 I.3.3.1. L’interleukine 6 _____________________________________________________________ 24 I.3.3.2. Le tumor necrosis factor α _____________________________________________________ 26 I.3.3.3. L’interleukine 10 ____________________________________________________________ 27 I.3.4. Cytokines spécifiques des sous-populations T _________________________________________ 28 I.3.4.1. Cytokine Th1: IFN-γ _________________________________________________________ 28 I.3.4.2. Cytokine Th2: IL-4 __________________________________________________________ 28 I.3.4.3. Cytokines Th17 _____________________________________________________________ 28 I.3.4.3.1. L’interleukine 17 ________________________________________________________ 28 I.3.4.3.2. L’interleukine 22 ________________________________________________________ 29

I.4. Le stress oxydant ___________________________________________________________ 31

I.4.1. Dégâts oxydatifs ________________________________________________________________ 32 I.4.1.1. Péroxydation lipidique ________________________________________________________ 32 I.4.1.2. Oxydation des protéines ______________________________________________________ 32 I.4.1.3. Dégâts oxydatifs de l’ADN ____________________________________________________ 33 I.4.2. Systèmes antioxydants ___________________________________________________________ 33 I.4.2.1. Systèmes antioxydants enzymatiques ____________________________________________ 33

x

I.4.2.1.1. Superoxyde dismutase ____________________________________________________ 34 I.4.2.1.2. Glutathion péroxydase ____________________________________________________ 34 I.4.2.1.3. Catalase _______________________________________________________________ 35 I.4.2.2. Systèmes antioxydants non-enzymatiques _________________________________________ 35 I.4.2.2.1. Vitamines E et C ________________________________________________________ 36 I.4.2.2.2. Le système du glutathion __________________________________________________ 36

I.5. Les GTPases de la famille Rho _______________________________________________ 37

I.5.1. Vue d’ensemble_________________________________________________________________ 37 I.5.2. Structure des protéines Rho _______________________________________________________ 38 I.5.3. Cycle d’activation des Rho GTPases ________________________________________________ 38 I.5.4. La sous-famille RAC ____________________________________________________________ 39 I.5.4.1. Fonctions __________________________________________________________________ 40 I.5.4.1.1. Régulation du cytosquelette d’actine _________________________________________ 40 I.5.4.1.2. Implication des GTPases RAC dans l’immunité ________________________________ 40 I.5.4.1.3. Implication des GTPases RAC dans la production de radicaux oxygénés _____________ 41 I.5.4.1.4. Implication des GTPases RAC dans la production de l’IL-1β ______________________ 41

I.6. Les maladies auto-inflammatoires_____________________________________________ 43

I.6.1. Progrès Conceptuel des maladies auto-inflammatoires ___________________________________ 43 I.6.2. Diagnostic différentiel des FRH ____________________________________________________ 46

I.7. La fièvre Méditerranéenne familiale (FMF) ____________________________________ 48

I.7.1. Epidémiologie __________________________________________________________________ 48 I.7.2. Manifestations cliniques __________________________________________________________ 49 I.7.3. Complications __________________________________________________________________ 51 I.7.4. Critères de diagnostic ____________________________________________________________ 51 I.7.5. Le gène MEFV _________________________________________________________________ 52 I.7.6. La pyrine ______________________________________________________________________ 53 I.7.7. Facteurs modificateurs ___________________________________________________________ 54 I.7.8. Caractère inflammatoire de la FMF _________________________________________________ 55 I.7.8.1. Aspects immunocellulaires ____________________________________________________ 55 I.7.8.2. Marqueurs non spécifiques de l’inflammation______________________________________ 55 I.7.8.3. Profil cytokinique des patients FMF _____________________________________________ 56 I.7.8.4. FMF et stress oxydant ________________________________________________________ 56 I.7.9. Physiopathologie ________________________________________________________________ 57 I.7.10. Traitement ____________________________________________________________________ 59 I.7.10.1. Traitement conventionnel ____________________________________________________ 59 I.7.10.2. Nouvelles approches thérapeutiques ____________________________________________ 60

II. Matériel et Méthodes _____________________________________________________ 62

II.1. Etude du profil cytokinique chez les patients FMF ______________________________ 63

II.1.1. Sélection des patients et échantillonnage _____________________________________________ 63 II.1.2. Etude ex vivo __________________________________________________________________ 64 II.1.2.1. Séparation des PBMC _______________________________________________________ 64 II.1.2.2. Culture cellulaire ___________________________________________________________ 64 II.1.3. Quantification des marqueurs inflammatoires CRP et MBL ______________________________ 65 II.1.4. Quantification des cytokines: technologie Luminex ____________________________________ 65 II.1.5. Analyse par cytométrie de flux et tri cellulaire ________________________________________ 66 II.1.5.1. Préparation et marquage des cellules ____________________________________________ 67 II.1.5.2. Principe du trieur FACS Aria III _______________________________________________ 67 II.1.5.3. Acquisition des données et analyse de l’échantillon ________________________________ 68 II.1.5.4. Culture cellulaire et quantification des cytokines par Luminex ________________________ 70

xi

II.2. Etude de l’implication de la protéine RAC1 dans la FMF ________________________ 71

II.2.1. Etude de l’expression du gène RAC1 ________________________________________________ 71 II.2.1.1. Isolation des globules blancs __________________________________________________ 71 II.2.1.2. Extraction, quantification et contrôle de la qualité de l’ARN _________________________ 71 II.2.1.3. Transcription inverse : technique de random priming _______________________________ 72 II.2.1.4. PCR globine _______________________________________________________________ 73 II.2.1.5. PCR en temps réel __________________________________________________________ 74 II.2.1.5.1. Principe _______________________________________________________________ 74 II.2.1.5.2. Efficacité de la PCR _____________________________________________________ 75 II.2.1.5.3. Calcul de la quantité relative normalisée par un calibreur: méthode des ∆∆CT ________ 77

II.2.1.5.4. Conditions de la PCR ____________________________________________________ 78 II.2.2. Etude du rôle de la protéine RAC1 dans la production de l’IL-1β et du stress oxydant _________ 79 II.2.2.1. Sélection des patients et échantillonnage _________________________________________ 79 II.2.2.2. Etude ex vivo ______________________________________________________________ 79 II.2.2.2.1. Séparation des PBMC et des PMN __________________________________________ 79 II.2.2.2.2. Culture cellulaire ________________________________________________________ 80 II.2.2.3. Quantification de l’IL-1β et de l’IL-6____________________________________________ 80 II.2.2.4. Evaluation du stress oxydant __________________________________________________ 80 II.2.2.4.1. Système oxydant: mesure de la péroxydation lipidique __________________________ 80 II.2.2.4.2. Système de défense enzymatique: mesure de la catalase _________________________ 81 II.2.2.4.3. Système antioxydant non enzymatique: système du glutathion ____________________ 81

II.3. Etude des polymorphismes des gènes IL-1β et IL-1RA chez les patients FMF ________ 82

II.3.1. Extraction et quantification de l’ADN _______________________________________________ 82 II.3.2. Etude moléculaire des gènes IL-1β et IL-1RA _________________________________________ 82 II.4. Analyse statistique _________________________________________________________ 84

III. Résultats ______________________________________________________________ 85

III.1. Etude du profil cytokinique chez les patients FMF _____________________________ 86

III.1.1. Etude sérique _________________________________________________________________ 86 III.1.2. Etude ex vivo _________________________________________________________________ 88 III.1.2.1. Cytokines appartenant à la famille de l’IL-1 ______________________________________ 88 III.1.2.2. Cytokines monocytaires/lymphocytaires ________________________________________ 89 III.1.2.3. Cytokines spécifiques des sous-populations Th1, Th2 et Th17 _______________________ 90 III.1.3. Analyse par cytométrie de flux et tri cellulaire________________________________________ 91 III.1.4. Etude de corrélation entre les taux des cytokines pro- et anti-inflammatoires ________________ 96 III.1.5. Etude de corrélation des taux des cytokines avec les mutations du gène MEFV ______________ 97

III.2. Etude de l’implication de la protéine RAC1 dans la FMF ________________________ 98

III.2.1. Etude de l’expression du gène RAC1 _______________________________________________ 98 III.2.2. Etude du rôle de la protéine RAC1 dans la production de l’IL-1β et du stress oxydant ________ 100 III.2.2.1. Quantification des cytokines IL-1β et IL-6 ______________________________________ 100 III.2.2.2. Etude des marqueurs du stress oxydant _________________________________________ 101 III.2.2.2.1. Quantification plasmatique ______________________________________________ 101 a. Mesure de la péroxydation lipidique: dosage du MDA ______________________________ 101 b. Evaluation du système antioxydant enzymatique: dosage de la catalase ________________ 102 c. Evaluation du système non enzymatique du glutathion ______________________________ 102 III.2.2.2.2. Etude ex vivo des marqueurs du stress oxydant _______________________________ 104 a. Dosage du MDA ___________________________________________________________ 104 b. Dosage de la catalase ________________________________________________________ 104 c. Quantification du système du glutathion _________________________________________ 105

xii

III.3. Etude des polymorphismes des gènes IL-1β et IL-1RA dans la FMF ______________ 107

III.3.1. Polymorphismes de l’IL-1β _____________________________________________________ 107 III.3.2. Polymorphisme VNTR de l’IL-1RA _______________________________________________ 112 III.3.3. Etude de corrélation des taux d’IL-1β avec les polymorphismes du gène IL-1β _____________ 113

IV. Discussion ____________________________________________________________ 115

IV.1. Etude du profil cytokinique chez les patients FMF ____________________________ 116 IV.2. Etude de l’implication de la proteine RAC1 dans la FMF _______________________ 121 IV.3. Etude des polymorphismes des gènes IL-1β et IL-1RA dans la FMF ______________ 125

Conclusions et Perspectives _________________________________________________ 128 Références _______________________________________________________________ 133 Annexe:Article soumis

xiii

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN: Acide désoxyribonucléique ADNc: ADN complémentaire APC: Allophycocyanin ARN: Acide ribonucléique

ASC: Apoptosis associated Speck-like protein containing a CARD ATP: Adénosine triphosphate

BET:Bromure d’éthidium BLB: Blood lysis buffer

CANDLE: Chronic atypical neutrophilic dermatosis with lipodystrophy and elevated temperature CAPS: Cryopyrin-asssociated periodic syndrome

CARD: Caspase recruitment domain CAT: Catalase

CeRéMAI: Centre de Référence des Maladies Auto-inflammatoires Ci: Concentration initiale

CINCA: Chronic infantile neurological cutaneous and articular Cf: Concentration finale

CLR: C-type lectin receptors COX: Cyclooxygenase CRP: C reactive protein CT: Cycle threshold

Cu: Cuivre

Cytochrome P: CYP

DAMP: Danger-associated molecular pattern DDF: Death domain fold

DIRA: Deficiency of IL-1 receptor antagonist DITRA: Deficiency of IL-36 receptor antagonist

xiv

dNTP: Deoxynucleotide triphosphate

DTNB: 5-5'-DiThiobis (2-acide NitroBenzoïque) DTT: Dithiothréitol

FADD: Fas-associating protein with a death domain FCAS: Familial cold autoinflammatory syndromes FCU: Familial cold urticaria

FMF: Familial mediterranean fever FRH: Fièvres récurrentes héréditaires FSC: Forward scatter

GAP: GTPase-activating proteins

GDI: Guanine nuclotide dissociation inhibitors GEF: Guanine nucleotide exchange factors Gp: Glycoprotein GPx: Glutathion péroxydase GR: Glutathion réductase GSH: Glutathion réduit GSSG: Glutathion oxydé H2O2:Péroxyde d’hydrogène

HIDS: Hyperimmunoglobulinemia D syndrome ICE: IL-1β converting enzyme

ICL: Immunology consultant laboratory IFN: Interferon

Ig: Immunoglobuline IkB: Inhibitor of kappa B IL: Interleukine

IL-1R: IL-1 receptor IL-17R: IL-17 receptor

IL-1RA: IL-1 receptor antagonist

xv

iNOS: inducible nitric oxide synthase IRAK: IL-1 receptor-associated kinase IRF3: IFN regulatory factor 3

JAK: Janus tyrosine kinase KO: Knock out

LBP: LPS-binding protein

LOO•: Radical lipidique péroxyle LPS: Lipopolysaccharide

LRR: Leucine rich repeat

MAC: Mature membrane attack complex MAPK: Mitogen-activated protein kinase

MAPS: Mevalonate kinase associated periodic syndrome MASP: MBL-associated serine protease

MBL: Mannose binding lectin MDA: Malondialdéhyde MEFV: Mediterranean fever

MIC: Major histocompatibility complex

MICA: Major histocompatibility complex class-I-chain-related gene A MKD: Mevalonate kinase deficiency

MMP: Matrix metalloproteinase Mn: Manganèse

MWS: Muckle Wells syndrome

NALP: NACHT-LRR-PYD-containing protein NF-κB: Nuclear factor-kappa B

NIK: NF-κB-inducing kinase NK: Natural killer

NLR: Nod-like receptors

NLRP: Nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich Repeat and Pyrin domain

xvi

NLRP12AD: NLRP12 associated disorders NOD: Nucleotide-binding oligomerization domain

NOMID: Neonatal onset multisystemic inflammatory disease NTC: No template control

O2•-: Superoxyde

OH•: Hydroxyle

PAF: Platelet activating factor

PAMP: Pathogen-associated molecular pattern

PAPA: Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne Pb: Paire de bases

PBMC: Peripheral blood mononuclear cell PCR: Polymerase chain reaction

PE: Phycoerythrin

PFAPA: Periodic fever aphtous stomatis pharyngitis adenitis PHGPx: Phospholipide-hydropéroxyde glutathion péroxydase PKB: Protein kinase B

PMN: polymorphonucléaires leucocytes PNN: Polynucléaires neutrophils

PRES: Paediatric rheumatology European society PRR: Pattern recognition receptors

PYD: Pyrin domain

RAC1: Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 RFLP: Restriction fragment length polymorphism

RLR: Retinoic acid-inducible gene (RIG)-I-like receptors ROS: Reactive oxygen species

RT: Reverse transcription SAA: Serum amyloid A SSC: Side scatter

xvii

SNP: Single nucleotide polymorphism SOD: Superoxyde dismutase

STAT: Signal transducer and activator of transcription SVF:Sérum de veau fœtal

Ta: Annealing temperature

TACE: TNF-α converting enzyme TBA: Thiobarbituric acid

TE: Tris-EDTA

TGF: Transforming growth factor Th0: T CD4 naïfs

TIR: Toll-interleukin-1 receptor TLR: Toll-like receptors

TNF: Tumor necrosis factor TNB: 5-Thio-2-nitrobenzoate

TRADD: Tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain TRAF: TNF receptor-associated factor

TRAPS: Tumor necrosis factor receptor periodic syndrome Treg: T régulateur

TRIF: TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β UV: Ultraviolet

VNTR: Variable number of tandem repeats WLB: White lysis buffer

χ2

: Chi 2 Zn: Zinc

4-HNE: 4-hydroxynonenal

xviii

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Structure simplifiée des récepteurs à domaine TIR __________________________ 8 Figure 2. (A) Détection des acides nucléiques des agents pathogènes par certains TLR, (B) Signalisation engendrée par l’activation du TLR4 __________________________ 9

Figure 3. Structure des NLR __________________________________________________ 10 Figure 4. Schéma simplifié de la phase précoce du processus inflammatoire ____________ 12 Figure 5. Modèle de polarisation des lymphocytes T CD4 naïfs ______________________ 15 Figure 6. Représentation schématique simplifiée du système du complément ____________ 17 Figure 7. Les trois voies d’activation du système du complément _____________________ 18

Figure 8. Représentation schématique du gène de la MBL, des polymorphismes identifiés et de la protéine fonctionnelle __________________________________________ 20 Figure 9. Représentation schématique des principaux SNP étudiés au niveau des gènes IL-1β,

IL-1α et IL-1RA (également appelé IL1RN) ______________________________ 23

Figure 10. Rôle de l’IL-6 dans la chronicisation de l’inflammation ____________________ 25

Figure 11. Voies de signalisation de TNFR1 et TNFR2 _____________________________ 27 Figure 12. Voie de signalisation de l’IL-22 ______________________________________ 30

Figure 13. Schéma des différentes formes de ROS _________________________________ 32 Figure 14. Schéma des défenses antioxydantes enzymatiques ________________________ 34 Figure 15. Elimination du H2O2 par les réactions enzymatiques combinées de la GPx et de la

GR ____________________________________________________________ 35 Figure 16. Exemple de réactions antioxydantes en chaîne mettant en jeu les vitamines E et C

_______________________________________________________________ 36 Figure 17. La classification des 6 sous-familles de la superfamille RAS ________________ 37

xix

Figure 18. Schéma représentant la structure générale des petites Rho GTPases __________ 38 Figure 19. Cycle d’activation des Rho GTPases ___________________________________ 39

Figure 20. Rôle de la protéine RAC1 dans l’activation de la NADPH oxydase ___________ 41 Figure 21. Modèle schématique représentant l’activation de la caspase-1 par la protéine RAC1

_______________________________________________________________ 42 Figure 22. Le concept de classification des maladies inflammatoires __________________ 44 Figure 23. Classification non exhaustive des maladies auto-inflammatoires (gènes en cause) par le CeRéMAI __________________________________________________ 45 Figure 24. Voies de diffusion de la FMF dans le monde entier _______________________ 48 Figure 25. Les différentes variantes du gène MEFV ________________________________ 52 Figure 26. Schéma représentant (A) la structure de la pyrine et (B) les interactions homotypiques du domaine PYD ______________________________________ 54 Figure 27. Modèles schématiques représentant le rôle (A) anti-inflammatoire et (B)

pro-inflammatoire de la pyrine dans la FMF _______________________________ 58 Figure 28. Les approches thérapeutiques ciblant l’IL-1 _____________________________ 61

Figure 29. Séparation des PBMC du sang périphérique par centrifugation sur coussin de Ficoll _______________________________________________________________ 64 Figure 30. (A) Schéma simplifié du système de détection des billes par double laser, (B) logiciel d’acquisition permettant le suivi et la classification des billes ________ 66 Figure 31. (A) Représentation schématique d’un trieur de cellules, (B) Visualisation du «break-off point» sous éclairage stroboscopique _________________________ 68 Figure 32. Caractérisation des sous-populations (A) lymphocytaires et (B) monocytaires __ 70 Figure 33. Gel d’agarose permettant de visualiser la qualité de l’ARN _________________ 72

xx

Figure 34. Vérification des échantillons RT-et NTC par amplification d’une partie du gène de la globine _______________________________________________________ 73 Figure 35. Système de détection par le SYBR Green _______________________________ 74 Figure 36. Illustration de la fluorescence émise au cours du temps d’une PCR en temps réel 75 Figure 37. Droite standard permettant de calculer l’efficacité du gène cible et des endogènes testés ___________________________________________________________ 76 Figure 38. (A) Principe et (B) illustration d’analyse de la courbe de fusion _____________ 77

Figure 39. Séparation des PMN et des PBMC par gradient de densité sur Polymorphprep __ 79 Figure 40. Principe de dosage du glutathion total basé sur la réaction entre le DTNB et la GSH ___________________________________________________________ 81 Figure 41. Corrélation entre les taux de la CRP et des cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-6 chez les patients FMF évalués en crise et hors crise __________________ 87 Figure 42. Taux des cytokines appartenant à la famille de l’IL-1 dans les surnageants de culture de PBMC des contrôles et des patients FMF hors crise et en crise avec et sans stimulation par le LPS _________________________________________ 88 Figure 43. Taux des cytokines monocytaires/lymphocytaires dans les surnageants de culture de PBMC des contrôles et des patients FMF hors crise et en crise avec et sans stimulation par le LPS ou les billes anti-CD3/CD28 ______________________ 89 Figure 44. Taux des cytokines spécifiques des sous-populations T dans les surnageants de culture de PBMC des contrôles et des patients FMF hors crise et en crise avec et sans stimulation par les billes anti-CD3/CD28 __________________________ 90 Figure 45. Présentation graphique des résultats de la purification (A) des lymphocytes et (B) des monocytes par FACS ___________________________________________ 92 Figure 46. Taux des cytokines IL-1β, IL-1α et IL-1RA dans les surnageants de culture de PBMC, de monocytes et de lymphocytes avec ou sans stimulation des cellules par LPS ou anti-CD3/CD28 ____________________________________________ 93

xxi

Figure 47. Taux des cytokines IL-6, TNF-α et IL-10 dans les surnageants de culture de PBMC, de monocytes et de lymphocytes avec ou sans stimulation des cellules par LPS ou anti-CD3/CD28 ____________________________________________ 94 Figure 48. Taux des cytokines IFN-γ, IL-4 et IL-17 dans les surnageants de culture de PBMC, de monocytes et de lymphocytes avec ou sans stimulation des cellules par LPS ou anti-CD3/CD28 __________________________________________________ 95 Figure 49. Corrélation entre les taux des cytokines dans les surnageants de culture de PBMC avec ou sans stimulation par le LPS ___________________________________ 96 Figure 50. Corrélation entre les génotypes des patients FMF et la production induite des cytokines par les PBMC issues de ces patients __________________________ 97 Figure 51. Niveaux d’expression du gène RAC1 chez les patients FMF hors crise et les contrôles ________________________________________________________ 98 Figure 52. Corrélation entre les génotypes des patients FMF et les niveaux d’expression du gène RAC1 chez ces patients ________________________________________ 99 Figure 53. Moyenne des niveaux d’expression du gène RAC1 chez les patients FMF, en crise ou non, et les contrôles ____________________________________________ 100 Figure 54. Taux (A) d’IL-1β et (B) d’IL-6 dans les surnageants de culture de PBMC des patients FMF et des contrôles _______________________________________ 101 Figure 55. Taux plasmatiques du MDA chez les contrôles et les patients FMF __________ 102 Figure 56. Taux plasmatiques de la catalase chez les contrôles et les patients FMF ______ 102 Figure 57. Quantification du système non enzymatique du glutathion dans le plasma des patients et des contrôles. (A) Taux du glutathion total, (B) taux du glutathion réduit et (C) rapport GSH/GSSG chez les patients FMF et les contrôles _____ 103 Figure 58. Taux de MDA dans les surnageants de culture de PMN des patients FMF et des contrôles _______________________________________________________ 104 Figure 59. Taux de la catalase dans les surnageants de culture de PMN des patients FMF et des contrôles ____________________________________________________ 105

xxii

Figure 60. Quantification du système non enzymatique du glutation dans les surnageants de culture de PMN des patients et des contrôles. (A) Taux du glutathion total, (B) taux du glutathion réduit et (C) rapport GSH/GSSG chez les patients FMF et les contrôles _______________________________________________________ 106 Figure 61. Produit d’amplification du polymorphisme IL-1β (-511) (rs16944) __________ 107

Figure 62. Produit d’amplification du polymorphisme IL-1β (-31) (rs1143627) _________ 108 Figure 63. Produit d’amplification du polymorphisme IL-1β (+3954) (rs1143634) ______ 108

Figure 64. Gel d’électrophorèse montrant les produits de la digestion par AvaI au niveau du SNP IL-1β (-511) (rs16944) ____________________________________ 109 Figure 65. Gel d’électrophorèse montrant les produits de la digestion par AluI au niveau du SNP IL-1β (-31) (rs1143627) _______________________________________ 109 Figure 66. Gel d’électrophorèse montrant les produits de la digestion par Taqα1 au niveau du SNP IL-1β (+3954) (rs1143634). ____________________________________ 110 Figure 67. Gel d’électrophorèse montrant les produits d’amplification de la séquence de 86 pb répétée en tandem au niveau du gène IL-1RA __________________________ 112 Figure 68. Corrélation entre les taux d’IL-1β et les génotypes des polymorphismes (A) IL-1β (-31) et (B) IL-1β (+3954) _________________________________________ 114 Figure 69. Modèle schématique résumant les différents mécanismes qui sous-tendent le caractère inflammatoire de la FMF __________________________________ 130

xxiii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Caractéristiques génétiques, cliniques et biologiques des fièvres récurrentes héréditaires _____________________________________________________ 47 Tableau 2. Signes cliniques de la FMF __________________________________________ 50 Tableau 3. Programme d’amplification de la PCR globine __________________________ 73 Tableau 4. Programme d’amplification de la PCR en temps réel ______________________ 78

Tableau 5. Composition du mélange réactionnel de la PCR __________________________ 83 Tableau 6. Détails des conditions expérimentales et des produits de PCR _______________ 83 Tableau 7. Produits des digestions par les enzymes de restriction utilisées ______________ 84 Tableau 8. Taux sériques des cytokines et des protéines de la phase aiguë de l’inflammation chez les patients FMF et les sujets sains _______________________________ 86 Tableau 9. Distribution génotypique des polymorphismes de l’IL-1β chez les patients FMF et les contrôles ____________________________________________________ 111 Tableau 10. Distribution allélique des 3 SNPs IL-1β (-511), IL-1β (-31) et IL-1β (+3954) chez

les patients FMF et les contrôles ____________________________________ 111 Tableau 11. Distribution génotypique du polymorphisme VNTR de l’IL-1RA chez les patients FMF et les contrôles ______________________________________________ 113 Tableau 12. Fréquences alléliques du polymorphisme VNTR de l’IL-1RA chez les patients et les contrôles ____________________________________________________ 113

2

Les fièvres récurrentes héréditaires, qui constituent le groupe prototype des maladies auto-inflammatoires, sont des pathologies rares d’origines génétiques variées, comportant des symptômes redondants et caractérisées par des épisodes fébriles de quelques jours à quelques semaines, séparées par des intervalles asymptomatiques de durée variable. La fièvre Méditerranéenne familiale (FMF) représente la pathologie la plus ancienne, la plus fréquente et la mieux étudiée. C’est une maladie autosomique récessive, fréquemment observée dans les populations du bassin méditerranéen. Elle est caractérisée par des accès répétés de fièvre accompagnés de douleurs abdominales, thoraciques, articulaires et/ou cutanées et éventuellement associés à une inflammation péritonéale, pleurétique et synoviale. Le traitement préventif des crises et de ses complications consiste à la prise régulière de la colchicine à vie.

La découverte du gène MEFV en 1997 a fortement contribué à la connaissance de la FMF et constitue actuellement le principal outil de diagnostic de la maladie. Cependant, ce gène à lui seul, ne permet pas d’expliquer les grandes variabilités qui existent entre les patients FMF, notamment au niveau de la présentation clinique de la maladie, la réponse à la colchicine ainsi que l’âge d’apparition de la maladie, d’autant plus qu’une seule mutation du gène MEFV est détectée chez un nombre non négligeable de patients FMF. Ce fait suggère la présence d’autres facteurs génétiques et/ou environnementaux impliqués dans la susceptibilité et/ou la sévérité de la maladie.

Le gène MEFV code pour la protéine pyrine/marénostrine exprimée essentiellement dans les polynucléaires neutrophiles et éosinophiles ainsi que dans les monocytes. Bien que la fonction de la pyrine ait fait récemment l’objet de multiples recherches, elle est à ce jour encore sujette à controverse. Cependant, quelle que soit la conséquence moléculaire des mutations du gène MEFV, une sécrétion exacerbée de cytokines pro-inflammatoires, dont l’IL-1β est observée. Malgré le rôle important que joue l’IL-1β dans la pathogenèse des maladies auto-inflammatoires, il a été impossible de la détecter dans le sérum des patients atteints de CAPS (Cryopyrin-asssociated periodic syndrome) et de NLRP12AD (NLRP12-associated disorder), probablement parce que les cytokines sont des molécules immunorégulatrices avec une courte demi-vie. Leur dosage sérique est difficile et dépend de plusieurs facteurs tels que la collecte, le traitement et la conservation des échantillons. Pour cela, l’étude ex vivo a été récemment considérée comme une approche alternative et intéressante pour étudier l’implication des cytokines, surtout celles non détectées dans le

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sérum, dans les maladies inflammatoires et auto-inflammatoires. Cette approche a déjà permis de montrer une hyperproduction spontanée ex vivo d’IL-1β par les PBMC des patients présentant des mutations au niveau des gènes NLRP3 et NLRP12, responsables des maladies auto-inflammatoires CAPS et NLRP12AD, respectivement.

La production accrue d’IL-1β a été associée récemment à plusieurs médiateurs inflammatoires notamment la protéine RAC1, dont le rôle a été étudié dans la MKD (Mevalonate kinase deficiency), mais jamais investigué dans la FMF. De nombreuses études ont porté également sur l’étude de la régulation de l’inflammation par les cytokines et les espèces réactives oxygénées ainsi que sur les populations cellulaires impliquées dans la FMF, sans pour autant clarifier les mécanismes responsables du processus pathologique sous-jacent. Les résultats obtenus sont variables et parfois contradictoires, justifiant une nouvelle étude approfondie en vue de confirmer les différentes cellules et marqueurs inflammatoires susceptibles d’intervenir dans la pathogenèse de la FMF.

Afin de mieux comprendre la physiopathologie et les mécanismes qui sous-tendent le caractère inflammatoire de la FMF, notre travail consistera en un premier temps à quantifier les marqueurs inflammatoires, CRP et MBL, ainsi que les cytokines pro- et anti-inflammatoires, dans le sérum des patients FMF, en crise ou non, et des contrôles. Les taux des cytokines seront également évalués dans les surnageants de culture de PBMC des patients et des contrôles avec ou sans stimulation des monocytes par LPS et des lymphocytes par anti-CD3/CD28. L’étude des sécrétions ex vivo de cytokines monocytaires (cytokines de la famille de l’IL-1 dépendantes de la caspase-1 ou non) et lymphocytaires (Th1, Th2 et Th17) vise à mieux comprendre le rôle de l’inflammasome à pyrine dans la physiopathologie de la FMF. Elle permettra aussi de définir et de valider des « signatures cytokiniques » d’hyper ou d’hypo sécrétion en vue de donner des orientations sur le statut inflammatoire des patients FMF.

En vue de rechercher un lien potentiel entre l’IL-1β, la protéine RAC1 et le stress oxydant, une deuxième approche consistera à étudier, d’une part, l’expression du gène RAC1 chez les patients FMF en crise et hors crise comparés aux sujets sains et, d’autre part, l’influence de l’inhibition de la protéine RAC1 sur la production spontanée et induite d’IL-1β et de ROS chez les patients et les contrôles. L’étude de corrélation des sécrétions ex vivo d’IL-1β et de ROS avec l’activité de la protéine RAC1 et les différentes mutations du gène MEFV procurera une meilleure compréhension du mécanisme physiopathologique dans lequel est

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impliquée la protéine pyrine/marénostrine. En fonction des résultats obtenus, plusieurs molécules pourraient ainsi se révéler comme cibles thérapeutiques dans les fièvres périodiques héréditaires, en particulier la FMF.

Enfin, pour tenter de comprendre l’éventuel rôle de l’IL-1β et de l’IL-1RA comme gènes modificateurs de la maladie, nous évaluerons les fréquences génotypique et allélique des polymorphismes IL-1β (-511), IL-1β (-31), IL-1β (+3954), ainsi que du VNTR au niveau du gène IL-1RA chez les patients FMF et les contrôles. Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre, d’une part, la production exacerbée d’IL-1β observée chez les patients FMF et, d’autre part, l’hétérogénéité clinique caractérisant cette maladie.

5

6

I.1. REACTION INFLAMMATOIRE

I.1.1. Définition

La réaction inflammatoire est une réponse physiologique de l’organisme contre toute agression d’origine exogène (cause infectieuse, traumatique) ou endogène (par exemple cause immunologique). La fonction première de la réaction inflammatoire est d’éliminer ou d’isoler l’agent pathogène du reste de l’organisme et de permettre la réparation du tissu lésé [1]. Cette réponse rapide et organisée, dénommée inflammation aiguë, est un phénomène bénéfique pour l’organisme qui peut ainsi retrouver son intégrité physiologique. Une réponse insuffisante conduit à une immunodéficience pouvant entraîner une infection secondaire ou un cancer. Exacerbée ou mal contrôlée, au contraire, elle devient agressive et peut s’étendre au reste de l’organisme via la circulation sanguine conduisant ainsi à des dommages tissulaires irréversibles locaux ou généralisés. Dans ce cas, elle peut être associée à une variété de situations pathologiques et parfois à un choc septique entraînant dans les cas les plus graves le décès [2]. La réponse inflammatoire peut-être divisée en deux branches interconnectées : l’immunité naturelle innée, la plus ancienne, et l’immunité adaptative. Les cellules du système immunitaire inné possèdent des récepteurs, les PRR (Pattern recognition receptors), et des voies de signalisation hautement conservés pour détecter et réagir face à un signal de danger. La détection de ces signaux exogènes d’origine microbienne, les PAMPs (Pathogen-associated molecular pattern), ou endogènes, les DAMPS (Danger-associated molecular pattern) ou alarmines, va conduire à l’initiation de la cascade inflammatoire et à l’activation d’une réponse immunitaire acquise ou adaptative [3]. A côté de ces signaux, le processus inflammatoire peut également être déclenché en absence de toute infection ou traumatisme, notamment lors de pathologies dites «auto-inflammatoires», parmi lesquelles les fièvres périodiques héréditaires.

I.1.2.

Activation de l’inflammation

I.1.2.1. Signaux de danger exogènes: les PAMPs

Les PAMPs sont des structures moléculaires spécifiques à des familles de microorganismes qui ne font en général pas partie du soi [4]. Parmi ceux-ci, on trouve le lipopolysaccharide (LPS), les protéines liant le mannose ainsi que les protéines du

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complément [5]. La reconnaissance des PAMPs par les cellules exprimant leurs récepteurs, les PRR, constitue le principal mécanisme d’induction de l’inflammation.

I.1.2.2. Signaux de danger endogènes: les DAMPs

Pour pouvoir différencier les molécules endogènes et exogènes qui entraînent un signal de danger dans la cellule, le terme d’alarmine a été proposé en 2007 par Oppenheim [6]. Les alarmines sont des signaux de danger endogènes libérés rapidement après la mort cellulaire non programmée (nécrose) mais non par les cellules apoptotiques. Elles recrutent et activent les cellules dendritiques et donc initient directement ou indirectement les réponses immunitaires adaptatives. Elles participent également au retour à l’homéostasie en promouvant la reconstruction du tissu lésé [7]. Les peptides antimicrobiens S100A8 et S100A9 ainsi que l’interleukine-(IL)-1α et l’IL-33 sont considérés comme des alarmines [8]. Les cristaux d’acide urique sont également des DAMPS, comme nous le verrons en étudiant l’inflammasome.

I.1.3. Les récepteurs des signaux de danger

Les récepteurs des signaux de danger peuvent être classés en 4 grandes catégories : les récepteurs de type Toll (TLR pour Toll-like receptors), les récepteurs de type Nod (NLR pour Nod-like receptors), les hélicases de type RIG (RLR pour Retinoic acid-inducible gene (RIG)-I-like receptors) et les lectines de type C (CLR pour C-type lectin receptors). Ces récepteurs sont exprimés dans différentes cellules de l’immunité innée telles que les macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques ainsi que dans d’autres cellules comme les cellules épithéliales et endothéliales [3–5].

I.1.3.1. Les TLR

Parmi les PRR, la famille des TLR est la plus étudiée. Jusqu’à présent, 10 TLR fonctionnels ont été identifiés chez l’homme, et 13 chez la souris. Il s’agit de protéines transmembranaires contenant dans leur domaine extracellulaire une région riche en leucines (LRR pour Leucine rich repeat) et un segment intracytoplasmique avec une région conservée appelée Toll/IL-1 receptor (TIR pour Toll-interleukin 1 receptor) commune à ces récepteurs et aux récepteurs pour l'IL-1 (IL-1R pour IL-1 receptor) [9] (Figure 1).

8

Figure 1. Structure simplifiée des récepteurs à domaine TIR [9]

La stimulation des TLR par les PAMPs est à l'origine d'une cascade d'activation moléculaire intracellulaire conduisant à la translocation nucléaire de facteurs de transcription régulant l’expression de gènes impliqués dans la réponse inflammatoire, notamment des cytokines [5,10]. Certains TLR, comme le TLR9, sont chargés de repérer les motifs CpG non méthylés de l’ADN d’agents pathogènes après leur passage à l’intérieur de la cellule (Figure

2A). Récemment, le TLR9 a été aussi impliqué dans les mécanismes inflammatoires

développés au cours de certaines maladies auto-immunes. En reconnaissant des molécules d’ADN faisant partie des complexes immuns anticorps antinucléaire/ADN, il induit la stimulation des cellules immunitaires et la production des chimiokines et des cytokines telles que l’IL-8 et l’IFN-α [10,11]. La réponse aux TLR est classée selon l’implication ou non de la voie de signalisation dépendante de MyD88, la principale protéine adaptatrice utilisée par les TLR. Par exemple, l’activation du TLR4 par le LPS engendre les deux voies de signalisation simultanément. La voie dépendante de MyD88 conduit à la translocation du facteur de transcription NF-κB (Nuclear factor-kappa B) et à l’activation des MAPK (Mitogen-activated protein kinase) induisant ainsi l’expression de cytokines pro-inflammatoires, tels l’IL-6, le pro-IL-1β ou le TNF-α (Tumor necrosis factor α). D’autre part, la voie dépendante de TRIF (TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β), indépendante de MyD88, conduit à l’activation tardive de NF-κB et à la translocation du facteur de transcription IRF3 (IFN regulatory factor 3), responsable de l’expression du gène codant l’IFN-β (IFN pour Interferon) [10]. Cependant, le TLR4 ne peut pas directement reconnaître le LPS. Il doit préalablement être opsonisé par la protéine circulante LBP (LPS-binding protein), et ce complexe LBP-LPS peut alors être reconnu par le CD14, une protéine

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membranaire que l’on retrouve essentiellement à la surface des monocytes. C’est l’association moléculaire LPS-LBP-CD14 qui va interagir avec le TLR4 par l’intermédiaire de la protéine adaptatrice MD2 [11] (Figure 2B).

A B

Figure 2. (A) Détection des acides nucléiques des agents pathogènes par certains TLR, [10], modifié, (B) Signalisation engendrée par l’activation du TLR4 [12]

I.1.3.2. Les NLR

Les NLR forment une famille de récepteurs de l’immunité innée présents dans le cytoplasme, et donc capables de reconnaître des PAMPs intracellulaires. Bien qu’ayant une forte homologie de séquence, les NLR peuvent être divisés en deux sous-familles selon leurs différences de transduction du signal. Cette différence est liée à leur structure, particulièrement à leur partie N-terminale. En effet, les NLR sont constitués de trois parties [13]

(Figure 3):

 un domaine N- terminal d’interaction protéine- protéine qui peut être:

 un domaine de recrutement de caspase (CARD pour Caspase recruitment domain) pour les protéines NOD (Nucleotide-binding oligomerization domain)  un domaine de liaison à la pyrine (PYD pour Pyrin domain) pour les protéines

NLRP (Nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich Repeat and