ET IL-1RA DANS LA FMF

Afin d’étudier un potentiel effet de polymorphismes des gènes IL-1β et IL-1RA sur l’apparition de la FMF, nous avons recherché une association possible de 3 polymorphismes au niveau du gène IL-1β et 1 polymorphisme au niveau du gène IL-1RA avec la maladie. Pour

cela, l’ADN génomique a été extrait de 42 patients FMF, génétiquement confirmés, parmi lesquels 30 ont participé à l’étude ex vivo décrite dans la première partie, et 42 sujets sains.

III.3.1. Polymorphismes de l’IL-1β

Les régions du gène IL-1β comportant les polymorphismes d’intérêt, à la position -511, -31

et +3954 ont été amplifiées par PCR ; les produits étant respectivement une bande de 305 pb, 239 pb et 249 pb (Figures 61, 62 et 63).

Figure 61. Produit d’amplification du polymorphisme IL-1β (-511) (rs16944). Les échantillons déposés au niveau des puits 1 à 5 présentent une bande spécifique de 305 pb. Le puits 6 correspond au contrôle négatif. Un marqueur de taille 100 pb est déposé dans le premier puits à gauche.

1 2 3 4 5 6

108

Figure 62. Produit d’amplification du polymorphisme IL-1β (-31) (rs1143627). Les échantillons déposés au niveau des puits 1 à 5 présentent une bande spécifique de 239 pb. Le puits 6 correspond au contrôle négatif. Un marqueur de taille 100 pb est déposé dans le premier puits à gauche.

Figure 63. Produit d’amplification du polymorphisme IL-1β (+3954) (rs1143634). Les échantillons déposés au niveau des puits 1 à 5 présentent une bande spécifique de 249 pb. Le puits 6 correspond au contrôle négatif. Un marqueur de taille 100 pb est déposé dans le premier puits à gauche.

Les produits de PCR sont ensuite digérés respectivement par les enzymes de restriction AvaI, AluI et Taqα1. Les produits de digestion figurent respectivement dans les Figures 64, 65 et 66. 100 200 400 500 300 1000

1 2 3 4 5 6

109

Figure 64. Gel d’électrophorèse montrant les produits de la digestion par AvaI au niveau du SNP IL-1β (-511) (rs16944).Les sujets homozygotes pour l’allèle T présentent une seule bande de 305 pb alors que les sujets ayant le génotype CC présentent 2 bandes de taille 190pb et 115 pb. Les sujets hétérozygotes pour ce polymorphisme montrent 3 bandes de taille 305, 190 et 115 pb. Un marqueur de taille 100 pb est déposé dans le premier puits à gauche.

Figure 65. Gel d’électrophorèse montrant les produits de la digestion par AluI au niveau du SNP IL-1β (-31) (rs1143627). La présence d’une seule bande de 239 pb correspond aux sujets homozygotes pour l’allèle C. La substitution de l’allèle C en T conduit à la création d’un site de restriction et, par conséquent, à la visualisation de 2 bandes de 137 pb et 102 pb chez les sujets homozygotes pour cet allèle. Les sujets hétérozygotes pour cet allèle présentent les 3 bandes simultanément. Un marqueur de taille 100 pb est déposé dans le premier puits à gauche.

239 bp 137 bp 102 bp 100 200 300 400 500 1000 100 200 300 400 500 1000 305 bp 190 bp 115 bp

110

Figure 66. Gel d’électrophorèse montrant les produits de la digestion par Taqα1 au niveau du SNP IL-1β (+3954) (rs1143634). Les sujets possédant uniquement l'allèle T n'ont pas le site de restriction et présentent par la suite une bande non coupée équivalente à la bande amplifiée de 249pb, alors que les sujets homozygotes pour l’allèle C créant le site de restriction de Taqα1 montrent deux bandes de 135 pb et 114 pb. Enfin, la visualisation des 3 bandes correspond aux sujets hétérozygotes pour cet allèle. Un marqueur de taille 100 pb est déposé dans le premier puits à gauche.

Les fréquences génotypiques et alléliques des polymorphismes du gène de l’IL-1β sont représentées dans les Tableaux 9 et 10. L’analyse des résultats montre une fréquence plus

élevée du génotype CC et de l’allèle C et plus faible du génotype TT et de l’allèle T pour les 2 polymorphismes IL-1β (-31) et IL-1β (+3954) chez les patients FMF par rapport aux contrôles. Cependant, aucune différence significative n’est signalée au niveau des fréquences génotypiques et alléliques du polymorphisme IL-1β (-511) entre les patients et les contrôles.

249 bp 135 bp 114 bp 100 200 300 400 500 1000

111

Tableau 9. Distribution génotypique des polymorphismes de l’IL-1β chez les patients FMF et les contrôles Contrôles n (%) Patients FMF n (%) χ 2 p IL-1β (-511) CC TT TC 17 (40,5%) 6 (14,3%) 19 (45,2%) 8 (19%) 6 (14,3%) 28 (66,7%) 4,96 0,083 IL-1β (-31) CC TT TC 6 (14,3%) 17 (40,5%) 19 (45,2%) 12 (28,6%) 7 (16,6%) 23 (54,8%) 6,55 0,038* IL-1β (+3954) CC TT TC 14 (33,4%) 9 (21,4%) 19 (45,2%) 22 (52,4%) 1 (2,4%) 19 (45,2%) 8,18 0,017*

n: nombre de sujets, * p < 0.05 basée sur le test de χ2

Tableau 10. Distribution allélique des 3 SNPs IL-1β (-511), IL-1β (-31) et IL-1β (+3954) chez les patients FMF et les contrôles

Contrôles n (%) Patients FMF n (%) p IL-1β (-511) C T 53 (63,1%) 31 (36,9%) 44 (52,4%) 40 (47,6%) 0,211 IL-1β (-31) C T 31 (36,9%) 53 (63,1%) 47 (56%) 37 (44%) 0,020* IL-1β (+3954) C T 47 (56%) 37 (44%) 63 (75%) 21 (25%) 0,015*

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III.3.2. Polymorphisme VNTR de l’IL-1RA

La séquence de 86 pb répétée en tandem au niveau du gène IL-1RA a été amplifiée par PCR. Les différents produits amplifiés sont représentés dans la Figure 67.

Figure 67. Gel d’électrophorèse montrant les produits d’amplification de la séquence de 86 pb répétée en tandem au niveau du gène IL-1RA. Les quatre allèles détectés sont les suivants : allèle 1 (4 répétitions=410 pb), allèle 2 (2 répétitions=240 pb), allèle 3 (5 répétitions=500 pb) et allèle 4 (3 répétitions=325 pb). Parmi les 15 génotypes possibles, compte tenu des 5 allèles observés jusqu’à présent au niveau de ce prolymorphisme, seulement les six représentés dans la figure sont observés dans notre étude : 1/1 (sujets 2, 5, 7 et 8), 1/2 (sujet 3), 1/3 (sujet 9) et 1/4 (sujet 6), 2/2 (sujet 1), et 2/3 (sujet 4). Un marqueur de taille 100 pb est représenté dans le puits à gauche.

Les distributions génotypique et allélique du polymorphisme de l’IL-1RA figurent

respectivement dans les Tableaux 11 et 12. Parmi les quatre allèles observés chez les groupes

de patients et de contrôles, l’allèle 1 est le plus fréquent dans les 2 groupes, suivi de l’allèle 2, alors que la fréquence des allèles 3 et 4 est trouvée inférieure à 5%, résultats en accord avec des études précédentes [86]. Six génotypes sont identifiés dans notre population. La plupart des sujets ont soit le génotype 1/1 soit 1/2. La prévalence des autres génotypes est généralement inférieure à 10%. L’analyse des résultats ne montre pas de différence significative au niveau des fréquences allélique et génotypique entre les malades et les contrôles.

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Tableau 11. Distribution génotypique du polymorphisme VNTR de l’IL-1RA chez les patients FMF et les contrôles

Génotypes IL-1RA Contrôles n (%) Patients FMF n (%) χ 2 p 1/1 1/2 1/3 1/4 2/2 2/3 17 (40,5%) 21 (49,9 %) 1 (2,4%) 1 (2,4%) 2 (4,8%) 0 (0%) 24 (57,1%) 11 (26,2%) 1 (2,4%) 1 (2,4%) 4 (9,5%) 1 (2,4%) 5,98 0,307 n: nombre de sujets

Tableau 12. Fréquences alléliques du polymorphisme VNTR de l’IL-1RA chez les patients et les contrôles

Allèles IL-1RA Contrôles n (%) Patients FMF n (%) χ 2 p 1 2 3 4 57 (67,8%) 25 (29,8%) 1 (1,2%) 1 (1,2%) 61 (72,6%) 20 (23,8%) 2 (2,4%) 1 (1,2%) 1,02 0,795 n: nombre d’allèles

III.3.3. Etude de corrélation des taux

d’IL-1β avec les

polymorphismes du gène IL-1β

Les taux d’IL-1β les plus élevés sont observés chez les patients présentant le génotype CC pour le polymorphisme IL-1β (-31). En effet, ces derniers présentent une production induite d’IL-1β 1.5 et 2.5 fois plus importante, comparée aux patients avec les génotypes TC et TT, respectivement (Figure 68A). Par contre, il n’y a pas de corrélation entre les taux d’IL- 1β et le polymorphisme IL-1β (+3954); la production spontanée ou induite de cette cytokine étant comparable dans les 3 groupes (Figure 68B).

114 A B CC TC TT 0 5000 10000 15000 20000 25000 ** * IL -1  ( p g /m l) CC TC TT 0 5000 10000 15000 20000 25000 IL -1  ( p g /m l)

Figure 68. Corrélation entre les taux d’IL-1β et les génotypes des polymorphismes (A) IL-1β (-31) et (B) IL-1β (+3954). Les barres d’erreur correspondent aux valeurs d’IL-1β minimales et

maximales. L’analyse des variances entre les 3 différents groupes est évaluée par le test non paramétrique One Way Anova suivi par le test «post-hoc» de Tukey. * p < 0.05 ; ** p < 0.001.

115

116

IV.1. ETUDE DU PROFIL CYTOKINIQUE CHEZ LES

PATIENTS FMF

Récemment, la mise en évidence d’une sécrétion accrue d’IL-1β, dépendante de l’activation de la caspase-1 au sein d’un inflammasome, a ouvert de nouvelles perspectives sur la pathogenèse des maladies auto-inflammatoires. Afin de déterminer le mécanisme inflammatoire impliqué dans la FMF, notre travail a consisté en un premier temps à étudier les taux sériques des cytokines pro- et anti-inflammatoires et des marqueurs inflammatoires, CRP et MBL, chez les patients Libanais atteints de FMF, pendant ou en dehors des crises, et de les comparer aux taux mesurés chez des sujets sains. Les taux sériques ont été aussi comparés au profil ex vivo qui vise à étudier la production spontanée et induite des cytokines chez les patients et les contrôles dans les surnageants de cultures de PBMC. L’analyse du profil ex vivo des cytokines monocytaires de la famille de l’IL-1, dépendantes de la caspase-1 ou non, des cytokines monocytaires/lymphocytaires IL-6, TNF-α et IL-10 et du profil lymphocytaire T nous a permis de mieux comprendre le rôle de l’inflammasome dans la FMF et de définir des « signatures cytokiniques » d’hyper ou d’hypo sécrétion en vue de donner des orientations sur le statut inflammatoire de ces patients.

La MBL est une protéine de l’immunité innée impliquée dans l’activation de la voie des lectines du complément. En plus de ses fonctions bénéfiques de protection contre les agents pathogènes invasifs, la MBL est associée à plusieurs maladies inflammatoires et auto- immunes comme le lupus érythémateux, l’arthrite rhumatoïde et la néphropathie diabétique [53,55,58]. Alors qu’une diminution non significative des taux de MBL est observée chez les patients FMF en crise, son augmentation est signalée chez les patients FMF en rémission comparés aux contrôles. Ce résultat suggère que la MBL pourrait avoir un rôle dans le maintien de l’inflammation durant la phase asymptomatique, probablement par la production des médiateurs anaphylatoxiques tels que le C5a [43]. Conformément à la littérature, les taux de CRP les plus élevés sont observés dans le sérum des patients FMF en crise comparés aux patients asymptomatiques et aux contrôles [224,225] (Tableau 8). La production de CRP est induite par les cytokines pro-inflammatoires, notamment l’IL-6 et le TNF-α [262]. La nette corrélation observée entre les taux sériques de ces 2 cytokines et les taux de CRP chez les patients FMF en crise reflète bien cette relation (Figure 41). Bien qu’elles soient détectées dans le sérum des patients et des contrôles, l’IL-17 et l’IL-1RA ne montrent aucune différence

117

significative entre les 3 groupes. Les autres cytokines testées ne sont pas détectées dans le sérum des patients ni des contrôles (Tableau 8). Rappelons que les cytokines sont des molécules immunorégulatrices à courte demi-vie; leur dosage sérique est parfois difficile et dépend aussi de plusieurs facteurs tels que la collecte, la conservation et le traitement des échantillons, de leur capacité à se lier à d’autres protéines (récepteurs solubles, anticorps…) perturbant leur dosage ainsi que du comportement des patients avant la collecte du sang (activité physique, stress, régime alimentaire, etc.) [263]. C’est particulièrement le cas pour les IL-1.

L’impossibilité de détecter la plupart des cytokines dans le sérum nous a conduit à les quantifier dans les surnageants de culture ex vivo de PBMC. La production spontanée d’IL-β et d’IL-α est comparable chez les patients FMF, en crise ou non, et les contrôles. Cependant, après stimulation au LPS, la production induite de ces cytokines par les moncytes de PBMC des patients FMF en crise est plus importante que celle des patients asymptomatiques ou des contrôles (Figure 42A, B). Ces résultats sont similaires à ceux obtenus chez les patients HIDS [264], mais en désaccord avec ceux signalés chez les patients atteints de CAPS et de NLRP12AD [19,265,266]. En effet, ces derniers patients, présentant respectivement des mutations au niveau des gènes NLRP3 et NLRP12, avaient une production spontanée d’IL-1β 50 fois plus importante comparée aux contrôles, suggérant ainsi une activation constitutive de l’inflammasome chez ces patients, ce qui ne semble pas être le cas dans la FMF. Récemment, il a été démontré que la sécrétion de la forme mature de l’IL-1α nécessite, en plus de l’activation de la voie NF-κB, l’activation de la caspase-1 et de l’inflammasome nécessaires au clivage de l’IL-1α via la calpaine [267]. En accord avec ces données, une forte corrélation est observée entre les taux d’IL-1β et d’IL-α dans les surnageants de culture de PBMC non stimulées ou stimulées par LPS. Les taux comparables d’IL-1RA, inhibiteur naturel de l’IL-1, chez les patients et les contrôles suggèrent l’absence de mécanismes compensateurs de l’inflammation dans la FMF et mettent en relief l’importance du traitement à l’anakinra, antagoniste du récepteur de l’IL-1, dans le traitement des patients FMF résistants à la colchicine (Figure 42C).

L’IL-1β induit l’expression des cytokines pro-inflammatoires, notamment L’IL-6 et le TNF-α [24,24]. Ce dernier, en synergie avec l’IL-6, joue un rôle très important dans la réponse humorale et cellulaire durant les crises de la FMF. Bien que les taux d’IL-6 et de TNF-α soient comparables chez les patients asymptomatiques et les contrôles, une production

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spontanée accrue de ces cytokines est observée chez les patients FMF en crise comparés aux contrôles. Cependant, après stimulation des PBMC par le LPS, une production d’IL-6 plus importante est observée, même en période asymptomatique (Figure 43A, B). Ces résultats pourraient suggérer que, contrairement aux patients CAPS et NLRP12AD, les PBMC des patients FMF asymptomatiques réagissent de façon comparable à celles des sujets normaux; la présence de facteurs endogènes ou de stimuli exogènes seraient ainsi indispensables pour l’activation anormale et persistante de ces cellules [268].

Au niveau cellulaire, la FMF est caractérisée par une activation anormale du profil lymphocytaire T en période de crise et de rémission [219]. En complément des études suggérant une simple polarisation Th1 [227], celles plus récentes suggèrent l’implication des cellules Th17 et Treg dans la pathogenèse de la FMF [218,220]. En accord, nous montrons des taux plus élevés d’IL-17 dans les surnageants de culture de PBMC stimulées par anti- CD3/CD28 des patients FMF hors crise par rapport aux contrôles (Figure 44C). Ovadia et al. montrent également une augmentation d’IL-17 ainsi que du nombre des cellules Th17 chez les patients FMF en crises comparés à ceux en rémission ou aux contrôles [221]. En induisant la sécrétion des chimiokines, l’IL-17 stimule le recrutement des neutrophiles et des monocytes au site de l’inflammation [35], processus à l’origine d’une réponse inflammatoire exacerbée, notamment au niveau des tissus fréquemment affectés dans la FMF tels que les reins. Bien qu’une diminution non significative des taux d’IL-22 soit observée chez les patients FMF en crise comparés aux contrôles, des taux plus élevés sont détectés dans les surnageants de culture de PBMC simulées par anti-CD3/CD28 des patients FMF asymptomatiques comparés aux contrôles (Figure 44D). Ces résultats mettent en relief le double rôle de l’IL-22 démontré préalablement dans plusieurs modèles expérimentaux [119,121]. En exerçant son rôle pro-inflammatoire, l’IL-22 pourrait participer au maintien de l’inflammation durant la phase asymptomatique alors que son effet protecteur ne serait signalé que tardivement, en participant à la résolution spontanée des crises. L’augmentation des cytokines Th17 est associée à une diminution importante de la réponse Th1 et Th2, surtout chez les patients FMF en crise, profil lymphocytaire intéressant non observé dans les autres maladies auto-inflammatoires.

L’IL-10 est une cytokine anti-inflammatoire produite tardivement par les monocytes et à un moindre degré par les cellules Treg pour moduler la réponse inflammatoire engendrée par les cytokines pro-inflammatoires [228]. Une étude récente effectuée par Rimar et al. a montré

119

l’implication des cellules Treg dans la pathogenèse de la FMF; cependant, le rôle de ces cellules n’est signalé que 7 jours après les crises de la maladie [220]. Cette cinétique pourrait ainsi expliquer les taux d’IL-10 comparables entre les patients FMF, en crise ou non, et les contrôles que nous observons dans toutes les conditions de culture.

La détection de taux élevés d’IL-1RA dans les surnageants de culture de PBMC stimulées par anti-CD3/CD28 n’était pas prévue, vu que l’IL-1RA est produite généralement par les monocytes. Dans le but de confirmer l’origine monocytaire de cette cytokine, nous avons procédé à la purification des monocytes et des lymphocytes T par FACS et à la mise en culture en parallèle des PBMC et des cellules séparées, avec ou sans stimulation par LPS ou anti-CD3/CD28. La quantification des cytokines dans les surnageants de ces différentes cultures cellulaires a permis d’observer une production élevée d’IL-1RA par les monocytes stimulés par LPS, mais négligeable par les lymphocytes stimulés par anti-CD3/CD28 (Figure

46C). Les taux élevés d’IL-1RA détectés, dans notre étude, chez les patients FMF et les

contrôles, dans les surnageants de PBMC stimulées par anti-CD3/CD28 pourraient être dûs à une activation des cellules T qui sécrètent des cytokines pouvant agir sur les monocytes. Ces derniers, ainsi activés, produisent, à leur tour, l’IL-1RA. La purification des sous-populations monocytaires et lymphocytaires permet l’évaluation de la part respective de ces différentes cellules dans la production des cytokines d’intérêt. Elle est cependant difficile à réaliser pour un grand nombre de sujets et nécessite un volume important de sang. De plus, l’évaluation du profil cytokinique ex vivo des PBMC est plus intéressant que celui des sous-populations monocytaires et lymphocytaires séparées vu que ce mélange cellulaire reflète les conditions physiologiques.

La mutation M694V est souvent associée au phénotype le plus sévère de la maladie et à des taux élevés d’IgD, surtout à l’état homozygote [176,226]. Dans la présente étude, une production accrue des cytokines pro-inflammatoires IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17 et IL-22 est observée chez les patients FMF homozygotes pour la mutation M694V par rapport aux patients présentant d’autres génotypes (Figure 50). Ces résultats sont en faveur d’une relation entre la pénétrance variable des mutations du gène MEFV, la production induite des cytokines par les PBMC des patients FMF et l’hétérogénéité clinique observée chez ces patients.

120

En conclusion, les taux élevés des protéines de la phase aiguë de l’inflammation CRP et MBL, et des cytokines pro-inflammatoires IL-6, IL-1β, IL-1α et IL-22 chez les patients FMF hors crise, confirme la présence d’une inflammation soutenue chez ces patients, même en période asymptomatique. Puisque les cytokines impliquées dans la cascade inflammatoire de la FMF sont pour certaines dépendantes, pour d’autres indépendantes de la caspase-1, nos données ne soulignent par une implication particulière de l’inflammasome dans la pathogenèse de cette maladie. Contrairement aux maladies autoi-nflammatoires CAPS, HIDS et NLRP12AD, la pyrine mutée n’entraîne pas d’activation constitutive de l’inflammasome. De plus, le profil lymphocytaire T caractérisé non seulement par une augmentation des taux des cytokines Th17, mais aussi par une suppression des réponses Th1 et Th2 représente une « signature cytokinique» spécifique des patients FMF. Dans l’ensemble, l’étude ex vivo représente une nouvelle approche permettant d’évaluer l’implication des cytokines dans la FMF et de comparer le profil à celui obtenu dans d’autres maladies auto-inflammatoires. La mesure d’autres cytokines pro- et anti-inflammatoires ainsi que d’autres marqueurs inflammatoires à différents moments de la maladie procurera une meilleure compréhension du processus inflammatoire de la maladie. Cependant, tester le profil cytokinique sur un nombre plus élevé de patients en crises n’est pas facilement réalisable puisque la colchicine, le traitement de choix dans la FMF, est efficace pour prévenir à la fois les crises et le développement de l'amylose. Ce point a d’ailleurs constitué une difficulté majeure dans notre étude.

Les résultats de cette première partie ont été exposés au 7ème congrès international de la FMF et des maladies auto-inflammatoires à Lausanne, Suisse ainsi qu’au 16ème _colloque

national cytokines de la Société Française d’Immunologie au Croisic, France. Ce travail fait l’objet d’un manuscrit soumis pour publication (voir Annexe).

121

IV.2. ETUDE DE L’IMPLICATION DE LA PROTEINE RAC1

DANS LA FMF

La protéine RAC1, petite protéine G de la famille Rho, semble être un acteur impliqué dans la production accrue d’IL-1β. Bien que son implication et son rôle dans l’activation de la caspase-1 aient été récemment décrits dans plusieurs maladies inflammatoires, les mécanismes d’action de RAC1 et son rôle dans la pathogenèse de la FMF n’ont jamais été investigués.

Cette étude représente donc la première approche visant à analyser l’expression du gène

RAC1 chez les patients FMF ainsi que le rôle de la protéine RAC1 dans la production d’IL-1β

et du stress oxydant. L’étude comparative de l’expression du gène RAC1 ne montre aucune différence significative dans les niveaux d’expression de ce gène chez les patients FMF