Observation in-vivo de la d´eformation de la coiffe racinaire d’Arabidopsis avec un microscope à feuillet de lumière.

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Observation in-vivo de la d´eformation de la coiffe

racinaire d’Arabidopsis avec un microscope à feuillet de

lumière.

Florent Delepine

To cite this version:

Florent Delepine. Observation in-vivo de la d´eformation de la coiffe racinaire d’Arabidopsis avec un microscope à feuillet de lumière.. [Stage] France. Université Clermont Auvergne (UCA), FRA. 2019, 58 p. �hal-02786685�

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UNIVERSIT ´

E CLERMONT AUVERGNE

UFR de Biologie

Rapport de stage de master 1 biologie v´eg´etale

Plant Integrative Biology And Breeding

Observation in-vivo de la d´eformation de la

coi

ffe racinaire d’Arabidopsis avec un

microscope `a feuillet de lumi`ere.

R´ealis´e par :

M. Florent Delepine

Soutenu le 5 septembre 2019,

devant le jury constitu´e de :

Mme. Julie Boudet

Mme. Nathalie Leblanc

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Informations

Organisme d’acceuil

Stage

Titre : Observation in-vivo de la déformation de la coiffe racinaire d’Arabidopsis avec un microscope à feuillet de lumière.

Dates : 27 mai 2019 – 19 juillet 2019 Lieu : PIAF

Enseignant R´ef´erent

Mme. Valérie Legué Téléphone 04.73.40.52.73

Mail Valerie.LEGUE@uca.fr

Tuteur de stage

Mr. Hugo Chauvet

Fonction Chercheur contractuel UCA T´el´ephone 04.43.76.14.39

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R´esum´e

Dans un sol, la racine d’une plante est soumise à de nombreux obstacles. Elle doit s’y adapter afin de se développer et d’assurer la croissance de la plante. Ici nous voulons observer, à l’échelle microscopique, le comportement de la racine d’Arabidopsis thaliana lorsque que cette dernière est soumise à un changement de contrainte mécanique. Pour ce faire un microscope à feuillet de lumière a été utilisé. Pour observer ces racines avec ce microscope à feuillet de lumière, un nouveau protocole a du être mis en place. Ce dernier est basé sur la superposition de deux milieux ayant une concentration différente en Phytagel dans un tube Fluorinated Ethylene Propylene. Ce protocole nous a permis de faire des premières observations du comportement de la racine d’Arabidopsis thaliana lors d’un changement de contrainte mécanique. Ces observations montrent un ralentissement de la croissance lors d’un changement de milieu. De plus quelques racines ont permis d’illustrer des réorientations et de la compression cellulaire au niveau de la pointe racinaire.

Abstract

In a soil root encounter many obstacles. The root has to adapt to it in order to develop herself and ensure the plant’s growth. Here we want to observe the Arabidopsis thaliana root behavior during to a change mechanical stress at the microscopy scale. To do so, we use a light sheet microscope. To observe this root with this light sheet microscope a new protocol had to be developped. The latter is based on the superposition of two culture medium containing different concentration of Phytagel in Fluorinated Ethylene Propylene tube. This device allows observation of the Arabidopsis thaliana root behavior when the latter is subject to a change mechanical stress. First observations shows a slow-down in the root growth when the concentration of gel increase. Some of these observation illustrate reorientation and compression of the root tip.

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Table des mati`eres

Informations . . . 2

R´esum´e . . . 4

Abstract . . . 4

Pr´esentation de la structure d’accueil . . . 8

Analyse bibliographique . . . 8

La racine dans le sol . . . 8

Comportement de la racine en pr´esence d’un obstacle . . . 10

La croissance de la racine s’effectue selon la gravit´e . . . 12

La racine, un organe m´ecanopercepteur . . . 14

Visualisation de la croissance racinaire avec un microscope `a feuillet de lumi`ere . . . 16

Objectif du stage . . . 18

Mat´eriels et m´ethodes . . . 18

Matériel végétal utilisé . . . 18

Stérilisation du matériel végétal . . . 18

Observation avec un microscope `a feuillet de lumi`ere . . . 20

Gestion des donn´ees . . . 20

R´esultats et discussion . . . 22

Protocole de pr´eparation du milieu bicouche . . . 22

Perc¸age du milieu, semis et conditions de culture . . . 26

Observations des racines . . . 26

D´etermination de l’interface entre les deux milieux . . . 28

D´etermination de la vitesse de croissance . . . 28

Observation des vitesses de croissance . . . 30

Observation des d´eformations de la racine . . . 34

Perpectives . . . 34

Visualisation de l’interface . . . 34

Calcul de la d´eformation et de la croissance diff´erentielle . . . 36

Compétences développées . . . 36

R´eflexion personnelle . . . 36

Bibliographie . . . 40

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Zone d'élongation Zone de différenciation Zone de division cellulaire Coiffe racinaire

A

250 micro-mètres 250 micro-mètre

B

Paroi cellulaire Noyau Membrane plasmique Vacuole Méristème apical racinaire Flux de cellules

Figure 1: Croissance primaire de la racine d’Arabidopsis thaliana A : Schéma de la zone de croissance primaire de la racine d’Arabidopsis thaliana, B : Schéma d’une cellule végétale. P représente la pression de turgescence qui est exercée au sein de la cellule

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Pr´esentation de la structure d’accueil

J’ai réalisé mon stage au sein de l’UMR PIAF (Physique et Physiologie Intégrative de l’Arbre en environnement Fluctuant). Le PIAF est une unité mixte de recherche entre l’INRA (Institut Na-tional de la Recherche Agronomique) et l’Université Clermont Auvergne (UCA). Ces recherches portent sur les réponses des arbres aux facteurs de l’environnement (hydrique, thermique, mécanique) touchés par le changement climatique. Les finalités de ces recherches sont d’identifier des génotypes ou écotypes résistants, proposer des modèles de conduite améliorant la durabilité et prévoir les chan-gements d’aires de répartitions des espèces en fonction du changement climatique. Les recherches sont divisées sur 4 équipes. La première équipe, l’équipe SurEau (Sureté hydraulique et résistance à la sécheresse des arbres), analyse les réponses des arbres aux phénomènes de sécheresse extrême, notamment en étudiant le mécanisme d’ascension de la sève brute dans l’arbre. La deuxième équipe, l’équipe MEA (Micro Environnement et Arbre), travaille sur les interactions entre le fonctionnement de l’arbre et son environnement thermique, lumineux, ou minéral fluctuant avec son architecture. La troisième équipe, l’équipe FolEau (Ecogénomique fonctionnelle du transport de l’Eau dans la feuille en régime hydrique fluctuant), travaille sur les mouvements de l’eau au sein de la feuille. La quatrième équipe, l’équipe MECA (BioMECAnique de l’arbre), analyse les réponses des arbres en réponse à des sollicitations mécaniques comme celles dues au vent ou à la gravité.

J’ai réalisé mon stage au sein de cette dernière équipe. Mon stage s’est déroulé sur une période de 8 semaines allant du 27 mai 2019 au 19 juillet 2019. Ce sujet de stage s’insère dans un objectif de recherche portant sur la perception des changements de contrainte mécanique par les racines.

Analyse bibliographique

La racine dans le sol

La plante est fixée dans son milieu de vie via son système racinaire. Ce dernier permet à la plante de puiser dans le sol les éléments minéraux nécessaires à sa croissance mais également de se fixer au substrat qu’est le sol. Un sol est caractérisé par sa texture, c’est à dire ses proportions relatives en limon, argile, sable fin, sable grossier. Il est également caractérisé par sa structure qui correspond au mode d’assemblage des particules qui le compose. Dans ce milieu hétérogène la racine doit réussir à croˆıtre. La croissance primaire implique deux processus qui sont la division et l’élongation cellulaire. La division des cellules, qui a lieu dans la zone méristématique de la racine, provoque un flux de cellules allant vers la zone d’élongation (Figure1A). La zone méristématique se trouve à l’apex de la

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0.2 %

0.5%

A

B

Figure 2: Croissance des racines primaire d’Arabidopsis thaliana dans des milieux MS1/2 contenant des concentrations différentes en Phytagel (0.2 % puis 0.5 %) A : Photographie d’une cuve permet-tant la culture des racines d’Arabidopsis thaliana dans un milieu contenant des concentrations de Phytagel diférentes (0.2 % puis 0.5 %) , B : Cinétique de la réorientation de la croissance primaire d’Arabidopsis thaliana lorsque la racine arrive à l’interface entre les deux milieux, la flèche rouge représente l’interface entre les deux milieux. Roue2018

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racine et s’étend sur les 250 premier µm. Dans le prolongement de cette zone, la zone d’élongation est présente et se situe sur une hauteur de 250 µm (Barrada A. et al.2015). Dans cette zone les pa-rois cellulaires subissent une acidification (Monshausen G B. et al.2011) qui entraine la cassure des liaisons intermoléculaires. Cela permet par la suite, avec une hausse de la pression de turgescence au sein de la cellule, un gonflement et une élongation cellulaire (Clark L.J. et al.1996; Clark L. J. et al.

2001) (Figure 1B). Lors de sa croissance, la racine est soumise à de nombreuses contraintes liées à ce dernier. Le sol exerce donc des contraintes mécaniques au niveau de la racine. Ces contraintes sont appliquées dans le sens opposé à celui de la croissance racinaire. Lors d’une augmentation impor-tante de la résistance du sol, la vitesse d’élongation de la racine diminue et les cellules subissent des déformations. La déformation se caractérise par un changement de taille des cellules au niveau de l’apex racinaire. Ces déformations sont mesurables contrairement aux contraintes qui ne le sont pas directement.

Pour observer les effets des changements de contrainte mécanique d’un sol, il faut pouvoir obser-ver la croissance de la racine au cours du temps. C’est pourquoi des sols artificiels à base de Phytagel ont été développés au sein du laboratoire (Figure2A). Le principe de ces sols repose sur la superposi-tion de deux milieux MS1/2 possédant chacun d’entre eux une concentrasuperposi-tion différente en Phytagel. Dans ces milieux plus la concentration en Phytagel sera élevée et plus le milieux sera rigide. Ce type de milieu permet de mimer les changements de contrainte mécanique que pourra rencontrer la racine lors de la rencontre d’un obstacle.

Comportement de la racine en pr´esence d’un obstacle

Les milieux permettent d’observer le comportement de la racine d’Arabidopsis thaliana lorsque cette dernière est soumise à un changement de contrainte mécanique (Roue2018). Dans les travaux de Roue 2018, une modification de l’orientation et de la vitesse de la croissance de la racine a pu être observée (Figure2B). Deux zones de courbures sont observées. La première zone de courbure se situe à une distance moyenne de 515 µm ± 98 µm de l’extrémité racinaire tandis que la deuxième zone de courbure se situe à une distance de 276 µm ± 23 µm de l’extrémité racinaire (Roue 2018). La première zone de courbure serait la conséquence d’un flambage mécanique de la racine. La racine étant en croissance continue, lorsque que cette dernière n’arrive pas à traverser un gel contenant une concentration en Phytagel de 0.5%, la force de compression de la racine devient trop forte par rapport à sa capacité de résistance à la flexion. Une courbure se forme donc. Cette flexion a pour conséquence une réorientation de l’apex qui va devenir parallèle à l’interface avant de se réorienter dans le sens de la gravité. Cette réorientation est due à une croissance différentielle de la racine. Ce

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phénomène s’explique par deux processus distincts. Tout d’abord un gradient latéral d’auxine est mis en place le long de la racine inclinée (Monshausen G B. et al. 2011). Ce gradient est permis par une relocalisation des transporteurs d’auxine PIN3 et PIN7 pour réorienter l’auxine vers les cellules inférieures de la coiffe (Kleine-Vehn J. et al. 2010). Cette relocalisation entraˆıne une concentration plus importante d’auxine du coté inférieure de la racine inclinée qui serait la cause d’une alcalinisation des parois via l’activation des pompes à protons et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Cette alcalinisation des parois s’oppose au phénomène d’acidification de ces dernières qui sera encore présent du coté supérieure de la racine et qui permettra de créer la croissance différentielle. Du côté supérieur de la racine, les parois subissent une acidification (Monshausen G B. et al.2011). Cette acidification induit la cassure de liaisons intermoléculaires. Cela permet par la suite, avec une hausse de la pression de turgescence au sein de la cellule, une élongation cellulaire et un gonflement cellulaire. (Clark L.J. et al.1996; Clark L. J. et al. 2001). Cette deuxième réorientation est donc la conséquence d’une relocalisation de transporteurs d’auxine et d’une réorientation de croissance qui sont en lien avec une perception de la gravité.

La croissance de la racine s’e

ffectue selon la gravit´e

La racine possède la capacité de percevoir la gravité. En effet la gravité est perçue par la racine au niveau des cellules de la columelle (Baldwin K L. et al. 2013). Certaines de ces cellules sont diffférenciées en statocytes. Elles contiennent des amyloplastes, appelés statolites, qui sédimentent au sein du cytoplasme en fonction de la gravité. Ce phénomène est possible car les statolites sont de densité plus importante que le cytoplasme dans lequel ils se trouvent. Cette sédimentation entraˆıne une cascade de réaction qui résulte, à l’échelle macroscopique, à une réorientation de la racine (Baldwin K L. et al.2013). Cependant il a été montré que ces statocytes ne sont pas les seuls capteurs de la gravité. En effet il a été observé une réponse gravitropique chez des racines ne possédant pas de coiffe racinaire (Mancuso S. et al.2006). Il existerait donc un deuxième lieu de perception de la réponse gravitropique chez la racine. Ce dernier est suspecté d’être dans la zone d’élongation distale (Kiss J Z. et al.1999; Wolverton C. et al.2002; Mancuso S. et al.2006). La racine percevant la gravité et cette dernière étant présente sur l’ensemble de la Terre, ce paramètre est donc impossible à exclure du protocole qui sera mis en place. Ce paramètre contraint les modes d’observations et de cultures dans un milieu vertical. Il a été montré que la gravité altère la croissance de la racine en causant une réorientation de cette dernière. La gravité peut donc provoquer une croissance différentielle de la racine. Cependant il existe d’autres phénomènes comme un changement de contrainte mécanique qui entraine une croissance différentielle de la racine. Ce phénomène pose la question de la mécanoperception chez la racine

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Figure 3: Modèle de la mécanotransduction et action des différents mécanorécepteurs. Une contrainte de tension provoque un étirement de la membrane plasmique. Cet étirement activerait l’ouverture de canaux ioniques tels que les MCAs ou MSLs qui permetrraient le passage d’ions Ca2+ _{ou Cl}−

dans le cytosol. L’influx de calcium déclencherait une voie de transduction du signal mécanique. En parralèle, une voie impliquant des kinases pourrait être déclenchée par la signalisation des protéines RLKs (Monshausen G.B. et al.2009b)

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primaire.

La racine, un organe m´ecanopercepteur

Des études visant à connaitre le comportement de la racine lorsque cette dernière doit contourner un obstacle ou lorsqu’elle est fléchie manuellement ont été menées (Monshausen G. B. et al.2009a). La réponse observée paraˆıt être similaire à celle observée chez une tige (Monshausen G. B. et al.

2009a). La perception de la déformation fait l’objet de plusieurs hypothèses. La transformation du signal mécanique, perçue lors d’une déformation, en signal électrochimique se fait par un passage d’ions au travers de la membrane plasmique (Monshausen G.B. et al.2009b) (Figure3). Ces ions qui peuvent être des ions Ca2+_{ou Cl− peuvent passer par deux types de canaux. Les premiers sont des}

ca-naux MSLs qui sont des caca-naux homologues aux caca-naux MscS (MechanoSensitive Channel of Small Conductance) pr´esent chez Escherisha coli. L’ouverture de ces canaux est directement control´ee par la tension de la membrane plasmique (Haswell E S. et al.2006).

Il a été identifié dans le génome d’Arabidopsis thaliana 10 protéines MSLs avec des profils d’ex-pressions et des localisations cellulaires distincts (Pivetti C. D. et al.2003, Haswell E S. et al.2006). Deux protéines MSLs, les MSLs 9 et 10 ont été localisées sur la membrane des cellules (Haswell E.S. et al. 2008). De plus elles sont préférentiellement localisées au niveau de l’apex racinaire, les tissus vasculaires racinaires ou aériens (Haswell E.S. et al.2008). Ces deux canaux sont activés lors de l’étirement de la membrane (Haswell E.S. et al.2008). Tout ces éléments amènent à penser que ces canaux joueraient un rôle dans la mécanoperception. Le deuxième type de canaux suspecté pour par-ticiper à la mécanoperception sont des canaux MCAs. Ce sont des canaux calciques. MCA1 et MCA2 ont été localisés dans la membrane plasmique (Nakagawa Y. et al.2007). MCA1 est exprimé dans les tissus vasculaires des cotylédons, dans les feuilles au centre de la rosette et dans l’apex racinaire, ex-cepté la coiffe (Yamanaka T. et al.2010). Les canaux de la famille des MCAs pourraient avoir un rôle dans l’influx de calcium cytosolique à la suite d’un étirement de la membrane plasmique des cellules végétales (Nakagawa Y. et al.2007). De plus la lignée mutante d’Arabidopsis thaliana mca1 possède une altération des capacités de pénétration des racines dans un milieu gélifié opposant une résistance (Yamanaka T. et al.2010). Ces observations peuvent nous amener à penser que le canal MCA1 serait impliqué dans les phénomènes de mécanoperception. Ces deux types de canaux passeraient dans un état ouvert lors d’un fléchissement permettant ainsi le passage des ions au travers de la membrane plasmique.

L’action de ces deux types de canaux pourraient être facilitée par l’action de protéines RLKs. Ces protéines, découvertes chez les animaux, forment un lien entre l’actine du cytosquelette et le

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Chambre d'observation Objectif d'illumination Objectif de détection B A

Figure 4: Microscope à feuillet de lumière (SPIM). A : Schéma réprésentant le principe du SPIM avec un objectif d’illumination positionné à 90◦_{par rapport à l’obectif de détection (Weber M. et al.}

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cytoplasme en se fixant sur des protéines contenant le motif RGD (Arg-Gly-Asp). L’hypothèse est donc émise que chez les plantes, de telles protéines pourraient relier les microtubules à la membrane plasmique et ainsi faciliter l’ouverture de canaux mécanosensibles (Jaffe M. J. et al.2002).

Il semblerait donc que la racine puisse détecter des déformations induites par un changement de contrainte mécanique. A l’échelle macroscopique, le comportement de la racine lorsqu’elle est sou-mise à un changement de contrainte mécanique a déjà été observée. Afin d’approfondir les connais-sances sur la mécanoperception, la racine doit être observée in vivo dans le plan de la gravité à l’échelle microscopique. Le microscope à feuillet de lumière permet de réaliser ces observations.

Visualisation de la croissance racinaire avec un microscope `a feuillet de lumi`ere

Pour visualiser la racine d’Arabidopsis thaliana lorsque cette dernière est soumise à un chan-gement de contrainte mécanique, un microscope à feuillet de lumière est utilisé. Ce microscope est également appelé SPIM (Selective Plane Illumunation Microscopy) et est un microscope à fluores-cence. Un modèle de ce type de microscope a été développé au laboratoire. Ce microscope possède 2 objectifs. Le premier sert à focaliser le faisceau du laser sur l’échantillon, alors que le deuxième sert à acquérir une image. Ces deux objectifs sont disposés afin de former un angle de 90◦ _(Weber

M. et al.2014) (Figure4A, B). Dans ce microscope l’échantillon est positionné verticalement, ce qui nous convient puisque nous voulons observer la croissance racinaire et que cette dernière s’effectue dans le plan de la gravité. Le faisceau émis par le laser va être focalisé par le premier objectif afin de former un feuillet de lumière (Weber M. et al. 2014). Ce feuillet de lumière est fixe et l’échantillon sera déplacé le long afin de pouvoir l’observer dans son intégralité.

L’échantillon peut être déplacé dans 3 dimensions, ce qui permet par la suite de reconstituer à par-tir de l’ensemble des images obtenues une reconstitution de l’échantillon en 3D. Cette reconstitution est obtenue en recollant les différents plans obtenus grâce au déplacement de l’échantillon le long du feuillet de lumière. Le principal avantage de ce microscope est que le temps d’acquisition est plus court que celui d’un microscope confocal. L’acquisition se réalise avec un seul passage de la nappe de lumière sur les différents pas pris pour l’observation alors que dans le cas de la microscopie confocal l’acquistion est réalisée point par point. Cela permet donc de réduire l’exposition de l’échantillon au laser et donc de réduire le risque de photoblanchiment de l’échantillon (Weber M. et al.2014). Par conséquent les périodes d’acquisitions des observations peuvent être plus longues. Enfin le photo-blanchiment est réduit car la vitesse d’acquisition des données est plus rapide que sur un microscope confocal à fluorescence. En effet sur ces dernier le laser parcours toutes l’image afin de retransmettre un signal alors que dans le cas du SPIM l’acquisition se faits en une seule fois.

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Dans ce microscope les échantillons sont observés de manière verticale, pour ce faire un porte échantillon adapté est nécessaire ainsi qu’un moyen de pouvoir faire croˆıtre les plantes dans un mi-lieu vertical. Pour ce faire des tubes FEP (Fluorinated Ethylene Propylene) sont utilisés. Ce type de tube possède la particularité d’avoir le même indice de réfraction que l’eau et ainsi donc ne pas pro-voquer des distorsions optiques. Ces tubes ont déjà été utilisés dans des protocoles d’observations microscopiques de racines et non pas eu d’influence sur les résultats obtenus (Oveˇcka M. et al.2015).

Objectif du stage

L’objectif de ce stage a été de concevoir un protocole expérimental permettant d’observer la racine d’Arabidopsis thaliana lorsqu’elle est soumise à un changement de contrainte mécanique. Ce chan-gement sera créé via une différence de concentration en Phytagel dans des milieux contenant deux couches. Ces milieux ont déjà été développés et caractérisés, à l’échelle macroscopique, au sein du la-boratoire pour observer la réponse de la racine d’Arabidopsis thaliana à un changement de contrainte mécanique (Roue 2018). Avec le SPIM, qui est maintenant développé au sein du laboratoire, un aménagement de ce précédent protocole pourrait permettre d’observer à l’échelle microscopique la réponse de la racine d’Arabidopsis thaliana à un changement de contrainte mécanique.

Mat´eriels et m´ethodes

Matériel végétal utilisé

Afin de réaliser ces expérimentations une lignée GFP PIP 1,4 d’Arabidospis thaliana a été uti-lisée. Les PIPs (Plasma membrane Intrasec Protein) sont des aquaporines se situant au niveau de la membrane des cellules. Cela nous permet donc d’observer le contour des cellules. Le GFP est un fluorophore qui possède un pic d’absorption à 480 nm et un pic de réémission à 508 nm.

Stérilisation du matériel végétal

Afin d’éviter les contaminations de nos milieux de culture une stérilisation des graines a été ef-fectuée. Pour ce faire une solution de stérilisation a été préparée. Cette dernière est composée d’eau de javel à 9◦ _{qui est à une concentration finale de 0.6258%. Elle est également composée de Triton}

X-100 à une concentration finale de 0.002%. La solution de stérilisation est complétée avec de l’eau stérile. Les graines sont baignées dans cette solution pendant 10 minutes avant d’être rincées 6 fois avec de l’eau stérile. Suite à ces rinçages les graines sont placées à sécher sur un papier filtre pendant

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Figure 5: SPIM utilisé au laboratoire. Le faisceau laser va être transformé en une nappe de lumière dans le bras d’illumination qui va par la suite être projeté grâce à l’objectif d’illumination sur l’échantillon. Le signal fluorescent émis par l’échantillon va être filtré puis être récupéré avant d’être traiter par une caméra afin de nous donner une image.

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30 minutes. Les graines sont par la suite stock´ees dans une chambre froide `a 4◦_C.

Observation avec un microscope `a feuillet de lumi`ere

Les observations microscopiques ont été réalisées à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière conçu au sein du laboratoire (Figure 5). La mise en place de ce microscope est basée sur le projet OpenSPIM (Pitrone P. G. et al. 2013). Ce microscope est composé de deux objectifs. Le premier, qui est celui qui va créer la nappe de lumière est un objectif 10X avec une ouverture numérique de 0.3 à immersion dans l’eau. La nappe de lumière formée sera d’une taille de ≈612 µm × ≈ 612 µm. La nappe est formée à partir d’un laser Cobolt MLD 488 qui émet un faisceau laser à une longueur d’onde de 488 nm.

Le deuxième est un objectif 20X avec une ouverture numérique de 0.5 à immersion dans l’eau. Avant de récupérer le signal fluorescent émis par l’échantillon un filtre est placé afin de ne pouvoir observé que la fluorescence émise par notre échantillon. Ici le filtre utilisé est le MF525-39. Ce filtre permet de filtrer les longueurs d’ondes allant de 486 à 564 nm. Les longueurs d’ondes filtrées sont ensuite récupérées par une caméra afin de produire une image. La caméra utilisée est une Hamamatsu ORCA-Flash 4.0. Cette caméra permet d’obtenir des images faisant 2048 pixels de large par 2048 pixels de haut. Le champ de vue obtenu grâce à cette caméra est de 500 µm × 500 µm et elle per-met également de capturer au maximum 100 images par secondes. Ce microscope perper-met également de déplacer l’échantillon grâce à une platine mobile. Cette platine est une platine 3 axes NanoMax (Thorlabs) avec moteur pas à pas. La résolution de cette platine est de 5 µm et possède une plage de déplacement de 4 mm.

Pour observer sur des périodes de plusieurs jours, un éclairage de l’échantillon a été mis en place. Grâce à cette lumière l’échantillon possède la même photopériode que dans la chambre de culture (cf Annexe Code pour contrôler l’illumination du SPIM). De plus un sysytème de tracking de la racine a été également mis en place. Ce tracking se base sur le calcul au niveau d’une ligne defini de la valeur des pixels. Si la courbe obtenu dépasse un certain seuil, alors la platine monte de 89 µm (cf Annexe Code de suivi automatique des racines lors de l’acquisition).

Gestion des donn´ees

Réduction de la taille des données. Pour faciliter les manipulations des données et aussi de gagner de la mémoire de stockage une réduction de la taille des données est nécessaire. Tout d’abord les images obtenues ont été recadrées afin de supprimer les parties de l’image ne contenant que des pixels noirs. Pour cela l’outil bfconvert a été utilisé avec la ligne de commande suivante :

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“bfconvert -option ometiff.companion metadata.ome.xml -crop x0,y0,x1,y1 nom-du-fichier -finalT%t.ome.tif ”

La première partie de la commande permet d’obtenir les metadata dans un fichier separé. x0 et y0 correspondent aux coordonnées en pixel d’un coin de l’image recadrée. x1 correspond à la largeur de l’image recadrée et y1 correspond à la hauteur de cette image. La dernière partie de la ligne de commande permet de séparer les images par pas de temps. Suite à cela le format de l’image est modifié. L’image de base est au format ”ome.tif”. Ce format d’image est utilisé en microscopie car il permet de stocker les metadata dans le même fichier. L’image est convertie au format ”HDF” afin de gagner de l’espace de stockage et pour permettre une lecture des images plus efficaces. Ces deux étapes permettent de réduire considérablement la taille des fichiers. Par exemple un fichier d’une acquisition de 3 heures avec une image prise toutes les 30 minutes faisait 144 go. Suite à la première étape, ce fichier n’en faisait plus que 95.7 go. La deuxième étape à permis de réduire encore la taille du fichier à 42.2 go. Ici cette compression des données a permis de réduction de la taille du fichier de 70%.

Représentation en 3D de l’échantillon. Une fois la réduction de la taille des données effectuée, une image en 3D de l’échantillon peut être effectuée. Pour cela le plugin BigDataViewer d’ImageJ a été utlisé (Pietzsch T. et al.2015).

Réalisation d’un maximum de projection. Les images obtenues précedement via la ligne de com-mande bfconvert sont des images en volume de notre échantillon pour chaque pas de temps. Pour chaque pas de temps un maximum de projection est réalisé c’est à dire que pour chaque pas de temps le plan contenant le maximum de signal lumineux est récupéré. Cette opération est possible via le logiciel Imagej avec la commande suivante : Image→Stacks→Z project. Suite à cela les différents maximum de projection obtenus pour chaque pas de temps sont réuni dans un seul fichier grâce à la commande suivante : Image→Stacks→Tools→Concatenate. Ces deux étapes ont été automatisées dans une macro (cf Annexe Code d’automatisation des maximums de projection).

R´esultats et discussion

Protocole de pr´eparation du milieu bicouche

Pour pouvoir observer la coiffe racinaire lors d’un changement de contrainte mécanique des tubes FEP d’un diamètre 4 mm et d’hauteur 3 cm sont utilisés. La hauteur des tubes nous a été donnée par

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Aspiration du milieu MS1/2 + Phytagel à 0.2% Aspiration du milieu MS1/2 + Phytagel à 1% Aspiration du bouchon de Phytagel à 2%

Perçage du premier milieu à l'aide d'une aiguille

1 3 6 Solidification du milieu en chambre froide à 4°C 2 Solidification du milieu en chambre froide à 4°C 5

Semis d'une graine à l'aide d'un cure dent

7 4 Tube finalisé Graine Milieu à 0.2% de Phytagel Milieu à 1% de Phytagel Bouchon à 2% de Phytagel

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la profondeur de la chambre d’observation. La découpe de ces tubes se réalise à l’aide d’un scapel afin d’obtenir des bords nets. Pour mimer un changement de contrainte mécanique, deux milieux Murashige et Skoog (MS1/2) (cf Annexe Milieu Murashige et Skoog) contenant des concentrations différentes en Phytagel vont être superposées (Figure6).

Ces deux milieux sont tout d’abord autoclavés sur une période de 20 minutes à une température de 120˚C. Le milieu MS contient tout les éléments minéraux nécessaire à la croissance de la plante. La première couche contient un milieu ayant une concentration en Phytagel de 0.2% (m/v). La deuxième couche contient le même milieu mais avec une concentration en Phytagel de 0.5% (m/v). Il a été également testé, pour cette deuxième couche une concentration en Phytagel de 1% (m/v). Cette aug-mentation de concentration en Phytagel a permis de mimer une augaug-mentation plus importante des contraintes mécaniques.

Pour préparer cette expérience le premier milieu est aspiré dans un tube FEP à l’aide d’une se-ringue de 1 mL. Une fois dans le tube la hauteur milieu est mesurée à l’aide d’une règle. Avec cette mesure nous avons une précision au millimètre, ce qui correspond à deux champs de vision complet du microscope. Ce premier milieu occupe une hauteur d’environ 1 cm au sein du tube FEP, ce qui correspond à un volume de 0.05 mL. La seringue est par la suite placé à 4◦_{C pour permettre une}

so-lidification plus rapide du milieu. 10 minutes sont nécessaire afin que le milieu solidifie dans le tube. Suite à cela le deuxième milieu est aspiré de la même manière que le premier. Cependant afin d’éviter la présence de bulle d’air entre les deux milieux, le premier milieu doit se situer à la limite inférieure du tube. Ce milieu occupe une hauteur de 1.5 cm environ. Le tube est ensuite de nouveau placé à 4◦_C

afin que le deuxième milieu se solidifie et se jointe au milieu déjà présent. Ce deuxième temps est estimé à 20 minutes environ. Le deuxième temps de solidification est plus important afin de permettre au milieu de solidifier et de se tenir parfaitement avec le premier milieu déjà présent. Afin d’éviter lors de la culture des plantes que le deuxième milieu ne fuit par le bord inférieur du tube un bouchon est créer avec une solution de Phytagel concentrée à 2% (m/v). Ce bouchon est inséré dans le tube de la même manière que le milieu contenant une concentration en Phytagel de 1% .La solidification de ce milieu se fait également à 4◦_{C et est réalisée sur une période de 10 minutes. Une fois le bouchon de}

Phytagel solidifier il faut dissocier la seringue,le tube qui a servi de raccord, et le tube FEP contenant le milieu à deux couches réalisé. Pour ce faire il faut tout d’abord retirer la seringue du tube faisant le raccord. A ce moment précis les couches de gels présentes dans le tube FEP peuvent remonter et se retrouver dans le tube servant de raccord. Pour éviter cela il faut lors de l’extraction de la seringue vérifier que ces deux milieux ne remontent pas. Si ils remontent il faut alors envoyer de l’air via la seringue pour le faire redescendre dans le tube FEP. Une fois la seringue retirée, le tube raccord peut être retiré à son tour. Le tube FEP contenant les deux couches de gels est ensuite placé dans un cône

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B Zone de division cellulaire Centre quiescent Coiffe racinaire A 3 cm 4 mm

Figure 7: Observation des racines d’Arabidopsis thaliana A : Image du porte échantillon utlisé pour observer les racines dans le plan de la gravité, B : Racine d’Arabidopsis thaliana (lignée GFP PIP1,4) observée grâce à un microscope à feuillet de lumière (SPIM). Image issue d’une acquisition avec un pas en profondeur de 0.8 µm, un temps d’exposition de 50 ms et une puissance de laser de 5 mWh.

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de micropipette de 200 µL qui va être placé dans la boite permettant de stocker verticalement ces cônes. Cette boˆıte va servir de support au tube durant le protocole.

Perc¸age du milieu, semis et conditions de culture

Lors de la croissance des racines il a été remarqué que ces dernières s’orientent vers la paroi du tube. Ce comportement de la racine peut poser problème lors de l’observation. En effet lors de l’ob-servation avec le SPIM, si la racine courbe en direction de l’objectif d’obl’ob-servation, alors la lumière diffuse trop et on ne pourra plus observer la racine. C’est pourquoi il a été décidé de percer le pre-mier milieu afin d’essayer de guider la croissance des racines. Pour ce faire une aiguille de 0.5mm de diamètre a été utilisée. Le perçage du milieu s’effectue sur une profondeur légèrement inférieure comparée à la profondeur du premier milieu. Le semis s’effectue à l’aide d’un cure dent avec lequel une graine est déposée à l’endroit où le perçage du milieu a été effectué. Les tubes sont ensuite insérés dans un cône à micropipette de 200 µL. Un deuxième cône est également utilisé afin de recouvrir le haut du tube. Le tout est ensuite rendu hermétique avec de la parafilm afin d’empêcher les gels de se déshydrater. Les tubes sont ensuite placés en chambre de culture à 23◦_{C avec une photopériode}

de jour long (16h de jour et 8h de nuit). La croissance s’effectue sur 6 jours. Dans ces conditions de culture il faut environ 6 jours pour que la racine arrive proche de l’interface entre les deux milieux `a environ 0.2 cm de cette derni`ere.

Observations des racines

Les racines sont placées dans un microscope à feuillet de lumière afin d’être observées. L’obser-vation de ces racines se fait de manière verticale puisque ces dernières se développe dans le plan de la gravité. Pour ce faire, un porte échantillon a été réalisé avec un logiciel de conception de pièce, Freecad. Cet objet a été usiné grâce à une imprimante 3D (Figure 7A). Avec ce porte échantillon les racines ont pu être positionnées de manière verticale au sein de la chambre d’observation. Sur la Figure 7B, nous pouvons observer les différentes assises cellulaires de la racine. Nous pouvons également observés que le marquage fluorescent n’est pas homogène sur toute la racine. En effet nous pouvons délimiter 3 zones. La première zone correspond aux cellules les plus externes de la coiffe racinaire. On peut y observer un marquage fluorescent assez présent pouvant nous permettre de délimiter les cellules. La deuxième zone se situe au niveau des initiales et des cellules du centre quiescent. Dans cette zone la fluorescence est très peu présente. Ce manque de fluorescence pour-rait s’expliquer par le fait que les cellules présentes dans cette zone ne sont pas encore différenciées et qu’elles ne possèdent donc pas encore les aquaporines. La troisième zone se situe au dessus du

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centre quiescent, dans la zone de division cellulaire. Dans cette zone, le marquage fluorescent est très bien visible permettant de distinguer les différentes cellules. Nous pouvons également voir qu’il est impossible de situer sur l’image l’interface entre les deux milieux MS contenant des concentra-tions différentes en Phytagel. Cependant il faut un moyen efficace pour pouvoir déterminer le moment auquel la racine va l’atteindre.

D´etermination de l’interface entre les deux milieux

Pour déterminer l’interface entre les deux milieux, et ainsi connaˆıtre l’endroit où la racine sera exposée à un changement de contrainte mécanique et marqué l’endroit où aura lieu la collision avec le deuxième milieu, un marquage du milieu inférieur a été réalisé. Ce marquage a été réalisé avec de la fluorescéine. La fluorescéine est un liquide qui émet de la fluorescence. Son pic d’absorption se situe à 494 nm alors que son pic d’émission se situe à 520 nm. Le principal inconvénient de cette méthode est que la fluorescéine, étant en concentration plus importante dans le milieu inférieur, migre dans le milieu supérieur. Pour résoudre ce problème il a été préparé des milieux comme vu précédemment mais de la fluoréscéine a été ajouté à la préparation du milieu inférieur. De plus dans cette expérimentation le deuxième gel contenait une concentration en Phytagel de 2%. Une fois 6 jours passées, temps durant lequel les plantes seront mises en chambre de culture, ces tubes ont été observés à l’aide du SPIM afin de voir sur quelle hauteur la diffusion s’effectue. A partir de cette hauteur, et connaissant le diamètre des tubes utilisés il est possible de déterminer sur quelle volume la diffusion s’effectue. La diffusion s’effectue sur une hauteur de 260 nm. Grâce à la formule permettant de calculer le volume d’un cylindre (π×r2_×_{h où h est la hauteur du cylindre et r le rayon du cylindre),}

nous avons pu d´eterminer que la diffusion s’effectuait sur un volume de 0.013mm3_{, ce qui correspond}

à 0.013 µL. Le volume obtenue est un volume beaucoup trop faible afin que ce dernier soit exploitable pour permettre de l’insérer dans la préparation des milieux et ainsi créer une zone tampon entre les deux gels initiaux.

Cette méthode ne donnant pas de résultat concluant, une autre méthode a été envisagée. En ef-fet lors de travaux réalisés au sein du laboratoire il a été observé, à l’échelle macroscopique, une différence de vitesse de croissance pour des racines poussant dans des milieux ayant des concentra-tions différentes en Phytagel (Roue2018).

D´etermination de la vitesse de croissance

Pour déterminer les vitesses de croissance les racines ont été suivies sur des périodes de temps importantes (1 jours minimum). Les images ont été prises à l’aide de la caméra toutes les 30

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mi-T=0h

T=1h

T=2h

V it esse (m m/ s ) Temps (min)

Figure 8: Détermination de la vitesse de croissance A, B, C : Cinétique de croissance d’une racine d’Arabidopsis thaliana. Ici le pointage est réalisé manuellement. Ces images sont des maximums de projection dans le plan de la profondeur. La puissance du laser était de 5mWh et le temps d’expo-sition de 50ms. D, E, F : Cinétique de croissance d’une racine d’Arabidopsis thaliana. Ici la vitesse est déterminée grâce au plugin ”Template matching” d’Imagej. Ces images sont des maximums de

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nutes. Les images obtenues ont été traités par la suite comme dans le protocole décrit en matériels et méthodes. Les différentes vitesses de croissance ont été calculées à partir des maximums de projec-tion de chaque pas de temps qui ont par la suite été assemblés.

Dans un premier temps, afin de déterminer la vitesse de croissance de la racine, un suivi de la position de l’apex de la racine est réalisé en utilisant le logiciel Imagej. Cette méthode se base sur le suivi des coordonnées de l’apex au cours du temps (Figure 8A, B, C). A partir des coordonnées on calcul la distance parcouru par le point entre deux pas de temps. Puis, en divisant par le temps entre chaque image, on calcul la vitesse de croissance entre chaque temps d’acquisition. Cette méthode est fastidieuse pour des suivis temporels longs car l’expérimentateur est obligé de pointer l’apex sur chaque image afin d’obtenir des coordonnées. Il est donc nécessaire de dévellopper une autre méthode de calcul de la vitesse de croissance de la racine qui soit plus automatisée afin de pouvoir réalisé des suivis temporels sur des plus longues périodes.

Nous avons décidés d’utiliser le plugin ”Template matching” (Tseng Q. et al. 2011) du logiciel Imagej via son option ”align slice in stack” (Figure8D, E, F). Ce plugin permet de suivre au sein d’un stack d’image une forme choisi. Pour ce faire l’expérimentateur choisi un carré contenant la forme souhaitée. La forme présente au sein de ce carré sera suivie au cours du temps. Ensuite le plugin donne les coordonnées du centre du carré choisi pour chaque pas de temps. Ces coordonnées sont ensuite exportées dans un tableur afin de pouvoir calculer la vitesse de croissance entre chaque pas de temps. Pour observer si la deuxième méthode est efficace nous avons décidés d’opposer les résultats obtenus par les deux méthodes. Cette comparaison est observable dans la Figure8G. Nous pouvons voir que les résultats obtenus par le pointage manuel possèdent une plus grande variation de valeur comparé à la méthode utilisant le plugin ”Template matching”. Cependant la valeur moyenne observée au niveau des variations pour la méthode du pointage manuel est similaire à la moyenne des valeurs observée sur le même pas de temps pour la deuxième méthode. Pour la suite des calculs de vitesse de croissance nous allons utilisés la méthode utilisant le plugin ”Template matching”

Observation des vitesses de croissance

Pour le milieu contenant un premier gel à une concentration en Phytagel de 0.2% et le deuxième gel contenant une concentration en Phytagel de 0.5%. L’analyse des images avec l’utilisation du plugin ”Template matching” nous a permis de calculer le déplacement des racines entre chaque pas

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Temps (h) Temps (h) Temps (h) Déplace ment (m m) V itesse (µm /min) V itesse (µm /min) 24/06 26/06 28/06 02/07 03/07 05/07 08/07 09/07 11/07 V itesse (µm /min) 24/06 26/06 28/06 02/07 V itesse (µm /min) 03/07 05/07 08/07 09/07 0,2%-0,5% 0,2%-1% Temps (h) Déplace ment (m m) A B C D E F G V itesse (µm /min) 0,5% 0,2% 1%

Figure 9: Analyse de la croissance des racines d’Arabidopsis thaliana A-B : Déplacements cumulés d’une racine d’Arabidopsis thaliana dans un milieu 0,2%-0,5% (A) et 0,2%-1% (B) Les point bleus correspondent aux déplacements de la racine dans le milieu 0,2%. Les points oranges correspondent aux déplacements de la racine dans le milieu 0,5% (A) et 1% (B), Les droites correspondent aux droites de tendance C-D : Vitesse de croissance d’une racine d’Arabidopsis thaliana poussant dans un milieu 0,2%-0,5% (C) et 0,2%-1% (D).Les point bleus correspondent aux vitesses de la racine dans le milieu 0,2%. Les points oranges correspondent aux vitesses de la racine dans le milieu 0,5% (A)

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de temps. Les acquisitions d’image ont été séparées par un pas de temps de 30 minutes. Comme nous le montres la Figure 9A, qui représentent les déplacements cumulés observés lors de la croissance des racines dans un milieu 0,2%-0,5%, nous pouvons voir une rupture de pente qui est caractérisée par le changement de couleurs des points. Cette rupture de pente est caractéristique d’un déplacement inférieur. Avec ces déplacements obtenus il est possible de calculer les vitesses de croissance des racines entre chaque pas de temps (Figure 9C). Sur cette figure nous constatons deux zones où les vitesses sont différentes. Ces deux zones sont caractérisées par des points de couleurs orange et bleu. Les droites représentent les moyennes de ces deux zones. Durant la première phase la vitesse moyenne de croissance est de 1.69 µm/min alors que durant la deuxième phase la croissance moyenne est de 0.48 µm/min. On peut donc voir un net ralentissement de la vitesse de croissance de la racine. Ce ralentissement pourrait s’expliquer par la collision de la racine avec l’interface entre les deux gels. Cependant il est impossible de l’affirmer puisque l’interface n’est pas visible et que la racine ne s’est pas courbée durant le temps d’acquisition, ce qui aurait pu être un signe de changement de contrainte mécanique. En comparaison avec les travaux réalisés à l’échelle macroscopique (Roue 2018), les vitesses de croissance obtenues à l’échelle microscopique sont bien plus faible. En effet dans les travaux réalisés dans Roue 2018 les vitesses de croissance observées étaient de 2.95 ±0.21 µ/min avant le contact et de 1.78 ± 0.20 µ/min après réorientation. Ici nous pouvons observées des vitesses de croissance plus faible (Figure 9E,F) Les vitesses de croissance sont donc pas comparable entre l’échelle macroscopique et microscopique. Ces différences pourraient s’expliquer par le fait que la racine, dans notre dispositif d’étude, beaucoup moins d’espace pour se develloper.

Pour le milieu contenant un premier gel à une concentration en Phytagel de 0.2 % et le deuxième gel contenant une concentration en Phytagel de 1 %. L’analyse des images nous a permis de déterminer le déplacement des racines entre chaque pas de temps. Le pas de temps était fixé à 30 minutes entre deux acquisitions. La Figure 9B nous montres les déplacements cumulés pour une racine ayant poussée dans un milieu 0,2%-1%. Nous pouvons également voir ici une baisse de la vitesse de croissance (Figure 9D) symbolisée par le changement de couleurs des points passant du bleu à l’orange. En effet la vitesse moyenne de croissance lors de la première phase est de 2.79 µm/min alors que durant la deuxième phase la vitesse moyenne de croissance est de 0.08 µm/minutes. Nous pouvons supposer que cette baisse de la vitesse de croissance est la conséquence du contact de l’apex racinaire avec le deuxième gel plus concentré. De plus la vitesse de croissance finale observée est très proche de 0, ce qui pourrait laisser penser que la racine ne parvient pas à traverser le milieu le plus dense. D’autre résultats de croissance de racine dans un milieu à 0,2%-1% ont été analysés (Figure

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T=2h A B C D E Co mp res s io n F Temps (min) T=15h T=2h T=7h T=15h30

Figure 10: Observation des déformations des racines d’Arabidopsis thaliana lorsqu’elles rencontrent un changement de contrainte mécanique. A, B, C : Image d’une racine d’Arabidopsis thaliana lorsque cette dernière se courbe. Les images sont issus de maximum de projection D, E : Racine d’Arabidopsis thalianasubissant une compression au niveau des cellules de la columelle. Le trait blanc correspond à la mesure réalisée afin de pouvoir calculer la compression. F : Graphique montrant la compréssion

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de la croissance racinaire on pu ˆetre observ´es.

Observation des d´eformations de la racine

Observation de la courbure de la racine. Lors de sa croissance dans un milieu contenant un gel avec une concentration en Phytagel à 1%, des courbures de racine ont pu être observées comme nous le montre la Figure 10A, B, C. Cette courbure peut être causée par un changement de contrainte mécanique dans le milieu qui force la racine à se réorienter. Cette courbure a eu lieu à environ 150 heures après le semis. Suite à cette courbure l’apex de la racine se retrouve en position horizontale. Observation de la compression des cellules. Lors du traitement des images, une compression de l’apex racinaire a été remarquée (Figure 10D, E). Les acquisitions d’images ont eue lieu toutes les 30 minutes. Cette compression peut être mesurée sur chaque pas de temps à partir de l’équation suivante :

= Lt− L0

L0 ,

dans laquelle L0 correspond `a la longueur de la columelle au temps initial et Lt `a la longueur de

la columelle estimée pour chaque pas de temps. Il a donc été mésuré pour chaque pas de temps la longueur de la columelle. Nous pouvons voir (Figure10F) qu’une compression plus importante a lieu dans les premières 2h30 d’acquisition. Nous pouvons donc supposer que cette compression est due à un contact de la racine avec l’interface. Pour confirmer cela la visualisation de l’interface entre les deux milieux est la principale amélioration qui pourrait être apportée à ce protocole.

Perpectives

Visualisation de l’interface

Utilisation des billes fluorescentes du microscope. Pour calibrer le SPIM des billes fluorescentes sont utilisées. Ces billes pourraient servir afin de déterminer l’interface entre les deux milieux. Pour cela des billes seraient insérées dans le milieu le plus dense. L’avantage de ces billes comparé à un marqueurs fluorescent tels que la fluorescéine est que ces dernières ne diffusent pas dans le milieu et que donc la fluorescence induite par les billes ne serait visible que dans le deuxième milieu.

Ajout d’une roue à filtre automatique. Pour visualiser l’interface entre les deux gels, qui n’est pas visible dans le tube que ce soit à l’oeil nu ou en observant la fluorescence avec un filtre laissant passer les longueurs d’ondes d’émission de la GFP, le laboratoire pourrait investir dans une roue à

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filtre automatique qui serait directement reliée à l’ordinateur afin de pouvoir changer le filtre plus facilement. Cela permettrait de voir l’interface au SPIM car cette dernière a été visualisée lorsque aucun filtre n’était appliqué lors de l’émission de la fluorescence. Cette roue de filtre permettrait donc de mettre ou retirer le filtre afin de pouvoir voir l’interface. Une fois ces améliorations effectuées, il faudrait appliquer de nouveau le protocole afin de voir si les compressions, les réorientations de croissance ou les baisses de vitesse de croissance sont la conséquence d’un contact de l’apex racinaire avec le gel le plus dense.

Calcul de la d´eformation et de la croissance di

ff´erentielle

Si les observations faites dans ce rapport sont bien la conséquence d’un contact entre l’apex de la racine et le milieu le plus dense, une méthode plus efficace devra être envisagée afin de pouvoir calculer la déformation d’une cellule ou d’une assise cellulaire. En effet la méthode utilisée est une méthode manuelle qui implique de tracer un trait afin de mesurer son évolution au cours du temps et d’ensuite calculer la compression grâce à la différence entre pas de temps. De plus afin de prouver qu’une croissance différentielle a lieu, il faudrait mettre en place une méthode permettant un suivi de croissance de part et d’autre de la racine. Pour cela il serait possible d’utiliser le package ”Template matching” et cibler avec le carré une cellule se situant sur les cotés de la racine.

Compétences développées

Ce stage m’a permis de développer de nombreuses compétences. Tout d’abord, ce sujet étant une sujet de recherche, il m’a permis de dévelloper ma capacité d’adaptation devant une situation. De plus il m’a permis d’affuter mon sens critique vis à vis des expériences réalisées et que j’ai pu lire dans les différentes publications. Ce stage m’a également permis d’appréhender des techniques et du matériels nouveau tels que le SPIM. Enfin ce stage m’a permis d’approfondir ma connaissance de logiciels vu en cours tels que Imagej.

R´eflexion personnelle

Au début de mon cursus en Master je prévoyais de faire ces deux années d’étude et de les terminer par un stage me permettant de m’engager dans la vie active. Cependant au cour de cette année univer-sitaire, et des cours qui m’ont été communiqués, les métiers liés à la recherche m’ont de plus en plus intéressés. En ce sens j’ai donc décidé de réalisé mon stage au sein d’un laboratoire de recherche afin

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de m’apercevoir du quotidien au sein d’une équipe de recherche et si cela pourrait me plaire. Durant ces 8 semaines j’ai pu m’apercevoir du quotidien d’une personne travaillant dans un laboratoire de recherche. Cette expérience m’ayant beaucoup plu et apporté je pense l’année prochaine m’orienté vers un Master recherche afin de poursuivre par la suite mes études par une thèse.

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Annexes

Code pour contrˆoler l’illumination du SPIM

1 // C o n f i g u r a t i o n arduino pour i l l u m i n a t i o n avec la lumiere blanche

2 // cf : https :// micro - manager . org / wiki / Arduino

3

4 // P A R A M E T R E S

5 s w i t c h _ p i n =" 2 "; // pin 9 2**1 en bit

6 d a y _ p e r i o d =16.; // periode en heure

7 f i r s t _ p e r i o d _ d e l a y =4.0; // delai en heure avant le premier c h a n g e m e n t ( pour synchro avec la chambre de culture )

8 i n i t _ a s _ d a y =true; // doit on d e m a r r e r en jour ou nuit

9 10 s w i t c h _ n a m e = " Arduino - Switch "; 11 s h u t t e r _ n a m e = " Arduino - Shutter "; 12 o n o f f _ n a m e = " OnOff "; 13 c o b o l t _ n a m e = " Cobolt "; 14

15 // Get the a c q u i s i t i o n engine

16 acq = mm . g e t A c q u i s i t i o n E n g i n e (); 17 18 L I G H T _ R U N = true; 19 PERIOD =0; 20 J O U R _ S T A T E =true; 21 22 // Convert time to m i l l i s e c o n d s 23 d a y _ p e r i o d *= 3600.0 * 1000.0; 24 f i r s t _ p e r i o d _ d e l a y *= 3 6 0 0 . 0 * 1 0 0 0 . 0 ; 25

26 // Do we need to take into account a delay of the first switch between day and night

27 if( f i r s t _ p e r i o d _ d e l a y > 0){ 28 PERIOD = f i r s t _ p e r i o d _ d e l a y ; 29 } else { 30 PERIOD = d a y _ p e r i o d ; 31 } 32 33 if ( i n i t _ a s _ d a y == false){ 34 J O U R _ S T A T E = false; 35 } 36 // INIT CURTIME 37 CURTIME = System . c u r r e n t T i m e M i l l i s (); 38 39 while( L I G H T _ R U N ){

40 if ( System . c u r r e n t T i m e M i l l i s () - CURTIME >= PERIOD ){

41 CURTIME = System . c u r r e n t T i m e M i l l i s ();

42

43 // Change the state between day and night

44 if ( J O U R _ S T A T E ){ 45 J O U R _ S T A T E = false; 46 } else { 47 J O U R _ S T A T E = true; 48 } 49

50 // If a delay as been set at s t a r t i n g time , change the period to the d a y _ p e r i o d

51 if ( PERIOD != d a y _ p e r i o d ){

52 print (" end of i n i t i a l i s a t i o n switch to d a y _ p e r i o d ");

53 PERIOD = d a y _ p e r i o d ; 54 } 55 56 } 57 58 c u r _ s h u t t e r _ s t a t e = mmc . g e t P r o p e r t y ( shutter_name , o n o f f _ n a m e ); 59 60 61

62 if ( mmc . g e t P r o p e r t y (" Multi Shutter ", " State "). equals (" 0 ")){

63 // Change the arduino pin to the light one

64 mmc . s e t P r o p e r t y ( switch_name , " Label ", s w i t c h _ p i n ); 65 66 // Do I need to light up 67 if ( J O U R _ S T A T E ){ 68 if ( c u r _ s h u t t e r _ s t a t e . equals (" 0 ")){ 69 mmc . s e t P r o p e r t y ( shutter_name , onoff_name , " 1 "); 70 } 71 } 72

73 // Do I need to light down

74 else{ 75 if ( c u r _ s h u t t e r _ s t a t e . equals (" 1 ")){ 76 mmc . s e t P r o p e r t y ( shutter_name , onoff_name , " 0 "); 77 } 78 } 79 } else {

80 // Need to s h u t d o w n the light when a c q u i s i t i o n is running

81 if ( c u r _ s h u t t e r _ s t a t e . equals (" 1 ")){ 82 mmc . s e t P r o p e r t y ( shutter_name , onoff_name , " 0 "); 83 } 84 } 85 86 Thread . sleep (100);

(49)

(50)

Code de suivi automatique des racines lors de l’acquisition

1 // SCRIPT POUR FAIRE UN T R A C K I N G TRES SIMPLE d ’ UNE RACINE 2 // Regarde si on a un signal fluo a une p o s i t i o n donnee

3 // sur l ’ image puis decale c e t t e p o s i t i o n au centre de FOV

4 // Pour le SPIM

5

6 // H . Chauvet

7 // Version : 2 7 0 6 2 0 1 9

8 mm . s c r i p t e r (). r e s e t I n t e r p r e t e r ();

9 import org . jfree . chart . J F r e e C h a r t ;

10 import org . jfree . chart . C h a r t F a c t o r y ;

11 import org . jfree . chart . C h a r t F r a m e ;

12 import org . jfree . data . xy . X Y S e r i e s ;

13 import org . jfree . data . xy . X Y S e r i e s C o l l e c t i o n ;

14 import org . jfree . chart . plot . P l o t O r i e n t a t i o n ;

15 import org . m i c r o m a n a g e r . data . Coords ;

16 import java . lang . Math ;

17 18 19

20 // F o n c t i o n pour r e c u p e r e r la moyenne des pixels a un Y donnee sur l ’ e n s e m b l e du zstack pour un temps donnee

21 float[] g e t L i n e M a x P r o j (int time , int chan , int plane , int Y_POS ) {

22 /*

23 * time , le temps sur lequel on veut faire la moyenne 24 * chan , le channel

25 * plane , la tuile en xy que l ’ on veut u t i l i s e r

26 * Y_POS , la p o s i t i o n en y sur l ’ image ou l ’ on veut faire la moyenne

27 *

28 */

29

30 // Recup de la fenetre ouverte

31 dw = mm . d i s p l a y s (). g e t C u r r e n t W i n d o w ();

32

33 // Recup le d a t a s t o r e de la fenetre

34 data = dw . g e t D a t a s t o r e (); 35 // On chope les limites

36 indices = data . g e t M a x I n d i c e s ();

37 maxZ = indices . z ;

38

39 W = mmc . g e t I m a g e W i d t h ();

40

41 // Vecteur pour stoquer les max pour chaque pixel de la ligne

42 float[] maxpix = new float[ W ];

43

44 // On cherche le max sur l ’ e n s e m b l e du stack en z

45 for (int z =0; z <= maxZ ; z ++){

46 coords = mm . data (). c r e a t e C o o r d s (" t = "+ time +" ,p = "+ plane +" ,c = "+ chan +" ,z = "+ z ); 47 // print ( coords );

48 if ( data . h a s I m a g e ( coords )){

49 // print (" process pixels ");

50 imgT = data . g e t I m a g e ( coords );

51 i j _ p r o c e s s o r = mm . data (). ij (). c r e a t e P r o c e s s o r ( imgT ); 52 // print ( i j _ p r o c e s s o r . getRoi ());

53 // print ( i j _ p r o c e s s o r . g e t S t a t i s t i c s ());

54 // print ( pixdata );

55 for(int i =0; i < W ; i ++){

56 pixdata = i j _ p r o c e s s o r . get (i , Y_POS );

57 // print ( i ); 58 if ( maxpix [ i ] < pixdata ){ 59 maxpix [ i ] = pixdata ; 60 } 61 } 62 63 } else {

64 print (" No image found for : ");

65 print ( coords ); 66 } 67 } 68 69 // print ( maxpix ); 70 return maxpix ; 71 } 72

73 // F o n c t i o n pour avoir le max

74 float max (float[] numlist ){ 75 float tmpmax = numlist [0];

76 for ( num : numlist ){

77 if ( num > tmpmax ){ 78 tmpmax = num ; 79 } 80 } 81 82 return tmpmax ; 83 } 1

(51)

(52)

84

85 // F o n c t i o n pour avoir le min 86 float min (float[] numlist ){

87 float tmpmin = numlist [0];

88 for ( num : numlist ){

89 if ( num < tmpmin ){ 90 tmpmin = num ; 91 } 92 } 93 94 return tmpmin ; 95 } 96 97 // F o n c t i o n pour c a l c u l e r la moyenne

98 double mean (float[] numlist ){

99 double sum = 0; 100 double n = 0; 101 for ( i : numlist ){ 102 sum += i ; 103 n += 1; 104 } 105 106 return sum / n ; 107 } 108 109 // F o n c t i o n pour c a l c u l e r le std

110 double std (float[] numlist ){

111 m = mean ( numlist );

112 double sum =0;

113 double n = 0; 114 for ( i : numlist ){

115 sum += Math . pow (( i - m ) , 2.0);

116 n +=1.0;

117 }

118 return Math . pow ( sum /n , 0.5);

119 } 120 121 122

123 class S i m p l e R a c i n e T r a c k R u n n a b l e extends Thread {

124 // i n i t i a l i s a t i o n des v a r i a b l e s 125 p r o t e c t e d v o l a t i l e boolean c h e c k _ a c q u i s i t i o n = true; 126 int dtsleep = 100; 127 128 acq = mm . a c q u i s i t i o n s (); 129 130 H = mmc . g e t I m a g e H e i g h t (); 131 W = mmc . g e t I m a g e W i d t h (); 132

133 // Il faut regler ca en f o n c t i o n de la vitesse de c r o i s s a n c e d ’ une racine

134 // En gros 0.01 - 0.02 microm / s soit ~1 microm / min -> pour un dt toute les 30 min : 36 microm

135 // Ecart entre 4/6 et 5/6 de l ’ image c ’ est ~89 microm 136 int Y _ M E A S U R E = (int) Math . round ( H * ( 5 / 6 . 0 ) ) ;

137 int Y_REF = (int) Math . round ( H * ( 4 / 6 . 0 ) ) ;

138 // La platine

139 xyStage = mmc . g e t X Y S t a g e D e v i c e ();

140

141 int cpt = 1; 142 double ref_std = 0;

143 float s t d _ o f f s e t = (float) 1.5; // Le seuil de d e c l a n c h e m e n t pour dire qu ’ il y a une racine 1.5* std semble bien

144

145 // c o r r e s p o n d a n c e pixel um ( pour la platine )

146 pxtoum = mmc . g e t P i x e l S i z e U m ();

147 // On r e c u p e r e l ’ engine de l ’ a c q u i s t i t i o n 148 a c q _ e n g i n e = acq . g e t A c q u i s i t i o n E n g i n e ();

149 150

151 // I n i t i a l i s a t i o n des series pour tracer les donnees

152 X Y S e r i e s l i n e d a t a = new X Y S e r i e s (" R a c i n e P i x e l s "); 153 X Y S e r i e s C o l l e c t i o n dataset = new X Y S e r i e s C o l l e c t i o n (); 154 dataset . a d d S e r i e s ( l i n e d a t a ); 155 156 157 158 159 public S i m p l e R a c i n e T r a c k R u n n a b l e () { 160 // Mon c o n s t r u c t e u r 161 } 162

163 public void run () { 164 i n i t _ p l o t ();

165 while( c h e c k _ a c q u i s i t i o n ){

166 if ( acq . i s A c q u i s i t i o n R u n n i n g ()){

(53)