3. Tests de criblage à haut-débit
3.7. Identification d’inhibiteurs : discussion et perspectives
3.7.4 D’autres voies pour identifier des inhibiteurs de la vBPO ?
Puisqu’aucun site de reconnaissance des substrats organiques ou de l’halogénure n’a pour l’heure été clairement identifié, il est impossible d’envisager des études de screening in
silico ou de docking.
On pourrait envisager de tester des chimiothèques autres que celles drug like en particulier celles constituées de produits naturels qui pourraient contenir des structures plus originales et plus volumineuses.
Une autre solution serait la mise au point d’inhibiteur suicide ou métaboliquement activé. Dans ce but, une étude approfondie du cycle catalytique des vHPO est à réaliser. Cependant, cette tâche pourrait se révéler ardue à réaliser puisque les vHPO présentent un turn-over élevé suggérant qu’elles sont peu sensibles aux entités qu’elles génèrent [42].
4.
Conclusion
Dans le cadre de cette étude, nous avons mis au point et validé une méthode spectrophotométrique de suivi des activité iodo- et bromo-péroxydase applicable à n’importe quelle vHPO. Cette méthode s’est révélée robuste, sensible et plus adaptée que les méthodes décrites dans la littérature pour la réalisation d’un test de criblage à haut-débit. Elle consiste à suivre, au cours du temps, la DO(620 nm) qui rend compte de l’apparition des produits d’halogénation du bleu de thymol par les systèmes vBPO/H2O2/X-. Nous avons exploré
l’application de cette méthode pour l’identification d’inhibiteurs de la vBPO. Nous avons déterminé les types de molécules pouvant modifier la cinétique d’halogénation du bleu de thymol et caractérisé les paramètres (V, R, Afin) de la courbe DO(620 nm) = f(t) afin
d’effectuer leur discrimination et d’identifier, en particulier, les inhibiteurs.
A partir de la méthode de suivi au bleu de thymol, nous avons mis au point et validé un double test de criblage robuste (Z’ > 0,8) dans le but d’identifier des inhibiteurs des activités iodo- et bromo-péroxydases de la vBPO native d’A. nodosum. La réalisation du double test de criblage à partir d’une chimiothèque commerciale de 16480 composés a conduit à la sélection de 400 hits c’est-à-dire à la sélection de 400 molécules perturbant fortement l’halogénation du bleu de thymol. Les tests secondaires ont permis de confirmer 80 % des hits et d’identifier les 20 molécules les plus actives. A ce stade, seulement 5 molécules se sont révélées susceptibles d’être des inhibiteurs de la vBPO, d’après l’analyse des courbes DO(620 nm) = f(t).
Une stratégie de validation a été ensuite développée pour caractériser le mode d’action de ces 20 molécules. Grâce à des études d’effet dose-réponse, à une expérience de perturbation de la iodation chimique du bleu de thymol et à des études CLHP-SM, nous avons montré que les hits ne sont pas des inhibiteurs de la vBPO : ils réagissent avec les espèces X+ libérés dans le milieu et bloquent de manière artificielle l’action de l’enzyme. Un tel effet est analogue à celui exercé par le MMI sur le système TPO/H2O2 en présence d’un excès
d’iodure. De manière remarquable, les arylhydrazides et les dérivés de la thiourée, connus pour être des inhibiteurs métaboliquement activés des péroxydases à hème, sont largement représentés parmi les hits de la vBPO. Cependant, nous avons vérifié que ces molécules n’inactivent pas la vBPO en présence de H2O2 (et en l’absence d’halogénure) contrairement à
Puisque nous avons montré qu’ils réagissent avec I+, certains hits seront néanmoins évalués in vivo pour conforter l’intervention des vHPO dans le mécanisme de captation des iodures chez L. digitata (cf. Chapitre 3).
Le diagramme ci-dessous résume les différentes étapes du test de criblage à haut-débit. Les caractéristiques et les paramètres du test de criblage sont résumés dans l’annexe 2.
16 480 Composés
400 Hits
20 hits
Test de criblage à haut-débit
Paramètre VN
Confirmation & Sélection
Paramètre VN, R, VH2O2 Validation 1. Conformité 2. Effet-dose réponse 3. Iodation chimique 4. Etudes CLHP-SM
Aucun inhibiteur de la vBPO
Mode d’action : réaction avec X+
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Chapitre 3 : Etude du mécanisme de captation de l’iode
1.
Introduction
Comme nous l’avons présenté dans le Chapitre 1 : Introduction bibliographique, la captation de l’iodure par l’algue brune L. digitata repose sur un mécanisme oxydatif. Les travaux de Shaw puis ceux de Küpper et al. ont suggéré que l’oxydation de l’iodure en une forme oxydée Iox par une vHPO apoplastique est nécessaire à sa captation. Il est en effet supposé que l’espèce Iox, étant plus lipophile, pourrait diffuser à travers les membranes teindre le compartiment intracellulaire où elle serait accumulée, après réduction [1, 2].
A la suite du test de criblage à haut-débit (Chapitre 2), nous n’avons pas identifié d’inhibiteurs spécifiques de la vBPO d’A. nodosum. Cependant, il a été mis en évidence que les hits sélectionnés bloquent indirectement l’activité iodopéroxydase par réaction avec l’espèce Iox générée par le système vBPO/H2O2/I-. De plus, nous avons vérifié que ces
molécules sont très peu réactives envers le système vBPO/H2O2 et H2O2.
Dans ce contexte, nous nous proposons d’évaluer si les hits du test de criblage à haut- débit inhibent la captation de l’iodure par L. digitata. Si un tel résultat est obtenu, nous pourrons conforter l’intervention de Iox et donc indirectement, l’implication d’une vHPO dans le mécanisme de captation de l’iode chez L. digitata.
2.
Principe d’évaluation
2.1.
Description
L’influence de chaque hit sur la captation de l’iodure par L. digitata a été étudiée par traçage avec le radionucléide 125I-.
Le mode opératoire consiste à incuber un échantillon de lame (0,5 cm de diamètre, 20 mg), dans de l’eau de mer artificielle en présence de la molécule à tester et du traceur 125I- et à suivre au cours du temps, l’appauvrissement en radioactivité du surnageant. La concentration en iodure dans l’eau de mer artificielle a été déterminée à 1,4 ± 0,2 µM (soit environ 4 fois la concentration de l’eau de mer naturelle) par une méthode basée sur la réaction de Sandell- Kolthoff [3]. Il est généralement proposé qu’au sein des tissus de L. digitata, la concentration en iodure est d’environ 10 mM. Par conséquent, compte tenu du facteur de dilution isotopique
au sein du tissu d’algue par rapport à celui de l’eau de mer artificielle, on peut supposer qu’en début d’expérience, le suivi de l’appauvrissement en radioactivité du surnageant permet de suivre l’influx d’iodure et non le flux net des échanges.
L’expérience témoin correspond à l’expérience menée en l’absence d’inhibiteur. Pour chaque condition expérimentale, à partir de la courbe moyenne d’appauvrissement du surnageant, la vitesse de l’influx est déterminée par régression linéaire sur l’intervalle 10-100 min. Pour chaque molécule, le pourcentage d’inhibition sur la vitesse d’influx Inh(V) est déterminé de la manière suivante.
témoin expérience l' pour influx l' de Vitesse : et molécule de présence en influx l' de Vitesse : avec 100 ) ( T T T V V V V V V Inh = × −
2.2.
Vérifications préliminaires
Avant d’effectuer l’évaluation des molécules, nous avons voulu vérifier que l’appauvrissement du surnageant se traduit bien par une augmentation quantitative de la radioactivité au sein de l’algue. A cette fin, la variation du taux de radioactivité présente dans l’échantillon et dans le surnageant a été suivie au cours du temps. Comme nous ne disposons pas de compteur de radioactivité γ, la détermination de la radioactivité au sein du tissu d’algue a été effectuée par scintillation liquide. A chaque point de la cinétique correspond donc un échantillon particulier d’algue. Comme présenté sur la figure Fig. 49.A, l’appauvrissement du surnageant se traduit bien par une augmentation de la radioactivité dans l’algue. Le bilan des échanges est quasiment constant ce qui montre que le phénomène d’iodovolatilisation est négligeable sur la durée de l’expérience.
Par ailleurs, l’évaluation des hits et de leurs analogues nécessite l’introduction dans le milieu de DMSO. Nous avons donc vérifié qu’un faible pourcentage de ce solvant n’a pas d’incidence sur la cinétique d’influx d’iodure (Fig. 49.B).
Lors de ces études, nous avons observé que la vitesse moyenne d’influx et le taux final d’accumulation de radioactivité peuvent varier fortement selon la zone de prélèvement de l’échantillon de lame et l’âge du sporophyte prélevé. De telles observations ont été précédemment rapportées par Ar Gall et al. [4].
A
0 0,05 0,1 0,15 0 100 200 300 Tem ps (m in) A c ti v it é ( µ C i)Algue (µCi) Surnageant (µCi) Total (µCi)
B
0 50 100 150 200 0 100 200 300 Tem ps ( m in) A c ti v it é ( 1 0 3 c o u p s /m in ) 0% 1% 2%Fig. 49 : Suivi de la captation des iodures par L. digitata par un traçage par 125I-
A. Suivi de l’activité dans le surnageant et au sein de l’échantillon de lame de L. digitata. Condition : 0,05 µCi/ml, 2 ml de surnageant, triplicat.
B. Effet du DMSO sur la cinétique de captation de I- par L. digitata. Condition : 6,5 µCi/ml, 2 ml de surnageant, triplicat