3. Tests de criblage à haut-débit
3.4. Résultats des tests de criblage à haut-débit
3.4.1 Remarques générales
Nous avons observé une déviation de la réponse des témoins négatifs au cours d’une journée de criblage (Fig. 33). Cette déviation est due à une perte d’activité de la solution de vBPO et de la solution de H2O2. Cet élément nous a conduit à traiter les résultats
indépendamment pour chaque microplaque et à effectuer la normalisation en interne comme présentée dans le paragraphe 3.1.5.
Journée N°1 Journée N°2 Témoins négatifs Témoins positifs
Fig. 33 : Illustration de la déviation de la réponse des témoins négatifs, en activité bromopéroxydase.
Au cours de deux journées consécutives du test de criblage (2 x 55 plaques). Chaque point correspond à une expérience. Sur chaque microplaque, sont réalisées 8 expériences témoins positifs et 8 témoins négatifs.
3.4.2 Résultats globaux
Les résultats obtenus à partir des expériences témoins positifs et négatifs nous ont permis de valider l’ensemble des deux tests de criblage à haut-débit : aucune microplaque de la chimiothèque n’a du être re-évaluée.
Sur l’ensemble du test de criblage, le paramètre Z en activité iodopéroxydase est de 0,68 ce qui permet de prédire que le test est discriminant et que la majorité des hits sera confirmée. En revanche, en activité bromopéroxydase, Z n’est que de 0,40, ce qui laisse suggérer une moins bonne discrimination avec un risque potentiel de faux positifs (Tab. 7). Pour améliorer le paramètre Z, il aurait fallu diminuer la concentration des molécules de la chimiothèque.
Z Activité Iodopéroxydase 0,68 Activité Bromopéroxydase 0,40
Tab. 7 : Paramètres Z sur l’ensemble des tests de criblages, calculés à partir de VN
Les résultats globaux des tests de criblage sont présentés dans la figure Fig. 34. Les graphiques Fig. 34.A et Fig. 34.B représentent, pour chaque molécule, la valeur du paramètre VN (vitesse maximale normalisée). Une molécule est considérée comme un hit si VN est faible
c’est-à-dire si elle diminue de manière significative la vitesse d’halogénation du bleu de thymol. En prenant en compte la définition de Zhang et al. [19], les molécules sont définies comme actives si leur VN est inférieure au seuil VN.moy - 3σ où VN.moy est la valeur moyenne
de la vitesse normalisée calculée pour l’ensemble des molécules évaluées et σ l’écart-type correspondant. Ce seuil est calculé à 0,4 pour l’activité bromopéroxydase et à 0,7 l’activité iodopéroxydase. Les composés ‘actifs’, définis à partir de ces seuils, représentent 3,2 % et 2,7 % de la chimiothèque, pour les activités iodopéroxydase et bromopéroxydase, respectivement.
Molécules actives
Molécules actives
Moyenne VN.moypour l’ensemble des molécules testées Seuils (VN.moy±3 σ)
A Activité Iodopéroxydase B
Activité Bromopéroxydase
Fig. 34 : Résultats globaux des tests de criblage à haut-débit (16 720 composés)
A. Représentation du paramètre VN en activité iodopéroxydase. Chaque point correspond à une molécule testée. Les molécules actives se situent au-dessous du seuil VN.moy-3 σ (0,7).
B. Représentation du paramètre VN en activité bromopéroxydase. Chaque point correspond à une molécule testée. Les molécules actives se situent au-dessous du seuil VN.moy-3 σ (0,3)
En activité bromopéroxydase, les VN des molécules actives sont beaucoup plus faibles
que celles observées en activité iodopéroxydase. Dans le cas d’inhibiteurs de la vBPO, ceci pourrait s’expliquer par une modulation de leur activité selon l’halogénure présent (par compétition avec l’halogénure, par exemple). Dans les autres cas (substrat ou molécules réagissant avec X+), les différences observées s’expliquent par la concentration plus faible de H2O2 utilisée en activité bromopéroxydase. On peut aussi mettre en avant que les espèces Br+
sont beaucoup plus réactives que les espèces I+ compte tenu de leur pouvoir oxydant. Pour illustration, le couple Br2/Br- a un potentiel rédox standard (E° = 1,07 V) supérieur à celui du
couple I2/I- (E° = 0,54 V). Nous verrons, par ailleurs, dans le paragraphe 3.6, que les réactions
mises en jeu entre les espèces X+ et les hits non inhibiteurs de la vBPO sont des réactions d’oxydation.
Sur les graphiques de la figure ci-après (Fig. 35), chaque molécule évaluée est représentée par un point dont les coordonnées sont définies par ses paramètres R et VN. Ces
graphiques montrent clairement que les molécules actives (VN < 0,4 et 0,7 pour les activités
BPO et IPO, respectivement) ne sont pas forcément des inhibiteurs de la vBPO. En effet, comme énoncé dans le paragraphe 3.1.5, des inhibiteurs potentiels de la vBPO se caractérisent soit par une VN très faible (VN < 0,2) soit par une VN plus élevée (0,2 < VN < VNseuil) mais
avec un retard très faible (R < 30 s). Compte tenu de ces seuils, les molécules actives potentiellement inhibitrices de la vBPO ne représentent plus que 0,9 % et 2,2 % des composés de la chimiothèque en activité iodo- et bromo-péroxydase, respectivement. Pour l’activité iodopéroxydase, seules deux molécules sont susceptibles d’être des inhibiteurs puissants.
Zone correspondant aux inhibiteurs Seuil VN= 0,7
Seuil VN= 0,4
Fig. 35 : Représentation VN = f(R) des résultats des deux tests de criblage à haut-débit
Chaque molécule testée est représentée par un point dont les coordonnées sont données par le couple (R, VN). Au-dessous du seuil VN les molécules sont actives. Parmi ces molécules, celles comprises dans la zone délimitée en bleu pointillé sont susceptibles d’être des inhibiteurs de la vBPO.
3.4.3 Sélection des hits
Compte tenu du faible nombre de molécules actives, nous avons décidé de ne pas discriminer, à ce niveau, les molécules potentiellement inhibitrices de la vBPO des molécules substrats ou réagissant avec X+. La sélection des hits a donc été effectuée en considérant uniquement le paramètre VN.
En activité iodopéroxydase, nous avons fixé le seuil VN < 0,6 ce qui a conduit à la
sélection de 120 composés. En activité bromopéroxydase, le seuil a été fixé à VN < 0,3 ce qui
a conduit à la sélection de 327 composés à laquelle nous avons rajouté trois molécules supplémentaires se caractérisant par un retard supérieur à 500 s et une VN supérieure à 0,6.
Après regroupement de ces deux sélections, élimination des doublons et des redondances structurales triviales, un total de 400 hits a été sélectionné.
Bien qu’il soit difficile à ce niveau d’effectuer une étude structure-activité, on peut tout de même remarquer que certaines familles de molécules sont fortement représentées :
hydrazine, hydrazide, imino-hydrazides, imino-thio-hydrazides, thiourées, imines et 1,3- dicétones (Tab. 8). Certaines de ces familles sont connues pour être facilement oxydées ou réagir avec X+, ce qui confirme que certains hits ont été sélectionnés pour leur réactivité chimique et non pour leur structure. On peut ainsi remarquer que 46 hydrazides sont présentes parmi les molécules les plus actives alors que la chimiothèque n’en comporte que 69, de structures très diverses. Il en est de même pour les 1,3-dicétones : 12 molécules parmi les 19 de la chimiothèque ont été sélectionnées.
Familles Structures Hydrazine R H N NH2 Immino-hydrazide R1 O N H N R3 R2 Hydrazide R O N H NH2 Thio hydrazide R1 S N H N R3 R2 Thiourées N H NH S R1 R2 D Imines R 1 N R2 1,3-dicétones R1 R2 O O
Tab. 8 : Familles de composés les plus présentées parmi les 400 hits
Il peut être remarqué que certaines de ces familles de molécules ont déjà été décrites pour être des pseudo-inhibiteurs des péroxydases à hème. En particulier, les dérivés de la thiourée tels que le 6-propylthiouracile (PTU) et le 1-methyl-2-mercapto-imidazole (MMI) sont des inhibiteurs de la synthèse des hormones thyroïdiennes iodées (T3 et T4) par la thyropéroxydase (TPO) et sont utilisés dans le traitement symptomatique de certaines pathologies thyroïdiennes telles que la maladie de Grave [20]. Dans certaines conditions, il a été montré que ces composés inactivent de manière irréversible différentes péroxydases à hème telles que la TPO et la lactopéroxydase. Ils sont alors considérés comme des inhibiteurs
suicides [21, 22]. De même, les arylhydrazines et les arylhydrazides sont des inhibiteurs métaboliquement activés des péroxydases à hème (myélopéroxydase, horseradish peroxidase) et ont été utilisés pour l’étude du site actif de ces enzymes [23, 24] .
Si l’activité des composés appartenant à la famille des hydrazides et des thiourées est confirmée, il sera donc intéressant de déterminer si leur mode d’action est identique dans le cadre des péroxydases à vanadate et dans le cadre des péroxydases à hème.