4. Conclusion
2.5. Application à la recherche d’inhibiteurs de la vBPO
Nous avons précédemment montré et validé que les activités iodo- et bromo- péroxydases peuvent être suivies en présence du bleu de thymol via la DO(620 nm). Il nous faut à présent déterminer l’influence d’un inhibiteur sur la courbe DO(620 nm) = f(t) et sélectionner un critère d’étude.
Quel que soit le type d’inhibition, si les concentrations en substrats ne sont pas saturantes (c’est-à-dire [I-] et [H2O2] inférieures ou de l’ordre de 10 x KM.app), un inhibiteur de
la vBPO diminuera la vitesse de formation de l’espèce X+ et par conséquent, la vitesse d’halogénation du bleu de thymol : Ceci se traduira par une diminution de la pente à l’origine (ou vitesse initiale Vi) de la courbe DO(620 nm) = f(t) (Fig. 28.A).
Cependant, dans le cadre de notre étude, le paramètre Vi n’est pas assez discriminant à cause de la libération dans le milieu de l’espèce X+ très réactive. X+ peut réagir avec la molécule M testée. Lors de l’évaluation d’une molécule M, l’allure de la DO(620 nm) = f(t) va donc être conditionnée par la réactivité du bleu de thymol pour X+ (Rt) et celle de la
molécule M pour X+ (RM). Plusieurs cas de figure sont donc envisageables dans le cas où M
n’est pas inhibiteur (Fig. 28.B) :
Si Rt >> RM alors la courbe DO(620 nm) = f(t) est identique à la courbe témoin. Si Rt ≈ RM, la vitesse d’apparition de la DO(620 nm) est diminuée. Comme H2O2
est introduit en défaut (0,5 eq en activité BPO) ou en faible excès (1,75 eq en activité IPO), le palier final s’observe à une valeur de DO plus faible.
Si Rt << RM, la réaction entre M et X+ se produit avant l’halogénation du bleu de
observé. Si M présente plusieurs groupements réactifs, l’augmentation de la DO(620 nm) peut être bloquée après ce retard, à cause de la consommation totale de H2O2. D’après les travaux de Butler et coll. concernant l’influence de dérivés
indoliques sur la cinétique de bromation du rouge de phénol [17], une courbe avec retard serait aussi observée si M est substrat de l’enzyme.
Ces points illustrent l’importance du choix de la sonde qui doit être la plus réactive possible envers X+ pour faciliter le traitement de données.
Ces cas de figures ont été vérifiés expérimentalement par l’évaluation de molécules connues pour réagir avec les X+ (réducteurs ou molécules halogénables) ou décrites comme substrat de la vBPO. A titre illustratif, nous présentons les courbes obtenues en présence de 2- méthylindole [17] et du MCD pour l’activité bromopéroxydase (Fig. 28.B).
A titre indicatif, la molécule pourrait aussi réagir directement avec H2O2. Les allures
possibles de la courbe DO(620 nm) =f(t) seraient analogues à celles présentées ci-dessous (Fig. 28.B)
A
0,1 0,5 0,9 1,3 0 500 1000 Tem ps (s) D O (6 2 0 n m ) Témoin Inhibiteur puissant inhibiteur Diminution vitesseB
0,1 0,5 0,9 1,3 0 500 1000 Tem ps (s) D O (6 2 0 n m ) Témoin MCD (RM~Rt) 2-méthylindole (RM>>Rt ou M substrat) Diminution vitesse Diminution DO finale RetardFig. 28 : Les différentes courbes possibles DO(620 nm) = f(t). Exemples en activité bromopéroxydase.
A. Courbes prédites pour des inhibiteurs de la vBPO en activité bromopéroxydase
B. Courbes expérimentales obtenues en présence de MCD (halogénable) et de 2-méthylindole (supposé être substrat). Conditions : tampon phosphate 110 mM, pH = 7,8, [vBPO] = 0,6 µg/ml, [Bleu de thymol] = 100 µM, [Molécule] = 50 µM, [Br-] = 10 mM, [H2O2] = 0,1 mM.
Pour caractériser le mode d’action d’une molécule sur l’halogénation du bleu de thymol par le système vBPO/H2O2/X-, il est donc nécessaire de déterminer trois paramètres de
la courbe DO(620 nm) = f(t) : la vitesse maximale d’apparition de la DO (V) (et non Vi), le retard (R) et la valeur de l’absorbance du palier (Afin), s’il est observable. V et R sont les
paramètres les plus discriminants. Pour un inhibiteur, la vitesse maximale (V) est égale à la vitesse initiale. La courbe DO(620 nm) = f(t) qu’il induit se caractérise soit par une V faible et un retard (R) nul (inhibiteur de moyenne activité) soit par une V ≈ 0 s-1 et un retard « infini » (inhibiteur de forte activité) (Fig. 28).
2.6.
Conclusion
Ce travail a permis de mettre en évidence que les molécules de la famille des sulfone- phthaleines peuvent être utilisées pour le suivi des activités de la vBPO d’A. nodosum. Parmi ces molécules, le bleu de thymol permet de suivre les activités iodo- et bromo-péroxydases par la mesure de la DO(620 nm) au cours du temps. Nous avons montré par suivi CLHP-SM que, sous l’action des systèmes vBPO/H2O2/X-, le bleu de thymol est converti en composés
mono- et di-halogénés et que l’apparition de ces composés est corrélée à l’augmentation de la DO(620 nm). Ce résultat a été corroboré par l’isolement des dérivés halogénés du bleu de thymol. La détermination de leurs pKa2 a permis de vérifier l’hypothèse selon laquelle les
dérivés di-halogénés sont sous forme dibasique (c’est-à-dire sous forme quinone di- anionique) aux pH réactionnels et qu’ils sont principalement responsables de l’absorbance à 620 nm.
La détermination de l’influence des différents paramètres réactionnels nous a permis de développer des méthodes de suivi des activités iodo- et bromo-péroxydases par le bleu de thymol qui sont très sensibles et reproductibles. Cependant, bien que le bleu de thymol soit très réactif envers les espèces X+, ces méthodes ne peuvent pas être utilisées pour caractériser avec rigueur les paramètres cinétiques des vBPO (KM, VMax) car la réaction entre
vBPO/H2O2/X- et le bleu de thymol n’est pas stoéchiométrique en raison de la de dismutation
assistée de H2O2.
Par ailleurs, nous avons mis en évidence que la détermination des paramètres (R, V et Afin) de la courbe DO(620 nm) = f(t) permet de caractériser le mode d’action de toute
molécule perturbant l’halogénation du bleu de thymol. Comme nous le verrons dans la suite de ce chapitre, les tests de criblage à haut-débit seront faciles à mettre en œuvre grâce à ces méthodes de suivi par le bleu de thymol. Cependant, la discrimination des inhibiteurs de la
vBPO et des molécules présentant une très forte réactivité envers X+ nécessitera la mise en place d’une stratégie de validation basée, en particulier, sur des études d’effet dose-réponse et sur des analyses CLHP-SM (cf. partie 3.6).