La voie NF-κB est anormalement activée dans les cellules CF

Les résultats des études des diverses équipes concernant l’inflammation sont assez disparates, et une vision synthétique est compliquée par la diversité des modèles et des stimuli pro-inflammatoires utilisés.

La voie NF-κB est impliquée dans de nombreux processus cellulaires autres que l’inflammation, et peut être activée par de nombreux stimuli intracellulaires variant selon les cellules utilisées. Nous avons donc voulu nous affranchir de l’influence du fond génétique en utilisant des modèles isogéniques.

Les cellules IB3-1 sont des cellules épithéliales bronchiques, immortalisées, issues d’un patient atteint de mucoviscidose et porteur du génotype CF [F508del]+[W1282X] (Zeitlin, et al., 1991). Deux lignées cellulaires de phénotype sauvage ont été générées à partir des IB3-1. Les cellules C38 sont des cellules IB3-1 transfectées stablement avec de l’ADNc CFTR-wt délété d’une partie de sa boucle extracellulaire 1 (ECL1), la protéine CFTR résultante étant toutefois fonctionnelle. Les cellules S9 sont des IB3-1 corrigées avec l’ADNc CFTR-wt complet. Toutefois, ces lignées bronchiques expriment très faiblement CFTR (Egan, et al., 1992; Eidelman, et al., 2001; Flotte, et al., 1993).

Nous disposons également au laboratoire de cellules HeLa stablement transfectées avec l’ADNc de CFTR (vecteur pTracer), wild-type ou porteur de diverses mutations, parmi lesquelles la mutation F508del (Clain, et al., 2001; Jungas, et al., 2002). Bien que ces cellules ne possèdent pas la même machinerie cellulaire que les cellules d’origine bronchique, elles expriment un taux très élevé de protéine CFTR, et sont donc appropriées pour étudier les mécanismes cellulaires propres à ce canal.

Afin d’évaluer le niveau d’activation relatif de la voie NF-κB dans nos lignées cellulaires, nous avons mesuré l’activité luciférase d’un vecteur rapporteur dont la transcription dépend de NF-κB via 5 éléments de liaison dans le promoteur (pNF-κBLuc, Stratagene) (Figure 53).

Résultats 140 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 BEAS2B IB3-1 S9 C38 RLU 0 1 2 3 4 5 6 BEAS2B IB3-1 S9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 BEAS2B IB3-1 S9 C38 RLU

Niveau basal Sous induction par le TNFα

Fold d’induction par le TNFα

Figure 53. Evaluation de l’activité NF-κB dans différentes lignées bronchiques. Un vecteur luciférase répondant à NF-κB (pNF-κBLuc, Stratagene) et un plasmide de contrôle Renilla ont été co-transfectés dans les différentes lignées, en l’absence (niveau basal) ou en présence de TNFα (30ng/mL, 4h). Les résultats normalisés par l’activité Renilla sont exprimés en RLU (Relative Luciferase Unit). Les folds d’induction sous TNF-α ont été calculés (RLU sous induction/basal) pour les cellules BEAS-2B, IB3-1 et S9. Ce fold ratio n’est pas représenté pour les cellules C38 : en effet, sa valeur très élevé de 9,6 fold est due à l’activité extrêmement faible de luciférase en condition basale, l’activité sous stimulation restant, malgré ce fold ratio, très faible. Résultats d’une seule expérience représentative en triplicat.

Les cellules BEAS-2B sont des cellules bronchiques avec un génotype CFTR normal. L’activité NF- κB semble beaucoup plus élevée dans ces cellules par rapport aux modèles plus souvent utilisés dans la mucoviscidose IB3-1, C38 et S9. Ceci peut notamment être attribué à un fond génétique différent. Ces cellules présentent d’ailleurs des différences morphologiques par rapports aux 3 autres lignées, se traduisant notamment in vitro par un étalement plus large en boîtes de culture. Comme rapporté dans de nombreuses études, les cellules non CF C38 présentent un taux d’inflammation basal (<0,1 RLU) et sous stimulation par le TNF-α (<1 RLU) très inférieur aux cellules IB3-1 (1 et 4,6 RLU respectivement). Cependant, ce taux est également très inférieur à celui des autres cellules non CF S9. Les cellules S9 présentent dans nos conditions une activité basale de NF-κB similaire à celle des cellules CF IB3-1. Néanmoins, une différence entre ces deux lignées est observable sous stimulation : la stimulation de l’activité NF-κB est plus importante dans les cellules IB3-1 (fold ratio d’environ 4,6) que dans les S9 (fold ratio proche de 3,5). Cette différence, qui peut sembler faible, est néanmoins reproductible, et d’autres expériences montrent qu’elle est statistiquement significative (p<0,005). Les cellules S9 et C38 diffèrent par la présence ou non de la boucle extracellulaire 1 de CFTR-wt, qui pourrait jouer un rôle dans les signaux de transduction de l’inflammation. Nous avons choisi pour notre étude d’utiliser les cellules S9, qui sont plus proches des cellules IB3-1 que les C38.

La même expérience au niveau basal a été menée dans nos modèles de cellules HeLa exprimant stablement CFTR (Figure 54). L’activité transcriptionnelle de NF-κB dans les cellules exprimant CFTR-

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wt est nettement plus basse que dans les cellules exprimant CFTR-F508del. Ceci est en accord avec l’hypothèse que la mutation F508del génère un état pro-inflammatoire par rapport à l’état sauvage. La comparaison des cellules exprimant le vecteur vide (PTracer) et CFTR-wt ne permettait pas de confirmer l’hypothèse que la protéine CFTR-wt aurait elle-même un potentiel anti-inflammatoire dans l’expérience présentée ici, choisie à cause de l’efficacité de transfection similaire dans les 3 types cellulaires. Des mises au point supplémentaires seraient nécessaires, nos cellules HeLa CFTR-wt présentant, dans nos conditions, un taux de mortalité augmenté par rapport aux cellules PTracer et CFTR-F508del. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Ptracer CFTR-wt CFTR-F508del RLU Niveau basal

Figure 54. Evaluation de l’activité basale NF-κB dans les cellules HeLa exprimant stablement CFTR-wt ou CFTR-F508del. Les cellules exprimant PTracer vide servent de contrôle. Résultats d’une expérience représentative réalisée en triplicat.

L’ensemble de ces résultats montre bien une augmentation de l’activité NF-κB dans les cellules CF par rapport aux cellules non CF. Cette différence est très subtile entre les cellules IB3-1 et S9, ce qui s’explique probablement par le très faible taux d’expression de CFTR dans ces cellules par rapport à nos cellules HeLa stablement transfectées.