1. CFTR , du gène à la protéine
Le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator, également appelé ABCC7, MIM*602421) est un des premiers gènes identifiés par clonage positionnel en pathologie humaine en 1989 (Riordan, et al., 1989; Rommens, et al., 1989b). Localisé en 7q31, il s’étend sur 190kb et est constitué de 27 exons classiquement numérotés de 1 à 24 (avec des exons 6a et 6b, 14a et 14b, 17a et 17b). Deux nomenclatures sont aujourd’hui utilisées concernant le gène CFTR : la nomenclature traditionnelle (anciennement utilisée, exons numérotés de 1 à 24) et la nomenclature HGVS (Human
Genome Variation Society) qui suit les recommandations internationales. A ce jour, si environ 1900
variations de séquence du gène CFTR ont été décrites, c’est une trentaine de mutations qui représente 85% des allèles retrouvés chez les patients (www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app). La plus
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fréquente, la mutation F508del (c.1521_1523delCTT, p.Phe508del selon la nomenclature HGVS), anciennement appelée deltaF508, et qui entraine la délétion d’un codon phénylalanine, représente à elle seule 70% des allèles (Castellani, et al., 2008).
7p11.2 7q11.1
7q31.2 CFTR 7p22.3
Figure 7. CFTR, du gène à la protéine. Localisé en 7q31, le gène CFTR s’étend sur 190 kb. Il est constitué de 27 exons (numérotés de 1 à 24 selon la nomenclature traditionnelle) et code un ARN messager de 6,5kb. Cet ARN est traduit en une protéine transmembranaire de 1480 acides aminés (175 kDa) glycosylée sur la 4ème boucle extra-cellulaire.
Structure de la protéine CFTR
Le gène CFTR code un ARN messager (ARNm) de 6,5 kb, qui est traduit en une protéine de 1480 acides aminés (Figure 7). Après différents processus de modifications post-traductionelles, la glycoprotéine mature CFTR, de 175 kDa, gagne la membrane apicale des cellules épithéliales où elle exerce son activité de canal anionique. Comme d’autres membres de la superfamille des ABC transporteurs (ATP Binding Cassette) dont elle fait partie, CFTR est une protéine monomérique relativement symétrique. Les 2 moitiés, constituées chacune d’un domaine hydrophobe transmembranaire (TMD pour TransMembrane Domain) et d’une importante région hydrophile intracytoplasmique capable de lier l’ATP (NBD pour Nucleotide Binding Domain) (Aleksandrov, et al.,
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2007; Gadsby, et al., 2006), sont reliées entre elles par le domaine régulateur R intra-cytoplasmique. Les TMD, constitués chacun de 6 segments transmembranaires (TM1-12), sont impliqués dans la formation du pore anionique (Riordan, et al., 1989).
Mécanisme d’ouverture du canal
A l’état basal, aucun courant chlorure n’est mesuré au travers du canal CFTR. L’augmentation intracellulaire de l’AMPc permet d’activer la kinase PKA (protéine kinase AMPc dépendante) capable alors de phosphoryler le domaine R. La phosphorylation du domaine R par les kinases PKA et PKC induit un changement conformationnel augmentant l’accessibilité des domaines de liaison des nucléotides NBD1 et NBD2 à l’ATP (Cotten and Welsh, 1997; Riordan, et al., 1989), sur les sites consensus de liaison à l’ATP nommés Walker A et B (Walker, et al., 1982). La liaison de deux molécules d’ATP au niveau des deux NBDs permet un rapprochement de ces deux domaines, enfermant les molécules d’ATP dans une poche. Un signal est alors transmis à la région transmembranaire, permettant l’ouverture du canal qui est maintenue jusqu’à l’hydrolyse de l’ATP au niveau du NBD2. L’hydrolyse de cette 2ème molécule d’ATP affaiblit la liaison NBD1-NBD2, ce qui déclenche la fermeture du canal (Aleksandrov, et al., 2007; Gadsby, et al., 2006; Zhou, et al., 2006)
2. La régulation de l’expression génique
Le profil d’expression de CFTR varie selon les tissus et le stade du développement. Une régulation si fine ne peut être encore expliquée par la seule présence des éléments régulateurs identifiés dans son promoteur. Cependant, cette séquence est clairement nécessaire pour l’expression génique, et mérite donc de plus amples investigations pour déterminer son mécanisme d’action. Des études ont montré les similarités de entre le promoteur CFTR et les promoteurs des gènes de ménage. D’autres éléments pouvant contribuer à la régulation spatio-temporelle de l’expression du gène sont l’utilisation de multiples sites de début de transcription et le recrutement d’exons 1 alternatifs.
2.1. Profil d’expression spatio-temporel de CFTR
Le gène CFTR montre un profil d’expression spatio-temporel très finement régulé selon les tissus et au cours du développement.
Notamment, chez le fœtus au 2ème trimestre, l’expression de CFTR est très importante dans les poumons, les canaux pancréatiques et les cryptes de l’intestin grêle, et plus faible dans l’épithélium épididymaire fœtal. Ce profil est maintenu après la naissance, à l’exception du système respiratoire
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(Harris, et al., 1991; Trezise, et al., 1993). En effet, l’expression de CFTR est fortement diminuée dans le poumon adulte par rapport au poumon fœtal (Figure 8) (Crawford, et al., 1991; Engelhardt, et al., 1994; Foulkes and Harris, 1993; Harris, et al., 1991).L’âge de transition pour le changement de taux d’expression pulmonaire du gène n’est pas connu, mais pourrait correspondre à un stade de développement particulier du tissu (White, et al., 1998). Dans le poumon adulte, l’expression de
CFTR est détectable dans les cellules séreuses et dans les canaux des glandes sous muqueuses, et
dans les cellules épithéliales des structures distales des bronches (bronchioles et alvéoles) (Engelhardt, et al., 1994).
Figure 8. Profil d'expression de CFTR, d'après la base de données UCSC genome browser.
2.2. Différents sites d’initiation de la transcription et transcrits alternatifs
1. Les sites alternatifs d’initiation de la transcription
Dans les cellules d’origine humaine, le site d’initiation de la transcription semble varier selon le niveau d’expression de la protéine CFTR. Ainsi, dans les cellules l’exprimant fortement, comme les cellules d’adénocarcinome de colon HT-29, T84 et Caco-2, le site majeur est en position c.-72 pb par
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rapport au codon initiateur ATG de l’exon 1, mais d’autres sites mineurs sont également utilisés (Koh, et al., 1993; Yoshimura, et al., 1991). Dans les cellules exprimant faiblement le canal, comme les cellules HeLa et PANC-1 (adénocarcinome épithélial pancréatique), c’est le site d’initiation en c.- 153 pb qui est le plus utilisé (Koh, et al., 1993).
Dans le poumon humain, un changement de site d’initiation s’opère au cours du développement : le site majoritaire dans le poumon fœtal est positionné en c.-132 pb, tandis que le site utilisé dans le poumon adulte est en c.-69 pb (Figure 9). Ce changement de site d’initiation de la transcription pourrait participer à la régulation de la transcription et expliquer la diminution d’expression de CFTR dans le poumon adulte par rapport au poumon fœtal (White, et al., 1998).
ATG +1 -72 -153 - 132 - 216 Expression faible (HeLa, PANC-1) Expression forte (Caco-2, HT29, T84) - 114 - 69 - 68
Poumon foetal Poumon adulte, intestin Pancréas Intestin Site majeur Site mineur Lignées cellulaires Site majeur in vivo
3’ 5’
Figure 9. Les différents sites de début de transcription de CFTR
2. les exons alternatifs à l’exon 1
Des exons alternatifs à l’exon 1 ont été décrits chez la souris (exon -1) (White, et al., 1998), le mouton (exons ov1aS et ov1aL) (Mouchel, et al., 2003; White, et al., 1998) et le lapin (exons -1A, -1B, -1C) (Davies, et al., 2004). Chez la souris, la production du transcrit contenant l’exon -1, qui utilise un site d’initiation de la traduction en position c.-549 pb, est régulée lors de la spermatogénèse (White, et al., 1998). Au cours du développement pulmonaire, le maximum d’expression du transcrit ov1aS chez le mouton correspond au moment où l’expression de CFTR commence à décliner (Mouchel, et al., 2003), tandis que les différents isoformes d’ARNm sont régulés au cours du développement cardiaque chez le lapin (Davies, et al., 2004).
Des isoformes d’ARNm CFTR contenant un exon 1 alternatif ont également été identifiés chez l’homme à partir d’une banque d’ADNc d’origine pancréatique (Rommens, et al., 1989a), puis
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confirmés dans les lignées d’adénocarcinome pancréatique CFPAC et coliqueT84, et dans des extraits de poumon fœtal humain (Koh, et al., 1993; Mouchel, et al., 2003). L’usage de ces exons alternatifs - 1a et 1a exclut l’exon 1 habituel (Koh, et al., 1993). L’exon -1a ne contient pas d’AUG, mais contient un codon d’initiation alternatif potentiel CUG. L’exon 1a contient des codons de terminaison quelle que soit la phase de lecture. Dans le poumon fœtal humain, on retrouve de manière transitoire les isoformes contenant les exons -1a/1a/2 et -1a/2 (Figure 10). Si le transcrit -1a/1a/2, contenant dans l’exon 1a un codon de terminaison, ne permet pas de produire de protéine, le transcrit -1a/2 pourrait utiliser un codon d’initiation alternatif CUG (exon -1a) et utilise in vitro des codons AUG de l’exon 4 (M150, M152 or M156) (Lewandowska, et al., 2009). Ces transcrits alternatifs apparaissent juste avant le début de la diminution globale de CFTR dans la phase canaliculaire du développement pulmonaire, et leur quantité diminue au cours de la grossesse, entre 14 et 26 semaines, alors que la quantité globale d’ARN CFTR ne semble pas varier (Mouchel, et al., 2003). Le rôle de cette transcription alternative est mal connu. Il est possible que ces ARNm, ne menant pas à une protéine fonctionnelle, aient un effet régulateur important lors du développement pulmonaire, par exemple en diminuant la traduction de CFTR (diminution de l’accrochage de la sous unité ribosomale 40S) (Mouchel, et al., 2003). Exon 1 Exon 1a Exon -1a +1 -132 -401 -633 -750 -937 -803 -600 Exon 2 CTG CTG ATG
Exon -1a Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exons 5…24
Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exons 5…24 Protéine normale de