Validation des vecteurs optimisés

Une fois construits, ces différents plasmides sont validés au niveau transcriptionnel (détection de l’ARN) et traductionnel (détection de la protéine).

Par RT-PCR

Pour vérifier la fonctionnalité des différents plasmides au niveau transcriptionnel, nous réa- lisons une transfection transitoire sur des cellules B16 (mélanome de souris). La transfection est réalisée en plaque 6 puits (100 000 cellules B16 par puits) avec 4nmoles de RPR209120/µg

3.7. Optimisation du fragment immunogène 141 d’ADN, à raison de 1,5µg de plasmide par puits. Quarante-huit heures après transfection la pré- sence des transcrits est montrée par RT-PCR à partir de l’ARN extrait du lysat cellulaire (figure 3.16) avec des amorces spécifiques de la séquence optimisée du fragment C-terminal de la toxine botulique A.

1kb Fc* M V Ø C- C+ Fc* M V Ø

RT-PCR PCR

1kb Fc* M V Ø C- C+ Fc* M V Ø

RT-PCR PCR

Fig. 3.16 – Analyse par RT-PCR de la présence des transcrits dans le lysat cel- lulaire après transfection des différentes constructions contenant la séquence opti- misée Fc*BoNTA. Une RT spécifique est effectuée avec les amorces appropriées avant amplification par PCR d’un fragment de 703pb de l’ADNc du fragment Fc*BoNTA (amorce sens : 5’gcctgaactacggcgagatcatctgg3’, amorce antisens : 5’gatctccagggcgctcaggatctt3’). Les produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur gel d’aga- rose 2%. Notations : 1kb : marqueur de taille ; les cellules ont été transfectées avec différents plasmides notés : Fc* : pVaxFc*BoNTA ; M : pVaxFc*BoNTA-Master ; V : pVaxFc*BoNTA-Variant ; ⊘ : cellules non transfectées ; C- : PCR sans ADN ; C+ :PCR contrôle sur le plasmide pVaxFc*BoNTA. En contrôle, une PCR est effectuée directement sur les ARN extraits avant RT des différentes conditions.

Par marquage immunofluorescent

Une fois la RT-PCR réalisée, nous effectuons une immunofluorescence sur cellules fixées afin de détecter la protéine FcBoNTA. Pour cela une transfection sur des cellules B16 est réalisée en plaque 12 puits (80 000 cellules par puits) avec 4nmoles de RPR209120/µg d’ADN, à rai- son de 0,5µg de plasmide par puits. Le marquage est réalisé 24 heures après transfection dans les différentes conditions testées : pVaxFcBoNTA, pVaxFc*BoNTA, pVaxFc*BoNTA-Master et pVaxFc*BoNTA-Variant. Un anticorps monoclonal fourni par le Dr. Hervé Volland (CEA) nous permet de détecter ce fragment C-terminal de la toxine botulique A. Les noyaux sont colorés au DAPI (figure 3.17).

Nous observons une localisation cytoplasmique de la protéine dans le cas de la transfection avec le plasmide pVaxFc*BoNTA. Là encore aucune expression n’est détectée dans le cas du fragment FcBoNTA non optimisé, la protéine doit être exprimée en trop faible quantité pour pouvoir la visualiser. Ceci nous confirme l’intérêt de cette optimisation des codons.

Dans le cas des plasmides pVaxFc*BoNTA-Master et Variant, la protéine semble être détec- tée dans des vésicules de sécrétion. Pour nous assurer de cette localisation nous avons effectué une double immunofluorescence avec d’une part un anticorps monoclonal dirigé contre une pro- téine de l’appareil de Golgi, GM130, et d’autre part l’anticorps monoclonal anti-FcBoNTA. Les deux anticorps étant des anticorps de souris, nous avons au préalable biotinylé l’anticorps anti-

142 Chapitre 3. Obtention d’antisérums antitoxines botuliques

Fc

Fc*

M

V

Fc

Fc*

M

V

Fig. 3.17 – Immunofluorescence pour la détection du fragment Fc de la toxine botu- lique A.Immunofluorescence réalisée sur des cellules de souris B16 24h après transfection. AcI : anti-FcBoNTA dilué au 1/200e

. AcII : anti-souris IgG-FITC dilué au 1/400e

. Les noyaux sont marqués au DAPI. Observation au microscope à fluorescence. Conditions : Fc : pVaxFcBoNTA ; Fc* : pVaxFc*BoNTA ; M : pVaxFc*BoNTA- Master ; V : pVaxFc*BoNTA-Variant. Grossissement X40 pour les photos Fc et Fc* ; grossissement X100 pour les photos M et V.

FcBoNTA (voir Matériel et Méthodes) pour permettre une double détection des deux anticorps de manière indépendante. Le résultat de ce double marquage est observé au microscope confocal pour s’assurer de la co-localisation des deux marquages (figure 3.18).

M

V

Fc*

M

V

Fc*

Fig. 3.18 – Immunofluorescence pour la co-localisation du fragment Fc de la toxine botulique A et de l’appareil de Golgi. Immunofluorescence réalisée sur des cellules de souris B16 24h après transfection. AcI : anti-FcBoNTA biotinylé dilué au 1/200 et anti-GM130 (Golgi) dilué au 1/250e

. AcII : streptavidine-rhodamine et anti-souris IgG-FITC dilués au 1/400e

. Observation au microscope confocal.

Le marquage du fragment FcBoNTA est observé en fluorescence rouge, celui de l’appareil de Golgi est observé en fluorescence verte : on observe effectivement une co-localisation des deux

3.7. Optimisation du fragment immunogène 143 marquages (détectable par une couleur jaune) pour les deux transfections avec les plasmides pVaxFc*BoNTA-Master et pVaxFc*BoNTA-Variant. Avec le plasmide pVaxFc*BoNTA, ne pos- sédant pas de signal de sécrétion, on observe un marquage rouge cytoplasmique, et le marquage vert de l’appareil de Golgi distincts.

Par ELISA et Western-Blot

Pour déterminer la quantité de protéine sécrétée, dans le cas des deux plasmides pVaxFc*BoNTA- Master et Variant possédant un signal de sécrétion, nous réalisons une transfection sur cellules B16 en plaque 6 puits (100 000 cellules par puits) avec 4nmoles de RPR209120/µg d’ADN, à raison de 1,5µg de plasmide par puits. Six heures après transfection, le milieu de culture de la transfection est changé et remplacé par un milieu contenant 2% de sérum au lieu des 10% habi- tuels. Le surnageant de culture est récupéré 48 heures après transfection. Le dosage par ELISA est encore en cours actuellement car nous avons eu des problèmes de mise au point.

En parallèle nous réalisons un Western-Blot à partir de ces surnageants de culture pour vérifier la nature de la protéine sécrétée. En contrôle la protéine recombinante est déposée (figure 3.19). On observe effectivement une bande spécifique du fragment FcBoNTA qui n’est pas présente dans la condition sans transfection.

M V Ø

prot.

FcBoNTA

Fig. 3.19 – Western-Blot pour la détection du fragment FcBoNTA sécrété dans le surnageant de culture in vitro. M : pVaxFc*BoNTA-Master, V :pVaxFc*BoNTA-Variant, ⊘ : sans transfection, prot. : protéine recombinante.

L’ensemble des constructions plasmidiques étant donc validé in vitro, nous pouvons les tester in vivo.