distincts, pour s’affranchir de ces éventuels mécanismes de compétitions au niveau d’une même cellule cible.
3.12
Application de la technique au lapin
3.12.1 Choix du protocole
Différents protocoles d’électrotransfert chez le lapin sont cités dans la littérature, avec chaque fois des conditions différentes d’électrotransfert (tableau 3.12). Nous avons choisi notre protocole sur la base de ces différents exemples (tableau 3.12 en italique) en utilisant des électrodes aiguilles conçues par la société Sphergen : elles sont constituées de trois aiguilles alignées (figure 3.33), celle du milieu est utilisée pour l’injection à 5mm de profondeur et constitue ensuite l’électrode négative, les deux extérieures servent d’électrodes positives.
+
-
5mm 15mm support Électrodes extérieures Électrode intérieure + injection+
-
5mm 15mm support Électrodes extérieures Électrode intérieure + injectionFig.3.33 – Electrodes Sphergen utilisées pour l’électrotransfert chez le lapin.
ADN
Muscle µg µl Conditions Ref.
gracilis 500-1000 900 200V/cm ; 6 impulsions ; 50ms ; 1Hz [96]
fémoral 500 300 50V/cm ; 3+3 impulsions ; 10ms ; 1Hz [357]
tibialis 200 200 90V/cm ; 1000 impulsions bipolaires ; 10 trains ; 1s [105]
squelettique 100 500 75V/cm ; 3+3 impulsions ; 50ms ; 1Hz [358]
tibialis 300-3000 300 90V/cm ; 1000 impulsions bipolaires ; 8 trains ; 1s [352]
fémoral 500 300 125V/cm ; 8 impulsions ; 20ms ; 2Hz Nous
164 Chapitre 3. Obtention d’antisérums antitoxines botuliques 3.12.2 Réalisation
Nous avons réalisé un essai sur deux lapins mâles néo-zélandais, nommés Mystère et Boulde- gomme, pour comparer une injection et électrotransfert (Mystère) à une injection seule (Boulde- gomme). Le lapin Bouldegomme est injecté directement avec 500µg de plasmide pVaxFc*BoNTA- Master dans 300µl de NaCl 0,9% dans le muscle fémoral sans anesthésie. Le lapin Bouldegomme est anesthésié à l’aide d’un mélange kétamine/xylazine en intramusculaire, puis sa patte arrière est rasée, et 500µg de plasmide pVaxFc*BoNTA-Master dans un volume de 300µl sont injectés également. Puis les électrodes sont appliquées au niveau du site de l’injection pour délivrer le champ électrique.
Des prélèvements de sang sont effectués régulièrement dans l’artère de l’oreille et le titre en anticorps des deux lapins est déterminé à chaque temps par dosage des anticorps dans le sérum grâce à un ELISA (figure 3.34).
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 J15 J21 J42 J70 ti tr e injection injection + ET
Fig. 3.34 – Titres en anticorps obtenus chez le lapin après une injection seule ou combinée avec un électrotransfert. Le lapin Mystère (rouge) est injecté et électrotransféré avec 100µg de plasmide pVaxFc*BoNTA-Master. Le lapin Bouldegomme (gris) recoit une injection seule de 100µg du même plasmide.
Cet essai nous permet de montrer qu’il est également possible d’obtenir des anticorps anti- FcBoNTA chez le lapin. Au vu des résultats l’électrotransfert semble améliorer légèrement la production d’anticorps, mais ce résultat ne nous permet pas vraiment de conclure sur l’efficacité de l’électrotransfert dans notre cas car nous n’avons travaillé que sur deux lapins.
Nous effectuons un test de neutralisation sur les sérums des deux lapins 6 semaines (J42) après le début de l’expérience (tableau 3.13).
Ce test de neutralisation nous permet de conclure qu’il est possible d’obtenir des anticorps neutralisants par injection d’ADN codant l’antigène correspondant chez le lapin, par contre les titres obtenus sont très faibles. A titre de comparaison, l’équipe du Dr. Michel Popoff à l’Institut Pasteur, a récemment obtenu un titre de 20 000 chez le lapin après trois injections de 100µg de protéine recombinante Hc purifiée [351]. Il sera nécessaire de vérifier l’efficacité de notre protocole d’électrotransfert chez le lapin en étudiant les niveaux d’expression d’un gène
3.13. Conclusion et Perspectives 165
Dilutions Titre neutral.
Condition 10−2 10−3 10−4 10−5 pour 10MLD
Mystère (inj+ET) 2/2 0/2 0/2 0/2 100
Bouldegomme (inj) 1/2 1/2 1/2 0/2 ?
Tab.3.13 – Test de neutralisation contre la toxine botulique A : preuve du concept chez le lapin et comparaison injection/ injection et électrotransfert. Les résultats correspondent au nombre de souris survivantes injectées par BoNTA et neutralisées par les sérums testés.
rapporteur. On pourra également réaliser un essai en intradermique sur le lapin : Medi et al. ont récemment montré un transfert efficace dans la peau en utilisant des électrodes plaques [359]. Il sear intéressant également de tester l’effet d’une réinjection.
3.13
Conclusion et Perspectives
3.13.1 Remarques générales
Les résultats présentés dans ce travail s’appuient sur des expériences réalisées avec seulement 4 souris par condition pour les traitements in vivo et deux souris par dilution sur les test de neutralisation : en effet vu le nombre important de constructions et de protocoles à tester, nous avons préféré limiter le nombre d’animaux dans cette première étape d’évaluation. Ce nombre est sans doute insuffisant pour tirer des conclusions définitives mais il nous permet cependant de dégager des tendances pour nous focaliser par la suite sur les conditions les plus intéressantes.
De nombreuses expériences complémentaires devront être réalisées pour confirmer ou clarifier certains résultats. Ces expériences n’ont pas encore été effectuées par manque de temps.
3.13.2 Bilan
Ces premières expériences nous ont permis de dégager un certain nombre d’informations : – Il est possible d’obtenir des anticorps anti-toxine botulique A, B et E par injection et élec-
trotransfert intramusculaire chez la souris d’un plasmide codant le fragment C-terminal immunogène correspondant.
– Il est possible d’obtenir des anticorps anti-toxine botulique A par injection et électrotrans- fert intradermique chez la souris d’un plasmide codant le fragment C-terminal immuno- gène correspondant.
– Les anticorps anti-toxine A obtenus sont neutralisants.
– L’électrotransfert permet d’améliorer la production d’anticorps par rapport à une injec- tion seule.
– L’optimisation de la séquence de l’antigène selon l’usage des codons chez la souris permet d’augmenter l’expression de l’antigène et par conséquent la réponse immune correspon- dante.
– L’ajout d’un signal de sécrétion n’améliore pas la production d’anticorps mais les anti- corps obtenus semblent avoir un meilleur pouvoir neutralisant. Le titre en anticorps neutra- lisants obtenu est comparable à celui obtenu après trois injections de protéine recombinante. Cependant le choix du signal de sécrétion a son importance. Nous n’avons pas les mêmes résultats avec deux signaux de sécrétion différents.
166 Chapitre 3. Obtention d’antisérums antitoxines botuliques – Un prétraitement à la hyaluronidase permet d’augmenter la production d’anticorps sur- tout lorsque l’antigène est faiblement exprimé. Cependant ce prétraitement semble pro- mouvoir principalement une réponse de type Th1.
– Deux traitements successifs (injection + électrotransfert) à 3 semaines ou un mois d’in- tervalle ou une double injection en deux sites distincts à J0 permettent d’améliorer le titre en anticorps obtenu, que l’antigène soit sécrété ou non. Le pouvoir neutralisant de ces sérums devra être évalué de façon plus précise.
– Il est possible d’obtenir des sérums multivalents anti-toxine A, B et E par co-injection des différents plasmides codant les fragments C-terminaux respectifs de ces toxines, mais une première évaluation semble montrer une moins bonne efficacité de neutralisation. – Il est possible d’obtenir des anticorps anti-toxine botulique A par injection seule ou combi-
née à l’électrotransfert intramusculaire chez le lapin d’un plasmide codant le fragment C-terminal immunogène correspondant. Le protocole n’est cependant pas optimisé. 3.13.3 Perspectives
Le protocole optimal sera sans doute une combinaison des protocoles testés jusqu’à pré- sent : il pourrait ressembler à une double injection de 40µg de plasmide pVaxFc*BoNTA ou pVaxFc*BoNTA-Master à J0 dans chaque muscle, une réinjection à un mois d’intervalle, et éven- tuellement un «boost» protéique un mois après pour augmenter encore la réponse immune.
D’autres paramètres pourront également être évalués, comme la co-injection de cytokines ou la comparaison de différents signaux de sécrétion.
Nous savons en effet que la co-injection suivie d’un électrotransfert de plusieurs plasmides en intramusculaire permet une co-expression au niveau du muscle des différentes protéines d’intérêt. Il peut donc être intéressant de co-injecter le plasmide codant l’antigène et un plasmide codant une cytokine qui permettrait d’améliorer la réponse humorale. Cette étude est actuellement en cours au laboratoire.
Par ailleurs, nous avons observé une différence significative entre les titre en anticorps neu- tralisants obtenus avec le signal de sécrétion de l’Epo et celui de la hSeAP. Nous essayons actuel- lement de déterminer la quantité de FcBoNTA sécrété dans le sérum dans chaque cas par dosage ELISA. Il serait éventuellement intéressant de tester d’autres signaux de sécrétion, comme par exemple le signal de sécrétion de l’activateur au plasminogène t-PA, qui a été utilisé avec effi- cacité dans des stratégies d’immunisation génétique dans le muscle [343]. Fattori et al. ont par ailleurs montré une amélioration de l’expression de l’Epo en changeant son signal de sécrétion pour celui du t-PA combiné à une optimisation de codons [352].
4
Etude de l’état de l’ADN plasmidique
après injection et électrotransfert
Sommaire
4.1 Contexte de travail . . . 167 4.2 Détection du plasmide sous forme épisomale . . . 168 4.3 Etude de la possible intégration de l’ADN plasmidique . . . 170 4.4 Etude de l’état de méthylation du promoteur CMV . . . 181 4.5 Conclusions et Perspectives . . . 187
4.1
Contexte de travail
Comme nous l’avons vu au cours de ce travail, le muscle squelettique est un tissu cible très intéressant pour le transfert de gène in vivo car il offre de nombreux avantages : le muscle est facilement accessible et de grand volume, il possède une vascularisation développée ce qui permet aux protéines produites d’atteindre rapidement la circulation sanguine, et surtout les fibres musculaires sont quiescentes ce qui permet un maintien du transgène et une expression à long terme.
De nombreuses cinétiques obtenues avec différents gènes rapporteurs ou thérapeutiques peuvent illustrer ce dernier point :
– après injection et électrotransfert sur des souris C57Bl6 de 1µg de plasmide codant l’éry- thropoïétine (mEpo), on observe une augmentation d’hématocrite pendant au moins 100 jours (voir chapitre 2, paragraphe 2.6.4, figure 2.20),
– après injection et électrotransfert de 50µg de plasmide pEGFP-C1 (GFP) sur des souris SWISS, on observe une fluorescence des fibres musculaires pendant au moins 169 jours (voir chapitre 1, paragraphe 1.5.2, figure 1.6),
– après injection et électrotransfert de 15µg de plasmide codant la phosphatase alcaline sécrétée humaine (hSeAP) sur des souris SCID on observe une expression à long terme pendant au moins un an [145]. Des cinétiques comparables ont été obtenues lors de la mise au point du système de régulation avec la hSeAP également (voir chapitre 2).
Le muscle squelettique est ainsi un organe de choix pour la production en systémique de protéines thérapeutiques. Cependant dans un tel contexte, il est indispensable d’étudier plus précisément les raisons de cette expression à long terme en analysant l’état de l’ADN plasmidique
168 Chapitre 4. Etude de l’état de l’ADN plasmidique après injection et électrotransfert une fois injecté : s’est il intégré dans l’ADN génomique, reste-il sous forme épisomale pendant une aussi longue période ?
D’autre part les promoteurs viraux sont souvent utilisés dans le cadre du transfert de gène car ils permettent des niveaux d’expression bien supérieurs à ceux obtenus avec des promoteurs eucaryotes, le plus connu étant celui dérivé du promoteur du cytomegalovirus (CMV). Les ciné- tiques précédentes par exemple ont été réalisées avec ce promoteur CMV ; or elles montrent un profil analogue : rapidement après injection et électrotransfert, l’expression du transgène aug- mente fortement, se stabilise pendant une période plus ou moins longue selon les études, puis décroît lentement au cours du temps. Nous avons voulu savoir si cette extinction de l’expression pouvait être due à une méthylation du promoteur CMV.
Ce travail s’articule donc autour de deux questions auxquelles nous avons tenté de répondre : après injection et électrotransfert d’un vecteur plasmidique dans le muscle tibial cranial d’une souris
– quel est l’état de l’ADN plasmidique injecté : reste-t-il sous forme épisomale et/ou est-il intégré dans l’ADN génomique ?
– quel est l’état de méthylation du promoteur CMV de ce vecteur plasmidique, cette méthy- lation étant une cause possible de l’extinction progressive de l’expression.
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