nouveau éventuellement avec le plasmide pVaxFc*BoNTA-Master. En effet il sera intéressant de savoir si c’est l’intervalle entre les deux injections qui a de l’importance ou la localisation de l’antigène dans notre cas.
Test de neutralisation
Nous avons réalisé un test de neutralisation sur les sérums prélevés 6 semaines après le début du traitement pour évaluer le pouvoir neutralisant des anticorps anti-FcBoNTA obtenus dans différents cas testés.
Nous avons regroupé les sérums des 4 souris de chaque lot : pVaxFc*BoNTA-Master en intradermique puis intramusculaire 3 semaines après, pVaxFc*BoNTA-Master deux fois en in- tramusculaire à 3 semaines d’intervalle, pVaxFc*BoNTA deux fois en intramusculaire à un mois d’intervalle.
Le tableau 3.9 présente les souris survivantes injectées par BoNTA et neutralisées par les sérums testés.
Dilutions Titre neutral.
Condition 10−2 10−3 10−4 10−5 pour 10MLD
Fc*BoNTA-Master i.m 2/2 2/2 2/2 0/2 10 000
Fc*BoNTA-Master i.d + i.m 2/2 1/2 0/2 1/2 ?
Fc*BoNTA-Master i.m+i.m 2/2 2/2 1/2 1/2 1000-10 000
Fc*BoNTA i.m 2/2 0/2 0/2 0/2 100
Fc*BoNTA i.m + i.m 2/2 2/2 1/2 1/2 1000-10 000
Tab.3.9 – Test de neutralisation contre la toxine botulique A : effet de deux électro- tansfert successifs. Les résultats correspondent au nombre de souris survivantes injectées par BoNTA et neutralisées par les sérums testés. Pour référence, les conditions Fc*BoNTA-Master i.m et Fc*BoNTA i.m déjà obtenues précédemment sont placées en italique.
Ces résultats ne nous permettent pas vraiment de conclure sur le protocole optimal. Les résultats ne sont pas exploitables puisque par exemple pour la condition id. + im. les deux souris de la dilution 10−4 sont mortes et une souris sur deux est vivante à la dilution 10−5. De plus
nous n’avons pas pu tester la condition Fc*BoNTA-Master en intradermique car nous n’avions pas assez de sérum. Ce test de neutralisation va être renouvelé sur un plus grand nombre de souris. Cependant on peut observer que la réinjection à un mois d’intervalle du pVaxFc*BoNTA permet d’augmenter le pouvoir neutralisant des anticorps. En effet nous n’avions qu’un titre de 100 après une injection et électrotransfert. Avec deux injections, on atteint au moins un titre de 1000 et une souris sur deux survit à la dilution 10−4 et 10−5. Ce protocole de réinjection semble
donc être intéressant.
3.9
Caractérisation des antisérums
Les sous types de réponse immune médiés par les cellules T helper sont bien compris et bien définis chez la souris. Une réponse immune de type Th1 est principalement une réponse cellulaire, elle est caractérisée par la forte présence d’anticorps IgG2a et la production de cytokines IFNγ et TNFα. Une réponse immune de type Th2 est principalement une réponse humorale avec
156 Chapitre 3. Obtention d’antisérums antitoxines botuliques production d’anticorps, elle est caractérisée par la forte présence d’anticorps IgG1 et la production de cytokines IL-4 et IL-10 [343].
Pour définir de façon plus précise le type de réponse immune généré dans les différents lots de souris nous réalisons donc deux ELISA en parallèle pour détecter au sein d’un sérum les anticorps de type IgG1 ou IgG2a et ainsi déterminer le profil d’IgG dans les différents sérums. Différentes conditions sont testées pour comparer les différents antigènes produits (sécrétés ou non), les différents protocoles d’électrotransfert (intradermique ou intramusculaire), l’effet d’un prétraitement à la hyaluronidase et de la réinjection. Nous avons dosé les sérums des lots traités avec les plasmides pVaxFcBoNTA (noté Fc), pVaxFc*BoNTA (Fc*), pVaxFc*BoNTA-Master (Fc*M), pVaxFc*BoNTA-Variant (Fc*V), pVAxFc*BoNTA+hyaluronidase (HFc*) au temps J42 après le début de l’expérience. En contrôle nous avons dosé un sérum de souris injectée trois fois avec la protéine recombinante FcBoNTA (sérum fourni par l’Institut Pasteur) (figure 3.28).
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Fc Fc* Fc*M Fc*V HFc* HFc*M Fc* Fc*M Fc*M BoNTA
i.m i.d i.d+i.m Pasteur
D O à 4 9 2 n m IgG1 IgG2a X 2,7 X 1,6 X 1,8 X 3,2 X 2,9 X 1 X 1 X 1 X 1 X 2,6
Fig. 3.28 – Rapport IgG1/IgG2a. Les sérums de chaque lot sont regroupés et dosés en triplicate, à la
dilution 1/100e
pour la détection des anticorps IgG1 et IgG2a. Le rapport IgG1/IgG2a est indiqué sur le graphe.
Pour les sérums Fc et Fc* dans le cas d’une injection et électrotransfert en intramusculaire, le rapport IgG1/IgG2a est proche de 1. L’ADN plasmidique code dans ce cas une protéine cytoplasmique (figure 3.17 d’immunofluorescence). La réponse semble être à la fois cellulaire et humorale.
Pour les sérums Fc*M et Fc*V dans le cas d’une injection et électrotransfert en intramus- culaire, le rapport IgG1/IgG2a est proche de 2. L’ADN plasmidique code dans ce cas une pro- téine sécrétée : l’antigène circule donc dans l’organisme. On se retrouve donc dans une situation mimant la vaccination protéique : nous avons d’ailleurs dosé en parallèle un sérum de souris immunisées par des injections de protéine recombinante (fourni par le laboratoire du Dr. M. Popoff), le rapport IgG1/IgG2a est sensiblement le même. L’antigène extracellulaire serait donc
3.9. Caractérisation des antisérums 157 pris en charge par des cellules présentatrices d’antigène qui le présentent sur des molécules de classe II du CMH, ce qui aboutit à une forte réponse humorale. Plusieurs études comparant différentes formes d’antigène (sécrété, cytoplasmique ou membranaire) ont montré que la loca- lisation cellulaire de l’antigène influait sur le type de réponse immune : ces études montrent en particulier que la forme sécrétée conduit à une forte réponse de type Th2 caractérisée par la présence essentiellement d’IgG1 [183, 354].
Si l’on ajoute un prétraitement à la hyaluronidase, cet effet n’est plus visible. Le rapport IgG1/IgG2a est proche de 1 que l’antigène soit sécrété (Fc*M) ou non (Fc*). Si l’on compare les conditions Fc*M et HFc*M (sécrété, avec ou sans hyaluronidase), on observe que la quantité d’IgG1 ne varie pas, par contre la quantité d’IgG2a augmente avec le prétraitement à la hyalu- ronidase. On peut supposer en effet, que dans le cas de ce prétraitement, la réponse cellulaire cytotoxique soit plus importante du fait de la dégradation de la matrice extracellulaire du tissu. C’est sans doute pour cela que nous avions observé une augmentation du titre en anticorps dans le cas d’un prétraitement à la hyaluronidase avec le plasmide pVaxFc*BoNTA-Master (figure 3.24), mais que ces anticorps n’avaient pas un pouvoir neutralisant supérieur (figure 3.7). Par contre, pour la condition HFc*, le rapport est toujours de 1 mais les quantités d’IgG1 et d’IgG2a ont augmenté de façon proportionnelle. Les anticorps dans la condition HFc* avaient effectivement un pouvoir neutralisant plus important que la condition Fc* (figure 3.7).
Dans le cas d’un électrotransfert en intradermique, on observe un rapport IgG1/IgG2a bien supérieur à 1, même dans le cas où l’antigène est cytoplasmique (Fc*). Dans leur étude d’immu- nisation génétique, Pavselj et al. n’ont détecté aucun sous-type IgG2a ni IgG2b après injection et électrotransfert en intradermique d’un plasmide codant l’ovalbumine, suggérant une réponse uniquement de type Th2 [112].
Dans le cas d’une réinjection (Fc*M id+im), on observe là encore un rapport proche de 3. Les deux dernières conditions (Fc*M id ou Fc*M id+im) semblent donc très intéressantes dans le cadre de notre projet : la réponse immune est essentiellement humorale avec des titres en anticorps élevés. Le test de neutralisation sur ces conditions sera réévalué prochainement.
Gronevik et al. ont très récemment montré que l’électrotransfert semblait favoriser une ré- ponse de type Th1 [355]. Pour vérifier cela, ils ont injecté et électrotransféré un vecteur d’ex- pression codant un antigène sous contrôle d’un promoteur régulable par la tétracycline pour retarder l’expression de l’antigène un mois après l’application des impulsions électriques. Dans le cas d’une expression retardée de l’antigène, ils ont observés des niveaux d’IgG2a fortement diminués (caractéristiques d’une réponse cellulaire Th1), alors que les niveaux d’IgG1 (caractéris- tiques d’une réponse humorale Th2) ne sont pas affectés. L’électroporation semble donc jouer un rôle d’adjuvant pour promouvoir une réponse de type Th1. Effectivement dans notre cas, pour l’ensemble des conditions, la quantité d’IgG2a est globalement stable et non négligeable. Elle est maximale dans le cas d’un prétraitement à la hyaluronidase. Par contre, la quantité d’IgG1 est très différente selon que l’antigène est sécrété ou non et selon le protocole d’injection. Cette analyse pourra nous aider à définir de façon plus précise le protocole optimal.
158 Chapitre 3. Obtention d’antisérums antitoxines botuliques